CN108841758B - 谷氨酸棒杆菌突变株及其在l-亮氨酸生产中的应用 - Google Patents

谷氨酸棒杆菌突变株及其在l-亮氨酸生产中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株谷氨酸棒杆菌突变株及其在L‑亮氨酸生产中的应用。所述的谷氨酸棒杆菌突变株，保藏编号为CGMCC No.15720。利用上述本发明的突变菌株及发酵方法，可以实现L‑亮氨酸的高效生产，并且在发酵生产的过程中，有效降低副酸产量。进一步由于发酵液中杂酸少，提纯过程中无需按照本领域常规方案添加晶种、洗晶剂或结晶助剂，也无需重结晶步骤。发酵液通过简单的分离提取，产品纯度高。整个生产工艺过程简单易控制，成本较低，适合大规模工业应用。

Description

谷氨酸棒杆菌突变株及其在L-亮氨酸生产中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及用于L-亮氨酸生产的谷氨酸棒杆菌突变菌株及其在微生物发酵工程中的应用。
背景技术
L-亮氨酸是人与动物自身无法合成而需依赖外源供给的八大必需氨基酸之一，L-亮氨酸具有多种生理功能，是临床上复合氨基酸静脉注射液不可缺少的原料，对维持危重病人的营养需要有积极的作用。另外，L-亮氨酸与L-缬氨酸、L-异亮氨酸同属于支链氨基酸，在食品、保健品、饲料等方面也有广泛的应用。
目前国内L-亮氨酸的生产工艺大多采用水解法，存在环境污染严重等问题。国内发酵法生产L-亮氨酸技术起步较晚且技术落后，与日本等国家相比仍存在一定的差距，原因就在于菌株遗传信息不稳定、培养工艺粗放、杂酸多影响产品收率和纯度等。因此，选育L-亮氨酸高产菌株，提高产酸水平、糖酸转化率和提取收率，降低生产成本，才能提高国内产品的市场竞争力。
发明内容
本发明的目的在于，提供可用于L-亮氨酸生产的高效高产菌株，并提供利用其进行发酵生产L-亮氨酸的方法。
首先，本发明提供一株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变株IBBH-15，保藏于位于中国北京市的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.15720，保藏日期为2018年05月02日。
本发明的上述突变株是以谷氨酸棒杆菌(CICC编号20193)为出发菌株，通过诱变筛选的得到的高产L-亮氨酸、副酸少的突变菌株。经检测，该所述的谷氨酸棒杆菌突变株的遗传标记为谷氨酸缺陷(Glu-)、甲硫氨酸缺陷(Met-)、异亮氨酸缺陷(Ile-)、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)、磺胺胍(SGr)和β-羟基亮氨酸抗性(β-HLr)。
进一步，本发明提供一种L-亮氨酸的生产方法，是微生物发酵的生产方法，该方法包括使用上述的谷氨酸棒杆菌突变株进行微生物发酵的步骤。
利用上述本发明的突变菌株及发酵方法，可以实现L-亮氨酸的高效生产，并且在发酵生产的过程中，有效降低副酸产量。进一步由于发酵液中杂酸少，提纯过程中无需按照本领域常规方案添加晶种、洗晶剂或结晶助剂，也无需重结晶步骤。发酵液通过简单的分离提取，产品纯度高。整个生产工艺过程简单易控制，成本较低，适合大规模工业应用。
具体实施方式
本发明提供了一株高产L-亮氨酸且副酸少的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)突变株(CGMCC No.15720)。
本发明对上述突变株的诱变及选育是以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum，CICC编号20193)为出发菌株，通过紫外及硫酸二乙酯两步诱变，并经选育、筛选得到高产L-亮氨酸且副酸少的生产菌株IBBH-15，其遗传标记为谷氨酸缺陷(Glu-)、甲硫氨酸缺陷(Met-)、异亮氨酸缺陷(Ile-)、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)、磺胺胍(SGr)、β-羟基亮氨酸抗性(β-HLr)。具体的诱变剂选育过程将具体描述如下。如无特殊说明，本发明中所述及的培养基如下：
