ES2529107T3 - Procedimiento para la producción por fermentación de L-aminoácidos mediando utilización de bacterias corineformes - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la producción por fermentación de L-aminoácidos, caracterizado por que se llevan a cabo las siguientes etapas: a) Cultivación de las bacterias corineformes recombinantes que producen el L-aminoácido deseado, en las que se presenta expresado por lo menos el polinucleótido heterólogo glpK, que codifica un polipéptido con la actividad de una glicerol cinasa, o sobreexpresado el polinucleótido endógeno glpK, en un medio que contiene glicerol o eventualmente de manera adicional una o varias fuentes de C en unas condiciones, en las que el deseado L-aminoácido se enriquece en el medio o en las células, y eventualmente b) aislamiento del L-aminoácido deseado, permaneciendo en el producto final eventualmente los componentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa en su totalidad o en porciones (desde > 0 hasta 100 %). realizándose que el polipéptido con la actividad de una glicerol cinasa, que es codificado por el polinucleótido heterólogo glpK, tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en por lo menos un 80 % a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16 y realizándose que el polipéptido con la actividad de una glicerol cinasa, que es codificado por el polinucleótido endógeno glpK, tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:38.

Description

Procedimiento para la producción por fermentación de L-aminoácidos mediando utilización de bacterias corineformes

Son objeto del invento unas bacterias corineformes recombinantes, en las cuales es(son) expresado(s) por lo menos uno o varios de los genes heterólogos del metabolismo del glicerol (en inglés "glycerol metabolism"), que se escoge(n) entre el conjunto que se compone de glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC, así como unos procedimientos para la producción por fermentación de L-aminoácidos, en particular de L-lisina y L-triptófano, conteniendo el medio glicerol como fuente de carbono, mediando utilización de estas bacterias. Estas bacterias muestran la capacidad para el aprovechamiento del glicerol y por consiguiente para la formación y el enriquecimiento eficaces de los L-aminoácidos.

Estado de la técnica

Unos compuestos químicos, por los que se entienden en particular los L-aminoácidos, las vitaminas, los nucleósidos y los nucleótidos, y los D-aminoácidos, encuentran uso en la medicina humana, en la industria farmacéutica, en la cosmética, en la industria alimentaria y en la nutrición de animales.

Numerosos de estos compuestos son producidos por fermentación de unas cepas de bacterias corineformes, en particular de Corynebacterium glutamicum. A causa de su gran importancia, se está trabajando constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de producción. Unos mejoramientos de los procedimientos pueden concernir a unas medidas técnicas de fermentación tales como p.ej. las de agitación y abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos, tal como p.ej. la concentración de azúcares durante la fermentación, o el tratamiento para dar la forma del producto mediante por ejemplo una cromatografía con intercambio de iones o las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho.

Para el mejoramiento de las propiedades de rendimiento de estas bacterias se usan unos métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen unas cepas que son resistentes frente a unos antimetabolitos tales como p.ej. el compuesto análogo a la lisina S-(2-amino-etil)-cisteína o el compuesto análogo al triptófano 5-fluoro-triptófano, o que son auxótrofas para unos metabolitos importantes para la regulación y que producen L-aminoácidos.

Desde hace algunos años se emplean asimismo unos métodos de la técnica de ADN recombinante para el mejoramiento de las cepas de Corynebacterium glutamicum que producen L-aminoácidos, mediante el recurso de que se amplifican unos genes individuales de la biosíntesis de aminoácidos, y se investiga la repercusión sobre la producción de L-aminoácidos. Una exposición recopilativa acerca de los más diversos aspectos de la genética, del metabolismo y de la biotecnología de Corynebacterium glutamicum se encuentra en la obra de Pühler (coordinador de edición jefe): Journal of Biotechnology 104 (1-3), 1-338 (2003) y en la obra "Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Manual de Corynebacterium glutamicum) de Eggeling y Bott (coordinadores de edición), CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton (2005)).

La totalidad de la industria de fermentación para la producción de L-aminoácidos utiliza como fuente de carbono hoy en día en la mayoría de los casos glucosa o sacarosa, que se obtienen en el caso de la elaboración de productos agrarios. Puesto que, sin embargo, está aumentando el precio de estas fuentes de carbono, es deseable una alternativa realizable tecnológicamente para la producción de los L-aminoácidos, de manera preferida de L-lisina y L-triptófano, el aprovechamiento de un material más barato como una materia prima alternativa para la fermentación.

El glicerol (propanotriol) es un componente natural de los aceites y las grasas, y une en forma de un "puente" a las moléculas de ácidos grasos en los triglicéridos. La molécula del glicerol es fuertemente polar y por lo tanto bien soluble en agua. Como producto de copulación o acoplamiento, esta valiosa materia prima resulta en el caso de la producción de un gasóleo biológico (= biodiesel) (p.ej. para el éster metílico de aceite de colza, RME) y se emplea en cosméticos, productos farmacéuticos, alimentos y para usos técnicos. Para el empleo del glicerol como una materia prima para la producción de componentes de piensos es decisiva la baratura. Se ha de partir del hecho de que con una producción creciente de gasóleo biológico, el glicerol se volverá interesante para la producción de aditivos para piensos.

El Corynebacterium glutamicum de tipo silvestre utiliza un gran número de azúcares monómeros y oligómeros tales como glucosa, sacarosa o maltosa como fuente de carbono (Vahjen y colaboradores, FEMS Microbiology Ecology [Microbiología eología] 18: 317-328 (1995)), pero no crece en glicerol como única fuente de carbono.

El Corynebacterium glutamicum de tipo silvestre dispone de algunos genes con una homología para genes conocidos del metabolismo del glicerol, pero hasta ahora no se pudo esclarecer porqué, a pesar de todo, no es posible el crecimiento en glicerol.

Misión del invento

Los autores del invento se han planteado la misión de poner a disposición unos nuevas bacterias corineformes, que estén en la situación de aprovechar el glicerol, a ser posible como la única fuente de carbono. Otra misión adicional, que está en conexión directa con este hecho,fue la de poner a disposición un procedimiento mejorado para la producción por fermentación de L-aminoácidos, en particular de L-lisina y L-triptófano, con ayuda de tales bacterias corineformes. En particular, de esta manera se debería hacer aprovechable al glicerol para una producción por fermentación de L-aminoácidos de un modo lo más rentable que sea posible.

Descripción del invento

Los problemas planteados por estas misiones, así como por otras misiones no mencionadas explícitamente, que se pueden descubrir o deducir sin problemas a partir de las conexiones discutidas en este contexto, son resueltos mediante un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1. Unas convenientes modificaciones y formas de realización del invento son puestas bajo protección en las reivindicaciones que se retrotraen a la reivindicación 1.

La descripción divulga unas bacterias corineformes recombinantes, que en particular ya segregan unos Laminoácidos, y en las cuales es(son) expresada(s) por lo menos una o varias de las secuencia(s) de nucleótidos que codifica(n) los productos génicos heterólogos del metabolismo del glicerol (en inglés "glycerol metabolism"), que se escoge(n) entre el conjunto que se compone de glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC. Estas bacterias muestran la capacidad para el aprovechamiento del glicerol.

A las bacterias utilizadas pertenecen en particular unas bacterias corineformes, en las cuales es expresado por lo menos un polinucleótido heterólogo, cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en por lo menos un 80 % o en por lo menos un 90 %, en particular en por lo menos un 95 %, de manera preferida en por lo menos un 98 %, de manera especialmente preferida en por lo menos un 99 % y de manera muy especialmente preferida en un 100 % con respecto a una secuencia de aminoácidos, que se escoge entre el conjunto que se compone de las SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, ID No. 34 y SEQ ID No. 36.

Las mencionadas bacterias contienen de manera preferida por lo menos un polinucleótido heterólogo, que se escoge entre el conjunto que se compone de:

a) Un polinucleótido con la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35 y unas secuencias de nucleótidos complementarias con éstas;

b) Un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos, que corresponde a la SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35 dentro del marco de la degeneración del código genético;

c) Una secuencia de polinucleótidos con una secuencia, que se hibrida con la secuencia complementaria a la secuencia SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35 en condiciones rigurosas, alcanzándose las condiciones rigurosas de manera preferida mediante una etapa de lavado, en la que la temperatura se extiende a lo largo de un intervalo de 64°C a 68°C y la concentración de sales del tampón se extiende a lo largo de un intervalo de 2xSSC hasta 0,1xSSC;

d) Un polinucleótido con una secuencia SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35, que contiene unas mutaciones con sentido de función neutra,

realizándose que los polinucleótidos codifican unas enzimas del metabolismo del glicerol.

La descripción divulga asimismo un procedimiento para la producción por fermentación de L-aminoácidos, en particular de L-lisina y L-triptófano, realizándose que el medio contiene glicerol como fuente de carbono, mediando utilización de unas bacterias corineformes recombinantes, que en particular ya producen L-aminoácidos, y en las que se expresa(n) por lo menos uno o varios de los genes heterólogos del metabolismo del glicerol, que se escoge(n) entre el conjunto que se compone de glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC o de unas secuencias de nucleótidos, que codifican los productos génicos de éstos.

De manera preferida, se emplean las bacterias divulgadas en la descripción.

Cuando en lo sucesivo se mencionan unos L-aminoácidos o aminoácidos, por este concepto se entiende(n) uno o varios de los aminoácidos proteinógenos, inclusive sus sales, escogidos entre el conjunto formado por el L-ácido aspártico, la L-asparagina, la L-treonina, la L-serina, el L-ácido glutámico, la L-glutamina, la L-glicina, la L-alanina, la L-cisteína, la L-valina, la L-metionina, la L-isoleucina, la L-leucina, la L-tirosina, la L-fenilalanina, la L-histidina, la L-lisina, el L-triptófano, la L-arginina y la L-prolina. Se prefieren especialmente la L-lisina y el L-triptófano. Entre los L-aminoácidos se cuenta también la L-homoserina.

Por el concepto de "aminoácidos proteinógenos" se entienden los aminoácidos que se presentan en proteínas naturales, es decir en proteínas de microorganismos, plantas, animales y seres humanos.

Cuando en lo sucesivo se mencionan unos aminoácidos, este concepto abarca también a sus sales tales como, por ejemplo, el monohidrocloruro de lisina o el sulfato de lisina en el caso del aminoácido L-lisina.

Los "genes heterólogos" o las "secuencias heterólogas de nucleótidos" pueden proceder de cualquier organismo donante procariótico, con la excepción de los representantes del género Corynebacterium. De manera preferida se emplean los genes procedentes de Escherichia coli.

