CN109652476B - 一种发酵生产l-缬氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵生产L‑缬氨酸的方法，包括以下步骤：将谷氨酸棒状杆菌接种到发酵培养液中发酵培养，当发酵培养至6‑8h时流加含维生素H和钼酸铵的葡萄糖溶液，使发酵培养液中的葡萄糖控制在20g/L，当发酵培养至30‑40h时流加含柠檬酸盐的葡萄糖溶液，使发酵培养液中的葡萄糖控制在5g/L。本发明的有益效果为：提高了L‑缬氨酸的产量和糖酸转化率，同时可以有效抑制杂酸的产生，提高发酵液中L‑缬氨酸的纯度，为L‑缬氨酸的规模化生产提供了技术支持。

Description

一种发酵生产L-缬氨酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，涉及一种L-缬氨酸的生产方法，更具体地说，涉及一种发酵生产L-缬氨酸的方法。

背景技术

L-缬氨酸是人体必需的一种支链氨基酸，具有多种生理功能，被广泛应用于食品、医药及饲料等行业，例如，缬氨酸可以作为食品的营养强化剂和增香剂；在医药工业中用于制造复合氨基酸注射液和用来合成缬沙坦等药物；在饲料行业中可以作为一种限制性氨基酸添加剂，提高动物的生产品质。由于其用途广泛，市场上高纯度的L-缬氨酸处于供不应求局面，因此，相关生产企业和科研人员都在努力提高缬氨酸的生产水平。

目前，L-缬氨酸的生产方法主要有提取法、合成法和发酵法，其中，微生物发酵法，具有原材料成本低，反应条件温和及易实现大规模生产等优点，成为广泛采用的生产方法。

CN101962664A公开了一种高效生产L-缬氨酸的发酵工艺，其以营养缺陷型和缬氨酸渗漏型菌株为生产菌株，以一些营养组分按一定比例配制成营养丰富且均衡的培养基作为发酵培养基，发酵过程中，通过调节发酵罐搅拌转速和风量将溶氧控制在适当的水平，通过流加液氨控制pH，并通过流加一定浓度的葡萄糖溶液将残糖控制在较低水平，发酵60h后L-缬氨酸的产量(55g/L以上)和转化率(25％以上)大幅度提高。

CN105695526A公开了一种通过分步补料提高L-缬氨酸产酸的发酵工艺，通过对培养基配方的调整，并同时采取分时段补料工艺及分段控制溶氧的方式，促进了缬氨酸的生物合成，避免了氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，减少了副酸的生成，该发酵工艺能使L-缬氨酸产酸由原来的70-80h产酸4.5-5.5％提高到现在的50-55h产酸7.0-8.0％，转化率由原来的20-25％提高到30-32％。

目前，我国以微生物发酵法生产L-缬氨酸的技术尚不成熟，国内生产水平和糖酸转化率都比较低，同时发酵过程中产生大量的丙氨酸等杂酸，增加了分离提纯的成本，极大地限制了我国L-缬氨酸的规模化发展。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种发酵生产L-缬氨酸的方法，可以有效降低发酵液中杂酸的含量，提高L-缬氨酸的产量和糖酸转化率，降低生产成本，为L-缬氨酸的国产化提供技术支持。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种发酵生产L-缬氨酸的方法，包括以下步骤：将谷氨酸棒状杆菌接种到发酵培养液中发酵培养，当发酵培养至6-8h时流加含维生素H和钼酸铵的葡萄糖溶液，使发酵培养液中的葡萄糖控制在20g/L。

优选地，所述的谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌VWB-17。

优选地，所述的发酵培养液，包括以下质量百分比的组分：玉米浆1.2-1.8％、硫酸铵1.0-1.5％、磷酸二氢钾0.15-0.2％、硫酸镁0.01-0.04％和螺旋藻粉0.01-0.05％，灭菌前pH为7.0-7.2。

优选地，所述的谷氨酸棒状杆菌的接种量为发酵培养液体积的3.5-6.2％。

优选地，所述发酵培养的条件为：温度30-32℃，搅拌速度为300-700r/min，溶解氧为15-28％，发酵周期为50-60h。

优选地，所述的葡萄糖溶液的质量浓度为400-800g/L，其中，所述的维生素H占葡萄糖溶液质量的0.0001-0.0005％；所述的钼酸铵占葡萄糖溶液质量的0.0001-0.0008％。

作为上述技术方案的进一步改进，本发明所述的发酵生产L-缬氨酸的方法，还包括当发酵培养至30-40h时流加含柠檬酸盐的葡萄糖溶液，使发酵培养液中的葡萄糖控制在5g/L。

