CN112725391A - 一种l-异亮氨酸发酵生产工艺 - Google Patents

一种l-异亮氨酸发酵生产工艺 Download PDF

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张宗华
边恩来
赵仁楷
田辉
王奎智
冯世红
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Abstract

本发明属于氨基酸发酵领域，公开了一种L‑异亮氨酸发酵生产工艺，该工艺包括如下步骤：步骤1）种子培育，步骤2）发酵培养，步骤3）膜过滤、脱色、蒸发结晶、离心及烘干。本发明工艺简单高效，可以使L‑异亮氨酸的产量和糖酸转化率提高，从而提高了发酵效率。

Description

一种L-异亮氨酸发酵生产工艺
技术领域
本发明属于氨基酸发酵领域，具体涉及到一种L-异亮氨酸发酵生产工艺。
背景技术
L-异亮氨酸，又称异白氨酸，化学名L-2-氨基-3甲基戊酸，异亮氨酸是生命有机体的重要组成部分，属于必需氨基酸，因为它特殊的结构和功能在人体生命代谢中占有重要作用。人体若长期缺乏异亮氨酸，将影响机体的生理功能，导致代谢紊乱、抵抗力下降等。
我国氨基酸产业发展较晚，起步较低，技术相对落后，如L-异亮氨酸的生产成本较高，生产质量较差。目前，国内外采用的微生物发酵法生产L-异亮氨酸，生产菌株存在产酸率较低，杂酸较多等问题，因此，迫切需要新的技术突破和创新，使L-异亮氨酸的产酸水平提高，特别是糖酸转化率的提高使生产成本降低。申请人采用先进的培育方法及发酵工艺，针对上述缺陷，对菌种培育和发酵工艺进行了改进和优化。
生物燃料泛指由生物体组成或转化的固体、液体或气体燃料。它是可再生能源开发利用的重要方向，具有良好的可贮藏性和可运输性，可提供可替代石油的液体燃料。生物燃料是全球绿色燃料使用的趋势。随着生物柴油的产量逐年增加，每年将会产生大量的甘油副产物，这些甘油副产物存在二次污染和综合利用的技术难题。
发明内容
为解决上述问题，克服现有技术的不足之处，本发明提供了一种L-异亮氨酸发酵生产工艺。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
一种L-异亮氨酸发酵生产工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：步骤1)种子液制备，步骤2)发酵培养，步骤3)膜过滤、脱色、蒸发结晶、离心及烘干。
进一步地，所述工艺包括如下步骤：
步骤1)种子液培育制备：
将活化后的L-异亮氨酸生产菌种黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)CGMCCNo.18060 接种至种子培养基中，培养得到种子液；
步骤2)发酵培养：将种子液以10％体积比的接种量接入发酵培养基中，培养温度为 30-33℃，风量为400-1800m3/h，压力为0.04-0.07Mpa，pH为6.7-7.8；当糖浓度降至1.0g/L 时，通过流加糖维持罐内糖浓度为0.5-2.0g/L，直至发酵结束，总发酵时间为64小时，得到L-异亮氨酸发酵液；
步骤3)膜过滤、脱色、蒸发结晶、离心及烘干：将L-异亮氨酸发酵液经陶瓷膜过滤后，收集滤液；将滤液加入活性炭脱色得到脱色液；再将脱色液打入蒸发器中进行蒸发浓缩；离心分离出湿晶体，烘干即得。
优选地，所述发酵培养基为：蔗糖19.8g/L，甘油20g/L，酵母粉4.8g/L，硫酸铵4.0g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，硫酸氢二钾8.5g/L，硫酸镁4.8g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰12.9mg/L, 硫酸锌0.27mg/L，硫酸铜0.48mg/L。
优选地，所述种子培养基为：蔗糖10g/L，甘油20g/L，酵母膏5g/L，硫酸镁0.8g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸亚铁10mg/L，硫酸锰10mg/L，VH0.2mg/L；
优选地，所述发酵培养过程中，溶氧：前期60％，后期50％；pH值：前期6.7-7.2，后期 6.9-7.3。
优选地，所述发酵培养过程中，溶氧：前期70％，后期40％；pH值：前期6.7-7.2，后期 6.9-7.3。
更优选地，所述发酵培养过程中，溶氧：前期80％，后期30％；pH值：前期6.7-7.2，后期6.9-7.3。
优选地，所述前期为0-16小时，后期为16-64小时。
本发明的技术方案具有以下突出的优点及独特性：
1、本发明采用特定的筛选培育方法获得能够有效利用甘油的黄色短杆菌，然后进行种子培养，新菌种具有很强的吸收能力，可以快速增长，实现高产酸率。
2、本发明采用的发酵法生产L-异亮氨酸，与传统的化学法和酶法相比，生产设备简单且占地面积较小，成本较低，适合大规模生产。
3、本发明通过优化发酵培养基的营养物质，提高菌体活力及其产酸能力，进一步提高了产量。
4、本发明在发酵不同时期进行溶氧控制，提高菌体的代谢活动，进一步提高产酸。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种L-异亮氨酸发酵生产工艺，该工艺包括如下步骤：步骤1)种子培育，步骤2)发酵培养，步骤3)膜过滤、脱色、蒸发结晶、离心及烘干。
具体的所述方法包括如下步骤：
步骤1)种子培育：
(1)本试验采用新疆阜丰生物科技有限公司菌种研究室保存的菌种作为出发菌株；将原始出发菌种通过活化、稀释，涂在适合细菌生长的培养基上；经分离后即为各种纯种菌株；
将菌株采用亚硝基胍(1mg/ml，30℃，60min)进行诱变处理，再涂布到诱导培养基(蔗糖5g/L、甘油设置为1-10g/L共10个浓度梯度、酵母膏3g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钠1g/L、琼脂20g/L)中进行筛选培养，温度为32℃，培养3d。获得一株能够高效利用甘油、L-异亮氨酸产率高的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)V1906-27，保藏号为CGMCC No.18060，于2019年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株的主要理化性质为：革兰氏染色阳性。短杆近球形， G+，不运动，无鞭毛，无芽孢，菌落产生非水溶性黄色素。兼性厌氧，化能异养型，葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、甘油产酸不产气，水解明胶、硝酸盐还原、接触酶阳性，抗酸染色阴性，M·R试验阳性，最适生长温度29-32℃。