El concepto de "expresión de genes heterólogos" describe en esta conexión la clonación de unos correspondientes genes y su expresión en el sistema heterólogo, lo que conduce a un establecimiento de la actividad intracelular o de la concentración de una o varias enzimas o proteínas en un microorganismo, que es(son) codificada(s) por el correspondiente ADN, mediante el recurso de que se produce por ejemplo un vector, que contiene el gen deseado o un alelo de este gen y un promotor que hace posible la expresión del gen, y se transfiere al microorganismo mediante una transformación, transducción o conjugación, y eventualmente se combinan estas medidas técnicas.

Por el concepto de "alelos" se entienden unas formas alternativas de un determinado gen. Las formas se distinguen por unas diferencias en la secuencia de nucleótidos.

Por el concepto de "producto génico" se designa a la proteína que es codificada por una secuencia de nucleótidos, es decir una proteína que es codificada por un gen o por un alelo, o al ácido ribonucleico codificado.

Es un objeto de este invento un procedimiento para la producción por fermentación de L-aminoácidos, caracterizado por que se llevan a cabo las siguientes etapas:

a) Cultivación de las bacterias corineformes recombinantes que producen el L-aminoácido deseado, en las que se presenta expresado el polinucleótido heterólogo glpK o sobreexpresado el polinucleótido endógeno glpK, en un medio que contiene glicerol o eventualmente de manera adicional una o varias otras fuentes de C, en unas condiciones, en las que el deseado L-aminoácido se enriquece en el medio o en las células, y eventualmente

b) aislamiento del L-aminoácido deseado, permaneciendo en el producto final eventualmente los componentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa en su totalidad o en porciones (desde > 0 hasta 100 %),

realizándose que el polipéptido con la actividad de una glicerol cinasa, que es codificado por el polinucleótido heterólogo glpK, tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en por lo menos un 80 % a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16

y realizándose que el polipéptido con la actividad de una glicerol cinasa, que es codificado por el polinucleótido endógeno glpK, tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:38.

Las bacterias corineformes empleadas producen unos L-aminoácidos, en particular la L-lisina y el L-triptófano, de manera preferida ya antes de la expresión de uno o varios de los genes del metabolismo del glicerol en las habituales fuentes de carbono tales como por ejemplo glucosa o sacarosa. El glicerol empleado se puede utilizar individualmente o como una mezcla, debiendo de ser la proporción del glicerol de manera preferida de ≥ 10 a 100 %.

Se encontró que las bacterias corineformes, después de una expresión heteróloga de uno o varios de los genes del metabolismo del glicerol producen unos L-aminoácidos, en particular la L-lisina y el L-triptófano, a partir del glicerol como la única fuente de carbono.

Las bacterias recombinantes conformes al invento son producidas por ejemplo mediante una transformación, transducción o conjugación, o una combinación de estos métodos, con un vector, que contiene el gen deseado, un alelo de este gen o unas partes de éste, y un promotor que hace posible la expresión del gen. La expresión heteróloga se consigue en particular mediante una integración del gen o de los alelos en el cromosoma de los microorganismos o en un vector que replica fuera del cromosoma (extracromosomalmente).

En el caso del promotor se puede tratar de la propia secuencia reguladora, que se encuentra situada corriente arriba del gen, o se fusiona con el gen a un promotor procedente de bacterias corineformes. Una recopilación acerca de unos promotores conocidos de Corynebacterium glutamicum ha sido descrita por Pátek y colaboradores (Journal of Biotechnology 104, 311-323 (2003)).

Las bacterias, en las que se llevan a cabo las medidas técnicas del invento y que por consiguiente constituyen el punto de partida del presente invento, pueden producir aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, una melaza, un almidón, una celulosa o a partior de etanol. Se trata de unos representantes de bacterias corineformes.

En el caso de las bacterias corineformes, se prefiere el género Corynebacterium. Se prefieren especialmente unas cepas que segregan aminoácidos, que se basan en las siguientes especies:

Corynebacterium efficiens tal como, por ejemplo, la cepa DSM44549,

Corynebacterium glutamicum tal como, por ejemplo, la cepa ATCC13032,

Corynebacterium thermoaminogenes tal como, por ejemplo, la cepa FERM BP-1539, y

Corynebacterium ammoniagenes tal como, por ejemplo, la cepa ATCC6871,

siendo muy especialmente preferida la especie Corynebacterium glutamicum.

Algunos representantes de la especie Corynebacterium glutamicum son conocidos en el estado de la técnica también por otras denominaciones de especies. A éstos pertenecen, por ejemplo:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium lilium DSM20137 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC14020

Unos conocidos representantes de cepas de bacterias corineformes, que segregan un aminoácido, son por ejemplo:

las cepas que producen L-lisina

Corynebacterium glutamicum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) que se ha descrito en el documento EP 0 358 940 Corynebacterium glutamicum MH20 (= DSM5714) que se ha descrito en el documento EP 0 435 132 Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= FermBP-7382) que se ha descrito en el documento EP 1 108 790 Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP3304) que se ha descrito en el documento de patente de los EE.UU. US 5.250.423

o las cepas que producen L-triptófano

Corynebacterium glutamicum K76 (=FermBP-1847) que se ha descrito en el documento US 5.563.052 Corynebacterium glutamicum BPS13 (= FermBP-1777) que se ha descrito en el documento US 5.605.818 Corynebacterium glutamicum FermBP-3055 que se ha descrito en el documento US 5.235.940.

Se encuentran datos acerca de la clasificación taxonómica de las cepas de este conjunto de bacterias, entre otros lugares, en las citas de Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983), Kämpfer y Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl y colaboradores (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991) y en el documento US-A-5.250.434.

Unas cepas con la denominación "ATCC" se pueden adquirir de la American Type Culture Collection (Colección americana de cultivos tipos) (Manassas, VA, EE.UU.). Unas cepas con la denominación "DSM" se pueden adquirir de la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares) (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Unas cepas con la denominación "FERM" se pueden adquirir del National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Instituto nacional de ciencia y tecnología industrial

avanzada (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japón). La mencionada cepa de Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539) se describe en el documento US-A 5.250.434.

Las secuencias de nucleótidos de los genes o los marcos abiertos de lectura (ORF) de Escherichia coli pertenecen al estado de la técnica y pueden ser tomadas de la secuencia genómica de Escherichia coli que ha sido publicada por Blattner y colaboradores (Science 277: 1453-1462 (1997)).

A partir de las Salmonella typhimurium (n° de acceso: NC 003197 (secuencia del genoma total)) y Shigella flexneri, (n° de acceso: NC 004337 (secuencia del genoma total), que pertenecen asimismo a la familia de las enterobacteriáceas, se conoce ejemplificativamente asimismo la secuencia de nucleótidos para los genes glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT und glpX. Por lo demás, a partir de las Salmonella typhimurium (n° de acceso: NC 003197 (secuencia del genoma total) se conoce la secuencia de nucleótidos para los genes gldA y talC y a partir de las Shigella flexneri, (n° de acceso: NC 004337 (secuencia del genoma total), se conoce la secuencia de nucleótidos para los genes dhaK, dhaL, dhaM, dhaR y fsa.

Los genes y las actividades del metabolismo del glicerol se han descrito a modo de recopilación también en la cita bibliográfica de Lin (en: Neidhardt (coordinador de edición), Escherichia coli und Salmonella [Escherichia coli y Salmonella], American Society for Microbiology [Sociedad americana de microbiología], Washington, D.C., EE.UU.: 307-342 (1996)).

El regulón de glicerofosfato (glp), que contiene los genes para el transporte y el metabolismo del glicerol, se compone de cinco operones, que están situados en tres sitios génicos diferentes en el cromosoma de E. coli (Cozzarelli y colaboradores, Journal of Molecular Biology [Revista de biología molecular] 31: 371-387 (1968)).

Un regulón es una unidad de genes, que ciertamente están localizados en diferentes sitios de un genoma, pero cuya expresión es controlada por las mismas proteínas reguladoras. Un operón es una unidad de genes regulados en común en un sitio del gen.

En la posición 88 min se encuentra el operón glpFKX (Cozzarelli y Lin, Journal of Bacteriology [Revista de bacteriología] 91: 1763-1766 (1966); Weissenborn y colaboradores, Journal of Biological Chemistry [Revista de química biológica] 267: 6122-6131 (1992)), que codifica el facilitador de glicerol GlpF y la glicerol cinasa GlpK y una fructosa-1,6 bisfosfatasa II GlpX (Donahue y colaboradores Journal of Bacteriology 182(19) 5624-5627 (2000)). En el operón cartografiado en 49 min se encuentran reunidos los genes glpT (de la glicerol-3-fosfato permeasa) y glpQ (de la glicerol fosfodiesterasa periplasmática), que son transcritos en el sentido contrario al de las agujas de un reloj. En un sentido opuesto a éste está dispuesto el operón glpABC, cuyos genes codifican las tres subunidades de la sn-glicerol-3-fosfato deshidrogenasa heterotrimérica, que es activa mediando exclusión del oxígeno del aire (en condiciones anaerobias) (Cole y colaboradores, Journal of Bacteriology 170: 2448-2456 (1988); Ehrmann y colaboradores, Journal of Bacteriology 169: 526-532 (1987)). En la posición 75 min en el cromosoma está situado el operón glpDEG, que codifica la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa GlpD, que es activa en presencia del oxígeno del aire (en condiciones aerobias) (Cozzarelli y colaboradores, Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968)), la azufre transferasa GlpE (Cozzarelli y colaboradores, Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968)) y el gen glpG, que tiene una función desconocida (Zeng y colaboradores, Journal of Bacteriology 178: 7080-7089 (1996).

Una breve recopilación acerca de los genes y las actividades del metabolismo del glicerol la proporciona la siguiente enumeración;

Gen glpA: Denominación: Subunidad grande de la sn-glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (anaerobia) Función: En el medio anaerobio, el glicerol-3-fosfato es oxidado para la obtención de energía por una

glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GlpABC) dependiente de FAD para dar el fosfato de dihidroxiacetona, que puede pasar a formar parte en la glicólisis como un compuesto intermedio. Los equivalentes de reducción, que se ponen en libertad en el caso de esta reacción de oxidación, son transferidos por la flavoenzima a un complejo de citocromo que está asociado con una membrana, sirviendo el fumarato o nitrato como un aceptor terminal de electrones (Lin, en: Neidhardt (coordinador de edición), Escherichia coli und Salmonella, American Society or Microbiology, Washington, D.C., USA: 307-342 (1996)). Mientras que los electrones se hacen pasar por el complejo de citocromo, la energía que se pone en libertad es aprovechada para bombear protones a través de la membrana desde el lado citoplasmático hasta el lado periplasmático. Con el gradiente de protones que se ha generado junto a la membrana se modifica el potencial tanto eléctrico como también químico, con lo cual se propulsa a la ATPasa fijada a la membrana y de esta manera se puede producir el ATP.

