CN109593800B - 一种发酵生产l-亮氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种发酵生产L‑亮氨酸的方法，涉及氨基酸生产技术领域。该方法以谷氨酸棒杆菌ACCC16522为L‑亮氨酸生产菌，包括活化培养、种子培养、发酵培养和L‑亮氨酸的提取。在发酵培养基中添加苹果酸钠，显著减少了副产物的生成，在补料培养基中添加肌醇，提高了糖酸转化率，缩短了发酵时间。该方法通过优化了发酵培养的培养基、培养条件和过程，以及对发酵液中L‑亮氨酸提取工艺等，显著提高了L‑亮氨酸的产量和得率，工艺简单易控制，成本较低，非常具有工业实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及氨基酸生产技术领域，具体涉及一种发酵生产L-亮氨酸的方法。
背景技术
L-亮氨酸(L-leucine)又称白氨酸，即α-氨基-γ-甲基戊酸、α-氨基异己酸，分子式为C6H13O2N。1819年Proust首先从奶酪中分离得到，后来Braconnot从肌肉与羊毛的酸水解物中得到结晶，并定名为亮氨酸。亮氨酸与缬氨酸、异亮氨酸同属于支链氨基酸，是人体八大必需氨基酸之一。L-亮氨酸具有多种生理功能，在医药、食品、化妆品、农业等方面应用广泛。
目前L-亮氨酸的生产方法主要有蛋白质水解提取法、化学合成法、酶法和微生物发酵法等。蛋白质水解法生产L-亮氨酸纯度低，且费时、污染严重、大规模生产受到限制。化学合成法得到的亮氨酸是消旋的DL-亮氨酸，为了得到L-亮氨酸，必须进行光学异构体的拆分，因此化学合成法很少用于L-亮氨酸的生产。酶法生产L-亮氨酸稳定性差，产率低，副产物较多，而微生物发酵法条件温和、环境友好、产品质量稳定，最具有发展前途。以微生物直接发酵法生产L-亮氨酸，主要的生产菌株有：谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、粘质赛氏杆菌(Serratea marcesoens)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)、天津短杆菌(Brevibacterium tianjinese)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)等。
在L-亮氨酸微生物发酵生产过程中，菌种、发酵培养的培养基和培养条件等均会影响L-亮氨酸的产量。中国专利公告CN104404095B公开了一种利用黄色短杆菌TL0412发酵生产L-亮氨酸的方法，通过对发酵过程残糖浓度、温度、pH与溶解氧的控制及培养基的基本组成进行调整，发酵周期由原来的50小时缩短至33小时，L-亮氨酸产量由原来的30g/L增加到41g/L。中国专利公告CN1314798C公开了一种L-亮氨酸高产菌及用其发酵生产L-亮氨酸的方法，经多重诱变选育得到了谷氨酸棒杆菌CGMCC NO.1378，在通气量为3L/min，搅拌转速为600rpm，发酵温度为30-35℃，发酵时间为50-55h的条件下，L-亮氨酸的产量为40g/L。另一方面，在L-亮氨酸微生物发酵生产过程中，副产物的积累和L-亮氨酸的提取工艺等会影响其得率，主要的副产物L-缬氨酸、L-苏氨酸和L-丙氨酸等。对于L-亮氨酸的提取工艺，目前国内外多采用沉淀法。中国专利公告CN1072721C公开了一种L-亮氨酸的生产方法，通过浓缩、盐析、等电点沉淀或其它手段收集L-亮氨酸。离子交换法具有成本低、操作方便、提取率高、设备简单等优点。因此，提高L-亮氨酸的产量和得率是目前急需解决的问题。
本发明为了解决现有技术中存在的问题，即L-亮氨酸产量低、发酵过程产生大量副产物、糖酸转化率低、提取工艺复杂、发酵周期长、得率低等。对发酵培养的培养基、培养条件、过程，以及对发酵液中L-亮氨酸提取工艺等进行优化。提高了L-亮氨酸的产量、糖酸转化率和得率，减少了发酵过程中副产物的产生，缩短了发酵时间，工艺简单易控制，成本较低，非常具有工业实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵生产L-亮氨酸的方法。克服了现有技术中存在的问题，提高了L-亮氨酸的产量和得率，减少了副产物的生成。
本发明一方面提供了一种发酵生产L-亮氨酸的方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)活化培养：将L-亮氨酸生产菌接种至活化培养基上进行活化培养，得到活化菌；
所述的L-亮氨酸生产菌为谷氨酸棒杆菌ACCC16522；
所述的活化培养基包括：无水葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NaCl、琼脂粉，pH＝7.0-7.2；
(2)种子培养：将步骤(1)得到的活化菌接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液；