将活化后的L-异亮氨酸生产菌种黄色短杆菌V1906-27接种至种子培养基中，作为发酵种子液。将种子罐进行空消、实消、降温处理后接入种子液进行种子培养，培养温度为30℃，罐压0.08Mpa，风量为100m3/h，pH为6.9。每4小时测定菌体光密度、pH镜检菌体变化情况；种子培养基：蔗糖10g/L，甘油20g/L，酵母膏5g/L，硫酸镁0.8g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸亚铁10mg/L，硫酸锰10mg/L，VH0.2mg/L；种子罐空消：压力0.15-0.20Mpa，时间： 40-60min，温度：128-140℃；实消：温度125-127℃，时间：大于30min。
步骤2)发酵培养：将L-异亮氨酸种子液以10％的接种量接入发酵培养基中，培养温度为30-℃，风量为800m3/h，压力为0.05Mpa，pH为6.9。当糖浓度降至1.0g/L时，通过流加糖维持罐内糖浓度为0.5-2.0g/L，直至发酵结束，总发酵时间为64小时，得到L-异亮氨酸发酵液；发酵培养基：蔗糖19.8g/L，甘油20g/L，酵母粉4.8g/L，硫酸铵4.0g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，硫酸氢二钾8.5g/L，硫酸镁4.8g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰12.9mg/L, 硫酸锌0.27mg/L，硫酸铜0.48mg/L；发酵罐空消：压力0.15-0.20Mpa，时间60-90min，温度128-140℃；连消：压力0.2-0.3Mpa，时间60min，温度121-130℃；发酵罐培养过程中，溶氧：前期(0-16小时)溶氧60％，后期(16至放罐前)溶氧50％；pH值：前期6.7-7.2，后期6.9-7.3。
步骤3)膜过滤、脱色、蒸发结晶、离心及烘干：将L-异亮氨酸发酵液经陶瓷膜过滤后，收集滤液；将滤液加入活性炭脱色得到脱色液；再将脱色液打入蒸发器中进行蒸发浓缩；最后启动离心机，放料离心分离，加水洗去晶体表面母液色素，再进行离心，确保L-异亮氨酸固液分离彻底，湿晶体装入料车等待烘干。
经检验，本实施例在其他条件不变，前期溶氧60％，后期溶氧50％时，产酸37.8g/L，糖酸转化率14.2％。
实施例2
本实施例参照实施例1，前期溶氧70％，后期溶氧40％时，产酸39.8g/L，糖酸转化率16.3％。
实施例3
本实施例参照实施例1，前期溶氧80％，后期溶氧30％时，产酸44.6g/L，糖酸转化率20.6％。
结论：由于菌体在不同生理阶段对氧的需求不同，溶氧过高或过低都会对正常发酵过程不利，溶氧过高会导致后期菌的活力降低，溶氧过低会影响前期菌体的生长，综合来考虑，溶氧需要在不同发酵阶段采取分段控制，保证发酵过程中菌体达到最好的状态，使产酸水平达到最高。
实施例4
不同发酵培养基组分对产酸量的影响。
实施例1发酵培养基：蔗糖19.8g/L，甘油20g/L，酵母粉4.8g/L，硫酸铵4.0g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，硫酸氢二钾8.5g/L，硫酸镁4.8g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰12.9mg/L,硫酸锌0.27mg/L，硫酸铜0.48mg/L。
对照组1发酵培养基：蔗糖39.8g/L，酵母粉4.8g/L，硫酸铵4.0g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，硫酸氢二钾8.5g/L，硫酸镁4.8g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰12.9mg/L，硫酸锌0.27mg/L，硫酸铜0.48mg/L。
对照组2发酵培养基：蔗糖34.8g/L，甘油5g/L，酵母粉4.8g/L，硫酸铵4.0g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，硫酸氢二钾8.5g/L，硫酸镁4.8g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰12.9mg/L，硫酸锌0.27mg/L，硫酸铜0.48mg/L。
对照组3发酵培养基：蔗糖29.8g/L，甘油10g/L，酵母粉4.8g/L，硫酸铵4.0g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，硫酸氢二钾8.5g/L，硫酸镁4.8g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰12.9mg/L，硫酸锌0.27mg/L，硫酸铜0.48mg/L。
对照组4发酵培养基：蔗糖24.8g/L，甘油15g/L，酵母粉4.8g/L，硫酸铵4.0g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，硫酸氢二钾8.5g/L，硫酸镁4.8g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰12.9mg/L，硫酸锌0.27mg/L，硫酸铜0.48mg/L。
对照组5发酵培养基：蔗糖14.8g/L，甘油25g/L，酵母粉4.8g/L，硫酸铵4.0g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，硫酸氢二钾8.5g/L，硫酸镁4.8g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰12.9mg/L，硫酸锌0.27mg/L，硫酸铜0.48mg/L。
均以实施例1工艺为实施方式。各培养基条件下发酵产酸量见表1：
表1
组别 产酸g/L 糖酸转化率％
实施例1 37.8 14.2
对照组1 27.5 11.4
对照组2 28.9 12.1
对照组3 31.6 12.8
对照组4 35.1 13.9
对照组5 34.4 13.7
结论：碳源添加量为蔗糖19.8g/L+甘油20g/L时，黄色短杆菌V1906-27的产酸效率最高，甘油含量过高或过低均不利于产酸。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。

