CN109207397A - 一种副猪嗜血杆菌培养基及高密度发酵培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业微生物技术领域，尤其涉及一种副猪嗜血杆菌培养基及高密度发酵培养方法。本发明得到利于副猪嗜血杆菌培养的培养基组分：葡萄糖2.5 g/L，蛋白胨10.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，K2HPO4 2.5 g/L，NaCl 5.0 g/L，三甲基甘氨酸1.5 g/L，氯化胆碱1.0 mL/L，VB1 30.0 mg/L，VH 10.0 mg/L，NAD 50 mg/L，3.0%牛血清，余量是水；本发明还提供了基于上述培养基组分的副猪嗜血杆菌发酵培养方法，在不含辅酶培养基中以牛血清作为限制性生长因子，建立电容值与牛血清消耗的线性关系，则可实时调节牛血清补加速率并维持在一定浓度。采用该方法，副猪嗜血杆菌活菌数目均达到x1010 CFU/mL以上，实现了其高密度发酵，且该方法可应用于多种情形副猪嗜血杆菌的规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，尤其涉及一种副猪嗜血杆菌培养基及高密度发酵培养方法。
背景技术
猪副猪嗜血杆菌病，是由副猪嗜血杆菌引起的以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的传染病，是近年来危害我国及世界养猪业发展的重要细菌传染病之一。目前证实主要影响5～8周的仔猪，发病率一般为10～15％，严重时死亡率高达50％以上，给我国养猪业造成巨大的经济损失。但是，目前副猪嗜血杆菌培养基成本高、培养密度低等问题造成其生产成本高，严重影响了该疫苗的使用。因此，研究一种副猪嗜血杆菌高密度发酵培养技术具有十分重要的意义。
当前副猪嗜血杆菌培养基及发酵方法得到的活菌数目最大值基本都在x109，例如CN103232962A的发明专利公布了一种副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基及其制备方法，该培养基包括以下组分：酵母粉、大豆胨、麦芽糖、NaCl、K2HPO4、NAD和牛血清，余量是水，pH7.0-7.4，活菌数目最大值为3x109；CN106282075A的发明专利公布了一种用于培养副猪嗜血杆菌的液体培养基，其包含有如下的组分：胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾、葡萄糖、酵母粉、牛血清和辅酶Ⅰ，活菌数目最大值为3x109。此外，由于在发酵过程中，牛血清的含量会减少，影响发酵效果，当前没有合适的实时调节血清补加速率将血清浓度维持一定水平的发酵方法，这都极大限制了副猪嗜血杆菌高密度发酵。
发明内容
本发明得到利于副猪嗜血杆菌培养的培养基组分，本发明还提供了基于上述培养基组分的副猪嗜血杆菌发酵培养方法，基于电容值与血清添加量的线性关系，可实时调节血清补加速率将血清浓度维持在设定值，通过该方法副猪嗜血杆菌活菌数目达到x1010CFU/mL以上，实现了其高密度发酵。
为了达到上述的技术效果，本发明采取以下技术方案：
一种副猪嗜血杆菌培养基，培养基包括以下组份：按照重量/体积计，葡萄糖2.0～3.0g/L，蛋白胨8.5～13.0g/L，酵母粉7.5～12.5g/L，K2HPO4 1.5～3.0g/L，NaCl 3.5～7.0g/L，三甲基甘氨酸1.0～2.5g/L，氯化胆碱0.5～1.5mL/L，VB1 25.0～35.0mg/L，VH 8.5～12.0mg/L，NAD 45～55mg/L；按照体积比计，2.0～4.0％牛血清，余量为水。
更优的，副猪嗜血杆菌培养基，培养基组份，按照重量/体积计，葡萄糖2.5g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉10.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，NaCl 5.0g/L，三甲基甘氨酸1.5g/L，氯化胆碱1.0mL/L，VB1 30.0mg/L，VH 10.0mg/L，NAD 50mg/L；按照体积比计，3.0％牛血清，余量是水。
