CN100455670C - 一株产l-丝氨酸的菌株及用该菌株生产l-丝氨酸的方法 - Google Patents

一株产l-丝氨酸的菌株及用该菌株生产l-丝氨酸的方法 Download PDF

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一株产L-丝氨酸的菌株及用该菌株生产L-丝氨酸的方法，属于生物法制备氨基酸技术领域。本发明包括从土壤中富集，分离，并使用茚三酮的变色圈法检出，经初筛，复筛得到一株产L-丝氨酸的菌株(Corynebacteriumglutamicum)SYPS-062，保藏编号为CGMCC No.1843；及用该菌株能够利用糖质原料直接发酵生产L-丝氨酸的方法。在优化条件下培养生产L-丝氨酸，产酸水平达到6g/L左右。

Description

一株产L-丝氨酸的菌株及用该菌株生产L-丝氨酸的方法
技术领域
一株产L-丝氨酸的菌株及用该菌株生产L-丝氨酸的方法，本发明涉及以蔗糖、硫酸氨为主要原料，利用该菌株发酵生产L-丝氨酸的方法。属于生物法制备氨基酸技术领域。
背景技术
L-丝氨酸属非必需氨基酸，是一种生糖氨基酸。它具有重要的生物学意义，是合成多种氨基酸、嘌呤、胸腺嘧啶、胆碱的前体，其衍生物磷脂丝氨酸是磷脂主要成分之一。它被广泛的应用于食品，医药及化妆品领域，作为氨基酸输液剂的主要成分，及作为抗癌药物，抗艾滋病药物等已在医药领域受到人们的关注；在化妆品领域，作为一种天然的保湿因子，是许多高档化妆品的关键添加剂。
除发酵法外，L-丝氨酸的制备方法目前有提取法，化学合成法，酶法等。这些方法存在操作费时，收率低，拆分困难，环境污染严重，不适于大规模生产等问题。
L-丝氨酸处于氨其酸代谢的中间位置，参与许多生物物质(如甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸等氨基酸，嘌吟、胸腺嘧啶之类的核酸碱基，磷脂丝氨酸、鞘磷脂等磷脂)的合成，代谢运转速度极快。因此与其它氨基酸相比，直按发酵法生产L-丝氨酸十分困难。至今研究的大多是以甘氨酸、甘氨酸三甲内盐或甘油酸为前体的发酵法。其中以甘氨酸为前体生产L-丝氨酸生产技术已经工业化，但添加的前体物价格偏高，因而成本高、价格较贵。
直接发酵法主要是利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸。但L-丝氨酸是氨基酸代谢的中间产物，参与许多生物物质如甘氨酸、半胱氨酸、核酸碱基等的合成。因此，L-丝氨酸在生物体内很难大量积累，成为利用糖类发酵生产L-丝氨酸的一个瓶颈。国内，新疆农科院微生物所崔春生等人利用基因工程菌Brevibacteriumflavm直接发酵生产L-丝氨酸。国外，没有查阅到直接发酵法生产L-丝氨酸的相关报道。Petra Peters-Wendisch等人成功的采用代谢工程的手段，利用谷氨酸棒杆菌构建了L-丝氨酸的产生菌，为进一步研究丝氨酸代谢途径奠定了基础。利用此类重组菌生产L-丝氨酸时，很难进行工艺放大，难以实现产业化。
从工业化角度看，要求生产L-丝氨酸的菌株遗传稳定性好，且产生的杂酸少，L-丝氨酸产量达一定水平，工艺放大较为容易，这样才能适合于工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产L-丝氨酸的菌株及用该菌株生产L-丝氨酸的方法，其中包括菌株的筛选以及在适宜条件下培养该菌株大量生产L-丝氨酸。
本发明所述的一株产L-丝氨酸的菌株，该菌株分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SYPS-062，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1843。
本发明中的L-丝氨酸的生产菌株可以这样筛选得到：采集土样，在富集培养基中对细菌进行富集培养。用茚三酮的显色反应在平板中检出具有变色圈的菌株；使用摇管初筛及摇瓶复筛最终筛选得到L-丝氨酸的生产菌。
该菌株的筛选方法：
(1)采集土样：采集糖厂周围土样。
(2)富集：采集的土样在装有含制霉菌素的富集培养基中富集培养。
(3)检出氨基酸产生菌：用茚三酮显色反应在平板中检出具有变色圈的菌株。