Claims (8)

1.一种L-异亮氨酸发酵生产工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：步骤1）种子液制备，步骤2）发酵培养，步骤3）膜过滤、脱色、蒸发结晶、离心及烘干。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：
步骤1）种子液培育制备：
将活化后的L-异亮氨酸生产菌种黄色短杆菌CGMCC No.18060接种至种子培养基中，培养得到种子液；
步骤2）发酵培养：将种子液以10%体积比的接种量接入发酵培养基中，培养温度为30-33℃，风量为400-1800m³/h，压力为0.04-0.07Mpa，pH为6.7-7.8；当糖浓度降至1.0g/L时，通过流加糖维持罐内糖浓度为0.5-2.0g/L，直至发酵结束，总发酵时间为64小时，得到L-异亮氨酸发酵液；
步骤3）膜过滤、脱色、蒸发结晶、离心及烘干：将L-异亮氨酸发酵液经陶瓷膜过滤后，收集滤液；将滤液加入活性炭脱色得到脱色液；再将脱色液打入蒸发器中进行蒸发浓缩；离心分离出湿晶体，烘干即得。
3.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养基为：蔗糖19.8g/L，甘油20g/L，酵母粉4.8g/L，硫酸铵4.0g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，硫酸氢二钾8.5g/L，硫酸镁4.8g/L，硫酸亚铁0.02g/L，硫酸锰12.9mg/L，硫酸锌0.27mg/L，硫酸铜0.48mg/L。
4.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述种子培养基为：蔗糖10g/L，甘油20g/L，酵母膏5g/L，硫酸镁0.8g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸亚铁10mg/L，硫酸锰10mg/L，VH0.2mg/L。
5.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养过程中，溶氧：前期60%，后期50%；pH值：前期6.7-7.2，后期6.9-7.3。
6.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养过程中，溶氧：前期70%，后期40%；pH值：前期6.7-7.2，后期6.9-7.3。
7.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养过程中，溶氧：前期80%，后期30%；pH值：前期6.7-7.2，后期6.9-7.3。
8.根据权利要求5-7任其一所述的工艺，其特征在于，所述前期为0-16小时，后期为16-64小时。
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