CN111172086B - 一种生产l-异亮氨酸的发酵方法 - Google Patents

一种生产l-异亮氨酸的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产L‑异亮氨酸的发酵方法，其包括种子培养和发酵培养；在发酵培养过程中，控制发酵液中残糖浓度在0.5g/L以下，将耗糖速率维持在低于菌体最大耗糖能力以下；在杂酸开始快速积累时，逐步降低耗糖速率直至放罐。本发明方法简单易行，杂酸积累得到显著抑制，在提高产酸水平的同时，进一步降低杂酸的积累，50L罐水平发酵产酸达到44.7g/L，总杂酸只有3.5g/L。

Description

一种生产L-异亮氨酸的发酵方法
技术领域：
本发明属于L-异亮氨酸生产技术领域，特别是涉及一种生产L-异亮氨酸的发酵方法。
背景技术：
L-异亮氨酸又称“L-异白氨酸”，属于支链氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)，是人与动物自身不能合成而必需以外源来供给的八大必需氨基酸之一，具有多种生理功能，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质生成和抑制其分解的效果，在人体生命活动中起着重要作用，因此在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。
L-异亮氨酸作为重要的食品添加剂，可调节食品中的氨基酸平衡，常被用于配制各种运动及健身营养品、氨基酸功能性饮料等，也是治疗各种肝脏疾病药物的重要成分。
目前，国内已有多家企业通过发酵法进行L-异亮氨酸的生产，多家高校实验室也在开展关于L-异亮氨酸发酵工艺研究的课题，但仍存在菌株产酸水平低、发酵杂酸(包括丙氨酸、赖氨酸等)高等问题。在现有发酵工艺中，培养基里的初糖耗尽后，一般采取控低残糖(葡萄糖浓度在10-40g/L)的方式进行菌种培养。天津科技大学2016年申请专利CN201610270771中，控残糖10g/L以上；武汉远大弘元股份有限公司2016年申请专利CN201611093973中，控残糖30-40g/L。发酵过程中维持一定的残糖水平，可以最大化释放菌体的代谢能力，维持较高的发酵强度，但同时会导致杂酸的持续积累，尤其是在发酵中后期，菌体代谢活力逐渐下降，胞内代谢通路改变，杂酸水平即会不受控的显著增加。
因此，改进生产L-异亮氨酸的发酵技术工艺，在提高产酸水平的同时，进一步降低杂酸的积累，对提高国内L-异亮氨酸的产量及产品市场竞争力具有重要的意义。
发明内容：
为提高产酸水平，同时降低杂酸积累量，本发明提供了一种生产L-异亮氨酸的发酵方法。
本发明的目的由如下技术方案实施：一种生产L-异亮氨酸的发酵方法，其包括种子培养和发酵培养；在发酵培养过程中，控制发酵液中残糖浓度在0.5g/L以下，并通过调节葡萄糖溶液的流加速度，将耗糖速率维持在6-9g/L/h；当发酵液中杂酸含量达到1-2g/L时，为降低杂酸的增加速度，开始以0.1-0.7g/L/h的速度逐步降低耗糖速率直至放罐。当杂酸含量达到1-2g/L时，如果不降低耗糖速率，在本申请中对残糖浓度无影响，因为本申请中菌体的耗糖能力截止到放罐时依然较强，但会导致杂酸的持续快速积累。因为，杂酸含量达到1-2g/L，表明此时由于胞外环境的变化、产物L-异亮氨酸含量的增加，菌体的代谢活力开始下降，胞内流向L-异亮氨酸的代谢通量减少，多余的代谢通量流向杂酸，导致杂酸开始明显增加，此时降低耗糖速率，可以有效抑制杂酸积累。
进一步，发酵液中杂酸含量低于1g/L时，溶氧维持在25-30％；发酵液中杂酸含量高于1g/L后，溶氧维持在15-20％。
进一步，在发酵培养过程中，罐压为0.05-0.1Mpa，通气量为10-25L/min，搅拌速度为200-800rpm，发酵温度为31-33℃，pH6.8-7.2。通过依次循环调节罐压、通气量、搅拌速度，来控制溶氧量。