筛选固体培养基：葡萄糖20～40g/L，(NH4)2SO410～40g/L，KH2PO41～5g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，FeSO4·7H2O 0.02～0.15g/L，MnSO4·H2O 0.02～0.15g/L，生物素30～50μg/L，硫胺素200～250μg/L，琼脂20g/L。
培养条件为30～35℃，1～4天。
(4)L-丝氨酸产生菌的筛选：在摇管中对检出的菌株进行初筛，筛选得到具有L-丝氨酸生产能力的菌株。再进行摇瓶复筛，得到产量性状较优的菌株。
筛选发酵培养基：葡萄糖40～80g/L，玉米浆10～30g/L，棉籽粉10～30g/L，(NH4)2SO420～50g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，FeSO4·7H2O0.01～0.05g/L，MnSO4·H2O 0.01～0.05g/L，生物素0.08～0.15mg/L，CaCO320g/L。
培养条件为30～35℃，摇瓶转速为往复90～120转/分，2～5天。
用于本发明的L-丝氨酸生产菌具有以下分类学特征：菌落呈圆形，表面光滑，颜色微黄；显微细胞形态为短杆状，呈单或成八字形排列；好氧；无芽孢、鞭毛，不运动，革兰氏阳性；不能利用葡萄糖产酸，硝酸盐还原试验阳性，甲基红试验阳性，V.P.试验阴性，不能水解明胶，不能利用尿素，可利用无机氮源。经16Sr DNA鉴定，结合分类学鉴定结果，该菌株为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SYPS-062。
本发明用通风发酵的方式培养微生物SYPS-062进行L-丝氨酸的生产。作为培养基需要有适当的碳源、氮源、无机物及所需的痕量其它营养物质和无机盐。
用CGMCC No.1843菌株生产L-丝氨酸的方法，发酵培养基为蔗糖50～70g/L，玉米浆10～30g/L，棉籽粉10～30g/L，(NH4)2SO420～50g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，FeSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，MnSO4·H2O 0.01～0.05g/L，生物素0.08～0.15mg/L，VB1500μg/L，CaCO320g/L，pH 6～8，121℃下灭菌20min。将菌株以5％-10％(w/w)接种量转接到发酵培养基中，培养在通气条件下进行，如摇瓶培养或搅拌式发酵罐通风培养，培养温度30～35℃左右，摇床转速90～120转/分钟，或发酵罐通风量2～3vvm，搅拌转速为400～600转/分钟。培养pH6～8范围内，pH值中性左右。可选用碳酸钙、氨、无机酸碱溶液调节pH值。通常培养72-120h，L-丝氨酸在发酵液中积累。
发酵培养基中的蔗糖可以改用葡萄糖或果糖。
本发明的有益效果：从自然界中筛选得到能够利用糖质原料直接发酵积累L-丝氨酸的产生菌，经鉴定为谷氨酸棒杆菌。在优化条件下培养生产L-丝氨酸，产酸水平达到5～7g/L。现有的生产L-丝氨酸的方法中，多为前体发酵法，而本发明提供直接发酵生产L-丝氨酸的菌株，这样就大大降低了生产L-丝氨酸的成本，提高了收益。本发明菌株具有遗传稳定性好、产量性状稳定，L-丝氨酸产量保持较高水平，且产生的杂酸少，工艺放大较为容易，适合于工业化生产。
附图说明
图1发酵培养基中不同浓度的蔗糖对L-丝氨酸产量的影响。
生物材料样品保藏
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SYPS-062，保藏日期2006年10月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1843。
具体实施方式
实施例1筛选具有L-丝氨酸合成能力的菌株。
采集糖厂周围的表面15cm以下的土样，1g土样在装有含有50μg/mL制霉菌素的富集培养基三角瓶(30mL/250mL)中于往复式摇床中30℃110rpm/min富集培养3天。将富集得到的菌悬液取0.1mL涂布于筛选培养基，使用灭过菌的滤纸片将涂布的平板影印至拷贝平板，培养3天。使用0.3％的茚三酮的丙酮溶液浸润平板，于105℃烘干显色10min，产生紫色变色圈的为氨基酸产生菌。
从拷贝平板挑取相应的氨基酸产生菌，在发酵培养基中进行摇管初筛，每株一管。培养结束后，用纸层析法检测发酵上清液中的L-丝氨酸含量，初筛得到6株有丝氨酸合成能力的菌株。