其中，K2HPO4中的磷元素可以调节细菌代谢流分布及细菌的生长速率；三甲基甘氨酸不仅可以为细菌生长提供甲基，而且可作为良好的渗透压保护剂，避免细菌生长收到的渗透压抑制作用；氯化胆碱可提供细菌生长的生长因子；VB1是细菌生长的关键生长因子，可以以辅酶形式参与各种生化反应；VH为B族维生素之一，是多种羧化酶的辅酶，且也是细胞壁合成的重要成分；NAD为副猪嗜血杆菌的限制性生长因子，副猪嗜血杆菌作为辅酶依赖性菌株，在不含NAD的培养基中不能生长；血清中含有多种生长因子和微量元素，且在不含NAD的培养基中添加血清可恢复副猪嗜血杆菌的生长性能。
副猪嗜血杆菌为辅酶依赖性菌株，且血清中含有多种生长因子及微量元素，则在不含辅酶培养基中，血清可作为副猪嗜血杆菌生长的限制性因子。调节菌株限制性生长因子的浓度水平，可有效控制菌株的生长速率，实现菌株的高密度发酵。基于此，本发明还提供了一种副猪嗜血杆菌高密度发酵培养方法，包括下列步骤：
(1)挑取副猪嗜血杆菌单菌落接种至种子培养基容器中，培养条件为：温度35～39℃，搅拌转速150～200rpm，培养时间10～14h；
(2)按照体积分数10％的接种量将步骤(1)中种子液接种至装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度35～39℃；溶氧水平维持在15～25％，pH维持在7.2～7.8，在发酵过程中，葡萄糖浓度维持在0.8～1.2g/L，维持血清浓度维持在2.5～3.5％。
发酵培养基包括以下组份：葡萄糖2.0～3.0g/L，蛋白胨8.5～13.0g/L，酵母粉7.5～12.5g/L，K2HPO4 1.5～3.0g/L，NaCl 3.5～7.0g/L，三甲基甘氨酸1.0～2.5g/L，氯化胆碱0.5～1.5mL/L，VB1 25.0～35.0mg/L，VH 8.5～12.0mg/L，NAD 45～55mg/L；按照体积比计，2.0～4.0％牛血清，余量为水。
其中，发酵培养过程中，细胞菌体浓度和电容值具有良好的线性关系，且线性方程为：y＝8.7459x(y：菌体浓度，OD600；x：电容值，pF/cm)，活细胞浓度与活菌数目具有良好的线性关系，且该线性方程为：y＝1.8417x(y：活菌数目x109CFU/mL；x：细胞菌体浓度OD600；R2＝0.9963)，血清添加量与副猪嗜血杆菌活菌数目具有良好的线性关系，且该线性方程为：y＝0.153x(y：活菌数目、x1012CFU/L；x：血清添加量，mL/L；R2＝0.9952)。
血清补加速率根据电容值变化量实时调节，血清添加量与电容值的线性关系y＝105.26x(y：血清添加量mL/L；x：电容值pF/cm)，根据电容值变化量计算血清消耗速率，实时调节血清补加速率将血清浓度维持在设定值。
优选的，种子培养基为TSB培养基，组分为葡萄糖2.5g/L，蛋白胨17.0g/L，大豆胨3.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，NaCl 5.0g/L、100mg/L NAD、体积分数为5.0％牛血清。
优选的，培养温度为37℃；溶氧水平维持在20％。
优选的，pH维持在7.5；葡萄糖浓度维持在1.0g/L。
优选的，基于发酵电容值变化量补加血清将牛血清浓度维持在3.0％。
优选的，副猪嗜血杆菌高密度发酵培养方法，包括下列步骤：
(1)挑取副猪嗜血杆菌单菌落接种至装有100mL TSB种子培养基(包括100mg/LNAD、5.0％牛血清)的500mL三角瓶中，培养条件为：温度37℃，搅拌转速200rpm，培养时间12h。
(2)按照体积分数10％的接种量将步骤(1)中种子液接种至装有6L发酵培养基的10L发酵罐中，培养温度37℃；通过调节搅拌转速和通风量将溶氧水平维持在20％；利用4mol/L NaOH溶液将pH维持在7.5；培养过程中，流加葡萄糖溶液维持葡萄糖溶液在1.0g/L，基于电容值变化量调节牛血清补加速率将牛血清浓度维持在3.0％。