N° DE EC: 1.1.99.5 Referencia. Blattner y colaboradores; Science 277 (5.331): 1453-1474 (1997) SEQ ID No.: 1 N° de acceso: U00096 (región: 2350669-2352297) Nombre alternativo del gen: b2241

Gen glpB:

Denominación: Subunidad para el anclaje a una membrana (en inglés "membrane anchor”) de la sn-glicerol-3fosfato deshidrogenasa (anaerobia)

Función: véase la del glpA

N° DE EC: 1.1.99.5

Referencia: Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.: 3

N° de acceso: U00096 (región: 2352287-2353546)

Nombre alternativo del gen: b2242

Gen glpC: Denominación: Subunidad pequeña de la sn-glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (anaerobia) Función: véase la del glpA N° DE EC: 1.1.99.5 Referencia: Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997) SEQ ID No.: 5 N° de acceso: U00096 (región: 2353543-2354733) Nombre alternativo del gen: b2243

Gen glpD:

Denominación: Glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (aerobia)

Función: La GlpD fue identificada como una glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa aerobia (Cozzarelli y colaboradores, Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968). En el medio aerobio, con el fin de obtener energía, el glicerol-3-fosfato es oxidado por esta glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GlpD) dependiente de FAD para dar el fosfato de dihidroxiacetona, que puede pasar a formar parte de la glicolisis como un compuesto intermedio. Los equivalentes de oxidación, que se ponen en libertad en el caso de esta reacción de reducción, son transferidos por la flavoenzima a un complejo de citocromo que está asociado con una membrana, sirviendo el oxígeno molecular o respectivamente el nitrato como un aceptor terminal de electrones (Lin, en: Neidhardt (coordinador de edición), Escherichia coli und Salmonella, American Society for Microbiology, Washington, D.C., EE.UU.: 307-342 (1996)). Mientras que los electrones se hacen pasar por el complejo de citocromo, la energía que se pone en libertad es aprovechada para bombear protones a través de la membrana desde el lado citoplasmático hasta el lado periplasmático. Con el gradiente de protones que se ha generado junto a la membrana se modifica el potencial tanto eléctrico como químico, con lo cual se propulsa a la ATPasa fijada a la membrana y de esta manera se puede producir el ATP. El marco abierto de lectura del gen glpD se compone de 501 codones y la secuencia traducida codifica una proteína con un peso molecular de 57 kDa (Austin y Larson, Journal of Bacteriology 173: 101-107 (1991)).

N° DE EC: 1.1.99.5

Referencia: Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.: 7

N° de acceso: U00096 (región: 3560036-3561541)

Nombres alternativos del gen: b3426, glyD

Gen glpE:

Denominación: Azufre transferasa; una rodanasa citoplasmática, de carácter ácido

Función: La GlpE fue identificada como una azufre transferasa (Cozzarelli y colaboradores, Journal of Molecular Biology 31: 371-387 (1968)). La rodanasa citoplasmática, de carácter ácido, que es codificada por el gen glpE, y que tiene un peso molecular de 12 kDa, cataliza como un dímero la transferencia de azufre al aceptor de la azufre tiorredoxina 1 ((Ray y colaboradores, Journal of Bacteriology 182: 2277-2284 (2000)).

N° DE EC: 2.8.1.1

Referencia. Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.: 9

N° de acceso: U00096 (región: 3559520-3559846)

Nombre alternativo del gen: b3425

Gen glpF:

Denominación: Facilitador del glicerol GlpF

Función: La difusión facilitada del glicerol desde del medio nutritivo es catalizada por el facilitador de glicerol GlpF (Borgnia y Agre, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 2888-2893 (2001)), que forma un canal específico para un substrato con un tamaño de poros de 0,4 nm (Heller y colaboradores, Journal of Bacteriology 144: 274-278 (1980)).

N° DE EC: -

Referencia. Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997) 7

SEQ ID NO: 11 N° de acceso: U00096 (región: 4115268-4116113) Nombre alternativo del gen: b3927

Gen glpG:

Denominación: Gen del regulón de glp

Función: La función fisiológica del glpG es todavía desconocida. El producto génico de glpG es una proteína citoplasmática o asociada a una membrana, de carácter básico, que tiene un peso molecular de 28 kDa (Zeng y colaboradores, Journal of Bacteriology 178: 7080-7089 (1996)).

N° DE EC: -

Referencia. Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.: 13

N° de acceso: U00096 (región: 3558645-3559475)

Nombre alternativo del gen: b3424

Gen glpK:

Denominación: Glicerol cinasa GlpK (dependiente de ATP)

Función: El glicerol citoplasmático es fosforilado inmediatamente por la glicerol cinasa K dependiente de ATP, que se presenta asociada con el facilitador de glicerol GlpF en su forma enzimáticamente activa (Voegele y colaboradores, Journal of Bacteriology 175: 1087-1094 (1993)).

N° DE EC: 2.7.1.30

Referencia. Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.: 15

N° de acceso: U00096 (región: 4113737-4115245)

Nombre alternativo del gen: b3926

Gen glpQ:

Denominación: Glicerol fosfodiesterasa

Función: Los diésteres de glicerol-fosfatos, que son los productos desacetilados de la degradación de los fosfolípidos (Lin, en: Neidhardt (coordinador de edición), Escherichia coli und Salmonella, American Society for Microbiology, Washington, D.C., USA: 307-342 (1996)) son hidrolizados en el periplasma por la fosfodiesterasa GlpQ, que está localizada allí, para dar un alcohol (etanol) y el glicerol-3-fosfato (Larson y colaboradores, Journal of Biological Chemistry 258: 5428-5432 (1983)). Puesto que a la glicerol fosfodiesterasa se le atribuye por consiguiente un modo de acción extracitoplasmático, el producto génico que se deriva del gen glpQ heterólogo debe de abarcar un péptido director (leader) en las bacterias reivindicadas, tal como el que es típico para las proteínas excretadas de bacterias gram positivas (Nielsen y colaboradores, Protein Engineering Design and Selection 10:1-6 (1997)). Esta secuencia de señal característica hace posible una exportación mediada por el aparato de secreción general (el sistema Sec) de la proteína GlpQ a través de la membrana citoplasmática (KeIl und Young, Current opinion in microbiology 3:238-243 (2000); Mukamolova y colaboradores, Molecular Microbiology 46:611-621 (2002a); Molecular Microbiology 46:613-635 (2002b)).

N° DE EC: 3.1.4.46

Referencia. Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.: 17

N° de acceso: U00096 (región: 2347957-2349033)

Nombre alternativo del gen: b2239

Gen glpT:

Denominación: Glicerol-3-fosfato permeasa

Función: El glicerol-3-fosfato es transportado al interior de la célula por la permeasa GlpT (Eiglmeier y colaboradores, Molecular Microbiology 1: 251-258 (1987); Larson y colaboradores, Journal of Bacteriology 152: 1008-1021 (1982)) en el intercambio por un fosfato inorgánico (Auer y colaboradores, Biochemistry 40: 6628-6635 (2001)). La energía requerida para el transporte es puesta a disposición por este antiporte y al mismo tiempo se impide una acumulación del fosfato, que actúa tóxicamente (Xavier y colaboradores, Journal of Bacteriology 177: 699-704 (1995)).

N° DE EC: -

Referencia. Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.: 19

N° de acceso: U00096 (región: 2349038-2350396)

Nombre alternativo del gen: b2240

Gen glpX:

Denominación: Fructosa-1,6-bisfosfatasa II

Función: Hasta ahora no se pudo encontrar ningún cometido fisiológico de la enzima GlpX. Una mutación en el fbp, que es el gen para la fructosa-1,6-bisfosfatasa I, no pudo ser complementada por la 8

GlpX. Sin embargo, parece ser segura a pesar de todo una importancia funcional, puesto que unos mutantes, que son trastornados en la glicolisis debido a una mutación en el pfkA (el gen de la fosfofructo cinasa A), crecen muchísimo más lentamente sin la GlpX (Donahue y colaboradores; Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627 (2000)).

N° DE EC: 3.1.3.11

Referencia. Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.: 21

N° de acceso: U00096 (región: 4112592-4113602)

Nombre alternativo del gen: 3925

Junto a los genes del transporte y del metabolismo del glicerol, pueden ser expresados heteròlogamente los siguientes genes de la degradación de diversos productos intermedios y finales de dicho metabolismo.

Gen gldA:

Denominación: Glicerol deshidrogenasa (NAD)

Función: La glicerol deshidrogenasa cataliza la reacción reversible, dependiente de NAD, del glicerol para dar la dihidroxiacetona (Truniger y Boos, Journal of Bacteriology 176(6): 1796-1800 (1994))

N° DE EC: 1.1.1.6

Referencia. Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.: 23

N° de acceso: U00096 (región: 4135955-4137097)

Nombre alternativo del gen: b3945

Gen dhaK:

Denominación: Subunidad de la dihidroxiacetona cinasa, dominio situado en el extremo terminal de N

Función: La dihidroxiacetona cinasa cataliza, en su función como una dihidroxiacetona fosfotransferasa dependiente del fosfoenol-piruvato (PEP), la reacción de la dihidroxiacetona para dar el fosfato de dihidroxiacetona (Gutknecht y colaboradores, The EMBO Journal 20(10): 2480-2486 (2001)). La DhaK lleva el sitio de fijación de la dihidroxiacetona.

N° DE EC: 2.7.1.29

Referencia. Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.: 25

N° de acceso: U00096 (región: 1248991-1250091)

Nombres alternativos del gen: dhaK1, ycgT, b1200

Gen dhaL:

Denominación: Subunidad de la dihidroxiacetona cinasa, dominio situado en el extremo terminal de C

Función: La dihidroxiacetona cinasa cataliza, en su función como una dihidroxiacetona fosfotransferasa dependiente del PEP, la reacción de la dihidroxiacetona para dar el fosfato de dihidroxiacetona (Gutknecht y colaboradores, The EMBO Journal 20(10): 2480-2486 (2001)). La DhaL lleva ADP como un cofactor para la transferencia de fosfato desde la DhaM hasta la dihidroxiacetona.

