CN106883990A - 高效发酵液培养基的制备方法 - Google Patents

高效发酵液培养基的制备方法 Download PDF

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Abstract

高效发酵液培养基的制备方法，将盐酸与三甲胺在常温下混合合成三甲胺盐酸盐，向三甲胺盐酸盐中通入环氧乙烷，生成缩合溶液再转入负压浓缩蒸发器中，蒸发得到高有效含量的氯化胆碱水剂；在反应釜中打入水，投入氯乙酸和无水碳酸钠，并定量投入三甲胺，对混合物料加热，待盐全部沉降，将盐分进行甩干，甩出的母液打入浓缩釜中重新进行浓缩得到甜菜碱，最后将氯化胆碱水剂与甜菜碱混合搅拌即可。本发明生产方法具有操作简单、生产成本低、适合大规模生产等优势，采用该生产方法生产出来的发酵液培养基主要成分为氯化胆碱、甜菜碱作为培养基中的甲基供体，促进菌种组分优化，诱导菌种单一方向发酵，减少副产物，提高产品效价量。

Description

高效发酵液培养基的制备方法
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种高效发酵液培养基的制备方法。
背景技术
发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。因此，要求发酵培养基的组成应丰富、完全，碳、氮源要注意速效和迟效的互相搭配，少用速效营养，多加迟效营养；还要考虑适当的碳氮比，加缓冲剂稳定pH值；并且还要有菌体生长所需的生长因子和产物合成所需要的元素、前体和促进剂等。除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。
发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。目前的发酵液培养基菌种发酵的杂质较多，组分复杂，影响产品的效价。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供了一种高效发酵液培养基的制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种高效发酵液培养基的制备方法，具体步骤如下：
(一)制备高有效含量的氯化胆碱水剂：
(1)将盐酸与三甲胺在常温下混合，合成浓度为62wt％～64wt％的三甲胺盐酸盐；
(2)向三甲胺盐酸盐中通入环氧乙烷，生成缩合溶液；
(3)将生成的缩合溶液转入负压浓缩蒸发器中，蒸发得到高有效含量的氯化胆碱水剂；
(二)制备甜菜碱：
(1)在反应釜中打入水，再投入氯乙酸，搅拌至氯乙酸全部溶解，缓慢投入无水碳酸钠，投料时注意反应速度，以不析出大量的二氧化碳为准，当温度超过50℃吋，开启少量的冷却水，使物料温度保持在50℃～60℃之间，投料完成后稳定30分钟；
(2)定量投入三甲胺，调节三甲胺的通料速度以及冷却水的给水量，使反应温度控制在55℃～60℃之间，反应釜压力最大不允许超过0.1Mpa，当三甲胺总加入量剩余15％以内时，减小冷却水的给水量，使反应温度上升至60℃～70℃之间，投料完毕后稳定ー小时；
(3)浓缩打开蒸汽阀，使蒸汽压力逐步提升、稳定在0.3MPa，给物料加热进行浓缩，真空压力应稳定在-0.08MPa，甜菜碱浓度达到60％时，停止加热，此时物料温度为115℃，停止搅拌，真空放空，停止搅拌30分钟后，待盐全部沉降，将物料中的上清液移至另ー浓缩釜，剩余的盐分进行甩干，甩出的母液打入浓缩釜中重新进行浓缩使用；
(4)烘干将温度保持在110～120℃，压力保持在-0.15～-0.2Mpa，进行烘干，烘干至水份低于1％时放出物料；
(5)包装干燥后的产品放入到大托盘中冷却，温度小于40℃后对物料进行包装，检测合格后入库；
(三)混合搅拌：
将步骤(一)制备得到的氯化胆碱水剂与步骤(二)制备得到的甜菜碱在常温下、以50转/秒的速度混合搅拌。
上述步骤(一)中盐酸为高纯盐酸，三甲胺的浓度为99.95wt％，二者混合时，盐酸的流速为33L/min，三甲胺的流速为20L/min。
上述步骤(一)中生成缩合溶液的过程通过调节环氧乙烷的流速控制PH在8～10之间。
本发明生产方法具有操作简单、生产成本低、适合大规模生产等优势，采用该生产方法生产出来的发酵液培养基主要成分为氯化胆碱、甜菜碱作为培养基中的甲基供体，促进菌种组分优化，诱导菌种单一方向发酵，减少副产物，提高产品效价量。
具体实施方式
例1
以制备1000ml发酵液培养基为例。
第一步：制备高有效含量的氯化胆碱水剂
1、合成三甲胺盐酸盐
将1000克盐酸(高纯盐酸)与521克三甲胺(浓度为99.95wt％)在常温下混合，合成三甲胺盐酸盐。二者混合时，盐酸的流速为33L/min，三甲胺的流速为20L/min。
经检测，合成的三甲胺盐酸盐的浓度为64wt％。
2、生成缩合溶液
向三甲胺盐酸盐中通入环氧乙烷，环氧乙烷的流速为0.5t/h，控制pH在8-10之间，约20h后生成缩合溶液。
3、蒸发得到水剂
将生成的缩合溶液转入四效蒸发器中，温度125℃，压力0.32MP，流量8000L/h，蒸发得到氯化胆碱水剂。
经检测，该水剂中氯化胆碱的含量为75.25wt％，总游离氨≤300ppm，重金属≤0.002％，乙二醇≤0.05％，灰分≤0.2％。
第二步制备甜菜碱：
(1)在反应釜中打入2吨水，投入1450-1550公斤氯乙酸，搅拌至氯乙酸全部溶解，缓慢投入800-900公斤无水碳酸钠，投料时注意反应速度，以不析出大量的二氧化碳为准，当温度超过50℃吋，开启少量的冷却水，使物料温度保持在50℃至60℃之间，投料完成后稳定30分钟；
(2)定量投三甲胺900-1000公斤，调节三甲胺的通料速度以及冷却水的给水量，使反应温度控制在55℃-60℃之间，反应釜压力最大不允许超过0.1Mpa,当通料至剩余三甲胺为150公斤时，减小冷却水的给水量，使反应温度上升至60℃-70℃之间，投料完毕后稳定ー小时；
(3)浓缩打开蒸汽阀，使蒸汽压力逐步提升、稳定在0.3MPa，给物料加热进行浓缩，真空压力应稳定在-0.08MPa，甜菜碱浓度达到60％时，停止加热，此时物料温度为115℃，停止搅拌，真空放空，停止搅拌30分钟后，待盐全部沉降，将物料中的上清液移至另ー浓缩釜，剩余的盐分进行甩干，甩出的母液打入浓缩釜中重新进行浓缩使用；
(4)烘干将温度保持在110-120℃，压力保持在-0.15至-0.2Mpa，进行烘干，烘干至水份低于1％时放出物料。
经测定，所得无水甜菜碱的纯度为98％，收率为98.8％。
第三步：混合搅拌
将步骤一制备得到的氯化胆碱水剂与步骤二制备得到的甜菜碱在常温下、以50转/秒的速度混合搅拌。
我们对生产出来的发酵液培养基的含量和性能进行了测定。
一、有效含量
经检测，采用本发明的方法生产出来的发酵液培养基有效成分：氯化胆碱含量为71％，甜菜碱含量1％。
二、总游离氨
经检测，采用本发明的方法生产出来的发酵液培养基中总游离氨的含量为86ppm。
三、PH值
经检测，采用本发明的方法生产出来的发酵液培养基PH值为6.86。
所以，采用本发明的方法生产出来的发酵液培养基不仅可以应用到赖氨酸，螺旋霉素，辅酶Q10，苏氨酸，色氨酸，多杀菌素中，更可以应用到红豆杉细胞、重组CHO细胞密度，提高细胞活力，增加目的蛋白的表达量，降低蛋白中的聚体含量。也可促进红霉素生物合成中的羟基化和甲基化进程；改变次级代谢通路，为生产过程提供甲基，也可作为刺激因素刺激甲基化酶的合成，从而使代谢通量流入红霉素A合成过程，改善红霉素组分；提高红霉素合成的溶氧，将代谢流引入次级代谢产物合成过程，从而加强发酵中的三羧酸循环。
采用本发明的方法生产出来的发酵液培养基，其从根本上解决了目前市场上发酵液培养基菌种发酵的杂质较多，组分复杂，影响产品的效价等诸多难题，是一种高效的发酵液培养基的新型产品。