发酵培养基包括以下组份：葡萄糖2.5g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉10.0g/L，K2HPO42.5g/L，NaCl 5.0g/L，三甲基甘氨酸1.5g/L，氯化胆碱1.0mL/L，VB1 30.0mg/L，VH 10.0mg/L，50mg/LNAD；按照体积比计，3.0％牛血清，余量为水。
上述副猪嗜血杆菌高密度发酵培养方法可在副猪嗜血杆菌血清5型、血清1型、血清3型、血清4型上应用。
本发明的有益效果为：本发明提供了利于副猪嗜血杆菌生长的培养基组分；同时提供了基于牛血清作为副猪嗜血杆菌生长的限制性因子的高密度发酵方法。通过分析电容值、活细胞浓度、活菌数目以及血清添加量之间关系，建立血清添加量与电容值的线性关系(y＝105.26x；y：血清添加量mL/L；x：电容值pF/cm)，根据电容值变化量计算血清消耗速率，则实时调节血清补加速率将血清浓度维持在设定值，有效控制菌体生长速率；同时确定牛血清维持浓度3.0％。通过该培养基及发酵方法，副猪嗜血杆菌活菌数目可达到X1010CFU/mL以上，实现了副猪嗜血杆菌的高密度发酵。
附图说明
图1为不同培养基对副猪嗜血杆菌发酵的影响曲线。
图2为活细胞浓度与电容值、活菌数目之间的线性关系曲线。
图3为血清添加浓度对副猪嗜血杆菌三角瓶培养的影响示意图。
图4为血清添加浓度对副猪嗜血杆菌发酵罐培养的影响示意图。
图5为血清添加浓度与细胞浓度/电容值的线性关系示意图。
图6为培养过程中电容值变化量与血清补加速率曲线。
图7为不同血清维持浓度的细胞浓度曲线。
图8为不同血清维持浓度的活菌数目与生长速率曲线。
图9为50L发酵罐副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基与培养方法的验证曲线(a、b：批次一；c、d：批次二；e、f：批次三)。
图10为不同血清型副猪嗜血杆菌的高密度发酵培养曲线(a、b：菌株I；c、d：菌株II；e、f：菌株III)。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例对本发明作进一步的阐述和说明。
本发明菌株采用副猪嗜血杆菌血清5型(CVCC3892)，购于中国兽医微生物菌种保藏中心，保存于山东省滨州畜牧兽医研究院菌种保藏室。
具体的试验检测仪器如下：利用在线活细胞检测仪(DN 12-120，Hamilton，瑞士)测定副猪嗜血杆菌培养过程中活细胞电容值。利用分光光度计在600nm处测定副猪嗜血杆菌菌体浓度(OD600)，细胞干重(DCW)根据公式1OD600＝0.42g/L DCW计算。通过平板计数测定副猪嗜血杆菌活菌数目。利用生物传感分析仪(SBA-40E)测定培养过程中葡萄糖浓度。基于细胞干重，通过Origin 8.0计算副猪嗜血杆菌比生长速率。
采用的种子培养基为TSB培养基(葡萄糖2.5g/L，蛋白胨17.0g/L，大豆胨3.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，NaCl 5.0g/L)，且其中包括100mg/L NAD、体积分数为5.0％的牛血清。
实施例1：不同培养基对副猪嗜血杆菌发酵的影响
本发明中采用四种培养基进行副猪嗜血杆菌发酵，分别是：
培养基I：TSB培养基按照重量/体积计，(葡萄糖2.5g/L，蛋白胨17.0g/L，大豆胨3.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，NaCl 5.0g/L)，NAD 50mg/L，按照体积比计，3.0％牛血清，余量为水；
培养基II：按照重量/体积计，葡萄糖2.5g/L，酵母粉3.0g/L，胰蛋白胨22.0g/L，K2HPO4 3.0g/L，NaCl 5.0g/L，NAD 50mg/L，按照体积比计，3.0％牛血清，余量为水；