优选地，所述的葡萄糖溶液的质量浓度为100-150g/L，其中，柠檬酸盐占葡萄糖溶液质量的0.001-0.01％。

进一步优选地，所述的柠檬酸盐为柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铁、柠檬酸铁铵中的至少一种。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明在发酵培养前期流加含维生素H和钼酸铵的葡萄糖溶液，可以促进细胞壁合成，有利于菌体的生长，提高糖酸转化率。

(2)同时发现，当维生素H和钼酸铵的添加比例为1:1.2时，有利于发酵后期L-缬氨酸分泌到细胞外，从而提高了L-缬氨酸的产量。

(3)本发明在发酵培养后期流加含柠檬酸盐的葡萄糖溶液，可以有效抑制杂酸的产生，提高发酵液中L-缬氨酸的纯度，降低后续分离纯化的难度和成本。

具体实施方式

本发明提供了一种发酵生产L-缬氨酸的方法，包括以下步骤：将谷氨酸棒状杆菌接种到发酵培养液中发酵培养，当发酵培养至6-8h时流加含维生素H和钼酸铵的葡萄糖溶液，使发酵培养液中的葡萄糖控制在20g/L。

本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

所述的谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌VWB-17；所述的发酵培养液可采用本领域技术人员熟知的发酵培养液，并未特殊限制，优选地采用以下质量百分比的组分：玉米浆1.2-1.8％、硫酸铵1.0-1.5％、磷酸二氢钾0.15-0.2％、硫酸镁0.01-0.04％和螺旋藻粉0.01-0.05％，灭菌前pH为7.0-7.2。

所述的菌种的接种方法为本领域技术人员熟知的接种方法，并无特殊的限制，所述的谷氨酸棒状杆菌的接种量优选为发酵培养液体积的3.5-6.2％。

所述的发酵培养在本领域常规的发酵罐中进行，并无特殊的限制。摇瓶筛选的条件和工业化生产的条件是两个不同尺度考量的问题，摇瓶产酸高并不完全意味着在发酵罐上会表现良好。本发明优选50L的发酵罐，淘汰产酸不稳定的菌种，为L-缬氨酸工业化生产提供了技术支持。

所述的发酵培养为本领域技术人员熟知的发酵培养方法，并无特殊的限制，发酵培养的条件优选为：温度30-32℃，搅拌速度为300-700r/min，溶解氧为15-28％，发酵培养的周期为50-60h。

为了提高发酵过程中的糖酸转化率，当发酵培养至6-8h时流加含维生素H和钼酸铵的葡萄糖溶液，使发酵培养液中葡萄糖质量浓度控制在20g/L；优选地，流加葡萄糖溶液的质量浓度为400-800g/L，其中，所述的维生素H占葡萄糖溶液质量的0.0001-0.0005％；所述的钼酸铵占葡萄糖溶液质量的0.0001-0.0008％。

为了进一步减少发酵过程中杂酸的产量，提高发酵液中L-缬氨酸的纯度，当发酵培养至30-40h时流加含柠檬酸盐的葡萄糖溶液，使发酵培养液中的葡萄糖控制在5g/L；优选地，流加葡萄糖溶液的质量浓度为100-150g/L，其中，柠檬酸盐占葡萄糖溶液质量的0.001-0.01％；进一步优选地，所述的柠檬酸盐为柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铁、柠檬酸铁铵中的至少一种。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种发酵生产L-缬氨酸的方法进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售，其中，所述的螺旋藻粉购买自湖北裕盈生物科技有限公司，有效物质含量为99％。

实施例1

一种发酵生产L-缬氨酸的方法，在50L的发酵罐内进行，包括以下步骤：将谷氨酸棒状杆菌VWB-17按照体积比3.5％接种到发酵培养液中发酵培养50h，发酵培养过程中控制发酵温度为30℃，搅拌速度为300r/min，溶解氧为15％；

所述发酵培养液，包括以下质量百分比的组分：玉米浆1.2％、硫酸铵1.0％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.01％和螺旋藻粉0.01％，灭菌前pH为7.0；

当发酵培养至6h时流加含维生素H和钼酸铵的的葡萄糖溶液，使发酵培养液中葡萄糖的含量控制在15g/L，所述的葡萄糖溶液的质量浓度为400g/L，其中，所述的维生素H占葡萄糖溶液质量的0.0001％；所述的钼酸铵占葡萄糖溶液质量的0.0001％；

当发酵培养至30h时流加含柠檬酸盐的葡萄糖溶液，使发酵培养液中葡萄糖的含量控制在5g/L，所述的葡萄糖溶液的质量浓度为100g/L，其中，所述柠檬酸盐占葡萄糖溶液质量的0.001-0.01％；所述的柠檬酸盐为柠檬酸铁。通过高效液相色谱测定L-缬氨酸的产量为66g/L，丙氨酸的产量为3.57g/L，糖酸转化率为37.5％。