残糖浓度：即指发酵液中残余/含有的葡萄糖浓度，单位g/L。
耗糖速率：即葡萄糖消耗速率，表征微生物代谢强度的一个参数。每小时单位体积的发酵液所减少的葡萄糖量称为耗糖速率。
发酵工艺：指利用微生物菌种来积累目标产物的全过程，包括培养基配方和配置，菌种复壮、扩培、培养过程的控制，含温度、pH、溶氧等关键参数控制，以及营养补充，培养结束控制等。
本发明的优点：通过将发酵液葡萄糖浓度控制在0.5g/L以下，使得发酵过程耗糖速率变得可控；将耗糖速率维持在低于菌体最大耗糖能力以下(6-9g/L/h)，从而减少胞内杂酸代谢途径的通量，降低杂酸的积累；在杂酸开始快速积累(含量达到1-2g/L)时，以0.1-0.7g/L/h的速度逐步降低耗糖速率直至放罐，可以抑制杂酸的快速积累。该方法简单易行，杂酸积累得到显著抑制，在提高产酸水平的同时，进一步降低杂酸的积累，50L罐水平发酵产酸达到44.7g/L，总杂酸只有3.5g/L。
具体实施方式：
实施例1：一种生产L-异亮氨酸的发酵方法，将培养好的谷氨酸棒状杆菌种子液按15％的接种量接入50L发酵罐中，初定容20L。种子所用培养基组成为：葡萄糖20g/L、玉米浆60g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.3mg/L、VB1 2mg/L，其余为水。发酵所用培养基组成为：葡萄糖80g/L、玉米浆30g/L、硫酸铵10g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.1mg/L、VB1 0.1mg/L，其余为水。发酵条件为：罐压0.05-0.1Mpa，通气量10-25L/min，搅拌200-800rpm，温度31-33℃，pH6.8-7.2。控制发酵液中残糖浓度在0.5g/L以下，耗糖速率维持在6g/L/h，当杂酸(包括丙氨酸、赖氨酸等)含量达到1g/L时，以0.3g/L/h的速度逐步降低耗糖速率直至放罐。通过依次循环调节罐压、通气量、搅拌，在杂酸含量低于1g/L时，溶氧维持25-30％；杂酸含量高于1g/L后，溶氧维持15-20％。发酵32h时，比生长速率达到0.1h-1，开始以50mL/h的速度流加补料培养基，发酵60h停止流加。补料培养基为玉米浆和玉米浆水解液按质量比为1:2的比例配制。
本实施例重复3次，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量、杂酸含量，发酵指标见下表1。
实施例2：一种生产L-异亮氨酸的发酵方法，其与实施例1不同之处在于：耗糖速率维持在7g/L/h，当杂酸(包括丙氨酸、赖氨酸等)含量达到1g/L时，以0.4g/L/h的速度逐步降低耗糖速率直至放罐，其余与实施例1完全相同。
本实施例重复3次，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量、杂酸含量，发酵指标见下表1。
实施例3：一种生产L-异亮氨酸的发酵方法，其与实施例1不同之处在于：耗糖速率维持在7g/L/h，当杂酸(包括丙氨酸、赖氨酸等)含量达到2g/L时，以0.4g/L/h的速度逐步降低耗糖速率直至放罐，其余与实施例1完全相同。
本实施例重复3次，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量、杂酸含量，发酵指标见下表1。
实施例4：一种生产L-异亮氨酸的发酵方法，其与实施例1不同之处在于：耗糖速率维持在7g/L/h，当杂酸(包括丙氨酸、赖氨酸等)含量达到2g/L时，以0.5g/L/h的速度逐步降低耗糖速率直至放罐，其余与实施例1完全相同。
本实施例重复3次，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量、杂酸含量，发酵指标见下表1。
实施例5：一种生产L-异亮氨酸的发酵方法，其与实施例1不同之处在于：耗糖速率维持在8g/L/h，当杂酸(包括丙氨酸、赖氨酸等)含量达到1g/L时，以0.4g/L/h的速度逐步降低耗糖速率直至放罐，其余与实施例1完全相同。