培养基III：按照重量/体积计，葡萄糖2.5g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉10.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，NaCl 5.0g/L，NAD 50mg/L，按照体积比计，3.0％牛血清，余量为水；
培养基IV：按照重量/体积计，葡萄糖2.5g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉10.0g/L，K2HPO4 2.5g/L，NaCl 5.0g/L，三甲基甘氨酸1.5g/L，氯化胆碱1.0mL/L，VB1 30.0mg/L，VH10.0mg/L，NAD 50mg/L，按照体积比计，3.0％牛血清，余量为水。
具体实验操作如下：
(1)副猪嗜血杆菌5型(CVCC3892)在37℃培育18小时，至单菌落长出。
(2)挑取单菌落接种到装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，温度为37℃、搅拌速度为200rpm，培养12h。按照10％的接种量接种至装有6.0L发酵培养基的10L发酵罐中。培养温度37℃；通过调节搅拌转速和通风量将溶氧水平维持在20％；利用4mol/L NaOH溶液将pH维持在7.5；培养过程中，流加葡萄糖溶液维持葡萄糖溶液在1.0g/L。分别接种以上四种发酵培养基，实验结果如附图1所示。
由附图1可知，培养基组分显著影响副猪嗜血杆菌培养的细胞浓度和活菌数目。利用培养基I、II、III及IV培养副猪嗜血杆菌，细胞浓度(OD600)与活菌数目分别为：2.89(5.29x109CFU/mL)、3.24(5.91x109CFU/mL)、3.77(6.84x109CFU/mL)、4.28(7.79x109CFU/mL)，则表明培养基IV利于副猪嗜血杆菌培养，因此选用培养基IV作为副猪嗜血杆菌发酵培养基。
实施例2：不同血清添加量对副猪嗜血杆菌发酵的影响以及电容值与菌体浓度/血清浓度之间关系
2.1活细胞浓度在线测定以及活细胞浓度与活菌数目之间关系
实施例1培养基IV作为副猪嗜血杆菌发酵培养基，在10L发酵罐上进行副猪嗜血杆菌培养，具体培养过程同实施例1。在培养初期，测定不同培养时间时的活细胞电容值、菌体浓度以及活菌数目，并计算菌体浓度与电容值、活菌数目之间的关系，结果如附图2所示。
由附图2(a)可知，细胞菌体浓度和电容具有良好的线性关系，且线性方程为：y＝8.7459x(y：菌体浓度，OD600；x：电容值，pF/cm)，则表明在副猪嗜血杆菌生长阶段的菌体浓度为活细胞浓度，且活细胞浓度可以通过测得的电容值计算得到。附图2(b)表明，活细胞菌体浓度与活菌数目具有良好的线性关系，且该线性方程为：y＝1.8417x(y：活菌数目x109CFU/mL；x：细胞菌体浓度OD600；R2＝0.9963)，则基于该线性方程，可通过细胞浓度计算副猪嗜血杆菌的活菌数目。
2.2血清添加浓度对副猪嗜血杆菌培养的影响
(1)血清添加浓度对副猪嗜血杆菌三角瓶培养的影响
发酵培养基采用实施例1中培养基IV。
副猪嗜血杆菌5型在37℃培育18小时，至单菌落长出。
挑取副猪嗜血杆菌单菌落接种到装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，温度37℃、搅拌速度为200rpm，培养12h，副猪嗜血杆菌进入对树生长中期(菌体浓度OD600为1.0)。取5.0mL培养液5000rpm离心20min，且用10mL发酵培养基洗涤2次。然后，将菌体接种至装有50mL发酵培养基(不同血清添加浓度)的250mL三角瓶中，温度为37℃、搅拌速度200rpm，培养16h。
血清添加量分别为1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％以及10.0％，且在培养结束时利用活细胞在线检测仪测定活细胞浓度，试验结果如附图3所示。