Claims (3)

1.一种高效发酵液培养基的制备方法，其特征是具体步骤如下：
(一)制备高有效含量的氯化胆碱水剂：
(1)将盐酸与三甲胺在常温下混合，合成浓度为62wt％～64wt％的三甲胺盐酸盐；
(2)向三甲胺盐酸盐中通入环氧乙烷，生成缩合溶液；
(3)将生成的缩合溶液转入负压浓缩蒸发器中，蒸发得到高有效含量的氯化胆碱水剂；
(二)制备甜菜碱：
(1)在反应釜中打入水，再投入氯乙酸，搅拌至氯乙酸全部溶解，缓慢投入无水碳酸钠，投料时注意反应速度，以不析出大量的二氧化碳为准，当温度超过50℃吋，开启少量的冷却水，使物料温度保持在50℃～60℃之间，投料完成后稳定30分钟；
(2)定量投入三甲胺，调节三甲胺的通料速度以及冷却水的给水量，使反应温度控制在55℃～60℃之间，反应釜压力最大不允许超过0.1Mpa，当三甲胺总加入量剩余15％以内时，减小冷却水的给水量，使反应温度上升至60℃～70℃之间，投料完毕后稳定ー小时；
(3)浓缩打开蒸汽阀，使蒸汽压力逐步提升、稳定在0.3MPa，给物料加热进行浓缩，真空压力应稳定在-0.08MPa，甜菜碱浓度达到60％时，停止加热，此时物料温度为115℃，停止搅拌，真空放空，停止搅拌30分钟后，待盐全部沉降，将物料中的上清液移至另ー浓缩釜，剩余的盐分进行甩干，甩出的母液打入浓缩釜中重新进行浓缩使用；
(4)烘干将温度保持在110～120℃，压力保持在-0.15～-0.2Mpa，进行烘干，烘干至水份低于1％时放出物料；
(5)包装干燥后的产品放入到大托盘中冷却，温度小于40℃后对物料进行包装，检测合格后入库；
(三)混合搅拌：
将步骤(一)制备得到的氯化胆碱水剂与步骤(二)制备得到的甜菜碱在常温下、以50转/秒的速度混合搅拌。
2.根据权利要求1所述的高效发酵液培养基的制备方法，其特征是步骤(一)中盐酸为高纯盐酸，三甲胺的浓度为99.95wt％，二者混合时，盐酸的流速为33L/min，三甲胺的流速为20L/min。
3.根据权利要求1所述的高效发酵液培养基的制备方法，其特征是步骤(一)中生成缩合溶液的过程通过调节环氧乙烷的流速控制PH在8～10之间。
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