本实施例重复3次，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量、杂酸含量，发酵指标见下表1。
实施例6：一种生产L-异亮氨酸的发酵方法，其与实施例1不同之处在于：耗糖速率维持在9g/L/h，当杂酸(包括丙氨酸、赖氨酸等)含量达到1g/L时，以0.6g/L/h的速度逐步降低耗糖速率直至放罐，其余与实施例1完全相同。
本实施例重复3次，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量、杂酸含量，发酵指标见下表1。
实施例7：一种生产L-异亮氨酸的发酵方法，其与实施例1不同之处在于：耗糖速率始终维持在6g/L/h，且不根据杂酸含量等因素，主动下降耗糖速率，其余与实施例1完全相同。
本实施例重复3次，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量、杂酸含量，发酵指标见下表1。
对比实验例：一种生产L-异亮氨酸的发酵方法，其与实施例1不同之处在于：始终控制发酵液中残糖浓度在20g/L，耗糖速率维持在菌体代谢活力所能允许的最高水平，且不根据杂酸含量等因素，主动下降耗糖速率，其余与实施例1完全相同。
本对比实验例重复3次，发酵结束，利用HPLC测定发酵液中的L-异亮氨酸含量、杂酸含量，发酵指标见下表1。
表1对比实验例与实施例1-7产酸及杂酸指标
Figure BDA0002415192510000061
注：*示与对比实验例相比具有极显著差异(P<0.01)。
由表1可知，通过将发酵液中残糖浓度控制在0.5g/L以下，使得发酵过程耗糖速率变得可控，理论上可以将耗糖速率维持在低于菌体最大耗糖能力以下，同时，在杂酸开始快速积累时，主动降低耗糖速率直至放罐，确实可以抑制杂酸的积累。其中，实施例2对降低杂酸效果最为显著，当耗糖速率维持在7g/L/h，杂酸含量达到1g/L时，以0.4g/L/h的速度逐步降低耗糖速率，结果：在L-异亮氨酸含量较对比实验例未下降的前提下，杂酸含量较对比实验例下降48.5％。
液相色谱测定L-异亮氨酸及杂酸的方法(HPLC测定法)：高效液相色谱检测方法，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。
本发明实施例1-7及对比试验例均采用安捷伦公司的高效液相色谱仪(AgilentTechnologies 1200)进行发酵液中积累的L-异亮氨酸含量检测，具体方法如下：
1、色谱柱：ZORBAX Eclipse-AAA柱(3.5μm，4.6×75mm)
2、流动相A：称取6.24g NaH2PO4·2H2O，转移到1000mL玻璃烧杯中。加入1000mL超纯水，搅拌，直到所有晶体完全溶解。用NaOH调节溶液pH值至7.80。
3、流动相B：乙腈:甲醇:水＝45:45:10(V/V/V)。
4、流速：2ml/min。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种生产L-异亮氨酸的发酵方法，其特征在于，其包括种子培养和发酵培养；在发酵培养过程中，控制发酵液中残糖浓度在0.5 g/L以下，将耗糖速率维持在6-9 g/L/h，低于菌体最大耗糖能力以下；在杂酸开始快速积累，发酵液中杂酸含量达到1-2 g/L时，以0.1-0.7g/L/h的速度逐步降低耗糖速率直至放罐;
发酵液中杂酸含量低于1 g/L时，溶氧维持在25-30%；发酵液中杂酸含量高于1 g/L后，溶氧维持在15-20%;
在发酵培养过程中，罐压为0.05-0.1 Mpa，通气量为10-25 L/min，搅拌速度为200-800rpm，发酵温度为31-33℃，pH6.8-7.2。
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