由附图3可知，血清添加范围在1％～5％时，总细胞浓度、活细胞浓度以及活细胞所占比率随着血清添加量的增加而提高；当不添加血清时，副猪嗜血杆菌不生长，则表明在不含辅酶培养基中，血清是副猪嗜血杆菌生长的限制性生长因子。血清添加量为5％和10％时，其总细胞浓度、活细胞浓度以及活细胞所占比率无显著性差异。血清添加量为0～5％范围内，副猪嗜血杆菌活细胞浓度与血清添加量具有一定的线性关系。
(2)血清添加浓度对副猪嗜血杆菌发酵罐培养的影响
发酵罐培养：发酵培养基采用实施例1中培养基IV；
副猪嗜血杆菌5型在37℃培育18小时，至单菌落长出。
挑取单菌落接种到装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，温度37℃、搅拌速度200rpm，培养12h。取600mL培养液以转速5000rpm离心20min，且用100mL发酵培养基洗涤2次。然后，将菌体接种至装有6.0L发酵培养基(不同血清添加浓度)的10L发酵罐中。培养温度37℃；通过调节搅拌转速和通风量将溶氧水平维持在20％；利用4mol/L NaOH溶液将pH维持在7.5；培养过程中，流加葡萄糖溶液维持葡萄糖溶液在1.0g/L。
血清添加量分别为1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％以及10.0％，试验结果如附图4所示。
由附图4可知，细胞浓度与活细胞浓度随着血清添加量的增加而提高，这一结果与三角瓶培养结果一致；且随着血清添加量的提高，菌体比生长速率增加。血清添加量为1％、2％、3％、4％及5％时，分别在培养11h、13h、15h、16h、17h时获得最大活细胞浓度分别为0.833、1.654、2.515、3.374、4.087；同时，分别占总细胞浓度的96.79％、94.29％、93.03％、92.87％、92.12％。随着血清添加量的增加，活细胞占总细胞浓度逐渐降低，可能与最大比生长的提高有关，则应通过调节血清浓度来控制其生长速率。血清添加量为1％、2％、3％、4％及5％时，活细胞最大比生长速率分别为0.3056h-1、0.3763h-1、0.4295h-1、0.4782h-1、0.4856h-1。
2.3副猪嗜血杆菌培养过程中血清浓度与活细胞浓度/电容值之间的关系
基于活细胞菌体浓度与活菌数目的线性方程(y＝1.8417x，y：活菌数目x109CFU/mL；x：细胞菌体浓度OD600；R2＝0.9963)，血清添加量分别为1％、2％、3％、4％及5％时，活菌数目分别为1.53x109CFU/mL、3.04x109CFU/mL、4.63x109CFU/mL、6.21x109CFU/mL、7.52x109CFU/mL(见附图5(a))。根据不同血清添加量的副猪嗜血杆菌活菌数目，分析其线性相关性(见附图5(b))，血清添加量与副猪嗜血杆菌活菌数目具有良好的线性关系，且该线性方程为：y＝0.153x(y：活菌数目、x1012CFU/L；x：血清添加量，mL/L；R2＝0.9952)。结合2.1中电容值、活细胞浓度、活菌数目之间的线性关系，得出电容值与血清消耗的线性方程为：y＝105.26x(y：血清添加量，mL/L；x：电容值，pF/cm；R2＝0.9967)，见附图5(c)，则基于此方程可以通过电容值的变化计算血清的消耗。
实施例3：血清补加策略在副猪嗜血杆菌发酵中的应用
发酵培养基：采用实施例1中培养基IV；
副猪嗜血杆菌5型在37℃培育18小时，至单菌落长出。
挑取单菌落接种到装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，温度37℃、搅拌速度200rpm，培养12h。按照10％的接种量接种至装有6.0L发酵培养基的10L发酵罐中。培养温度37℃；通过调节搅拌转速和通风量将溶氧水平维持在20％；利用4mol/L NaOH溶液将pH维持在7.5；培养过程中，流加葡萄糖溶液维持葡萄糖溶液在1.0g/L，且基于电容值变化量与血清消耗之间关系，调节血清补加速率将血清浓度维持在一定水平。
3.1不同血清补加策略的血清补加速率
