ES2374837T3

ES2374837T3 - Alelos del gen opca de bacterias corineformes.

Info

Publication number: ES2374837T3
Application number: ES06777211T
Authority: ES
Inventors: Natalie Schischka; Brigitte Bathe; Georg Thierbach
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2005-05-24
Filing date: 2006-05-03
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2026-05-03
Also published as: US20100196959A1; WO2006125714A2; PL1902067T3; US20080131927A1; DK1902067T3; ATE530568T1; US7700313B2; CN101180314A; EP1902067A2; EP1902067B1; US7915394B2; DE102005023829A1; WO2006125714A3

Abstract

Mutantes aislados de bacterias corineformes, que contienen un gen, que codifica el polipéptido glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, realizándose que la secuencia de aminoácidos del polipéptido se escoge entre el conjunto que se compone de a) la SEQ ID NO: 6, en la que en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina, en la posición 219 se encuentra L-asparagina, en la posición 233 se encuentra L-serina y en la posición 261 se encuentra L-histidina, b) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 intercambios conservativos de aminoácidos, y c) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 inserciones o supresiones.

Description

Alelos del gen opcA de bacterias corineformes

Son objeto del invento mutantes y alelos del gen opcA, que codifican variantes de la subunidad OpcA de la glucosa6-fosfato-deshidrogenasa (EC: 1.1.1.49) y unos procedimientos para la producción de aminoácidos, en particular de L-lisina y L-triptófano mediando utilización de bacterias, que contienen estos alelos.

Estado de la técnica

Los aminoácidos encuentran utilización en la medicina humana, en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y en particular en la nutrición de animales.

Es conocido el hecho de que ciertos aminoácidos pueden ser producidos por fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular de Corynebacterium glutamicum. A causa de la gran importancia de esto, se está trabajando constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de producción. Unos mejoramientos de los procedimientos pueden concernir a unas medidas técnicas de fermentación tales como por ejemplo la agitación y el abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos, tal como por ejemplo la concentración de azúcares durante la fermentación, o al tratamiento para dar la forma del producto mediante por ejemplo una cromatografía con intercambio de iones, o a las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho.

Para el mejoramiento de las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se utilizan unos métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen unas cepas, que son resistentes frente a los antimetabolitos o que son auxótrofas para los metabolitos importantes en regulación y que producen aminoácidos. Un antimetabolito conocido es el compuesto análogo a lisina S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC).

Desde hace algunos años se emplean asimismo unos métodos de la técnica de ADN recombinante para el mejoramiento de las cepas de Corynebacterium que producen L-aminoácidos, que consisten en que se amplifican unos genes individuales para la biosíntesis de los aminoácidos, y se investiga la repercusión sobre la producción de aminoácidos. Una representación recopilativa acerca de los aspectos más diversos de la genética, del metabolismo y de la biotecnología de Corynebacterium glutamicum se encuentra en la cita de Pühler (coordinador principal de edición) en: Journal of Biotechnology 104: (1-3), 1-338, 2003.

Moritz y colaboradores (European Journal of Biochemistry 267, 3442-3452 (2000)) informan acerca de investigaciones fisiológicas y bioquímicas en la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Corynebacterium glutamicum. De acuerdo con las investigaciones de Moritz y colaboradores, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se compone de una subunidad Zwf y de una subunidad OpcA.

Un método para la determinación de la actividad enzimática de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se ha descrito en la cita de Moritz y colaboradores (European Journal of Biochemistry 267, 3442-3452 (2000).

La secuencia de nucleótidos del gen que codifica la subunidad OpcA de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Corynebacterium glutamicum, está generalmente disponible, entre otros lugares, en el banco de datos del National Center for Biotechnology Information (Centro nacional para información de biotecnología) (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.). de la National Library of Medicin (Bethesda, MD, EE.UU.) bajo el número AX121828. Ella se puede tomar además de la solicitud de patente europea EP1108790 como la secuencia n° 1744.

Se pueden aprovechar asimismo otros bancos de datos, tales como, por ejemplo, el banco de datos de secuencias de nucleótidos de los European Molecular Biologies Laboratories (Laboratorios europeos de biología molecular) (EMBL, Heidelberg, Alemania o respectivamente Cambridge, Reino Unido) o el del Swiss Institute of Bioinformatics (Instituto suizo de bioinformática) (Swissprot, Ginebra, Suiza) o de la Protein Information Resource Database (Base de datos de recursos de información sobre proteínas) (PIR, Washington DC, EE.UU.).

La biosíntesis microbiana de L-aminoácidos en bacterias corineformes es un sistema complejo y está entrelazada en múltiples aspectos con otras diversas rutas metabólicas en la célula. Por ello, no se puede realizar ninguna predicción sobre si el polipéptido OpcA de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se modifica por mutación de tal manera que se mejore la producción de L-aminoácidos. Para el mejor carácter sinóptico, la secuencia de nucleótidos del gen zwf (gen de tipo silvestre) que codifica la subunidad OpcA de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Corynebacterium glutamicum, se representa de acuerdo con los datos del banco de datos del NCBI en la SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa codificada, que se establece a partir de ésta, se representa en las SEQ ID NO: 2 y 4. En la SEQ ID NO: 3 se indican adicionalmente unas secuencias de nucleótidos, que están situadas corriente arriba (en inglés "upstream") y corriente abajo (en inglés "downstream").