所述的种子培养基包括：无水葡萄糖、玉米浆干粉、硫酸铵、KH2PO4·3H2O、维生素B1、生物素，pH＝7.0-7.2；
(3)发酵培养：按照10％的接种量，取步骤(2)得到的种子液，接种至发酵培养基中培养，期间加入补料培养基2次，得到发酵液；
所述的发酵培养基包括：苹果酸钠、无水葡萄糖、玉米浆干粉、硫酸铵、KH2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、维生素B1、生物素、CaCO3、消泡剂，pH＝7.0-7.2；
所述的补料培养基包括：苹果酸钠、肌醇、玉米浆干粉、硫酸铵、KH2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、维生素B1、生物素、CaCO3、消泡剂，pH＝7.0-7.2；
(4)L-亮氨酸的提取：将发酵结束后的发酵液离心，收集上清液，将上清液过离子交换柱提取纯化，得到L-亮氨酸。
具体地，上述步骤(1)的操作包括：将L-亮氨酸生产菌(谷氨酸棒杆菌ACCC16522)接种至活化培养基上，培养箱中32℃活化培养12h，得到活化菌。
具体地，上述步骤(2)的操作包括：取一环生长良好的活化菌，接种至含有种子培养基的摇瓶中进行培养，装液量为200mL/500mL，种子培养的条件为32℃，150r/min摇床培养20h，至菌体OD620值达到1.2，得到种子液。
优选地，所述的活化培养基包括：无水葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 2.5g/L、琼脂粉20g/L，pH＝7.0-7.2。
优选地，所述的种子培养基包括：无水葡萄糖20g/L、玉米浆干粉25g/L、硫酸铵2g/L、KH2PO4·3H2O 1.5g/L、维生素B1 300μg/L、生物素200μg/L，pH＝7.0-7.2。
优选地，所述的发酵培养基包括：苹果酸钠2.0-4.0g/L、无水葡萄糖140-160g/L、玉米浆干粉35g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、MnSO4·H2O0.1g/L、维生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO3 30g/L、消泡剂0.5％，pH＝7.0-7.2。
进一步优选地，所述的发酵培养基包括：所述的发酵培养基包括：苹果酸钠3.0g/L、无水葡萄糖150g/L、玉米浆干粉35g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 1.0g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、MnSO4·H2O 0.1g/L、维生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO3 30g/L、消泡剂0.5％，pH＝7.0-7.2。
优选地，所述的补料培养基包括：苹果酸钠1.0g/L、肌醇1.0-2.0g/L、玉米浆干粉12g/L、硫酸铵25g/L、KH2PO4·3H2O 2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L、维生素B1 400μg/L、生物素60μg/L、CaCO3 20g/L、消泡剂1.0％，pH＝7.0-7.2。
优选地，所述步骤(3)中的培养温度为30℃-35℃，搅拌转速600rpm/min，前12h的通气量为80-100L/h，12h之后的通气量为100-120L/h，通过自动流加氨水控制发酵过程中pH＝6.6±0.05，培养30-32h；进一步优选地，所述步骤(3)中的培养温度为32℃，前12h的通气量为90L/h，12h之后的通气量为110L/h。
优选地，所述步骤(3)中加入补料培养基2次包括，在培养12h时第一次加入补料培养基，在培养22h时第二次加入补料培养基。
优选地，所述步骤(4)中将上清液过离子交换柱提取纯化，0.5BV/h流速上样，上样量为260mL的发酵液，所用洗脱剂为3.0mol/L的氨水，所述的洗脱剂的洗脱流速为0.1-1.0BV/h；进一步优选地，所述的洗脱流速为0.5BV/h。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
本发明提供的发酵生产L-亮氨酸的方法，优化了发酵培养的培养基、培养条件和过程，增加了补料环节，以及对发酵液中L-亮氨酸提取工艺等的优化，显著提高了L-亮氨酸的产量和得率，在发酵培养基中添加苹果酸钠，显著减少了副产物的生成，在补料培养基中添加肌醇，提高了糖酸转化率，缩短了发酵时间。该方法工艺简单易控制，成本较低，非常具有工业实用价值。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
一、基础实施例：一种发酵生产L-亮氨酸的方法
(1)活化培养：取L-亮氨酸生产菌(即谷氨酸棒杆菌ACCC16522，购自上海复祥生物科技有限公司)接种至活化培养基上，在培养箱中32℃活化培养12h，得到活化菌。