完全培养基(CM)：葡萄糖5g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0～7.2。
基本培养基(MM)：葡萄糖20g/L，硫酸铵2.0g/L，尿素2.0g/L，K2HPO4 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素100μg/L，维生素B1100μg/L，pH7.0～7.2。
补充培养基(SM)：在基本培养基(MM)中加入支链氨基酸的结构类似物。
无氮基本培养基：葡萄糖20g/L，K2HPO4 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素100μg/L，维生素B1100μg/L，pH7.0～7.2。
2倍氮基本培养基：葡萄糖20g/L，硫酸铵4.0g/L，尿素2.0g/L，K2HPO4 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素100μg/L，维生素B1 100μg/L，pH7.0～7.2。
摇瓶发酵培养基：葡萄糖130g/L，硫酸铵30g/L，玉米浆15mL/L，K2HPO4 5g/L，MgSO4·7H2O 2.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素200μg/L，维生素B1 300μg/L，CaCO3 35g/L，pH7.0～7.2。
诱变选育的过程包括如下步骤：
(1)诱变前处理：
取一环活化的菌种(CICC No.20193)接入装有25ml液态完全培养基的锥形瓶中，置于30℃、80～90rpm的往复式摇床中振荡培养16～20h。再取1培养液接入另一盛有25ml液态完全培养基的锥形瓶中，置于30℃、80～90rpm的往复式摇床中振荡4～6h，至细胞处于对数生长期。
(2)菌悬液的制备
取10ml步骤(1)所制得的培养液于无菌离心管中，5000rpm离心10min，弃去上清液，采用生理盐水重悬细胞后倒入锥形瓶中，振荡10min，调整细胞浓度为5×108个/ml。
(3)紫外诱变
取步骤(2)所制得的菌悬液于30W紫外灯下诱变30～120s，每隔10s取样稀释涂布，平板避光培养后计算致死率。采用饥饿培养和青霉素法淘汰野生型、浓缩缺陷型，通过影印培养法检出缺陷型菌株(Glu-+Met-+Ile-)，并按步骤(5)检验发酵产酸能力。
(4)硫酸二乙酯诱变
将步骤(3)所制得的缺陷型菌株按步骤(1)和步骤(2)制备菌悬液，加入0.5％(V％)的硫酸二乙酯(DES)，30℃振荡处理20min，中止处理后涂布于SM平板上，30℃静止培养4～6天。挑选在SM上生长的突变株单菌落转接至添加了5～10g/L 2-噻唑丙氨酸、10～20g/L磺胺胍或5～10g/Lβ-羟基亮氨酸的CM平板上，30℃静止培养24小时后进入摇瓶复筛。
(5)摇瓶复筛
将四环步骤(3)或步骤(4)获得的突变株接种于摇瓶发酵培养基中，30℃、100rpm振荡培养72小时，然后用纸层析法检测突变株发酵液中积累的L-亮氨酸。在所有突变株中产L-亮氨酸最高的菌株为IBBH-15。
以该菌株为发酵菌株，本发明进一步提供了一种L-亮氨酸的生产方法。该方法中包括了使用上述谷氨酸棒杆菌突变株CGMCC No.15720进行微生物发酵的步骤。
进一步，通过对发酵过程中温度、pH、溶解氧的控制，以及培养基的组成和添加方式进行调整，在500L发酵罐上实现发酵周期由67h缩短至48h，将L-亮氨酸产量由30g/L增加到40g/L，并且副酸总含量＜3g/L。用于实现该技术效果的具体实施方式之一，是包括下述步骤的方法：
(1)制备摇瓶种子液：将谷氨酸棒杆菌突变株接入摇瓶种子培养基中，30℃、100rpm振荡培养至OD600＝10～15，得到摇瓶种子液；
