CN108486133B - 一种l-丝氨酸转运蛋白的应用方法 - Google Patents

一种l-丝氨酸转运蛋白的应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L‑丝氨酸转运蛋白及其应用方法。本发明在研究氨基酸转运蛋白基础上，发现了谷氨酸棒杆菌中NCgl0580序列具有转运L‑丝氨酸功能，将其命名为serE，进一步将serE运用于L‑丝氨酸的生产菌株，用于提高L‑丝氨酸的产量。

Description

一种L-丝氨酸转运蛋白的应用方法
技术领域
本发明涉及一种生物工程领域的技术，具体是一种新的L-丝氨酸转运蛋白SerE及其应用。
L-丝氨酸是一种非必需氨基酸，在医药，食品化妆品等领域有着广泛的应用，其年需求量大约是3000吨。谷氨酸棒杆菌是食品安全级氨基酸生产菌株，广泛应用于L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸等氨基酸的生产。然而一般的谷氨酸棒杆菌却不能利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸。
目前国内外对谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的研究集中在其合成和降解途径的分子改造，Stolz等以不产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，构建的重组菌以葡萄糖和果糖为混合碳源时L-丝氨酸产量36.2g/L。来书娟等在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中加强表达3-磷酸甘油酸激酶(PGK)，增加了L-丝氨酸前体3-磷酸甘油酸的合成，提高了L-丝氨酸的产量。
本课题组前期从自然界中筛选得到一株能利用糖质原料发酵产L-丝氨酸的野生型谷氨酸棒杆菌SYPS-062，以它为出发菌株通过多轮化学诱变获得突变株C.glutamicumSYPS-062-33a。该突变株L-丝氨酸产量提高65％，达到11.0g/L，副产物L-丙氨酸和L-缬氨酸的积累量也明显提高。进一步在突变株上解除L-丝氨酸合成途径关键酶反馈抑制，敲除降解途径，阻断和弱化副产物积累途径，所获得重组菌C.glutamicum SYPS-062 33aΔSSA(缩写为ΔSSA)(CGMCC NO.8668)其L-丝氨酸摇瓶产量可以达到26.25g/L，是野生型菌株的3.9倍。
尽管代谢工程改造L-丝氨酸合成和降解途径的基因取得很好的效果，但是为了适用工业规模的生产，目前L-丝氨酸的产量仍需要提高。氨基酸的转运出胞是其在培养基中积累的重要前提，所以为了实现氨基酸大量生产，转运系统受到越来越多的关注。近几十年，在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中，人们鉴定了许多氨基酸转运出胞蛋白，并利用代谢工程将其用于提高氨基酸的产量，例如赖氨酸转运蛋白LysE，苏氨酸转运蛋白ThrE，半胱氨酸转运蛋白EamA，蛋氨酸转运蛋白BrnFE等，但是仅有报道苏氨酸转运蛋白ThrE可以转运丝氨酸。本发明在研究了一些转运蛋白基础上，发现NCgl0580序列具有转运L-丝氨酸功能，将其命名为SerE，进一步研究发现其属于谷氨酸棒杆菌中DMT(drug/metabolite transporter)家族的蛋白。采用基因工程手段，将serE基因在丝氨酸产生菌ΔSSA中敲除或过表达，敲除serE的重组菌L-丝氨酸的产量显著下降，而过表达serE的重组菌L-丝氨酸的产量有提高。
发明内容
本发明提供一种新型L-丝氨酸转运蛋白及其应用方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因敲除的方法。
步骤一，利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCC NO.8668)的基因组，如下：
SEQ:903bp
Figure BDA0001579267010000021
其氨基酸序列为：
Figure BDA0001579267010000022
步骤二，以ΔSSA的基因组作为模板，使用Takara公司的高保真酶，设计基因敲除特异的引物分别扩增目的基因上游序列和下游片段，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的同源臂片段
步骤三，将同源臂片段连接到谷氨酸棒杆菌敲除质粒pk18mobsacB，构建得到重组敲除质粒，并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素和10％蔗糖平板进行筛选，然后通过PCR验证，得到基因敲除的重组菌。
谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因过表达的方法。
步骤一，利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCC NO.8668)的基因组。
步骤二，以ΔSSA的基因组作为模板，使用Takara公司的高保真酶，以及基因特异的引物扩增得到基因片段。