Misión del invento

Los autores del invento se han planteado la misión de poner a disposición unas cepas mejoradas de microorganismos, que produzcan unas cantidades aumentadas de aminoácidos, en particular de L-lisina y Ltriptófano.

Descripción del invento

5 Son objeto del invento unos mutantes de bacterias corineformes, producidos in vitro y/o in vivo, o respectivamente aislados, que segregan de manera preferida ciertos aminoácidos, y que contienen un gen o respectivamente un alelo, que codifica la subunidad OpcA de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, siendo escogida la secuencia de aminoácidos del polipéptido entre el conjunto que se compone de

a) la SEQ ID NO: 6, en la que en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina, en la posición 219 se encuentra L-asparagina, en la posición 233 se encuentra L-serina y en la posición 261 se encuentra L-histidina,

15 b) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 intercambios conservativos de aminoácidos, y

c) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 inserciones o supresiones.

El polipéptido, que está contenido en los mutantes conformes al invento, puede ser designado asimismo como polipéptido OpcA, polipéptido OpcA de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, como subunidad OpcA de la glucosa-6fosfato deshidrogenasa, o como subunidad de polipéptido OpcA. En el documento EP 1 108 790 (véase la SEQ ID

25 NO: 1744 en la Tabla 1) el polipéptido OpcA es designado también como proteína de ensamblaje de la glucosa-6fosfato deshidrogenasa (en inglés "glucose 6-phosphate dehydrogenase assembly protein").

En el caso de las bacterias corineformes se prefiere el género Corynebacterium. Se prefieren especialmente unas cepas que segregan aminoácidos, que se basan en las siguientes especies:

Corynebacterium efficiens, tal como por ejemplo la cepa DSM44549,

Corynebacterium glutamicum, tal como, por ejemplo, la cepa ATCC13032,

35 Corynebacterium thermoaminogenes, tal como, por ejemplo, la cepa FERM BP-1539, y

Corynebacterium ammoniagenes, tal como, por ejemplo, la cepa ATCC6871,

prefiriéndose muy especialmente la especie Corynebacterium glutamicum.

Algunos representantes de la especie Corynebacterium glutamicum son conocidos a partir del estado de la técnica también bajo otras denominaciones de especies. A estas pertenecen, por ejemplo:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870,

45 Corynebacterium lilium DSM20137, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, y Brevibacteritium divaricatum ATCC14020.

Unos representantes conocidos de cepas de bacterias corineformes, que segregan aminoácidos, son, por ejemplo,

las cepas que producen L-lisina

55 Corynebacterium glutamicum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) descrita en el documento de patente europea EP 0 358 940, Corynebacterium glutamicum MH20-22B (= DSM16835) descrita en la cita de Menkel y colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)), Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= FermBP-7382)) descrita en el documento EP 1 108 790, Corynebacterium glutamicum NRRL B-11474, descrita en el documento de patente de los EE.UU. US 4.275.157, Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP-3304) descrita en el documento US 5.250.423,

o las cepas que producen L-triptófano

Corynebacterium glutamicum K76 (= FermBP-1847) descrita en el documento US 5.563.052, Corynebacterium glutamicum BPS13 (= FermBP-1777) descrita en el documento US 5.605.818, y Corynebacterium glutamicum FermBP-3055, descrita en el documento US 5.235.940.

Se encuentran datos sobre la clasificación taxonómica de las cepas de este conjunto de bacterias, entre otros lugares, en las citas de Seiler (Journal of General Microbiology, 129, 1433-1477 (1983)), de Kämpfer y Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl y colaboradores (International Journal of Systematic Bacteriology, 41, 255-260 (1991)) y en el documento US-A-5.250.434.

Las cepas con la denominación "ATCC" se pueden adquirir de la American Type Culture Collection (Colección americana de cultivos tipos) (Manassas, VA, EE.UU.). Las cepas con la denominación "DSM" se pueden adquirir de la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares) (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Las cepas con la denominación "FERM" se pueden adquirir del National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Instituto nacional de ciencia y tecnología industrial avanzada (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japón). Las cepas mencionadas de Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539, FERM BP-1540, FERM BP-1541 y FERM BP-1542) se describen en el documento US-A 5.250.434. Las cepas con la denominación "NRRL" se pueden adquirir de la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (Colección de cultivos de patentes del servicio para la investigación agrícola) (ARS, Peoria, Illinois, EE.UU.).

Por el concepto de aminoácidos proteinógenos se entienden los aminoácidos, que se presentan en proteínas naturales, es decir en proteínas de microorganismos, plantas, animales y seres humanos. A éstos pertenecen en particular los L-aminoácidos, que se escogen entre el conjunto que se compone de ácido L-aspártico, L-asparagina, L-treonina, L-serina, ácido L-glutámico, L-glutamina, glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptófano, L-prolina y L-arginina. A los L-aminoácidos pertenece asimismo la L-homoserina.