再进行摇瓶复筛，首先经种子培养，再以接种量5％(v/v)接入发酵培养基，每株三瓶，用氨基酸分析仪检测发酵上清液中L-丝氨酸的含量，结果见表1。其中菌株SYPS-062的产量最高，达2.9g/L。经过传代实验考察，具有较好的传代稳定性。
种子培养基(g/100mL)：葡萄糖3.0，玉米浆2.0，(NH4)2SO42.0，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.05，尿素0.15，豆饼水解液2.0，pH 7.0-7.2，121℃下灭菌20min，装液量20mL/250mL。
发酵培养基：葡萄糖80g/L，玉米浆30g/L，棉籽粉30g/L，(NH4)2SO430g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，生物素0.08mg/L，CaCO320g/L。培养条件为30℃，摇瓶转速为往复110转/分，培养3天。
表1
Figure C20061009773000061
实施例2选择发酵培养基的最适碳源种类及浓度。
以实施例1中的发酵培养基为基础培养基，将其中的葡萄糖换为80g/L蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、淀粉等碳源，结果见表2。在以葡萄糖、蔗糖或果糖为碳源时，L-丝氨酸的产量较高；而以乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉为唯一碳源时，几乎不产L-丝氨酸。其中以蔗糖为碳源时，L-丝氨酸的产量最高，为5.1g/mL。
并且以蔗糖为碳源，生产强度亦最高。表2
Figure C20061009773000062
实施例3以40-80g/L不同浓度的蔗糖为碳源进行发酵。
实验结果见图1所示。以60g/L为最优浓度，L-丝氨酸产量可达到5.5g/L。
实施例4VB1对菌体生长和L-丝氨酸积累有较大影响。
在发酵培养基：蔗糖60g/L，玉米浆10～30g/L，棉籽粉10～30g/L，(NH4)2SO420～50g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，FeSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，MnSO4·H2O 0.01～0.05g/L，生物素0.08～0.15mg/L，CaCO320g/L的基础上，分别添加50μg/L、200μg/L、500μg/L、800μg/L的VB1，发酵罐通风量2～3vvm，搅拌转速为400～600转/分钟，培养pH6～8范围内。结果表明，500μg/L为最优浓度，L-丝氨酸产量可达6.0-6.4g/L。与未加VB1比较提高了20％左右。

Claims (3)

1、一株产L-丝氨酸的菌株，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriutmglutamicum)SYPS-062，保藏编号为CGMCC No.1843，该菌株具有以下特性：能利用糖质原料直接发酵生产L-丝氨酸。
2、一种利用权利要求1所述菌株CGMCC No.1843生产L-丝氨酸的方法，其特征在于发酵培养基为：蔗糖50～70g/L，玉米浆10～30g/L，棉籽粉10～30g/L，(NH4)2SO4 20～50g/L，KH2PO4 1.0～2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，FeSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，MnSO4·H2O 0.01～0.05g/L，生物素0.08～0.15mg/L，VB1 500μg/L，CaCO3 20g/L，pH6～8，121℃下灭菌20min，将菌株以5％-10％W/W接种量转接到发酵培养基中，在通气条件下，以摇瓶培养或搅拌式发酵罐通风培养，培养温度30～35℃，培养时间为72～120小时，进行L-丝氨酸生产。
3、根据权利要求2所述的生产L-丝氨酸的方法，其特征是发酵培养基中的蔗糖改用葡萄糖或果糖。
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