步骤三，将目的基因片段与表达质粒连接，构建过表达重组质粒并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素筛选重组菌，并提取质粒进行验证，得到正确的重组菌。
谷氨酸棒杆菌发酵培养方法。
将谷氨酸棒杆菌接种至发酵培养基中发酵培养120h，定时取样检测生物量和氨基酸浓度。发酵培养基为(g/L):蔗糖100；硫酸铵30；碳酸钙60；MgSO4·7H2O 0.5；FeSO4·7H2O 0.02；MnSO4·H2O 0.02；原儿茶酸30mg；生物素50μg；硫胺素450μg；调节初始pH为7.0。
本发明的优点和有益效果：
转运在代谢工程改造菌株高产氨基酸过程中起重要的作用。迄今为止，发现谷氨酸棒杆菌中的多种氨基酸转运蛋白，但是目前仅有报道苏氨酸转运蛋白ThrE可以转运L-丝氨酸。本发明提供一种新型L-丝氨酸转运蛋白SerE，它具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，全长903个核苷酸，编码300个氨基酸。通过基因工程手段，将serE在高产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌ΔSSA实现过表达，能够提高L-丝氨酸的产量。这为代谢工程改造菌株提高L-丝氨酸产量提供了新思路。
附图说明
图1是thrE敲除和过表达重组菌发酵特性评价
A、重组菌ΔSSAΔthrE B、重组菌ΔSSA-thrE
图2是基因NCgl2065、NCgl2050敲除重组菌发酵特性评价
A、重组菌ΔSSAΔ2065 B、重组菌ΔSSAΔN2050
图3是敲除serE基因重组菌ΔSSAΔserE发酵特性评价
图4是过表达serE基因重组菌ΔSSA-serE发酵特性评价
具体实施方案
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不受这些实施例的限制。
实施例1
本实施例说明L-苏氨酸转运蛋白ThrE对ΔSSA产L-丝氨酸的影响。
ThrE是谷氨酸棒杆菌中L-苏氨酸的转运蛋白。因为L-苏氨酸和L-丝氨酸在化学结构上具有相似性，文献报道ThrE也有转运丝氨酸的作用。所以本实施例说明ThrE对ΔSSA产L-丝氨酸的影响。利用特异性引物thrE-1:5’-GCTCTAGACATCAATCTGGTCAACGAA；thrE-2:5’-GACATGGAGATGAGCTAAGAATGCGGCCACGAAGGGTC；thrE-3:5’-CTTAGCTCATCTCCATGTCTCAACCCATACCGTGCATT；thrE-4:5’-CCCAAGCTTATCATCCATATAAGATCCG，按照谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因敲除的方法实现thrE的敲除，构建重组菌ΔSSAΔthrE。利用特异性引物thrE-F：5’-GAAGATCTAGAAGGAGATATACCATGTTGAGTTTTGCGACCCT；thrE-R：5’-CCCAAGCTTTTACCTTTTATTACCGAATC按照谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因过表达的方法实现thrE的过表达，构建重组菌ΔSSA-thrE。
在以100g/L蔗糖为底物的发酵培养基中评价重组菌ΔSSAΔthrE、ΔSSA-thrE的发酵特性，用于说明其对ΔSSA产L-丝氨酸的影响。从图1A中可以看出，敲除L-苏氨酸的转运蛋白ThrE，对菌株生长和L-丝氨酸的产量未造成显著的影响；从图1B中可以发现，过表达ThrE后，L-丝氨酸产量并未提高，说明L-苏氨酸转运蛋白ThrE对于提高L-丝氨酸产量没有显著影响。
实施例2
本实施例说明其它DMT家族转运蛋白对ΔSSA产L-丝氨酸并没有影响。
DMT家族是一个药物/代谢物转运蛋白家族，转运的底物范围非常广，例如毒化合物和细胞代谢物，现今发现的很多氨基酸转运蛋白都是这个家族的成员。本实施例说明的是谷氨酸棒杆菌两个DMT家族成员NCgl2065、NCgl2050对ΔSSA产L-丝氨酸的影响。利用特异性引物2065-1：5’-CGGAATTCTGGTGAGGAAGCTGTTGCAT；2065-2：5’-AGACAGACATGTGGAGACCCACGCCGTTAACCACCATCA；2065-3：5’-GGTCTCCACATGTCTGTCTTCCTAGCGGTTTCCCACAC；2065-4：5’-CCCAAGCTTCCGAGGAGGGTAAGCCAGT以及2050-1：5’-CGGAATTCCTAGCTGGCCTTCGTACGAT；2050-2：5’-TGGACGAAGCCTAGACAACGCAATTACGCCGTAGATCAT；2050-3：5’-GTTGTCTAGGCTTCGTCCAGCGGTGGCGATCTATCTCACCG；2050-4：5’-GCTCTAGAGTGACATGCTCGGCCAAGAC，按照谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因敲除的方法分别实现NCgl2065和NCgl2050的敲除,构建敲除重组菌ΔSSAΔN2065和ΔSSAΔN2050。