活化培养基：无水葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、NaCl2.5g/L、琼脂粉20g/L，pH＝7.0-7.2。
(2)种子培养：取一环生长良好的活化菌接种至含有种子培养基的摇瓶中进行种子培养，装液量为200mL/500mL，种子培养的条件为32℃，150r/min摇床培养20h，用分光光度计测定发酵液中的菌体浓度，菌体OD620值达到1.2可作为合格的种子液，得到种子液。
种子培养基：无水葡萄糖20g/L、玉米浆干粉25g/L、硫酸铵2g/L、KH2PO4·3H2O1.5g/L、维生素B1 300μg/L、生物素200μg/L，pH＝7.0-7.2。
(3)发酵培养：按照10％的接种量，取步骤(2)得到的种子液，接种至含有发酵培养基的10L发酵罐中，装液量为6L/10L，培养温度为30℃-35℃，搅拌转速600rpm/min，在培养过程中加入补料培养基，前12h的通气量为80-100L/h，12h之后的通气量为100-120L/h，通过自动流加氨水控制发酵过程中pH＝6.6±0.05，培养30-32h，得到发酵液。发酵结束时间以产酸不再增加为判断标准。发酵培养前后，用高效液相色谱法测定L-亮氨酸含量；利用生物传感分析仪检测发酵液残糖的含量。
发酵培养基：苹果酸钠2.0-4.0g/L、无水葡萄糖140-160g/L、玉米浆干粉35g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、MnSO4·H2O 0.1g/L、维生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO3 30g/L、消泡剂0.5％，pH＝7.0-7.2。
补料培养基：苹果酸钠1.0g/L、肌醇1.0-2.0g/L、玉米浆干粉12g/L、硫酸铵25g/L、KH2PO4·3H2O 2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L、维生素B1 400μg/L、生物素60μg/L、CaCO3 20g/L、消泡剂1.0％，pH＝7.0-7.2。
(4)L-亮氨酸的提取：取发酵结束后的发酵液，8000r/min离心10min，收集上清液，将上清液过离子交换柱提取纯化，0.5BV/h流速上样，上样量为260mL的发酵液，所用洗脱剂为3.0mol/L的氨水，洗脱流速为0.1-1.0BV/h，收集流出液，用高效液相色谱法测定发酵液和流出液中L-亮氨酸的含量，计算得率。
对比例1：一种发酵生产L-亮氨酸的方法
中国专利公告CN104404095B的实施例1所述的发酵生产L-亮氨酸的方法。
对比例2：一种L-亮氨酸高产菌及用其发酵法生产L-亮氨酸
中国专利公告CN1314798C的实施例7所述的一种L-亮氨酸高产菌及用其发酵生产L-亮氨酸的方法。
实施例1：一种发酵生产L-亮氨酸的方法
与基础实施例的区别在于，步骤(3)中发酵培养温度为32℃，前12h的通气量为90L/h，12h之后的通气量为110L/h，步骤(4)中洗脱流速为0.5BV/h。发酵期间补料2次，所用补料培养基：苹果酸钠1.0g/L、肌醇1.5g/L、玉米浆干粉12g/L、硫酸铵25g/L、KH2PO4·3H2O2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L、维生素B1 400μg/L、生物素60μg/L、CaCO320g/L、消泡剂1.0％，pH＝7.0-7.2。
分别用以下四种培养基进行发酵培养：
发酵培养基1：苹果酸钠2.0g/L、无水葡萄糖140g/L、玉米浆干粉35g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、MnSO4·H2O 0.1g/L、维生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO3 30g/L、消泡剂0.5％，pH＝7.0-7.2；
发酵培养基2：苹果酸钠3.0g/L、无水葡萄糖150g/L、玉米浆干粉35g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、MnSO4·H2O 0.1g/L、维生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO3 30g/L、消泡剂0.5％，pH＝7.0-7.2；
发酵培养基3：苹果酸钠4.0g/L、无水葡萄糖160g/L、玉米浆干粉35g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、MnSO4·H2O 0.1g/L、维生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO3 30g/L、消泡剂0.5％，pH＝7.0-7.2；