基于2.3中电容值与血清浓度的线性关系(y＝105.26x；y：血清添加量，mL/L；x：电容值，pF/cm)，根据电容值的变化，计算副猪嗜血杆菌培养过程中的血清消耗速率；根据血清消耗速率，调节血清补加速率，将培养过程中的血清浓度分别维持在1％(策略I)、2％(策略II)、3％(策略III)、4％(策略IV)以及5％(策略V)，具体见附图6。
3.2不同血清补加策略的菌体浓度
根据副猪嗜血杆菌培养过程中电容值的变化，调节血清补加速率，维持不同的血清浓度进行培养，细胞浓度如附图7所示。
由附图7可知，采用策略III(血清浓度维持在3％)进行副猪嗜血杆菌培养时，细胞浓度、或活细胞浓度以及活细胞所占比率最高，分别为10.51、10.28、97.84％；血清浓度低于3％时，细胞浓度、活细胞浓度以及活细胞所占比率随着血清浓度提高而提高；血清浓度高于3％时，细胞浓度、活细胞浓度以及活细胞所占比率随着血清浓度提高而降低。采用策略I、II、III、IV及V进行培养时，分别在19h、18h、16h、15h、14h时活细胞浓度达到最高。
3.3不同血清补加策略的活菌数目与生长速率
不同血清维持浓度下，副猪嗜血杆菌的活菌数目与生长速率如图8所示。由附图8可知，血清维持浓度低于3％时，活菌数目随着血清浓度增加而提高；血清浓度低于3％时，活菌数目随着血清浓度的提高而降低；血清浓度为3％(策略III)时，活菌数目最高为1.88X1010CFU/mL。菌体生长速率血清维持浓度的提高而升高。采用策略I、II、III、IV及V时，菌体最大比生长速率分别为0.3045h-1、0.3786h-1、0.4315h-1、0.4806h-1、0.4889h-1。
实施例4：不同培养条件下的对比
试验1：培养基组份及配比，按照重量/体积计，葡萄糖2.0g/L，蛋白胨8.5g/L，酵母粉7.5g/L，K2HPO4 1.5g/L，NaCl 3.5g/L，三甲基甘氨酸1.0g/L，氯化胆碱0.5mL/L，VB125.0mg/L，VH 8.5mg/L，NAD 45mg/L；按照体积比计，2.5％牛血清，余量是水。
发酵方法：副猪嗜血杆菌5型在37℃培育18小时，至单菌落长出。
挑取单菌落接种到装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，温度35℃、搅拌速度150rpm，培养10h。按照10％的接种量接种至装有6.0L发酵培养基的10L发酵罐中。培养温度35℃；通过调节搅拌转速和通风量将溶氧水平维持在15％；利用4mol/L NaOH溶液将pH维持在7.2；培养过程中，流加葡萄糖溶液维持葡萄糖溶液在0.8g/L，且基于电容值变化量与血清消耗之间关系，调节血清补加速率将血清浓度维持在体积分数2.5％。
试验2：培养基组份及配比，按照重量/体积计，葡萄糖3g/L，蛋白胨13g/L，酵母粉12.5g/L，K2HPO4 3g/L，NaCl 7g/L，三甲基甘氨酸2.5g/L，氯化胆碱1.5mL/L，VB1 35.0mg/L，VH 12mg/L，NAD 55mg/L；按照体积比计，3.5％牛血清，余量是水。
发酵方法：与试验1不同在于，种子培养基容器中，培养条件为：温度39℃，搅拌转速200rpm，培养时间14h；发酵罐中，培养温度39℃；溶氧水平维持在25％，pH维持在7.8，葡萄糖溶液在1.2g/L，在发酵过程中，维持血清浓度维持在体积分数为3.5％。
实验表明，试验1、试验2活菌数目均达到1010CFU/mL以上。
实施例5：副猪嗜血杆菌高密度发酵方法规模化放大及其在其他血清型副猪嗜血杆菌培养中的应用
5.1 50L发酵罐上发酵培养实验
(1)本发明得到的副猪嗜血杆菌高密度发酵的培养基和培养工艺
发酵培养基：采用实施例1中培养基IV；
副猪嗜血杆菌在37℃培育18小时，至单菌落长出。
挑取单菌落接种到装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，温度37℃、搅拌速度200rpm，培养12h。按照10％的接种量接种至装有30L发酵培养基的50L发酵罐中。培养温度37℃；通过调节搅拌转速和通风量将溶氧水平维持在20％；利用4mol/L NaOH溶液将pH维持在7.5；培养过程中，流加葡萄糖溶液维持葡萄糖溶液在1.0g/L，且基于电容值变化量与血清消耗之间关系，调节血清补加速率将血清浓度维持在3.0％。