实施例2

一种发酵生产L-缬氨酸的方法，在50L的发酵罐内进行，包括以下步骤：将谷氨酸棒状杆菌VWB-17按照体积比6.2％接种到发酵培养液中发酵培养60h，发酵培养过程中控制发酵温度为32℃，搅拌速度为700r/min，溶解氧为28％；

所述发酵培养液，包括以下质量百分比的组分：玉米浆1.8％、硫酸铵1.5％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.04％和螺旋藻粉0.05％，灭菌前pH为7.2；

当发酵培养至8h时流加含维生素H和钼酸铵的的葡萄糖溶液，使发酵培养液中葡萄糖的含量控制在15g/L，所述的葡萄糖溶液的质量浓度为800g/L，其中，所述的维生素H占葡萄糖溶液质量的0.0005％；所述的钼酸铵占葡萄糖溶液质量的0.0008％；

当发酵培养至40h时流加含柠檬酸盐的葡萄糖溶液，使发酵培养液中葡萄糖的含量控制在5g/L，所述的葡萄糖溶液的质量浓度为150g/L，其中，所述柠檬酸盐占葡萄糖溶液质量的0.01％，所述的柠檬酸盐为柠檬酸钠。通过高效液相色谱测定L-缬氨酸的产量为69g/L，丙氨酸的产量为2.93g/L，糖酸转化率为40.5％。

实施例3

一种发酵生产L-缬氨酸的方法，在50L的发酵罐内进行，包括以下步骤：将谷氨酸棒状杆菌VWB-17按照体积比5.0％接种到发酵培养液中发酵培养55h，发酵培养过程中控制发酵温度为31℃，搅拌速度为500r/min，溶解氧为20％；

所述发酵培养液，包括以下质量百分比的组分：玉米浆1.5％、硫酸铵1.2％、磷酸二氢钾0.18％、硫酸镁0.02％和螺旋藻粉0.03％，灭菌前pH为7.2；

当发酵培养至6.5h时流加含维生素H和钼酸铵的的葡萄糖溶液，使发酵培养液中葡萄糖的含量控制在15g/L，所述的葡萄糖溶液的质量浓度为600g/L，其中，所述的维生素H占葡萄糖溶液质量的0.0002％；所述的钼酸铵占葡萄糖溶液质量的0.0004％；

当发酵培养至35h时流加含柠檬酸盐的葡萄糖溶液，使发酵培养液中葡萄糖的含量控制在5g/L，所述的葡萄糖溶液的质量浓度为120g/L，其中，所述柠檬酸盐占葡萄糖溶液质量的0.005％，所述的柠檬酸盐为柠檬酸铁铵。通过高效液相色谱测定L-缬氨酸的产量为71g/L，丙氨酸的产量为2.34g/L，糖酸转化率为42.5％。

实施例4

一种发酵生产L-缬氨酸的方法，在50L的发酵罐内进行，包括以下步骤：将谷氨酸棒状杆菌VWB-17按照体积比5.8％接种到发酵培养液中发酵培养58h，发酵培养过程中控制发酵温度为32℃，搅拌速度为400r/min，溶解氧为25％；

所述发酵培养液，包括以下质量百分比的组分：玉米浆1.6％、硫酸铵1.4％、磷酸二氢钾0.16％、硫酸镁0.025％和螺旋藻粉0.04％，灭菌前pH为7.0；

当发酵培养至7h时流加含维生素H和钼酸铵的的葡萄糖溶液，使发酵培养液中葡萄糖的含量控制在15g/L，所述的葡萄糖溶液的质量浓度为700g/L，其中，所述的维生素H占葡萄糖溶液质量的0.0003％；所述的钼酸铵占葡萄糖溶液质量的0.00036％；

当发酵培养至37h时流加含柠檬酸盐的葡萄糖溶液，使发酵培养液中葡萄糖的含量控制在5g/L，所述的葡萄糖溶液的质量浓度为130g/L，其中，所述柠檬酸盐占葡萄糖溶液质量的0.007％，所述的柠檬酸盐为柠檬酸铁铵。通过高效液相色谱测定L-缬氨酸的产量为82.6g/L，丙氨酸的产量为1.17g/L，糖酸转化率为45.8％。

实施例5

一种发酵生产L-缬氨酸的方法，在50L的发酵罐内进行，包括以下步骤：将谷氨酸棒状杆菌VWB-17按照体积比4.5％接种到发酵培养液中发酵培养54h，发酵培养过程中控制发酵温度为32℃，搅拌速度为550r/min，溶解氧为22％；