在以100g/L蔗糖为底物的发酵培养基中评价重组菌ΔSSAΔN2065和ΔSSAΔN2050的发酵特性，用于说明其对ΔSSA产L-丝氨酸的影响。从图2中可以看出，分别敲除基因NCgl2065，NCgl2050后，对ΔSSA的生长和L-丝氨酸的产量未造成显著的影响。说明这两个DMT家族的成员并未参与L-丝氨酸的转运。
实施例3
本实施例说明敲除serE基因对ΔSSA产L-丝氨酸的影响。
SerE也是谷氨酸棒杆菌中DMT家族的成员。利用特异性引物serE-1:5’-TCCCCCGGGTTCGAGCGCTGCGGTGACT；serE-2:5’-GACATGGATACGGCGACTTTGCAGGGATAGGGCGGAAC；serE-3:5’-AAGTCGCCGTATCCATGTCGTGGGCCGCGATCATCCTT；serE-4:5’-GCTCTAGAATGTTCCTGTCATCGCTGG，按照谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因敲除的方法实现serE的敲除，构建重组菌ΔSSAΔserE。
在以100g/L蔗糖为底物的发酵培养基中评价重组菌ΔSSAΔserE的发酵特性，结果见图3。从图3中可以看出，敲除serE后，L-丝氨酸的产量却发生显著的下降。发酵120h，重组菌ΔSSAΔserE的L-丝氨酸积累量为11.30g/L，与出发菌株ΔSSA相比下降了56.5％，说明SerE是L-丝氨酸一个极其重要的转运蛋白。
实施例4
本实施例说明L-丝氨酸转运蛋白SerE在ΔSSA中的应用。
将L-丝氨酸转运蛋白运用于谷氨酸棒杆菌ΔSSA中，构建过表达serE的重组菌，为代谢工程改造ΔSSA提高L-丝氨酸产量提供新思路。为了实现SerE在ΔSSA中的过表达，在设计引物时，在起始密码子ATG前引入谷氨酸棒杆菌的核糖体结合位点及一定长度的间隔序列(见引物下划线部分)，以确保核糖体更好的结合，实现高效的翻译。特异性的引物如下serE-F:5’-CCCAAGCTTAGAAGGAGATATACCATGAATAAACAGTCCGC；serE-R:5’-CGGAATTCTTAACTAGGTGTGTGTACTC，按照谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因过表达的方法实现thrE的过表达，构建重组菌ΔSSA-serE。
在以100g/L蔗糖为底物的发酵培养基中评价重组菌ΔSSA-serE的发酵特性，结果见图4。从图4中可以看出，过表达serE后，L-丝氨酸积累量为28.67g/L，比出发菌株ΔSSA提高了10.5％，说明成功地将serE应用于提高L-丝氨酸产量。
本发明不限于这些公开的实施例，本发明将覆盖技术方案所描述的范围，以及权利要求范围的各种变形和等效变化，在不偏离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域技术人员容易实现的任何修改或改进均属于本发明所要求保护的范围。
<110> 江南大学
<120> 一种L-丝氨酸转运蛋白的应用方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 903
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
atgaataaac agtccgctgc agtgttgatg gtgatgggtt ccgccctatc cctgcaattt 60
ggtgctgcca ttggaacgca gcttttcccc ctcatcggcc cctgggctgt cacctcttta 120
aggctgttca tcgcaggctt gatcatgtgc ctggtgatcc gcccgcgact tcgttcctgg 180
actaaaaaac aatggatcgc cgtgctgctg ttgggattat ctcttggcgg aatgaacagc 240
ctgttttacg catccatcga actcatcccg ctgggcaccg ccgtgaccat tgagttcctc 300
ggccccctga ttttctccgc ggtgttagcc cgcacgctga aaaacggatt gtgcgtggct 360
ttagcgtttc tcggcatggc actgctgggt atcgattccc tcagcggcga aacccttgac 420
ccactcggcg tcattttcgc agccgtcgca ggaatcttct gggtgtgcta catcctggca 480
tcaaagaaaa tcggccaact catccccgga acaagtggcc tcgccgtcgc actgatcatc 540
ggcgcagtag cagtatttcc gctgggtgcc acacacatgg gcccgatttt ccagacccca 600
accctactca tcctggcgct tggcacagca cttctcgggt cgcttatccc ctattcgctg 660