N° DE EC: 2.7.1.29

Referencia. Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID NO: 27

N° de acceso: U00096 (región: 1248348-1248980)

Nombres alternativos del gen: dhaK2, ycgS, b1199

Gen dhaM:

Denominación: Subunidad de la proteína PTS de la dihidroxiacetona cinasa, una proteína de transferencia multifosforilada

Función: La dihidroxiacetona cinasa cataliza, en su función como una dihidroxiacetona fosfotransferasa dependiente del PEP, la reacción de la dihidroxiacetona para dar el fosfato de dihidroxiacetona (Gutknecht y colaboradores, The EMBO Journal 20(10): 2480-2486 (2001)). La DhaM se compone de tres dominios que tienen una similaridad con los tres dominios del sistema de la fosfotransferasa dependiente del fosfoenolpiruvato. La DhaM fosforilada transfiere el fosfato al ADP que está unido a la DhaL.

N° DE EC: 2.7.1.29

Referencia. Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997)

SEQ ID No.: 29

N° de acceso: U00096 (región: 1246919-1248340)

Nombres alternativos del gen: dhaH, ycgC, b1198

Gen dhaR:

Denominación: Activador del operón de dha (dhaKLM)

Función: Un activador transcripcional, que estimula la transcripción del operón de dha de un promotor sigma70 (Bachler y colaboradores, The EMBO Journal 24 (2): 283-293 (2005)) 9

N° DE EC: - Referencia: Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997) SEQ ID No.: 31 N° de acceso: U00096 (región: 1250280-1252208)

5 Nombres alternativos del gen: ycgU, b1201

Gen fsa: Denominación: Fructosa-6-fosfato aldolasa I Función: La fructosa-6-fosfato aldolasa I cataliza un desdoblamiento aldólico del fructosa-6-fosfato, los

10 substratos de la enzima son la dihidroxiacetona así como el fructosa-6-fosfato y el glicerolaldehído3-fosfato, no es aprovechadan la fructosa, el fructosa-1-fosfato, el fructosa-1,6-bisfosfato ni el dihidroxiacetona-fosfato (Schurmann y Sprenger, Journal of Biological Chemistry 276 (14): 1105511061 (2001))

N° DE EC: 4.1.2.

15 Referencia. Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997) SEQ ID No.: 33 N° de acceso: U00096 (región: 862793-863527) Nombres alternativos del gen: mipB, ybiZ, B0825

20 Gen talC: Denominación: Fructosa-6-fosfato aldolasa II Función: La fructosa-6-fosfato aldolasa II cataliza un desdoblamiento aldólico del fructosa-6-fosfato

(Schurmann und Sprenger, Journal of Biological Chemistry 276 (14): 11055-11061 (2001)). El gen talC está situado directamente junto al gen gldA.

25 N° DE EC: 4.1.2.-Referencia. Blattner y colaboradores; Science 277 (5331): 1453-1474 (1997) SEQ ID No.: 35 N° de acceso: U00096 (región: 4137069-4137731) Nombres alternativos del gen: fsaB, yijG, b3946

30 Las secuencias de ácidos nucleicos se pueden tomar de los bancos de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD, EE.UU.), del banco de datos de secuencias de nucleótidos de los European Molecular Biology Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemania o respectivamente Cambridge, Reino Unido) o del banco de datos de ADN del Japón (DDBJ, Mishima, Japón).

35 Para una mejor claridad de comprensión, las secuencias conocidas para los genes tratados de Escherichia coli se han representado bajo las SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 35.

40 Los marcos de lectura abiertos que se han descrito en las citas bibliográficas indicadas pueden ser utilizados conforme al invento. Además, se pueden utilizar unos alelos de los genes o unos marcos de lectura abiertos, que resultan a partir de la degenerabilidad del código genético o por mutaciones con sentido, que son neutras en su función (en inglés "sense mutations").

45 Entre los alelos de los genes tratados, que contienen unas mutaciones con sentido, que son neutras en su función, se cuentan, entre otros, los que conducen a lo sumo a 13 o a lo sumo a 10, de manera preferida a lo sumo a 7 o a lo sumo a 5, de manera especialmente preferida a lo sumo a 3 o a lo sumo a 2 o a por lo menos un intercambio(s) conservativo(s) de aminoácidos en la proteína codificada por ellos.

50 En el caso de los aminoácidos aromáticos se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian unos/as por otros/as la fenilalanina, el triptófano y la tirosina. En el caso de los aminoácidos hidrófobos se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian unas por otras la leucina, la isoleucina y la valina. En el caso de los aminoácidos polares se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian una por otra la glutamina y

55 la asparagina. En el caso de los aminoácidos de carácter básico se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian unas por otras la arginina, la lisina y la histidina. En el caso de los aminoácidos de carácter ácido se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian uno por otro el ácido aspártico y el ácido glutámico. En el caso de los aminoácidos que contienen grupos hidroxilo se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian una por otra la serina y la treonina.

60 De igual manera, se pueden utilizar también aquellas secuencias de nucleótidos, que codifican unas variantes de las mencionadas proteínas, que contienen adicionalmente, junto al extremo terminal de N o C, una prolongación o un acortamiento en por lo menos un (1) aminoácido. Esta prolongación o este acortamiento es de no más que 13, 10, 7, 5, 3 o 2 aminoácidos o radicales de aminoácidos.

Es conocido el hecho de que por medio de unas enzimas propias del anfitrión, las denominadas aminopeptidasas, se puede disociar la metionina situada en un extremo en el caso de la síntesis de proteínas.

Entre los alelos adecuados se cuentan también aquellos que codifican unas proteínas, en las que se ha introducido (por inserción) o suprimido (por deleción) por lo menos un (1) aminoácido. El número máximo de tales modificaciones denominadas como “indels” puede ser de 2, 3, 4, 5, pero en ningún caso de más que 6 aminoácidos.

Entre los alelos adecuados se cuentan además los que son obtenibles mediante una hibridación, en particular en condiciones rigurosas, mediando utilización de las SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35 o de partes de éstas, en particular de las regiones codificadoras o respectivamente de las secuencias complementarias a éstas.

Un experto en la especialidad puede encontrar instrucciones para la identificación de secuencias de ADN mediante una hibridación, entre otros lugares, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization (Guía para los usuarios del sistema DIG para la hibridación en filtros)" de la entidad Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en la cita de Liebl y colaboradores (International Journal of Systematic Bacteriology [Revista internacional de bacteriología sistemática] 41: 255-260 (1991)). La hibridación tiene lugar en condiciones rigurosas, es decir que se forman solamente unos híbridos, en los que la sonda y la secuencia diana, es decir los polinucleótidos tratados con la sonda, son idénticas/os en por lo menos un 70 %. Es conocido que la rigurosidad de la hibridación, inclusive las etapas de lavado, es influida o respectivamente determinada por una variación de la composición de los tampones, de la temperatura y de la concentración de las sales. La reacción de hibridación se lleva a cabo por lo general con una rigurosidad relativamente baja en comparación con las etapas de lavado (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Reino Unido, 1996).

Para la reacción de hibridación se puede emplear, por ejemplo, un tampón correspondiente al tampón 5x SSC a una temperatura de aproximadamente 50°C -68°C. En este caso, también se pueden hibridar unas sondas con unos polinucleótidos, que tienen una identidad de menos que un 70 % con respecto a la secuencia de la sonda. Tales híbridos son menos estables y son eliminados mediante un lavado en condiciones rigurosas. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante una disminución de la concentración de las sales hasta 2x SSC y eventualmente a continuación hasta 0,5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995), ajustándose una temperatura de aproximadamente 50°C -68°C, aproximadamente 52°C -68°C, aproximadamente 54°C -68°C, aproximadamente 56°C -68°C, aproximadamente 58°C -68°C, aproximadamente 60°C -68°C, aproximadamente 62°C -68°C, aproximadamente 64°C -68°C o aproximadamente 66°C -68°C. Se prefieren unos intervalos de temperatura de aproximadamente 64°C -68°C, o aproximadamente 66°C -68°C. Eventualmente, es posible disminuir la concentración de las sales hasta una concentración correspondiente a 0,2x SSC o a 0,1x SSC. Mediante un aumento escalonado de la temperatura de hibridación en unos escalones de aproximadamente 1 -2°C desde 50°C hasta 68°C se pueden aislar unos fragmentos de polinucleótidos, que poseen una identidad de por ejemplo por lo menos un 70 % o de por lo menos un 80 % o de por lo menos un 90 %, por lo menos un 91 %, por lo menos un 92 %, por lo menos un 93 %, por lo menos un 94 %, por lo menos un 95 %, por lo menos un 96 %, por lo menos un 97 %, por lo menos un 98 % o por lo menos un 99 % con respecto a la secuencia de la sonda empleada o respectivamente a las secuencias de nucleótidos que se representan en las SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35. Otras instrucciones adicionales para la hibridación son obtenibles en el comercio en forma de los denominados estuches (p.ej. el DIG Easy Hyb de la entidad Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, n° de catálogo 1603558).

También se pueden emplear unos polinucleótidos de Bacillus subtilis (n° de acceso: NC 000964 (secuencia del genoma total)) y de Streptomyces coelicolor (n° de acceso: NC 003888 (secuencia del genoma total)), que poseen por ejemplo una identidad de por lo menos un 70 % o de por lo menos un 80 % o de por lo menos un 90 %, por lo menos un 91 %, por lo menos un 92 %, por lo menos un 93 %, por lo menos un 94 %, por lo menos un 95 %, por lo menos un 96 %, por lo menos un 97 %, por lo menos un 98 % o por lo menos un 99 % con respecto a las secuencias de nucleótidos que se representan en las SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 o SEQ ID No. 35 y que tienen las funciones descritas. Las secuencias de nucleótidos de los genes y de los ORFs, que se conocen a partir de los proyectos de genomas, pertenecen al estado de la técnica y se pueden deducir de diversas publicaciones, solicitudes de patentes así como del banco de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD, EE.UU.).

La expresión de los genes del metabolismo del glicerol se puede detectar en el gel con ayuda de una separación de proteínas en un gel uni-o bidimensional (de 1 y 2 dimensiones) y de una subsiguiente identificación óptica de la concentración de proteínas con un correspondiente software (programa lógico) de evaluación. Un método habitual para la preparación de los geles para proteínas en el caso de bacterias corineformes y para la identificación de las proteínas lo constituye el modo de proceder descrito por Hermann y colaboradores (Electrophoresis [Electroforesis],

22:1712-23 (2001). La concentración de las proteínas se puede determinar asimismo mediante una hibridación por transferencia de borrón Western con un anticuerpo específico para la proteína que se ha de detectar (Sambrook y colaboradores, Molecular cloning: a laboratory manual [Clonación molecular. Un manual de laboratorio]. 2a edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) y una subsiguiente evaluación óptica con un correspondiente software para la determinación de la concentración (Lohaus y Meyer (1998) Biospektrum [Espectro biológico] 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie [Química aplicada] 111: 2630-2647 (1999)). La actividad de las proteínas que fijan al ADN se puede determinar mediante un ensayo de desplazamiento de banda de ADN ([en inglés "DNA-Band-Shift-Assay"], también designado como retardación en el gel) (Wilson y colaboradores (2001) Journal of Bacteriology 183:2151-2155). El efecto de unas proteínas que fijan al ADN sobre la expresión de otros genes se puede detectar mediante diversos métodos bien descritos del ensayo del gen reportero (Sambrook y colaboradores, Molecular cloning: a laboratory manual. 2a edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.,1989). Las actividades enzimáticas intracelulares se pueden determinar según diversos métodos que han sido descritos (Donahue y colaboradores (2000) Journal of Bacteriology 182(19): 5624-5627; Ray y colaboradores (2000) Journal of Bacteriology 182(8): 2277-2284; Freedberg y colaboradores (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823).