Los mutantes conformes al invento segregan de manera preferida los mencionados aminoácidos proteinógenos, en particular L-lisina y L-triptófano. El concepto de aminoácidos abarca también sus sales, tales como por ejemplo el monohidrocloruro de lisina o el sulfato de lisina en el caso del aminoácido L-lisina.

Son objeto del invento además unos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo opcA, que codifica un polipéptido OpcA, que está caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido se compone de la SEQ ID NO: 6, en la que

a): en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina,

b): en la posición 219 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-asparagina,

c): en la posición 233 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-serina, y

d): en la posición 261 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina,

abarcando el alelo una secuencia de nucleótidos, que es idéntica a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido, que es obtenible mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediando utilización de un par de cebadores, cuyas secuencias de nucleótidos abarcan en cada caso por lo menos 15 nucleótidos consecutivos, que se escogen entre las posiciones 1 y 334 de la SEQ ID NO: 3 y entre la secuencia de nucleótidos complementaria situada entre las posiciones 1.600 y 1.292 de la SEQ ID NO: 3. Un ejemplo de un tal par de cebadores es el par de cebadores opcA-A1 y opcA-E1 representado en la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12. Como material de partida (ADN de molde, en inglés "template-DNA") se prefiere un ADN cromosomal de bacterias corineformes, que ha sido tratado en particular con un mutágeno. Se prefiere especialmente el ADN cromosomal del género Corynebacterium y se prefiere muy especialmente el de la especie Corynebacterium glutamicum.

Además, se describen unos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo opcA, que codifica un polipéptido OpcA, que abarca una secuencia de aminoácidos con una longitud correspondiente a 319 Laminoácidos, teniendo la secuencia de aminoácidos del polipéptido uno o varios de los aminoácidos, que se escogen entre el conjunto que se compone de:

a) L-histidina en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos,

b) L-asparagina en la posición 219 de la secuencia de aminoácidos,

c) L-serina en la posición 233 de la secuencia de aminoácidos, y

d) L-histidina en la posición 261 de la secuencia de aminoácidos.

Además, son objeto del invento unos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo opcA, que contiene un polipéptido OpcA, que en las posiciones 107 hasta 261 de la secuencia de aminoácidos contiene la secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 107 hasta 261 de la SEQ ID NO: 6. De manera preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado contiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 98 hasta 270 de la SEQ ID NO: 6 o a las posiciones 83 hasta 285 de la SEQ ID NO: 6 o a las posiciones 63 hasta 305 de la SEQ ID NO: 6 o a las posiciones 38 hasta 315 de la SEQ ID NO: 6 o a las posiciones 8 hasta 315 de la SEQ ID NO: 6 o a las posiciones 2 hasta 315 de la SEQ ID NO: 6 o a las posiciones 2 hasta 317 de la SEQ ID NO: 6 o a las posiciones 2 hasta 319 de la SEQ ID NO: 6. De manera muy especialmente preferida, la longitud del polipéptido codificado abarca 319 aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

Además, se describen unos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo opcA, que codifica un polipéptido OpcA, teniendo la secuencia de aminoácidos del polipéptido uno o varios de los aminoácidos, que se escogen entre el conjunto que se compone de:

a): L-histidina en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos,

b): L-asparagina en la posición 219 de la secuencia de aminoácidos,

c): L-serina en la posición 233 de la secuencia de aminoácidos, y

d): L-histidina en la posición 261 de la secuencia de aminoácidos,

y cuya secuencia de aminoácidos es idéntica además por lo menos en un 90 %, de manera preferida por lo menos en un 92 % o por lo menos en un 94 % o por lo menos en un 96 %, y de manera muy especialmente preferida por lo menos en un 97 % o por lo menos en un 98 % o por lo menos en un 99 % o 100 % a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 6 o 2.

Son objeto del invento además unos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo opcA, que codifica un polipéptido OpcA, estando constituida la secuencia de aminoácidos del polipéptido por la SEQ ID NO: 6, en la que

a) en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina,

b) en la posición 219 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-asparagina,

c) en la posición 233 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-serina, y

d) en la posición 261 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina,

y cuya secuencia de nucleótidos es idéntica además por lo menos en un 90 %, de manera preferida por lo menos en un 92 % o por lo menos en un 94 % o por lo menos en un 96 %, y de manera muy especialmente preferida por lo menos en un 97 % o por lo menos en un 98 % o por lo menos en un 99 % o 100 % a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.

Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos de un alelo opcA, que posee por lo menos una identidad de 99 % con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, se muestra en la SEQ ID NO: 7. La secuencia de nucleótidos de este alelo opcA posee, adicionalmente a los intercambios de nucleótidos de timina por citosina en la posición 319, de adenina por citosina en la posición 657, de citosina por timina en la posición 697 y de timina por citosina en la posición 781 (véase la SEQ ID NO: 5), los intercambios de nucleótidos de citosina por timina en la posición 402, de timina por citosina en la posición 600 y de guanina por citosina en la posición 648 (véase la SEQ ID NO: 7). La formulación "guanina por citosina en la posición 648" -y formulaciones comparables - significan que la nucleobase guanina, que está presente en la posición 648 de la secuencia de tipo silvestre de la región codificadora (véase la SEQ ID NO: 1), ha sido reemplazada por citosina (véase la SEQ ID NO: 7).