gaattatcgg cactgcgccg actccccgcc cccattttca gcattctgct cagcctcgaa 720
ccggcattcg ccgccgccgt cggctggatc ctgcttgatc aaacccccac cgcgctcaag 780
tgggccgcga tcatccttgt catcgcggcc agcatcggcg tcacgtggga gcctaaaaag 840
atgcttgtcg acgcgcccct ccactcaaaa acgcaacgcg aagaggcgag tacacacacc 900
tag 903
<210> 2
<211> 300
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 2
Met Asn Lys Gln Ser Ala Ala Val Leu Met Val Met Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ser Leu Gln Phe Gly Ala Ala Ile Gly Thr Gln Leu Phe Pro Leu Ile
20 25 30
Gly Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Arg Leu Phe Ile Ala Gly Leu Ile
35 40 45
Met Cys Leu Val Ile Arg Pro Arg Leu Arg Ser Trp Thr Lys Lys Gln
50 55 60
Trp Ile Ala Val Leu Leu Leu Gly Leu Ser Leu Gly Gly Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Phe Tyr Ala Ser Ile Glu Leu Ile Pro Leu Gly Thr Ala Val Thr
85 90 95
Ile Glu Phe Leu Gly Pro Leu Ile Phe Ser Ala Val Leu Ala Arg Thr
100 105 110
Leu Lys Asn Gly Leu Cys Val Ala Leu Ala Phe Leu Gly Met Ala Leu
115 120 125
Leu Gly Ile Asp Ser Leu Ser Gly Glu Thr Leu Asp Pro Leu Gly Val
130 135 140
Ile Phe Ala Ala Val Ala Gly Ile Phe Trp Val Cys Tyr Ile Leu Ala
145 150 155 160
Ser Lys Lys Ile Gly Gln Leu Ile Pro Gly Thr Ser Gly Leu Ala Val
165 170 175
Ala Leu Ile Ile Gly Ala Val Ala Val Phe Pro Leu Gly Ala Thr His
180 185 190
Met Gly Pro Ile Phe Gln Thr Pro Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Gly
195 200 205
Thr Ala Leu Leu Gly Ser Leu Ile Pro Tyr Ser Leu Glu Leu Ser Ala
210 215 220
Leu Arg Arg Leu Pro Ala Pro Ile Phe Ser Ile Leu Leu Ser Leu Glu
225 230 235 240
Pro Ala Phe Ala Ala Ala Val Gly Trp Ile Leu Leu Asp Gln Thr Pro
245 250 255
Thr Ala Leu Lys Trp Ala Ala Ile Ile Leu Val Ile Ala Ala Ser Ile
260 265 270
Gly Val Thr Trp Glu Pro Lys Lys Met Leu Val Asp Ala Pro Leu His
275 280 285
Ser Lys Thr Gln Arg Glu Glu Ala Ser Thr His Thr
290 295 300

Claims (2)

1.一种L-丝氨酸转运蛋白在提高L-丝氨酸产量中的应用，其特征为，将L-丝氨酸转运蛋白SerE目的基因片段与表达质粒连接，构建过表达重组质粒并将其电转入宿主菌谷氨酸棒杆菌（ C.glutamicum ） ΔSSA感受态中；其中，所述的L-丝氨酸转运蛋白SerE目的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的谷氨酸棒杆菌ΔSSA的保藏编号为CGMCCNO.8668。
2.如权利要求1所述的应用，其特征为，所述表达质粒包括pXMJ19质粒，pDXW 系列，pET系列，pPICZ系列。
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