Los genes heterólogos son expresados por ejemplo con ayuda de unos plásmidos episómicos. Como plásmidos se adecuan aquéllos que son replicados en bacterias corineformes. Numerosos vectores plasmídicos conocidos tales como por ejemplo el pZ1 (Menkel y colaboradores, Applied and Environmental Microbiology [Microbiología aplicada y ambiental] (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmans y colaboradores, Gene [Genes] 102: 93-98 (1991)) o pHS2-1 (Sonnen y colaboradores, Gene 107:69-74 (1991)) se basan en los plásmidos crípticos pHM1519, pBL1 o pGA1. Otros vectores plasmídicos tales como p.ej. los que se basan en el pCG4 (véase el documento de patente de los EE.UU. US-A 4.489.160), o en el pNG2 (Serwold-Davis y colaboradores, FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), o pAG1 (documento US-A 5.158.891) se pueden utilizar de igual manera. Un artículo recopilativo sobre el tema de los plásmidos naturales de bacterias corineformes que producen aminoácidos se encuentra en la obra Handbook of [Manual de] Corynebacterium glutamicum (Tauch, capítulo 4, 57-80, coordinadores de edición: Eggeling y Bott, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton (2005)).

Por lo demás, también se adecuan aquellos vectores plasmídicos con cuya ayuda se puede aplicar el procedimiento de la amplificación de genes mediante una integración en el cromosoma, tal como se había descrito, por ejemplo, por Reinscheid y colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) para la duplicación o respectivamente la amplificación del operón hom-thrB o en el documento de patente internacional WO03/040373. En el caso de este método, el gen se clona en un vector plasmídico, que se puede replicar en un anfitrión (típicamente en E. coli) pero no en C. glutamicum. Como vectores entran en consideración, por ejemplo, el pSUP301 (Simon y colaboradores, Bio/Technology [Bio/Tecnología] 1, 784-791 (1983)), el pK18mob o el pK19mob (Schäfer y colaboradores, Gene 145, 69-73 (1994)), el pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), el pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry [Revista de química biológica] 269:32678-84; documento US-A 5.487.993), el pCR®Blunt (de la entidad Invitrogen, Groningen, Países Bajos); Bernard y colaboradores, Journal of Molecular Biology [Revista de biología molecular], 234: 534-541 (1993)), el pEM1 (Schrumpf y colaboradores, 1991, Journal of Bacteriology [Revista de bacteriología] 173:4510-4516) o el pBGS8 (Spratt y colaboradores,1986, Gene

41: 337-342). El vector plasmídico, que contiene el gen heterólogo que debe de ser amplificado, eventualmente inclusive las señales de expresión y/o regulación, y las regiones de borde de un gen homólogo no esencial, se transfiere a continuación mediante una conjugación o transformación a la deseada cepa de C. Glutamicum. El método de la conjugación se ha descrito por ejemplo en la cita de Schäfer y colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Unos métodos para la transformación se han descrito por ejemplo en las citas de Thierbach y colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican y Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) y Tauch y colaboradores (FEMS Microbiology Letters 123, 343-347 (1994)). Después de una recombinación homóloga mediante un suceso de cruzamiento (en inglés "cross-over"), la cepa resultante contiene una copia del gen heterólogo inclusive la del vector plasmídico en el deseado sitio del gen del cromosoma de C. Glutamicum, que se había determinado previamente en el plásmido a través de las secuencias homólogas de nucleótidos. Mediante un adecuado segundo suceso de cruzamiento, que da lugar a una excisión en el gen diana o respectivamente en la secuencia diana, se consigue la introducción de solamente el gen heterólogo. En este caso, junto al respectivo sitio del gen natural no queda ninguna secuencia de nucleótidos capacitadora de una replicación episómica en microorganismos, ninguna secuencia de nucleótidos capacitadora de una transposición ni ninguna secuencia de nucleótidos mediadora de una resistencia contra antibióticos.

Adicionalmente, para realizar la producción de L-aminoácidos puede ser ventajoso, de manera adicional a la expresión funcional de uno o varios de los genes heterólogos del metabolismo del glicerol, que se escogen entre el conjunto que se compone de glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC, de una o varias enzimas de las rutas metabólicas, que aumentan o disminuyen la formación del aminoácido deseado, tales como p.ej. las de la ruta de biosíntesis, de la glicolisis, de las reacciones anapleróticas, del ciclo del ácido cítrico, del ciclo del pentosa-fosfato, de la exportación de aminoácidos, y eventualmente de unas proteínas reguladoras o bien para reforzar, en particular sobreexpresar, o bien debilitar, en particular para disminuir la expresión.

El concepto de "reforzamiento" o respectivamente de "reforzar" describe dentro de este contexto el aumento de la actividad intracelular de una o varias enzimas o respectivamente proteínas en un microorganismo, que es(son) codificada(s) por el correspondiente ADN, mediante el recurso de que por ejemplo se aumenta el número de copias del gen o respectivamente de los genes, se utiliza un promotor fuerte o un gen o respectivamente un alelo, que codifica una correspondiente enzima o proteína con una alta actividad y eventualmente se combinan estas medidas técnicas.

Mediante las medidas técnicas del reforzamiento, en particular de la sobreexpresión, se aumenta la actividad o concentración de la correspondiente proteína por lo general en por lo menos un 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 %, como máximo hasta en un 1.000 % o 2.000 %, referido a la actividad o concentración de la proteína de tipo silvestre o respectivamente a la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.

Para la consecución de una sobreexpresión se puede aumentar el número de copias de los correspondientes genes,

o se puede mutar la región de promotor y de regulación o el sitio de fijación a ribosomas, que se encuentra situado secuencia arriba del gen estructural. De igual manera actúan unos casetes de expresión, que son incorporados secuencia arriba del gen estructural. Por medio de unos promotores inducibles es adicionalmente posible aumentar la expresión en el transcurso de la producción por fermentación de aminoácidos. Por medio de unas medidas técnicas para la prolongación de la duración de vida del ARNm (mensajero) se mejora asimismo la expresión. Por lo demás, mediante la evitación de la degradación de la proteína enzimática se refuerza asimismo la actividad enzimática. Los genes o las construcciones artificiales de genes pueden presentarse o bien en plásmidos con diferentes números de copias, o se pueden integrar en un cromosoma y amplificar. Alternativamente, se puede conseguir además una sobreexpresión de los correspondientes genes mediante una modificación de la composición de los medios y mediante la realización de la cultivación.

Instrucciones acerca de esto las puede encontrar un experto en la especialidad, entre otros lugares, en las citas de Martin y colaboradores (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), de Guerrero y colaboradores (Gene 138, 35-41 (1994)), de Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), de Eikmanns y colaboradores (Gene 102, 93-98 (1991)), en el documento EP 0 472 869, en el documento US 4.601.893, en las citas de Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), de Reinscheid y colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 60,126132 (1994), de LaBarre y colaboradores (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en el documento WO 96/15246, en la cita de Malumbres y colaboradores (Gene 134, 15-24 (1993)), en el documento de solicitud de patente japonesa JP-A-10-229891, en las citas de Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,191-195 (1998)), de Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996) y en los conocidos libros de texto de genética y biología molecular.

Para el reforzamiento, los genes son sobreexpresados por ejemplo con ayuda de plásmidos episómicos. Como plásmidos se adecuan aquéllos que son replicados en bacterias corineformes. Numerosos vectores plasmídicos conocidos, tales como p.ej. el pZ1 (Menkel y colaboradores, Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549554), el pEKEx1 (Eikmanns y colaboradores, Gene 102: 93-98 (1991)) o el pHS2-1 (Sonnen y colaboradores, Gene

107: 69-74 (1991)) se basan en los plásmidos crípticos pHM1519, pBL1 o pGA1. Otros vectores plasmídicos, tales como los que se basan en el pCG4 (documento de patente de los EE.UU. US-A 4.489.160) o el pNG2 (Serwold-Davis y colaboradores, FEMS Microbiology Letters 66,119-124 (1990)) o el pAG1 (documento US-A 5.158.891), pueden ser utilizados de igual manera.

Por lo demás, también se adecuan aquellos vectores plasmídicos con cuya ayuda se puede usar el procedimiento de la amplificación de genes mediante una integración en el cromosoma, tal como ha sido descrito por ejemplo por Reinscheid y colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132) (1994)) para realizar la duplicación o respectivamente la amplificación del operón de hom-thrB. En el caso de este método, el gen completo es clonado en un vector plasmídico, que se puede replicar en un anfitrión (típicamente en E. coli), pero no en C. glutamicum. Como vectores entran en cuestión, por ejemplo, el pSUP301 (Simon y colaboradores, Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), el pK18mob o el pK19mob (Schäfer y colaboradores, Gene 145, 69-73 (1994)), el pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, EE.UU.), el pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; documento US-A 5.487.993), el pCR®Blunt (de la entidad Invitrogen, Groningen, Holanda; Bernard y colaboradores, Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), el pEM1 (Schrumpf y colaboradores, 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516) o el pBGS8 (Spratt y colaboradores,1986, Gene 41: 337-342). El vector plasmídico, que contiene el gen que debe de ser amplificado, se transfiere a continuación mediante transformación a la deseada cepa de C. glutamicum. El método de la conjugación se ha descrito por ejemplo en la cita de Schäfer y colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Unos métodos para la transformación se han descrito, por ejemplo, en las citas de Thierbach y colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), de Dunican y Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) y de Tauch y colaboradores (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). Después de una recombinación homologa mediante un suceso de cruzamiento (“cross-over”), la cepa resultante contiene por lo menos dos copias del pertinente gen.