摇瓶种子培养基：葡萄糖30g/L，玉米浆40mL/L，硫酸铵25g/L，尿素2g/L，KH2PO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素100μg/L，维生素B1 300μg/L，pH7.0～7.2；
(2)发酵罐培养：将摇瓶种子液按8～10％(V/V)比例接入发酵罐发酵培养基中培养40～50h；发酵温度30～32℃，溶氧5～15％，pH 6.7～7.2，残糖降至10～40g/L以下时流加800g/L葡萄糖；其中溶氧可以通过调节通风控制，pH优选以流加氨水进行控制；
发酵罐发酵培养基：葡萄糖130g/L，硫酸铵5g/L，玉米浆10mL/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 2.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素100μg/L，维生素B1 300μg/L，L-蛋氨酸0.1g/L，L-异亮氨酸0.1g/L，L-谷氨酸0.1g/L，泡敌0.05g/L，pH7.0～7.2。
上文描述了利用本发明的突变菌种经发酵法生产L-亮氨酸的一般工艺过程。在不同规模的发酵体系中，可以根据体系进行调整。本领域的技术人员应当能够根据需求选择并调整。
更为具体的技术方案中，所述的L-亮氨酸的生产方法还包括对发酵液的后处理，包括下述步骤：过滤除菌、除杂、脱色、除盐以及调pH至等电点后闪蒸浓缩、过滤、烘干。在所述的后处理阶段，区别于常规技术手段，由于发酵液中杂酸少，提纯过程中无需按照本领域常规方案添加晶种、洗晶剂或结晶助剂，也无需重结晶步骤。发酵液通过简单的分离提取，产品纯度可达到95％以上，折纯收率达到85％以上。
下述非限制性实施例用于进一步说明本发明的技术方案及其效果，不应当理解为对发明内容任意形式的限定。
实施例1
将谷氨酸棒杆菌突变株IBBH-15的CM斜面菌苔接四环于3L摇瓶中，将其置于80r/min、30℃条件下培养至OD600＝15，得到摇瓶种子液，备用。按照10％(V/V)接种量将摇瓶种子液接入30L发酵罐发酵培养基中，初始温度为30℃，初始通风量为0.8L/min，然后通过控制搅拌转速和风量，使发酵过程的前24h溶解氧为10-20％，24h之后溶解氧为5～15％；通过自动流加氨水控制发酵过程的pH，初始控pH值为6.7，菌体OD600增长到20后pH提高至6.9，菌体OD600增长到25后pH提高至7.0，菌体OD600增长到36后pH提高到7.2；发酵过程中控制残糖浓度为20～30g/L。发酵16h后，每2～4h取一次样进行测定，发酵45h时L-亮氨酸产量最高为40.6g/L，糖酸转化率为26.6％(W/W)，副酸总含量约为2.8g/L。将发酵液经孔径0.22μm的陶瓷膜过滤除菌、截留分子量2000Dalton有机超滤膜除杂脱色、RO反渗透膜除盐，通过调pH至5.98，闪蒸浓缩后过滤，滤饼烘干得到晶体纯度达到95％以上，折纯收率达到85％以上。
实施例2
发酵培养条件对谷氨酸棒杆菌突变株IBBH-15生产L-亮氨酸能力考察。
本实施例设置2个测试组：
第1组：实施例1所述的培养条件进行试验；测试结果：发酵45h时L-亮氨酸产量最高为40.6g/L，糖酸转化率为26.6％(W/W)，副酸总含量约为2.8g/L。
第2组，为对照测试组，按照如下条件进行试验：将斜面菌种IBBH-15接入3L摇瓶中，将其置于80r/min、30℃条件下培养16h，得到种子液，备用。按照10％(V/V)接种量将种子液接入有发酵培养基的50L发酵罐中，初始温度为30℃，初始通风量为1.0L/min，通过控制搅拌转速和风量，使发酵过程中溶解氧为10～20％，通过自动流加氨水控制发酵过程的pH6.7～7.0，发酵过程中控制残糖浓度为4.0％。发酵24小时后，每2～4个小时取一次样进行测定，发酵67h时L-亮氨酸产量最高为30.5g/L，糖酸转化率为20.3％，副酸总含量约为8.7g/L。
通过对比可见，在本发明所提供的优化的发酵条件下(第1组)，L-亮氨酸产量提高了30％，糖酸转化率提高了31％，副酸总含量降低了67％。
实施例3