En el caso de los aminoácidos aromáticos se habla de intercambios conservativos cuando la fenilalanina, el triptófano y la tirosina se intercambian entre sí. En el caso de los aminoácidos hidrófobos se habla de intercambios conservativos cuando la leucina, la isoleucina y la valina se intercambian entre sí. En el caso de los aminoácidos polares se habla de intercambios conservativos cuando la glutamina y la asparagina se intercambian entre sí. En el caso de los aminoácidos de carácter básico se habla de intercambios conservativos cuando la arginina, la lisina e la histidina se intercambian entre sí. En el caso de los aminoácidos de carácter ácido se habla de intercambios conservativos cuando el ácido aspártico y el ácido glutámico se intercambian entre sí. En el caso de los aminoácidos que contienen grupos hidroxilo, se habla de intercambios conservativos cuando la serina y la treonina se intercambian entre sí.

Finalmente, son objeto del invento unos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo opcA, que codifica un polipéptido OpcA, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

Es conocido que la metionina que está situada en un extremo, es eliminada en el caso de la síntesis de proteínas por unas enzimas propias del anfitrión, las denominadas aminopeptidasas,.

Por medio de tales inserciones y supresiones o intercambios conservativos de aminoácidos no es afectada esencialmente la actividad enzimática de las glucosa-6-fosfato deshidrogenasas que contienen la correspondiente subunidad OpcA. El concepto de "no es afectada esencialmente" significa, que la actividad enzimática de las mencionadas variantes se diferencia en como máximo un 10 %, como máximo un 7,5 %, como máximo un 5 %, como máximo un 2,5 % o como máximo un 1 % de la actividad de una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que contiene una subunidad del polipéptido OpcA con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, conteniendo ésta los intercambios de aminoácidos

a): de L-histidina en lugar de L-tirosina en la posición 107,

b): de L-asparagina en lugar de L-lisina en la posición 219,

c): de L-serina en lugar de L-prolina en la posición 233, y

d): de L-histidina en lugar de L-tirosina en la posición 261.

Para la producción de los mutantes conformes al invento se pueden utilizar procedimientos clásicos de mutagénesis in vivo con unas poblaciones celulares de bacterias corineformes mediando utilización de sustancias mutágenas tales como, por ejemplo, la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), el metanosulfato de etilo (EMS), el 5bromouracilo, o de luz ultravioleta. Unos métodos de mutagénesis se describen, por ejemplo, en la obra "Manual of Methods for General Bacteriology" (Manual de métodos de bacteriología general) (de Gerhard y colaboradores (coordinadores de edición), American Society for Microbiology, Washington, DC, EE.UU., 1981) o en la cita de Tosaka y colaboradores (Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978), o en la cita de Konicek y colaboradores (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988). Unas mutagénesis típicas mediando utilización de MNNG comprenden unas concentraciones de 50 a 500 mg/l o también unas concentraciones más altas de hasta como máximo 1 g/l, y un período de tiempo de incubación de 1 a 30 minutos a un pH de 5,5 a 7,5. En estas condiciones, el número de las células capaces de vivir es reducido en una proporción de aproximadamente 50 % a 90 % o de aproximadamente 50 % a 99 % o de aproximadamente 50 % a 99,9 % o más.

A partir de la población mutagenizada de células se sacan y multiplican mutantes o respectivamente células. De manera preferida, en otra etapa adicional se investiga su capacidad de segregar aminoácidos, de manera preferida L-lisina o L-triptófano, en un cultivo de tandas (en inglés "batch") mediando utilización de un medio nutritivo adecuado. Unos adecuados medios nutritivos y unas adecuadas condiciones de ensayo se describen, entre otros, en los documentos US 6.221.636, US 5.840.551, US 5.770.409, US 5.605.818, US 5.275.940 y US 4.224.409. En los casos de utilizaciones de unas instalaciones robóticas apropiadas, tales como las que se describen por ejemplo en la cita de Zimmermann y colaboradores (VDI Berichte n° 1.841, editorial VDI-Verlag, Düsseldorf, Alemania 2004, 439-443) o de Zimmermann (Chemie Ingenieur Technik 77 (4), 426-428 (2005)), se pueden investigar numerosos mutantes en un breve período de tiempo. De esta manera son identificados los mutantes que, en comparación con la cepa parental o respectivamente con la cepa de partida no mutagenizada, segregan aminoácidos de manera multiplicada al medio nutritivo o al interior de las células. A éstos pertenecen, por ejemplo, los mutantes cuya secreción de aminoácidos se ha aumentado por lo menos en un 0,5 %.

A continuación, a partir de los mutantes se pone a disposición o respectivamente se aísla un ADN, y con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa, mediando utilización de unos pares de cebadores, que permiten la amplificación del gen opcA o respectivamente de los alelos opcA conformes al invento o de las mutaciones conformes al invento en las posiciones 107, 219, 233 y 261 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido OpcA, se sintetiza el correspondiente polinucleótido. De manera preferida, el ADN se aísla a partir de aquellos mutantes, que, en comparación con la cepa de partida, segregan aminoácidos en una medida aumentada o los enriquecen en el interior de las células.