Un método habitual para introducir una o varias copias adicionales de un gen de C. glutamicum en el cromosoma de la deseada bacteria corineforme, es el método descrito en los documentos WO03/014330 y WO03/040373 de la

duplicación del gen. Para esto, en el documento WO03/040373, la secuencia de nucleótidos del deseado ORF, gen

o alelo, eventualmente inclusive sus señales de expresión y/o regulación, se aísla y se clonan dos copias, de manera preferida en disposición en tándem, en un vector no replicador para C. glutamicum tal como por ejemplo, el pK18mobsacB o pK19mobsacB (Jäger y colaboradores, Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)). El vector se transfiere a continuación mediante una transformación o conjugación a la deseada bacteria corineforme. Después de una recombinación homóloga mediante un primer suceso de cruzamiento, que da lugar a una integración, y un adecuado segundo suceso de cruzamiento, que da lugar a una excisión, en el gen diana o respectivamente en la secuencia diana se consigue la introducción de la copia adicional del gen. Después de esto, se aíslan aquéllas bacterias, en las que están presentes dos copias del ORF, gen o alelo en el respectivo sitio natural en lugar de la copia singular presente originalmente. En este caso, en el respectivo sitio natural del gen no permanece ninguna secuencia de nucleótidos capacitadora de una replicación episómica en microorganismos, ninguna secuencia de nucleótidos capacitadora de una transposición ni ninguna secuencia de nucleótidos que medie por una resistencia frente a unos antibióticos.

El concepto de "debilitamiento" describe en este contexto la disminución o desconexión de la actividad intracelular de una o varias enzima(s) (proteína(s)) en un microorganismo, que es (son) codificada(s) por el correspondiente ADN, mediante el recurso de que, por ejemplo, se utiliza un promotor débil o se utiliza un gen o respectivamente alelo, que codifica una correspondiente enzima o respectivamente proteína con una baja actividad, o respectivamente se desactiva al gen o a la enzima (proteína) correspondiente, y eventualmente se combinan estas medidas técnicas.

Mediante las medidas técnicas del debilitamiento se reduce la actividad o concentración de la correspondiente proteína por lo general a0 hasta 75 %, a 0 hasta 50 %, a 0 hasta 25 %, a 0 hasta 10 % o a 0 hasta 5 % de la actividad o concentración de la proteína de tipo silvestre, o respectivamente de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.

El aumento o la disminución de la concentración de proteínas es detectable mediante los métodos ya mencionados anteriormente (Hermann y colaboradores, Electrophoresis, 22:1712-23 (2001); Lohaus y Meyer (Biospektrum 5:3239 (1998); Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999)); Wilson y colaboradores, Journal of Bacteriology 183:2151-2155 (2001)).

La utilización de genes endógenos se prefiere por regla general. Por el concepto de "genes endógenos" o de "secuencias endógenas de nucleótidos" se entienden los genes o respectivamente las secuencias de nucleótidos, que están presentes en la población de una especie.

Así, por ejemplo, para la producción de L-lisina, junto a la expresión de uno o varios de los genes heterólogos del metabolismo del glicerol (glycerol metabolism) que se escogen entre el conjunto que se compone de glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC, se puede(n) reforzar, en particular sobreexpresar, uno o varios de los genes, que se escogen entre el conjunto que se compone de los genes o alelos de la producción de lisina. Por el concepto de "genes o alelos de la producción de lisina" se entienden todos los marcos abiertos de lectura, genes o alelos, de manera preferida los marcos abiertos de lectura, genes o alelos endógenos, cuyo/a reforzamiento/sobreexpresión puede dar lugar a un mejoramiento de la producción de lisina.

A estos pertenecen, entre otros los siguientes genes o alelos: accBC, accDA, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dapA, dapB, dapC, dapD, dapE, dapF, ddh, dps, eno, gap, gap2, gdh, gnd, lysC, lysCFBR, lysE, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppcFBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal , thyA, tkt, tpi, zwa1, zwf y zwf A243T. Éstos se han recopilado e ilustrado en la Tabla 1.

Tabla 1

Genes y alelos para la producción de lisina

Nombre

Denominación de la enzima o proteína codificada Referencia N° de acceso

accBC

Acil-CoA carboxilasa EC 6.3.4.14 (acyl-CoA carboxylase) Jäger y colaboradores Archives of Microbiology (1996) 166:76-82 EP1108790; WO0100805 U35023 AX123524 AX066441

accDA

Acetil-CoA carboxilasa EC 6.4.1.2 (acetyl-CoA carboxylase) EP1055725 EP1108790 WO0100805 AX121013 AX066443

cstA

Proteína A de privación de carbono (carbon starvation protein A) EP1108790 WO0100804 AX120811 AX066109

Nombre

Denominación de la enzima o proteína codificada Referencia N° de acceso

cysD

Sulfato-adenilil transferasa subunidad II EC 2.7.7.4 (sulfate adenyltransferase small chain) EP1108790 AX123177

cysE

Serina acetil transferasa EC 2.3.1.30 (serine acetyltransferase) EP1108790 WO0100843 AX122902 AX063961

cysH

3'-Fosfoadenilsulfato reductasa EC 1.8.99.4 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate reductase) EP1108790 WO0100842 AX123178 AX066001

cysK

Cisteína sintasa EC 4.2.99.8 (cysteine synthase) EP1108790 WO0100843 AX122901 AX063963

cysN

Sulfato-adenilil transferasa subunidad I EC 2.7.7.4 (sulfate adenylyltransferase) EP1108790 AX123176 AX127152

cysQ

Proteína transportadora CysQ (trans¡porter cysQ) EP1108790 WO0100805 AX127145 AX066423

dapA

Dihidrodipicolinato sintasa EC 4.2.1.52 (dihydrodipicolinate synthase) Bonnassie y colaboradores Nucleic Acids Research 18:6421 (1990) Pisabarro y colaboradores, Journal of Bacteriology 175:2743-2749 (1993) EP1108790 WO0100805 EP0435132 EP1067192 EP1067193 X53993 Z21502 AX123560 AX063773

dapB

Dihidrodipicolinato reductasa EC 1.3.1.26 (dihydrodipicolinat reductase) EP1108790 WO0100843 EP1067192 EP1067193 Pisabarro y colaboradores, Journal of Bacteriology 175:2743-2749 (1993) JP1998215883 JP1997322774 JP 1997070291 JP1995075578 AX127149 AX063753 AX137723 AX137602 X67737 Z21502 E16749 E14520 E12773 E08900

dapC

N-Succinil-aminocetopimelato transaminasa EC 2.6.1.17 (N-succinyl-diaminopimelate transaminase) EP1108790 WO0100843 EP1136559 AX127146 AX064219

dapD

Tetrahidrodipicolinato succinilasa EC. 2.3.1.117 (tetrahydrodipicolinat succinylase) EP1108790 WO0100843 Wehrmann y colaboradores Journal of Bacteriology 180:3159-3165 (1998) AX127146 AX063757 AJ004934

dapE

N-Succinil-diaminopimelato desuccinilasa EC 3.5.1.18 (N-succinyl-diaminopimelate desuccinylase) EP1108790 WO0100843 Wehrmann y colaboradores Microbiology 140:3349-3356 (1994) AX127146 AX063749 X81379

dapF

Diaminopimelato epimerasa EC 5.1.1.7 (diaminopimelate epimerase) EP1108790 WO0100843 EP1085094 AX127149 AX063719 AX137620

Nombre

Denominación de la enzima o proteína codificada Referencia N° de acceso

ddh

Diaminopimelato deshidrogenasa EC 1.4.1.16 (diaminopimelate dehydrogenase) EP1108790 WO0100843 Ishino y colaboradores, Nucleic Acids Research 15:3917-3917 (1987) JP1997322774 JP1993284970 Kim y colaboradores, Journal of Microbiology and Biotechnology 5:250-256 (1995) AX127152 AX063759 Y00151 E14511 E05776 D87976

dps

Proteína de protección del ADN durante la privación (protection during starvation protein) EP1108790 AX127153

eno

Enolasa EC 4.2.1.11 (enolase) EP1108790 WO0100844 EP1090998 Hermann y colaboradores, Electrophoresis 19:3217-3221 (1998) AX127146 AX064945 AX136862

gap

Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa EC 1.2.1.12 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) EP1108790 WO0100844 Eikmanns y colaboradores, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992) AX127148 AX064941 X59403

gap2

Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa EC 1.2.1.12 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2) EP1108790 WO0100844 AX127146 AX064939

gdh

Glutamato deshidrogenasa EC 1.4.1.4 (glutamate dehydrogenase) EP1108790 WO0100844 Boermann y colaboradores, Molecular Microbiology 6:317326 (1992). AX127150 AX063811 X59404 X72855

gnd

6-Fosfogluconato deshidrogenasa EC 1.1.1.44 (6-phosphogluconate dehydrogenase) EP1108790 WO0100844 AX127147 AX121689 AX065125

lysC

Aspartato cinasa EC 2.7.2.4 (aspartate kinase) EP1108790 WO0100844 Kalinowski y colaboradores, Molecular Microbiology 5:1197-204 (1991) AX120365 AX063743 X57226

lysE

Proteína exportadora de lisina (lysine exporter protein) EP1108790 WO0100843 Vrljic y colaboradores, Molecular Microbiology 22:815-826 (1996) AX123539 AX123539 X96471

msiK

Proteína importadora de azúcar múltiple (multiple sugar import protein) EP1108790 AX120892

opcA

Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa subunidad (subunit of glucose-6-phosphate dehydrogenase) WO0104325 AX076272

oxyR

Regulador de la transcripción (transcriptional regulator) EP1108790 AX122198 AX127149

ppcFBR

Fosfoenolpiruvato carboxilasa resistente frente a la retroalimentación EC 4.1.1.31 (phosphoenolpyruvate carboxylase feedback resistant) EP0723011 WO0100852

ppc

Fosfoenolpiruvato carboxilasa EC 4.1.1.31 (phosphoenolpyruvate carboxylase) EP1108790 O'Reagan y colaboradores, Gene 77(2):237-251 (1989) AX127148 AX123554 M25819

pgk

Fosfoglicerato cinasa EC 2.7.2.3 (phosphoglycerate kinase) EP1108790 WO0100844 Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992) AX121838 AX127148 AX064943 X59403