将谷氨酸棒杆菌CICC No.20193和谷氨酸棒杆菌突变株IBBH-15分别接一环于摇瓶种子培养基中，30℃、100rpm振荡培养至OD600＝10，得到两种摇瓶种子液。按照5％(V/V)将摇瓶种子液接入摇瓶发酵培养基中，30℃、120rpm振荡培养72小时。使用高效液相色谱检测发酵液中L-亮氨酸含量，谷氨酸棒杆菌CICC No.2019的L-亮氨酸产量为0.6g/L，而突变株IBBH-15的L-亮氨酸产量为28.1g/L，比原始菌株提高了45倍。可见，突变菌株IBBH-15具有更加优异的L-亮氨酸生产能力。
实施例4
在500L发酵罐上谷氨酸棒杆菌突变株IBBH-15的发酵培养
将谷氨酸棒杆菌突变株IBBH-15的CM斜面菌苔接四环于3L摇瓶中，将其置于80r/min、30℃条件下培养至OD600＝15，得到摇瓶种子液，备用。将摇瓶种子液按1％(V/V)比例接入50L发酵罐中，控制发酵温度30℃，pH6.7～7.2(流加氨水控制)，转速200～340rpm，通风量6.0L/min，培养至OD600＝15，得到发酵罐种子液。
按照10％(V/V)接种量将发酵罐种子液接入500L发酵罐中，初始温度为30℃，初始通风量为50L/min，然后通过控制搅拌转速和风量，使发酵过程的前24h溶解氧为10～20％，24h之后溶解氧为8～12％；通过自动流加氨水控制发酵过程的pH，初始控pH值为6.7，菌体OD600增长到20后pH提高至6.9，菌体OD600增长到25后pH提高至7.0，菌体OD600增长到36后pH提高到7.2；发酵过程中控制残糖浓度为20～30g/L。发酵16h后，每2～4h取一次样进行测定，发酵48h时L-亮氨酸产量最高为40.1g/L，糖酸转化率为26.7％，副酸总含量约为2.9g/L。

Claims (5)

1.谷氨酸棒杆菌突变株，保藏编号为CGMCC No.15720。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌突变株，其特征在于，其遗传标记为谷氨酸缺陷、甲硫氨酸缺陷、异亮氨酸缺陷、2-噻唑丙氨酸抗性、磺胺胍和β-羟基亮氨酸抗性。
3.L-亮氨酸的生产方法，是微生物发酵的生产方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌突变株进行微生物发酵的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备摇瓶种子液：将谷氨酸棒杆菌突变株接入摇瓶种子培养基中，30℃、100rpm振荡培养至OD600＝10～15，得到摇瓶种子液；
摇瓶种子培养基：葡萄糖30g/L，玉米浆40mL/L，硫酸铵25g/L，尿素2g/L，KH2PO4·3H2O1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素100μg/L，维生素B1 300μg/L，pH7.0～7.2；
(2)发酵罐培养：将摇瓶种子液按8～10％(V/V)比例接入发酵罐发酵培养基中培养40～50h；发酵温度30～32℃，溶氧5～15％，pH 6.7～7.2，残糖降至40g/L以下时流加800g/L葡萄糖；
发酵罐发酵培养基：葡萄糖130g/L，硫酸铵5g/L，玉米浆10mL/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 2.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，生物素100μg/L，维生素B1 300μg/L，L-蛋氨酸0.1g/L，L-异亮氨酸0.1g/L，L-谷氨酸0.1g/L，泡敌0.05g/L，pH7.0～7.2。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括对发酵液的后处理，包括下述步骤：过滤除菌、除杂、脱色、除盐以及调pH至等电点后闪蒸浓缩、过滤、烘干。
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