A este fin, se pueden se pueden escoger unos pares de cebadores arbitrarios a partir de la secuencia de nucleótidos, que se encuentra corriente arriba y corriente abajo de la mutación conforme al invento, y de la secuencia de nucleótidos complementaria con aquella. Un cebador de un par de cebadores comprende en este caso de manera preferida por lo menos 15, por lo menos 18, por lo menos 20, por lo menos 21 o por lo menos 24 nucleótidos consecutivos, que se escogen entre la secuencia de nucleótidos que se encuentra entre las posiciones 1 y 652 de la SEQ ID NO: 3. El segundo cebador correspondiente de un par de cebadores comprende por lo menos 15, por lo menos 18, por lo menos 20, por lo menos 21 o por lo menos 24 nucleótidos consecutivos, que se escogen a partir de la secuencia complementaria de nucleótidos entre las posiciones 1.600 y 1.118 de la SEQ ID NO: 3. Si se desea la amplificación de la región codificadora, entonces el par de cebadores se escoge de manera preferida a partir de la secuencia de nucleótidos, que se encuentra entre las posiciones 1 y 334 de la SEQ ID NO: 3 y a partir de la secuencia complementaria de nucleótidos que se encuentra entre las posiciones 1.600 y 1.292 de la SEQ ID NO:

3. Si se desea la amplificación de una parte de la región codificadora, tal como se representa en las SEQ ID NO: 15

y 17, entonces el par de cebadores se escoge de manera preferida a partir de la secuencia de nucleótidos que se encuentra entre las posiciones 335 y 652 de la SEQ ID NO: 3 y a partir de la secuencia complementaria de nucleótidos que se encuentra entre las posiciones 1.291 y 1.118 de la SEQ ID NO: 3.

Unos adecuados pares de cebadores son, por ejemplo, el par de cebadores opcA-A1 y opcA-E1, reproducido bajo las SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 y el par de cebadores opcA-int1 y opcA-int2 reproducido bajo las SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14. El cebador puede ser provisto además de unos sitios de reconocimiento para enzimas de restricción, de un grupo de biotina o de otros elementos accesorios, tales como los que se describen dentro del estado de la técnica. La longitud total del cebador es por lo general como máximo de 30, 40, 50 ó 60 nucleótidos.

Para la producción de polinucleótidos mediante amplificación de unas secuencias escogidas, tales como las del alelo opcA conforme al invento, a partir de un ADN dispuesto previamente, por ejemplo cromosomal (ADN de molde), mediante amplificación por medio de una PCR, se emplean por lo general unas polimerasas de ADN termoestables. Ejempos de tales polimerasas de ADN son la polimerasa Taq procedente de Thermus aquaticus, que es distribuida, entre otras, por la entidad Qiagen (Hilden, Alemania), la polimerasa Vent de Thermococcus litoralis, que es distribuida, entre otras, por la entidad New England Biolabs (Francfort, Alemania) o la polimerasa Pfu de Pyrococcus furiosus, que es distribuida, entre otras, por la entidad Stratagene (La Jolla, EE.UU.). Se prefieren unas polimerasas con una actividad de lectura de comprobación (en inglés "proof-reading"). El concepto de "lectura de comprobación" significa que estas polimerasas están en la situación de reconocer a los nucleótidos que han sido introducidos erróneamente y de solventar el error mediante una polimerización renovada (Lottspeich y Zorbas, Bioanalytik, editorial Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania (1998). Ejemplos de polimerasas con actividad de lectura de comprobación son la polimerasa Vent y la polimerasa Pfu.

Las condiciones en la tanda de reacción se ajustan según los datos del fabricante. Las polimerasas son proporcionadas por el fabricante por lo general en común con el tampón habitual, que tiene usualmente unas concentraciones de 10 - 100 mM de Tris/HCl y de 6 - 55 mM de KCl, a un pH de 7,5 - 9,3. El cloruro de magnesio se añade en una concentración de 0,5 -10 mM, en el caso de que no esté contenido en el tampón suministrado por el fabricante. A la tanda de reacción se le añaden además desoxinucleósido-trifosfatos en una concentración de 0,1 16,6 mM. Los cebadores se disponen previamente en la tanda de reacción con una concentración final de 0,1 - 3 μM y el ADN de molde, en el caso óptimo, con 102 hasta 105 copias. También se pueden emplear de 106 hasta 107 copias. La correspondiente polimerasa se añade a la tanda de reacción en una cantidad de 2-5 unidades. Una típica tanda de reacción tiene un volumen de 20 - 100 μl.

Como otras sdicionas se pueden añadir a la reacción albúmina de suero bovino, Tween-20, gelatina, glicerol, formamida o DMSO (Dieffenbach y Dveksler, PCR Primer -A Laboratory Manual (Cebadores de PCR - Un manual de laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory Press, EE.UU. 1995).