Nombre

Denominación de la enzima o proteína codificada Referencia N° de acceso

pknA

Proteína cinasa A (protein kinase A) EP1108790 AX120131 AX120085

pknB

Proteína cinasa B (protein kinase B) EP1108790 AX120130 AX120085

pknD

Proteína cinasa D (protein kinase D) EP1108790 AX127150 AX122469 AX122468

pknG

Proteína cinasa G (protein kinase G) EP1108790 AX127152 AX123109

ppsA

Fosfoenol-piruvato sintasa EC 2.7.9.2 (phosphoenolpyruvate synthase) EP1108790 AX127144 AX120700 AX122469

ptsH

Proteína H del sistema de la fosfotransferasa EC 2.7.1.69 (phosphotransferase system component H) EP1108790 WO0100844 AX122210 AX127149 AX069154

ptsI

Enzima I del sistema de la fosfotransferasa EC 2.7.3.9 (phosphotransferase system enzyme I) EP1108790 AX122206 AX127149

ptsM

Enzima II específica para la glucosa del sistema de la fosfotransferasa EC 2.7.1.69 (glucose-phosphotransferase-system enzyme II) Lee y colaboradores, FEMS Microbiology Letters 119(12):137-145 (1994) L18874

pyc

Piruvato carboxilasa EC 6.4.1.1 (pyruvate carboxylase) WO9918228 Peters-Wendisch y colaboradores, Microbiology 144:915-927 (1998) A97276 Y09548

pyc P458S

Piruvato carboxilasa EC 6.4.1.1 (pyruvate carboxylase) intercambio de aminácidos P458S EP1108790

sigC

Factor sigma C alternativo de la función extracitoplasmática EC. 2.7.7.6 (extracytoplasmic function alternative sigma factor C) EP1108790 AX120368 AX120085

sigD

Factor sigma D de la polimerasa de ARN EC 2.7.7.6 (RNA polymerase sigma factor) EP1108790 AX120753 AX127144

sigE

Factor sigma E alternativo de la función extracitoplasmática EC 2.7.7.6 (extracytoplasmic function alternative sigma factor E) EP1108790 AX127146 AX121325

sigH

Factor sigma H EC 2.7.7.6 (sigma factor SigH) EP1108790 AX127145 AX120939

sigM

Factor sigma M EC 2.7.7.6 (sigma factor SigM) EP1108790 AX123500 AX127153

ta1

Transaldolasa EC. 2.2.1.2 (transaldolase) WO0104325 AX076272

thyA

Timidilato sintasa EC 2.1.1.45 (thymidylate synthase) EP1108790 AX121026 AX127145

tkt

Transcetolasa EC 2.2.1.1 (transketolase) Ikeda y colaboradores, NCBI AB023377

tpi

Triosa-fosfato isomerasa EC 5.3.1.1 (triose-phosphate isomerase) Eikmanns, Journal of Bacteriology 174:6076-6086 (1992) X59403

zwa1

Factor de crecimiento celular 1 (growth factor 1) EP1111062 AX133781

Nombre

Denominación de la enzima o proteína codificada Referencia N° de acceso

zwf

Glucosa-6-fosfato-1 deshidrogenasa EC 1.1.1.49 (glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase) EP1108790 WO0104325 AX121827 AX076272

zwf A213T

Glucosa-6-fosfato-1 deshidrogenasa EC 1.1.1.49 (glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase) intercambio de aminoácidos A213T EP1108790

Además, para la producción de L-lisina puede ser ventajoso que, adicionalmente a la expresión funcional de uno o varios genes heterólogos del metabolismo del glicerol, que se escogen entre el conjunto que se compone de glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC, sean

5 debilitados uno o varios de los genes, que se escogen entre el conjunto que se compone de los genes o alelos, que no son esenciales para el crecimiento o la producción de lisina, en particular que ellos sean desconectados o que su expresión sea reducida.

A éstos pertenecen, entre otros los siguientes marcos abiertos de lectura, genes o alelos: aecD, ccpA1, ccpA2, citA,

10 citB, citE, fda, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, mqo, pck, pgi, poxB y zwa2, que son recopilados e ilustrados en la Tabla 2.

Tabla 2:

15 Genes y alelos, que no son esenciales para la producción de lisina

Nombre del gen

Denominación de la enzima o proteína codificada Referencia N° de acceso

aecD

Beta C-S liasa EC 2.6.1.1 (beta C-S lyase) Rossol y colaboradores, Journal of Bacteriology 174(9):2968-77 (1992) M89931

ccpA1

Proteína de control de catabolitos (catabolite control protein A1) WO0100844 EP1108790 WO 02/18419 AX065267 AX127147

ccpA2

Proteína A2 de control de catabolitos (catabolite control protein A2) WO0100844 EP1108790 AX065267 AX121594

citA

Cinasa del sensor CitA (sensor kinase CitA) EP1108790 AX120161

citB

Regulador de la transcripción CitB (transcription regulator CitB) EP1108790 AX120163

citE

Citrato liasa EC. 4.1.3.6 (citrate lyase) WO0100844 EP1108790 AX065421 AX127146

fda

Fructosa-bisfosfato aldolasa EC 4.1.2.13 (fructose-1,6-bisphosphate aldolase) von der Osten y colaboradores, Molecular Microbiology 3(11):1625-37 (1989) X17313

gluA

Proteína de transporte de glutamato fijadora de ATP (glutamate transport ATP-binding protein) Kronemeyer y colaboradores, Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995) X81191

gluB

Proteína fijadora de glutamato (glutamate binding protein) Kronemeyer y colaboradores, Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995) X81191

gluC

Permeasa del transporte de glutamato (glutamate transport system permease) Kronemeyer y colaboradores, Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995) X81191

gluD

Permeasa del transporte de glutamato (glutamate transport system permease) Kronemeyer y colaboradores, Journal of Bacteriology 177(5):1152-8 (1995) X81191

luxR

Regulador de la transcripción LuxR (transcription regulator LuxR) WO0100842 EP1108790 AX065953 AX123320

luxS

Histidina cinasa LuxS (histidine kinase LuxS) EP1108790 AX123323 AX127153

lysR1

Regulador de la transcripción LysR1 (transcription regulator LysR1) EP1108790 AX064673 AX127144

lysR2

activador de la transcripción LysR2 (transcription regulator LysR2) EP1108790 AX123312

Nombre del gen

Denominación de la enzima o proteína codificada Referencia N° de acceso

lysR3

regulador de la transcripción LysR3 (transcription regulator LysR3) WO0100842 EP1108790 AX065957 AX127150

menE

Ácido O-succinil-benzoico-CoA ligasa EC 6.2.1.26 (O-succinylbenzoate-CoA ligase) WO0100843 EP1108790 AX064599 AX064193 AX127144

mqo

Malato-quinona oxidorreductasa (malate-quinone-oxidoreductase) Molenaar y colaboradores, Eur. Journal of Biochemistry 1;254(2): 395-403 (1998) AJ224946

pck

Fosfoenolpiruvato carboxi-cinasa (phosphoenolpyruvate carboxykinase WO0100844 EP-A-1094111 AJ269506 AX065053

pgi

Glucosa-6-fosfato-isomerasa EC 5.3.1.9 (glucose-6-phosphate isomerase) EP1087015 EP1108790 WO 01/07626 AX136015 AX127146

poxB

Piruvato oxidasa EC 1.2.3.3 (pyruvate oxidase) WO0100844 EP1096013 AX064959 AX137665

zwa2

Factor de crecimiento celular 2 (growth factor 2) EP1106693 EP1108790 AX113822 AX127146

También pueden ser reforzados unos polinucleótidos endógenos de Corynebacterium glutamicum (n° de acceso NC 006958 o respectivamente NC 003450 (secuencia de gel genoma total)), que poseen una identidad de por lo menos un 45 % o de por lo menos un 50 % o de por lo menos un 60 % o de por lo menos un 70 % o de por lo menos un 80 % o de por lo menos un 90 %, de por lo menos un 91 %, de por lo menos un 92 %, de por lo menos un 93 %, de por lo menos un 94 %, de por lo menos un 95 %, de por lo menos 96 %, de por lo menos un 97 %, de por lo menos un 98 % o de por lo menos un 99 % con respecto a las secuencias de nucleótidos representadas en las SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33 ó SEQ ID No. 35, y que tienen las funciones descritas. Las secuencias de nucleótidos conocidas a partir de los proyectos del genoma de los genes y de los ORFs pertenecen al estado de la técnica y pueden ser deducidas de diversas publicaciones, solicitudes de patentes así como del banco de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD, EE.UU.),

Se encontró que las bacterias corineformes, también después de una sobreexpresión en común de los polinucleótidos endógenos glpK (con una identidad de un 58 % con respecto a la SEQ ID No. 15), que codifica la glicerol cinasa K dependiente de ATP, y glpD (con una identidad de un 47 % con respecto a la SEQ ID No. 7), que codifica la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa del metabolismo del glicerol, producen ciertos L-aminoácidos, en particular la L-lisina y el L-triptófano, a partir del glicerol como única fuente de carbono.

Para conseguir una mejor claridad de comprensión, las conocidas secuencias correspondientes a los genes tratados de Corynebacterium glutamicum se han representado bajo las SEQ ID No. 37 y SEQ ID No. 39.

Las bacterias conformes al invento se pueden cultivar continuamente -tal como se ha descrito por ejemplo en el documento PCT/EP2004/008882 -o discontinuamente en el procedimiento batch (cultivación por tandas) o en el procedimiento fed batch (procedimiento de afluencia) o en el procedimiento fed batch repeated (procedimiento de afluencia repetida) con el fin de efectuar la producción de L-aminoácidos. Una recopilación de tipo general acerca de métodos de cultivación conocidos se describe en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Técnica de bioprocesos 1. Introducción en la técnica de los bioprocesos] (editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Biorreactores y disposiciones periféricas] (editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo que se ha de utilizar, debe de satisfacer de una manera apropiada las exigencias de las respectivas cepas. Unas descripciones de medios de cultivo de diferentes microorganismos están contenidas en el manual “Manual of Methods for General Bacteriology” [Manual de métodos para la bacteriología general] de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., EE.UU., 1981).

Como fuente de carbono se utiliza el glicerol. Éste se puede utilizar individualmente o como una mezcla. Se pueden añadir unos azúcares y unos hidratos de carbono tales como p.ej. glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, unos almidones y eventualmente unas celulosas, unos aceites y unas grasas, tales como p.ej. aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, unos ácidos grasos, tales como p.ej. ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, unos alcoholes, tales como p.ej. glicerol, metanol y etanol, y unos ácidos orgánicos, tales como p.ej. ácido acético, debiendo ser la proporción del glicerol por lo menos mayor o igual (≥) que 10 %, o por lo menos ≥ 25 %, o por lo menos ≥ 50 %, o por lo menos ≥ 75 %, o por lo menos ≥ 90 %, o por lo menos ≥ 95 %, o por lo menos ≥ 99 %, de manera preferida de 100 % en peso.

Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar unos compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, tales como peptonas, un extracto de levadura, un extracto de carne, un extracto de malta, agua de maceración de maíz, harina de soja y urea, o unos compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar individualmente o como una mezcla.

Como fuente de fósforo se pueden utilizar ácido fosfórico, dihidrógeno-fosfato de potasio o hidrógeno-fosfato de dipotasio o bien las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe de contener por lo demás unas sales de metales, tales como p.ej. sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, de manera adicional a las sustancias más arriba mencionadas se pueden emplear unas sustancias de crecimiento esenciales, tales como unos aminoácidos y unas vitaminas. Al medio de cultivo se le pueden añadir además de ello unos adecuados compuestos precursores. Las mencionadas sustancias empleadas de partida se pueden añadir al cultivo en forma de una tanda única o se pueden alimentar de una manera apropiada durante la cultivación.

Para realizar el control del pH del cultivo se emplean de un modo apropiado unos compuestos de carácter básico, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o respectivamente agua amoniacal, o unos compuestos de carácter ácido, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para la represión del desarrollo de espuma se pueden emplear unos agentes antiespumantes, tales como p.ej. unos ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Para la conservación de la estabilidad de los plásmidos, se le pueden añadir al medio unas apropiadas sustancias que actúan de un modo selectivo, tales como p.ej. unos antibióticos. Con el fin de mantener unas condiciones aerobias, se introducen en el cultivo oxígeno o unas mezclas gaseosas que contienen oxígeno, tales como por ejemplo aire. La temperatura del cultivo está situada normalmente en 20ºC hasta 45ºC y de manera preferida en 25ºC hasta 40°C. Se continúa realizando la cultivación hasta que se haya formado una cantidad máxima del deseado producto. Este objetivo se alcanza normalmente en el transcurso de 10 horas hasta 160 horas. En el caso de los procedimientos continuos son posibles unos más largos períodos de tiempo de cultivación.

Unos métodos para la determinación de L-aminoácidos se conocen a partir del estado de la técnica. El análisis se puede efectuar, por ejemplo, tal como se ha descrito en la cita de Spackman y colaboradores (Analytical Chemistry [Química analítica], 30, (1958), 1.190) mediante una cromatografía con intercambio de aniones con una subsiguiente derivatización con ninhidrina, o él se puede efectuar mediante una HPLC (cromatografía de fase líquida de alto rendimiento) de fase inversa (en inglés "reversed phase HPLC), tal como se ha descrito en la cita de Lindroth y colaboradores (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

LISTA DE SECUENCIAS:

<110> Evonik Degussa GmbH

Forschungszentrum Jülich GmbH 5

<120> Procedimiento para la producción por fermentación de L-aminoácidos mediando utilización de unas bacterias corineformes, en las cuales son expresados heterólogamente los genes del metabolismo del glicerol

<130> 2005P10064 WE01 10

<160> 40

<170> PatentIn version 3.3

15 <210> 1

<211> 1629

<212> ADN

<213> Escherichia coli

20 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1629)

<223> región codificadora de glpA

25 <400> 1

<210> 2

<211> 542

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 2

<210> 3

<211> 1260

<212> ADN

<213> Escherichia coli 5

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1260)

<223> región codificadora de glpB 10

<400> 3

<210> 4

<211> 419

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 4

<210> 5

<211> 1191

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1191)

<223> región codificadora de glpC

<400> 5

<210> 6

<211> 396

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 6

<210> 7

<211> 1506

<212> ADN 5 <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1506) 10 <223> región codificadora de glpD

<400> 7

<210> 8

<211> 501

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 8

<210> 9

<211> 327

<212> ADN 5 <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(327) 10 <223> región codificadora de glpE

<210> 10

<211> 108

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 10

100 105

<210> 11

<211> 846

<212> ADN

<213> Escherichia coli 5

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (846)

<223> región codificadora de glpF 10

<400> 11

<210> 12

<211> 281

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 12

<210> 13

<211> 831

<212> ADN 5 <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (831) 10 <223> región codificadora de glpG

<400> 13

<210> 14

<211> 276

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 14

<210> 15

<211> 1509

<212> ADN 5 <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1509) 10 <223> región codificadora de glpK

<400> 15

<210> 16

<211> 502

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 16

<210> 17

<211> 1077

<212> ADN 5 <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1077) 10 <223> región codificadora de glpQ

<400> 17

<210> 18

<211> 358

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 18

<210> 19

<211> 1359

<212> ADN

<213> Escherichia coli 5

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1359)

<223> región codificadora de glpT 10

<400> 19

<210> 20

<211> 452

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 20

<210> 21

<211> 1011

<212> ADN 5 <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1011) 10 <223> región codificadora de glpX

<400> 21

<210> 22

<211> 336

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 22

<210> 23

<211> 1143

<212> ADN 5 <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1143) 10 <223> región codificadora de gldA

<400> 23

<210> 24

<211> 380

<212> PRT

<213> Escherichia coli

400> 24

<210> 25

<211> 1101

<212> ADN 5 <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1101) 10 <223> región codificadora de dhaK

<400> 25

<210> 26

<211> 366

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 26

<210> 27

<211> 633

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (633)

<223> región codificadora de dhaL

<400> 27

<210> 28

<211> 210

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 28

<210> 29

<211> 1422

<212> ADN

<213> Escherichia coli 5

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1422)

<223> región codificadora de dhaM 10

<400> 29

<210> 30

<211> 473

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 30

<210> 31

<211> 1929

<212> ADN 5 <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1929) 10 <223> región codificadora de dhaR

<400> 31

<210> 32

<211> 642

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 32

<210> 33

<211> 735

<212> ADN 5 <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (735) 10 <223> región codificadora de fsa

<400> 33

<210> 34

<211> 244

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 34

<210> 35

<211> 663

<212> ADN 5 <213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (663) 10 <223> región codificadora de talC

<400> 35

<210> 36

<211> 220

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 36

<210> 37 10 <211> 1530

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1530)

<223> región codificadora de glpK

<400> 37

<210> 38

<211> 509

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 38

<210> 39

<211> 1725

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1725) 10 <223> región codificadora de glpD

<400> 39

<210> 40

<211> 574

<212> PRT

<213> Corynebaeteriurn glutamicum

<400> 40

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para la producción por fermentación de L-aminoácidos, caracterizado por que se llevan a cabo las siguientes etapas:

   a) Cultivación de las bacterias corineformes recombinantes que producen el L-aminoácido deseado, en las que se presenta expresado por lo menos el polinucleótido heterólogo glpK, que codifica un polipéptido con la actividad de una glicerol cinasa, o sobreexpresado el polinucleótido endógeno glpK, en un medio que contiene glicerol o eventualmente de manera adicional una o varias fuentes de C en unas condiciones, en las que el deseado L-aminoácido se enriquece en el medio o en las células, y eventualmente

   b) aislamiento del L-aminoácido deseado, permaneciendo en el producto final eventualmente los componentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa en su totalidad o en porciones (desde > 0 hasta 100 %).

   realizándose que el polipéptido con la actividad de una glicerol cinasa, que es codificado por el polinucleótido heterólogo glpK, tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en por lo menos un 80 % a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16

   y realizándose que el polipéptido con la actividad de una glicerol cinasa, que es codificado por el polinucleótido endógeno glpK, tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:38.

2. 2.

   Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el polipéptido heterólogo con la actividad de una glicerol cinasa tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en un 100 % a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16.

3. 3.

   Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que en las bacterias recombinantes de la especie Corynebacterium glutamicum, que producen el L-aminoácido deseado, se presenta sobreexpresado adicionalmente el polinucleótido heterólogo glpD, que codifica un polipéptido con la actividad de una glicerol-3fosfato deshidrogenasa, o el polinucleótido endógeno glpD, realizándose que el polipéptido con la actividad de una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, que es codificado por el polinucleótido heterólogo glpD, tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en por lo menos un 80 % con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8, y realizándose que el polipéptido con la actividad de una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, que es codificado por el polinucleótido endógeno glpD, tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:40.

4. 4.

   Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que el polipéptido heterólogo con la actividad de una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en un 100 % a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:8.

5. 5.

   Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 hasta 4, en las cuales el polinucleótido heterólogo expresado procede de un organismo procariótico, de manera preferida de Enterobacteriaceae, de manera muy especialmente preferida de Escherichia coli.

6. 6.

   Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que como fuente de C se emplea el glicerol en ≥ 10 hasta 100 %.

7. 7.

   Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizado por que se produce L-lisina o L-triptófano.

8. 8.

   Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizado por que se emplean unas bacterias, en las cuales han sido reforzadas por lo menos parcialmente las rutas del metabolismo, que aumentan la formación del deseado L-aminoácido.

9. 9.

   Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 hasta 8, caracterizado por que se emplean unas bacterias, en las cuales se han desconectado por lo menos parcialmente las rutas del metabolismo que disminuyen la formación del deseado L-aminoácido.

10. 10.

    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que para la producción de L-aminoácidos, en particular de L-lisina y L-triptófano, se fermentan unas bacterias de la especie Corynebacterium glutamicum, en las cuales se refuerza(n), en particular se sobreexpresa(n), uno o varios de los genes, que se escogen entre el conjunto que se compone de accBC, accDA, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN, cysQ, dapA, dapB, dapC, dapD, dapE, dapF, ddh, dps, eno, gap, gap2, gdh, gnd, lysC, lysCFBR, lysE, msiK, opcA, oxyR, ppc, ppCFBR, pgk, pknA, pknB, pknD, pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC, sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwa1, zwf y zwf A243T, glpA, glpB, glpC, glpE, glpF, glpG, qlpQ, glpT, glpX, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa y talC.

11. 11.

    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que la actividad o concentración de la(s) proteína(s), que es(son) codificada(s) por el(los) gen(es) reforzado(s), aumenta en cada caso en 10 hasta 2.000 %, referida a la de la proteína de tipo silvestre o respectivamente a la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.

12. 12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado por que para la producción de L-aminoácidos, en particular de L-lisina, se fermentan unas bacterias de la especie Corynebacterium glutamicum, en las cuales, de manera simultánea, se debilita(n), en particular se desconecta(n) o se disminuye la expresión de, uno o varios de los genes, que se escogen entre el conjunto que se compone de aecD, ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, fda, gluA, gluB,

    10 gluC, gluD, luxR, luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, mqo, pck, pgi, poxB y zwa2.
13. 13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado por que la actividad o concentración de la(s) proteína(s), que es(son) codificada(s) por el(los) gen(es) debilitado(s), disminuye en cada caso a un 0 hasta 75 %, referido a la proteína de tipo silvestre o respectivamente a la actividad o concentración de la proteína en el

    15 microorganismo de partida.