所述发酵培养液，包括以下质量百分比的组分：玉米浆1.48％、硫酸铵1.35％、磷酸二氢钾0.17％、硫酸镁0.03％和螺旋藻粉0.02％，灭菌前pH为7.2；

当发酵培养至7.5h时流加含维生素H和钼酸铵的的葡萄糖溶液，使发酵培养液中葡萄糖的含量控制在15g/L，所述的葡萄糖溶液的质量浓度为500g/L，其中，所述的维生素H占葡萄糖溶液质量的0.0004％；所述的钼酸铵占葡萄糖溶液质量的0.00048％；

当发酵培养至32h时流加含柠檬酸盐的葡萄糖溶液，使发酵培养液中葡萄糖的含量控制在5g/L，所述的葡萄糖溶液的质量浓度为110g/L，其中，所述柠檬酸盐占葡萄糖溶液质量的0.003％，所述的柠檬酸盐为柠檬酸铁铵。通过高效液相色谱测定L-缬氨酸的产量为89.4g/L，丙氨酸的产量为0.56g/L，糖酸转化率为48.6％。

对比例1

本对比例与实施例5的不同之处在于：当发酵培养至7.5h时，流加的葡萄糖中不含维生素H。通过高效液相色谱测定L-缬氨酸的产量为29.3g/L，丙氨酸的产量为3.06g/L，糖酸转化率为16.9％。

对比例2

本对比例与实施例5的不同之处在于：当发酵培养至7.5h时，流加的葡萄糖中不含钼酸铵。通过高效液相色谱测定L-缬氨酸的产量为34.8g/L，丙氨酸的产量为3.15g/L，糖酸转化率为19.6％。

对比例3

本对比例与实施例5的不同之处在于：当发酵培养至7.5h时，流加的葡萄糖中，所述的维生素H占葡萄糖溶液质量的0.0006％；所述的钼酸铵占葡萄糖溶液质量的0.0009％。通过高效液相色谱测定L-缬氨酸的产量为31.9g/L，丙氨酸的产量为3.10g/L，糖酸转化率为18.9％。

对比例4

本对比例与实施例5的不同之处在于：当发酵培养至32h时，流加的葡萄糖溶液中，不含柠檬酸盐。通过高效液相色谱测定L-缬氨酸的产量为40.8g/L，丙氨酸的产量为5.89g/L，糖酸转化率为23.2％。

对比例5

本对比例与实施例5的不同之处在于：当发酵培养至32h时，流加的葡萄糖溶液中，所述柠檬酸盐占葡萄糖溶液质量的0.02％。通过高效液相色谱测定L-缬氨酸的产量为39.7g/L，丙氨酸的产量为5.56g/L，糖酸转化率为22.4％。

对比例6

本对比例与实施例5的不同之处在于：发酵培养液中，包括质量百分比为0.02％的柠檬酸铁铵，当发酵培养至32h时，流加的葡萄糖溶液中，不含柠檬酸铁铵。通过高效液相色谱测定L-缬氨酸的产量为28.7g/L，丙氨酸的产量为4.77g/L，糖酸转化率为16.5％。

以上是结合具体实施例对本发明进一步的描述，但这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种发酵生产L-缬氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：将谷氨酸棒状杆菌接种到发酵培养液中发酵培养，当发酵培养至6-8h时流加含维生素H和钼酸铵的葡萄糖溶液，使发酵培养液中的葡萄糖控制在20g/L；

所述的葡萄糖溶液的质量浓度为400-800g/L，所述的维生素H占葡萄糖溶液质量的0.0001-0.0005％；所述的钼酸铵占葡萄糖溶液质量的0.0001-0.0008％；

还包括当发酵培养至30-40h时流加含柠檬酸盐的葡萄糖溶液，使发酵培养液中的葡萄糖控制在5g/L；

所述的葡萄糖溶液的质量浓度为100-150g/L，其中，柠檬酸盐占葡萄糖溶液质量的0.001-0.01％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养液，包括以下质量百分比的组分：玉米浆1.2-1.8％、硫酸铵1.0-1.5％、磷酸二氢钾0.15-0.2％、硫酸镁0.01-0.04％和螺旋藻粉0.01-0.05％，灭菌前pH为7.0-7.2。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的谷氨酸棒状杆菌的接种量为发酵培养液体积的3.5-6.2％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：温度30-32℃，搅拌速度为300-700r/min，溶解氧为15-28％，发酵周期为50-60h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的柠檬酸盐为柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铁、柠檬酸铁铵中的至少一种。