(2)本发明中副猪嗜血杆的初始培养基和培养工艺
发酵培养基：TSB培养基、50mg/L NAD、3.0％血清。
副猪嗜血杆菌在37℃培育18小时，至单菌落长出。
挑取单菌落接种到装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，温度37℃、搅拌速度200rpm，培养12h。按照10％的接种量接种至装有发酵培养基的发酵罐中。培养温度37℃；通过调节搅拌转速和通风量将溶氧水平维持在20％；利用4mol/L NaOH溶液将pH维持在7.5；培养过程中，流加葡萄糖溶液维持葡萄糖溶液在1.0g/L。
为进一步验证本发明中副猪嗜血杆菌高密度发酵的培养基和培养工艺，在50L发酵罐上进行三批次发酵培养实验，同时与初始培养条件进行比较，实验结果如附图9所示。
由附图9可知，副猪嗜血杆菌利用初始培养条件和高密度发酵工艺培养三批次，三批次得到的活细胞浓度和活菌数目无显著差异。采用初始培养条件时，副猪嗜血杆菌细胞浓度和活菌数目为2.95、5.44x109CFU/mL；采用高密度发酵培养基和培养工艺时，副猪嗜血杆菌细胞浓度和活菌数目为10.22、1.89x1010CFU/mL；则表明本发明中得到的培养基组分和高密度发酵培养工艺可稳定用于副猪血杆菌的高密度发酵生产。
5.2本发明培养基与培养工艺在其他副猪血杆菌发酵的应用
为进一步探究该发明中副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基与培养工艺在其他副猪嗜血杆菌的适用性，利用本单位保存的三种不同血清型的副猪嗜血杆菌(菌株I：血清1型、菌株II：血清3型、菌株III：血清4型)采用本发明的培养基与培养工艺进行培养，实验结果如附图10所示。
由附图10可知，三种菌株利用本发明培养基和高密度发酵培养方法培室时，得到的细胞浓度和活菌数目均高于利用初始培养条件的。菌株I、菌株II和菌株III采用本发明培养基和高密度发酵培养方法所得到的细胞浓度和活菌数目分别为9.05、1.67x1010CFU/mL；9.81、1.81x1010CFU/mL；10.79、1.99x1010CFU/mL。因此，表明本发明的培养基和高密度培养方法适用于不同血清型副猪嗜血杆菌的高密度发酵，且采用本发明中的副猪嗜血杆菌高密度发酵培养基与培养工艺可使不同血清型副猪嗜血杆菌的活菌数目达到x1010CFU/mL以上。
Claims (10)
1.一种副猪嗜血杆菌培养基，其特征在于：培养基包括以下组份：按照重量/体积计，葡萄糖 2.0~3.0 g/L，蛋白胨 8.5~13.0 g/L，酵母粉 7.5~12.5 g/L，K2HPO4 1.5~3.0 g/L，NaCl 3.5~7.0 g/L，三甲基甘氨酸 1.0~2.5 g/L，氯化胆碱 0.5~1.5 mL/L，VB1 25.0~35.0mg/L，VH 8.5~12.0 mg/L，NAD 45~55 mg/L；按照体积比计，2.0~4.0 %牛血清，余量为水。
2.根据权利要求1 所述的副猪嗜血杆菌培养基，其特征在于：培养基组份，按照重量/体积计，葡萄糖 2.5 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，酵母粉 10.0 g/L，K2HPO4 2.5 g/L，NaCl 5.0g/L，三甲基甘氨酸 1.5 g/L，氯化胆碱 1.0 mL/L，VB1 30.0 mg/L，VH 10.0 mg/L，NAD 50mg/L；按照体积比计，3.0%牛血清，余量为水。
3.一种副猪嗜血杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）挑取副猪嗜血杆菌单菌落接种至种子培养基容器中，培养条件为：温度35~39 ºC，搅拌转速150~200 rpm，培养时间10~14 h；