Una típica evolución de la PCR se compone de tres diferentes escalones de temperatura, que se repiten consecutivamente. De antemano, la reacción se inicia con un aumento de la temperatura a 92°C - 98°C durante 4 a 10 minutos, con el fin de desnaturalizar el ADN dispuesto previamente. Luego siguen, repitiéndose, en primer lugar una etapa para la desnaturalización del ADN dispuesto previamente durante 10 -60 segundos a aproximadamente 92 -98°C, luego una etapa para la unión de los cebadores al ADN dispuesto previamente durante 10 - 60 segundos a una determinada temperatura, que depende de los cebadores (temperatura de reanillamiento = en inglés “annealing temperature”), que está situada, conforme a la experiencia, en 50°C hasta 60°C, y que se puede calcular individualmente para cada par de cebadores. Informaciones exactas acerca de esto las encontrará un experto en la especialidad en la cita de Rychlik y colaboradores (Nucleic Acids Research 18 (21): 6409-6412). A continuación sigue una etapa de síntesis para la prolongación del cebador dispuesto previamente (extensión) en el valor óptimo de la actividad que se indica en cada caso para la polimerasa, que usualmente, según sea la polimerasa, está situada en el intervalo de 73°C a 67°C, de manera preferida de 72°C a 68°C. La duración de esta etapa de extensión depende de la productividad de la polimerasa y de la longitud del producto de PCR que debe de ser amplificado. En una típica PCR, esta etapa dura 0,5 -8 minutos, de manera preferida 2 - 4 minutos. Estas tres etapas se repiten de 30 hasta 35 veces, eventualmente hasta 50 veces. Una etapa final de extensión durante 4 - 10 minutos finaliza la reacción. Los polinucleótidos producidos de esta manera son designados también como materiales amplificados; el concepto de fragmento de ácido nucleico es asimismo habitual.

Otras instrucciones e informaciones adicionales acerca la PCR las encontrará un experto en la especialidad, por ejemplo, en el manual "PCR-Strategies" (Estrategias de PCR) (Innis, Felfand y Sninsky, Academic Press, Inc., 1995), en el manual de Diefenbach y Dveksler "PCR Primer - a laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995), en el manual de Gait "Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach" (Síntesis de oligonucleótidos: un enfoque práctico) (IRL Press, Oxford, Reino Unido 1984) y en la cita de Newton y Graham "PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994).

La secuencia de nucleótidos se determina a continuación, por ejemplo, según el procedimiento de rotura de la cadena de Sanger y colaboradores (Proceedings of the National Academies of Sciences, EE.UU., 74, 5463-5467 (1977)) con las modificaciones indicadas por Zimmermann y colaboradores (Nucleic Acids Research 18, páginas 1067 y siguientes (1990)), y se analiza el polipéptido codificado por esta secuencia de nucleótidos en particular en lo

que respecta a la secuencia de aminoácidos. Para esto, la secuencia de nucleótidos se introduce en un programa para la traducción de una secuencia de ADN en una secuencia de aminoácidos. Unos programas adecuados son, por ejemplo, el programa "Patentin", que es obtenible de las oficinas de patentes, por ejemplo, de la Oficina de patentes de los EE.UU. (USPTO), o la herramienta de traducción "Translate Tool", que está disponible en el Servidor ExPASy Proteomics en el world wide web (internet) (Gasteiger y colaboradores, Nucleic Acids Research 31, 37843788 (2003).

De esta manera se identifican unos mutantes, cuyos alelos opcA codifican los polipéptidos OpcA, que contienen las mutaciones conformes al invento.

De modo correspondiente, es un objeto del invento un mutante de una bacteria corineforme, que es obtenible mediante las siguientes etapas:

a) tratamiento de una bacteria corineforme, que posee la capacidad de segregar aminoácidos, con un agente mutágeno,

b) aislamiento y multiplicación del mutante producido en a)

c) de manera preferida, determinación de la capacidad del mutante para segregar por lo menos un 0,5 % más de un aminoácido a un medio, o de enriquecerlo en el interior de las células como las de la bacteria corineforme empleada en a),

d) puesta a diposición de un ácido nucleico procedente del mutante obtenido en b)

e) producción de una molécula de ácido nucleico / un material amplificado / un fragmento de ácido nucleico mediando utilización de la reacción en cadena de la polimerasa, del ácido nucleico procedente de d), y de un par de cebadores, que se compone de un primer cebador, que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos que se escogen a partir de la secuencia de nucleótidos que se encuentra entre las posiciones 1 y 334 de la SEQ ID NO: 3, y de un segundo cebador, que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos, que se escogen a partir de la secuencia complementaria de nucleótidos que se encuentra entre las posiciones 1.600 y 1.292 de la SEQ ID NO: 3,

f) determinación de la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácidos nucleicos obtenida en e), y determinación de la secuencia de aminoácidos codificada.

g) eventualmente comparación de la secuencia de aminoácidos determinada en f) con la SEQ ID NO: 6, e

h) identificación de un mutante, que contiene un polinucleótido, que codifica un polipéptido, cuya secuencia de aminoácidos se compone de la SEQ ID NO: 6, en la que

i) en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina,

ii) en la posición 219 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-asparagina,

iii) en la posición 233 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-serina, y

iv) en la posición 261 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina.

Los mutantes obtenidos de este modo contienen típicamente una (1) copia de uno de los alelos opcA que se han descrito. El procedimiento aquí descrito es asimismo un objeto del invento.