发酵培养基4(对照)：无水葡萄糖150g/L、玉米浆干粉35g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、MnSO4·H2O 0.1g/L、维生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO3 30g/L、消泡剂0.5％，pH＝7.0-7.2。
发酵培养前后，用高效液相色谱法测定L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸的含量。结果见表1。
表1：不同培养基中L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸的含量
由表1可知，利用本发明所提供的方法发酵生产L-亮氨酸，能够有效地减少副产物(即：L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸)的生成。其中，利用发酵培养基2进行发酵培养，效果最佳。
实施例2：一种发酵生产L-亮氨酸的方法
与基础实施例的区别在于，步骤(3)中发酵培养温度为32℃，前12h的通气量为90L/h，12h之后的通气量为110L/h，步骤(4)中洗脱流速为0.5BV/h，所用发酵培养基包括：苹果酸钠3.0g/L、无水葡萄糖150g/L、玉米浆干粉35g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、MnSO4·H2O 0.1g/L、维生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO3 30g/L、消泡剂0.5％，pH＝7.0-7.2。发酵期间补料2次，分别用以下补料培养基进行补料：
补料培养基1：苹果酸钠1.0g/L、肌醇1.0g/L、玉米浆干粉12g/L、硫酸铵25g/L、KH2PO4·3H2O 2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L、维生素B1 400μg/L、生物素60μg/L、CaCO3 20g/L、消泡剂1.0％，pH＝7.0-7.2；
补料培养基2：苹果酸钠1.0g/L、肌醇1.5g/L、玉米浆干粉12g/L、硫酸铵25g/L、KH2PO4·3H2O 2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L、维生素B1 400μg/L、生物素60μg/L、CaCO3 20g/L、消泡剂1.0％，pH＝7.0-7.2；
补料培养基3：苹果酸钠1.0g/L、肌醇2.0g/L、玉米浆干粉12g/L、硫酸铵25g/L、KH2PO4·3H2O 2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L、维生素B1 400μg/L、生物素60μg/L、CaCO3 20g/L、消泡剂1.0％，pH＝7.0-7.2；
补料培养基4(对照)：苹果酸钠1.0g/L、玉米浆干粉12g/L、硫酸铵25g/L、KH2PO4·3H2O 2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L、维生素B1 400μg/L、生物素60μg/L、CaCO3 20g/L、消泡剂1.0％，pH＝7.0-7.2。结果见表2。
表2：不同补料培养基下的糖酸转化率和发酵时间
| 组别 | L-亮氨酸含量(g/L) | 糖酸转化率(％) | 发酵时间(h) |
| 补料培养基1 | 46.86 | 24.63 | 31.5 |
| 补料培养基2 | 48.92 | 26.78 | 30.6 |
| 补料培养基3 | 47.53 | 25.12 | 31.2 |
| 补料培养基4 | 45.77 | 19.22 | 38.7 |
由表2可知，利用本发明所提供的方法发酵生产L-亮氨酸，显著提高了糖酸转化率，有效地缩短了发酵时间，其中，利用补料培养基2进行发酵培养，效果最佳。
实施例3：一种发酵生产L-亮氨酸的方法
与基础实施例的区别在于，步骤(3)中发酵培养温度为32℃，前12h的通气量为90L/h，12h之后的通气量为110L/h，步骤(4)中洗脱流速为0.5BV/h，所用发酵培养基包括：苹果酸钠3.0g/L、无水葡萄糖150g/L、玉米浆干粉35g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、MnSO4·H2O 0.1g/L、维生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO3 30g/L、消泡剂0.5％，pH＝7.0-7.2。所用补料培养基：苹果酸钠1.0g/L、肌醇1.5g/L、玉米浆干粉12g/L、硫酸铵25g/L、KH2PO4·3H2O 2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L、维生素B1 400μg/L、生物素60μg/L、CaCO3 20g/L、消泡剂1.0％，pH＝7.0-7.2。补料培养基加入次数分别为0次、1次(12h时加入1次)、2次(12h时和22h时各加入1次)、3次(8h、16h和24h时各加入1次)。结果见表3。