（2）按照体积分数10%的接种量将步骤（1）中种子液接种至装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度35~39 ºC；溶氧水平维持在15~25%，pH维持在7.2~7. 8，在发酵过程中，葡萄糖浓度维持在0.8~1.2 g/L，且维持血清浓度维持在2.5~3.5%；
发酵培养基包括以下组份：按照重量/体积计，葡萄糖 2.0~3.0 g/L，蛋白胨 8.5~13.0g/L，酵母粉 7.5~12.5 g/L，K2HPO4 1.5~3.0 g/L，NaCl 3.5~7.0 g/L，三甲基甘氨酸 1.0~2.5 g/L，氯化胆碱 0.5~1.5 mL/L，VB1 25.0~35.0 mg/L，VH 8.5~12.0 mg/L，NAD 45~55mg/L；按照体积比计，2.0~4.0 %牛血清，余量为水。
4.根据权利要求3所述的副猪嗜血杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于：发酵过程中血清补加速率根据发酵电容值变化量确定，且血清添加量与电容值的线性关系为y=105.26x（y：血清添加量 mL/L；x：电容值pF/cm），根据电容值变化量计算血清消耗速率，实时调节血清补加速率将血清浓度维持在设定值。
5.根据权利要求4所述的副猪嗜血杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于：发酵培养过程中，细胞菌体浓度和电容值线性方程为：y=8.7459x（y：菌体浓度，OD600；x：电容值，pF/cm），活细胞浓度与活菌数目该线性方程为：y=1.8417x（y：活菌数目 x109 CFU/mL；x：细胞菌体浓度 OD600；R2=0.9963），血清添加量与副猪嗜血杆菌活菌数目线性方程为：y=0.153x（y：活菌数目、x1012 CFU/L；x：血清添加量，mL/L；R2=0.9952）。
6.根据权利要求3所述的副猪嗜血杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于：培养温度为37℃、溶氧水平维持在20%。
7.根据权利要求3 所述的副猪嗜血杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于：pH维持在7.5、葡萄糖浓度维持在1.0 g/L。
8.根据权利要求3所述的副猪嗜血杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于：基于发酵电容值变化量补加血清将牛血清浓度维持在3.0%。
9.根据权利要求3所述的副猪嗜血杆菌高密度发酵培养方法，其特征在于：包括下列步骤：
（1）挑取副猪嗜血杆菌单菌落接种至装有100 mL TSB种子培养基（包括：100 mg/LNAD、体积分数为5.0%的牛血清）的500 mL三角瓶中，培养条件为：温度37℃，搅拌转速200rpm，培养时间12 h；
（2）按照体积分数10%的接种量将步骤（1）中种子液接种至装有6L发酵培养基的10L发酵罐中，培养温度37℃；通过调节搅拌转速和通风量将溶氧水平维持在20%；利用4 mol/LNaOH溶液将pH维持在7.5；培养过程中，流加葡萄糖溶液维持葡萄糖溶液在1.0 g/L，基于电容值变化量调节牛血清补加速率将牛血清浓度维持在3.0%；
发酵培养罐培养基包括以下组份：葡萄糖 2.5 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，酵母粉 10.0g/L，K2HPO4 2.5 g/L，NaCl 5.0 g/L，三甲基甘氨酸 1.5 g/L，氯化胆碱 1.0 mL/L，VB130.0 mg/L，VH 10.0 mg/L，50 mg/L NAD；按照体积比计，3.0%牛血清，余量为水。
10.权利要求3-9任一项所述副猪嗜血杆菌高密度发酵培养方法在副猪嗜血杆菌血清5型、血清1型、血清3型、血清4型上的应用。
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