En la SEQ ID NO: 5 se reproducen a modo de ejemplo las regiones codificadoras de un alelo opcA de un mutante conforme al invento. La región codificadora del gen de tipo silvestre se reproduce como la SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 1 contiene en las posiciones 319 hasta 321 el codón TAT que codifica el aminoácido L-tirosina. La SEQ ID NO: 5 contiene en la posición 319 la nucleobase citosina. Por medio de esta transición de timina a citosina resulta en las posiciones 319 hasta 321 el codón CAT que codifica el aminoácido L-histidina.

La SEQ ID NO: 1 contiene en las posiciones 655 hasta 657 el codón AAA que codifica el aminoácido L-lisina. La SEQ ID NO: 5 contiene en la posición 657 la nucleobase citosina. Por medio de esta transversión de adenina a citosina resulta en las posiciones 655 hasta 657 el codón AAC que codifica el aminoácido L-asparagina.

La SEQ ID NO: 1 contiene en las posiciones 697 hasta 699 el codón CCA que codifica el aminoácido L-prolina. La SEQ ID NO: 5 contiene en la posición 697 la nucleobase timina. Por medio de esta transición de citosina a timina en resulta en las posiciones 697 hasta 699 el codón TCA que codifica el aminoácido L-serina.

La SEQ ID NO: 1 contiene en las posiciones 781 hasta 783 el codón TAT que codifica el aminoácido L-tirosina. La SEQ ID NO: 5 contiene en la posición 781 la nucleobase citosina. Por medio de esta transición de timina a citosina, resulta en las posiciones 781 hasta 783 el codón CAT que codifica el aminoácido L-histidina.

5 Además de esto, la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID NO: 5 puede contener otros intercambios de bases, que resultan por medio del tratamiento de mutagénesis, pero que no se exteriorizan en una secuencia modificada de aminoácidos.

Tales mutaciones son designadas en el mundo especializado también como mutaciones mudas o neutras. Estas

10 mutaciones mudas pueden estar contenidas asimismo en la bacteria corineforme que se emplea para el tratamiento de mutagénesis. Ejemplos de tales mutaciones mudas son la transición de citosina a timina en la posición 402, la transición de timina a citosina en la posición 600 y la transversión de guanina a citosina en la posición 648 tal como se representa en la SEQ ID NO: 7.

15 Las bacterias corineformes utilizadas para la mutagénesis poseen de manera preferida ya la capacidad de segregar el aminoácido deseado en el medio nutritivo que lo rodea o respectivamente en el caldo de fermentación, o de enriquecerlo en el interior de las células.

Las bacterias corineformes que producen L-lisina, poseen típicamente una aspartato cinasa resistente a la

20 retroalimentación (en inglés "feed back") o respectivamente desensibilizada. Por el concepto de "aspartato cinasas resistentes frente a la retroalimentación" se entienden unas aspartato cinasas que, en comparación con la forma silvestre, tienen una sensibilidad más pequeña frente a la inhibición por mezclas de lisina y treonina o por mezclas de AEC (aminoetilcisteína) y treonina, o por lisina a solas o por AEC a solas. Los genes o respectivamente alelos que codifican estas aspartato cinasas desensibilizadas son designados también como alelos lysCFBR. Dentro del

25 estado de la técnica (Tabla 1) se describen numerosos alelos lysCFBR, que codifican unas variantes de la aspartato cinasa, que poseen intercambios de aminoácidos en comparación con la proteína de tipo silvestre. La región codificadora del gen lysC de tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum correspondiente al número de acceso AX756575 del banco de datos NCBI se representa en la SEQ ID NO: 19 y la proteína codificada por este gen se representa en la SEQ ID NO: 20.