表3：不同补料次数对L-亮氨酸产量的影响
由表3可知，在发酵培养期间补料2-3次L-亮氨酸产量较高，补料2次和3次的效果差异不大，为了避免浪费和简化操作步骤，本发明在发酵培养过程中补料2次。
实施例4：一种发酵生产L-亮氨酸的方法
与基础实施例的区别在于，步骤(3)中分别用30℃，32℃，35℃进行发酵培养，前12h的通气量为90L/h，12h之后的通气量为110L/h，步骤(4)中洗脱流速为0.5BV/h，所用发酵培养基包括：苹果酸钠3.0g/L、无水葡萄糖150g/L、玉米浆干粉35g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、MnSO4·H2O 0.1g/L、维生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO3 30g/L、消泡剂0.5％，pH＝7.0-7.2。发酵期间补料2次，所用补料培养基：苹果酸钠1.0g/L、肌醇1.5g/L、玉米浆干粉12g/L、硫酸铵25g/L、KH2PO4·3H2O 2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L、维生素B1 400μg/L、生物素60μg/L、CaCO3 20g/L、消泡剂1.0％，pH＝7.0-7.2。结果见表3。
表4：不同温度对L-亮氨酸产量的影响
由表4可知，利用本发明提供的方法发酵生产L-亮氨酸产量高，当发酵温度为32℃时，L-亮氨酸的产量最高。
实施例5：一种发酵生产L-亮氨酸的方法
与基础实施例的区别在于，步骤(3)中发酵培养温度为32℃，步骤(4)中洗脱流速为0.5BV/h，所用发酵培养基包括：苹果酸钠3.0g/L、无水葡萄糖150g/L、玉米浆干粉35g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、MnSO4·H2O 0.1g/L、维生素B1300μg/L、生物素50μg/L、CaCO3 30g/L、消泡剂0.5％，pH＝7.0-7.2。发酵期间补料2次，所用补料培养基：苹果酸钠1.0g/L、肌醇1.5g/L、玉米浆干粉12g/L、硫酸铵25g/L、KH2PO4·3H2O2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L、维生素B1 400μg/L、生物素60μg/L、CaCO320g/L、消泡剂1.0％，pH＝7.0-7.2。
步骤(3)中的通气量设置如下：通气量1：前12h的通气量为80L/h，12h之后的通气量为100L/h；通气量2：前12h的通气量为90L/h，12h之后的通气量为110L/h；通气量3：前12h的通气量为100L/h，12h之后的通气量为120L/h；通气量4(对照)：110L/h。结果见表5。
表5：不同通气量对L-亮氨酸产量的影响
由表5可知，利用本发明提供的方法发酵生产L-亮氨酸产量高，当通气量设置为：前12h的通气量为90L/h，12h之后的通气量为110L/h时，L-亮氨酸的产量最高。
实施例6：一种发酵生产L-亮氨酸的方法
与基础实施例的区别在于，步骤(3)中发酵培养温度为32℃，前12h的通气量为90L/h，12h之后的通气量为110L/h，所用发酵培养基包括：苹果酸钠3.0g/L、无水葡萄糖150g/L、玉米浆干粉35g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、MnSO4·H2O 0.1g/L、维生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO3 30g/L、消泡剂0.5％，pH＝7.0-7.2。发酵期间补料2次，所用补料培养基：苹果酸钠1.0g/L、肌醇1.5g/L、玉米浆干粉12g/L、硫酸铵25g/L、KH2PO4·3H2O 2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L、维生素B1 400μg/L、生物素60μg/L、CaCO3 20g/L、消泡剂1.0％，pH＝7.0-7.2。步骤(4)中洗脱流速分别为0.05BV/h、0.1BV/h、0.5BV/h、1.0BV/h、1.5BV/h。结果见表6。一般洗脱速度不宜过快或过慢，速度太快，拖尾较严重，影响得率；速度太慢，洗脱周期长，且会造成堵柱。
表6：不同的洗脱流速对L-亮氨酸得率的影响
由表6可知，洗脱流速为0.1-1.0BV/h，L-亮氨酸的得率高，均大于95％。因此，本发明提供的提取发酵液中L-亮氨酸所用的洗脱流速为0.1-1.0BV/h，其中，洗脱流速为0.5BV/h的效果最佳。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种发酵生产L-亮氨酸的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)活化培养：将L-亮氨酸生产菌接种至活化培养基上进行活化培养，得到活化菌；
所述的L-亮氨酸生产菌为谷氨酸棒杆菌ACCC16522；
所述的活化培养基包括：无水葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NaCl、琼脂粉，pH＝7.0-7.2；
(2)种子培养：将步骤(1)得到的活化菌接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液；
所述的种子培养基包括：无水葡萄糖、玉米浆干粉、硫酸铵、KH2PO4·3H2O、维生素B1、生物素，pH＝7.0-7.2；
(3)发酵培养：按照10％的接种量将步骤(2)得到的种子液，接种至发酵培养基中培养，期间加入补料培养基2次，得到发酵液；
所述的发酵培养基包括：苹果酸钠2.0-4.0g/L、无水葡萄糖140-160g/L、玉米浆干粉35g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、MnSO4·H2O 0.1g/L、维生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO3 30g/L、消泡剂0.5％，pH＝7.0-7.2；
所述的补料培养基包括：苹果酸钠1.0g/L、肌醇1.0-2.0g/L、玉米浆干粉12g/L、硫酸铵25g/L、KH2PO4·3H2O 2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L、维生素B1 400μg/L、生物素60μg/L、CaCO3 20g/L、消泡剂1.0％，pH＝7.0-7.2；
(4)L-亮氨酸的提取：将发酵结束后的发酵液离心，收集上清液，将上清液过离子交换柱提取纯化，得到L-亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的活化培养基包括：无水葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 2.5g/L、琼脂粉20g/L，pH＝7.0-7.2；
所述的种子培养基包括：无水葡萄糖20g/L、玉米浆干粉25g/L、硫酸铵2g/L、KH2PO4·3H2O 1.5g/L、维生素B1 300μg/L、生物素200μg/L，pH＝7.0-7.2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括：苹果酸钠3.0g/L、无水葡萄糖150g/L、玉米浆干粉35g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 1 .0g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、MnSO4·H2O 0 .1g/L、维生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO3 30g/L、消泡剂0.5％，pH＝7.0-7.2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)种子培养的条件为：培养温度32℃，150r/min摇床培养20h，至菌体OD620值达到1.2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中培养温度为30℃-35℃，搅拌转速600rpm/min，前12h的通气量为80-100L/h，12h之后的通气量为100-120L/h，通过自动流加氨水控制发酵过程中pH＝6.6±0.05，培养30-32h。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的培养温度为32℃，前12h的通气量为90L/h，12h之后的通气量为110L/h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中加入补料培养基2次是分别在培养至12h时和22h时加入补料培养基。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中将上清液过离子交换柱提取纯化，0.5BV/h流速上样，上样量为260mL的发酵液，所用洗脱剂为3.0mol/L的氨水。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的洗脱剂的洗脱流速为0.1-1.0BV/h。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的洗脱剂的洗脱流速为0.5BV/h。
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