30 Tabla 1 Alelos lysCFBR, que codifican aspartato cinasas resistentes frente a la retroalimentación

Designación del alelo: Otros datos Referencia Número de acceso

lysCFBR-E05108: documento JP 1993184366-A (secuencia 1) E05108

lysCFBR-E06825: lysC A279T documento JP 1994062866-A (secuencia 1) E06825

lysCFBR-E06826: lysC A279T documento JP 1994062866-A (secuencia 2) E06826

lysCFBR-E06827: documento JP 1994062866-A (secuencia 3) E06827

lysCFBR-E08177: documento JP 1994261766-A (secuencia 1) E08177

lysCFBR-E08178: lysC A279T documento JP 1994261766-A (secuencia 2) E08178

lysCFBR-E08179: lysC A279V documento JP 1994261766-A (secuencia 3) E08179

lysCFBR-E08180: lysC S301F documento JP 1994261766-A (secuencia 4) E08180

lysCFBR-E08181: lysC T308I documento JP 1994261766-A (secuencia 5) E08181

lysCFBR-E08182: documento JP 1994261766-A (secuencia 6) E08182

lysCFBR-E12770: documento JP 1997070291-A (secuencia 13) E12770

lysCFBR-E14514: documento JP 1997322774-A (secuencia 9) E14514

lysCFBR-E16352: documento JP 1998165180-A (secuencia 3) E16352

lysCFBR-E16745: documento JP 1998215883-A (secuencia 3) E16745

lysCFBR-E16746: documento JP 1998215883-A (secuencia 4) E16746

Designación del alelo: Otros datos Referencia Número de acceso

lysCFBR-I74588: documento US 5688671-A (secuencia 1) I74588

lysCFBR-I74589: lysC A279T documento US 5688671-A (secuencia 2) I74589

lysCFBR-I74590: documento US 5688671-A (secuencia 7) I74590

lysCFBR-I74591: lysC A279T documento US 5688671-A (secuencia 8) I74591

lysCFBR-I74592: documento US 5688671-A (secuencia 9) I74592

lysCFBR-I74593: lysC A279T documento US 5688671-A (secuencia 10) I74593

lysCFBR-I74594: documento US 5688671-A (secuencia 11) I74594

lysCFBR-I74595: lysC A279T documento US 5688671-A (secuencia 12) I74595

lysCFBR-I74596: documento US 5688671-A (secuencia 13) I74596

lysCFBR-I74597: lysC A279T documento US 5688671-A (secuencia 14) I74597

lysCFBR-X57226: lysC S301Y documento EP 0387527 Kalinowski y colaboradores, Molecular and General Genetics 224:317-324 (1990) X57226

lysCFBR-L16848: lysC G345D Folletie y Sinskey Base de datos de nucleótidos NCBI (1990) L16848

lysCFBR-L27125: lysC R320G lysC G345D Jetten y colaboradores, Applied Microbiology Biotechnology 43:76-82 (1995) L27125

lysCFBR: lysC T311I documento WO0063388 (secuencia 17)

lysCFBR: lysC S301F documento US 3732144

lysCFBR: lysC S381F documento EP 0435132

lysCFBR: lysC S317A documento US 5688671 (secuencia 1)

lysCFBR: lysC T380I documento WO 01/49854

Las bacterias corineformes que segregan L-lisina, poseen típicamente uno o varios de los intercambios de aminoácidos expuestos en lista en la Tabla 1.

5 Se prefieren los siguientes alelos lysCFBR: lysC A279T (intercambio de alanina en la posición 279 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 20 por treonina), lysC A279V (intercambio de alanina en la posición 279 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 20 por valina), lysC S301F (intercambio de serina en la posición 301 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 20 por fenilalanina), lysC T308I (intercambio de treonina en la posición 308 de la proteína aspartato cinasa

10 codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 20 por isoleucina), lysC S301Y (intercambio de serina en la posición 308 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 20 por tirosina), lysC G345D (intercambio de glicina en la posición 345 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 20 por ácido aspártico), lysC R320G (intercambio de arginina en la posición 320 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 20 por glicina), lysC T311I (intercambio de treonina en la posición 311 de la proteína

15 aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 20 por isoleucina), lysC S381F (intercambio de serina en la posición 381 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 20 por fenilalanina) y lysC S317A (intercambio de serina en la posición 317 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 20 por alanina).

20 Se prefieren especialmente el alelo lysCFBR lysC T311I (intercambio de treonina en la posición 311 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 20 por isoleucina), y un alelo lysCFBR que contiene por lo menos un intercambio, que se escoge entre el conjunto que se compone de A279T (intercambio de alanina en la posición 279 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 20 por treonina) y de S317A (intercambio de serina en la posición 317 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:

25 20 por alanina).

El alelo lysCFBR lysC T311I está contenido en la cepa DM1797 depositada en la DSMZ bajo el número DSM16833. El DM1797 es un mutante de Corynebacterium glutamicum ATCC13032.

Un alelo lysCFBR que contiene el intercambio de aminoácidos A279T está contenido en el mutante que ha sido depositado en la NRRL bajo el número NRRL B-11474.

Según el modo descrito más arriba, partiendo de la cepa DM1797, se aísla un mutante designado como DM1825, que contiene un alelo opcA, que codifica un polipéptido OpcA, en el que en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos está contenida L-histidina, en la posición 219 está contenida L-asparagina, en la posición 233 está contenida L-serina y en la posición 261 está contenida L-histidina. La secuencia de nucleótidos de la región codificadora del alelo opcA del mutante DM1825 se representa como la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado se representa como la SEQ ID NO: 8 o respectivamente 10. La SEQ ID NO: 7 contiene en la posición 319 citosina en lugar de timina, en la posición 402 timina en lugar de citosina, en la posición 600 citosina en lugar de timina, en la posición 648 citosina en lugar de guanina, en la posición 657 citosina en lugar de adenina, en la posición 697 timina en lugar de citosina y en la posición 781 citosina en lugar de timina. La formulación "en la posición 648 contiene citosina en lugar de guanina" -y otras formulaciones comparables – significa(n) que la nucleobase guanina que está presente en la secuencia de tipo silvestre de la región codificadora en la posición 648 (véase la SEQ ID NO: 1) ha sido reemplazada por citosina (véase la SEQ ID NO: 7).

En la SEQ ID NO: 9 se indican las secuencias de nucleótidos que están situadas corriente arriba (en inglés "upstream") y corriente abajo (en inglés "downstream") de la SEQ ID NO: 7.

Además de esto, se pueden utilizar unas bacterias corineformes que segregan L-lisina, las cuales tienen una homoserina deshidrogenasa o una homoserina cinasa debilitada o poseen otras propiedas distintas, tales como las que se conocen a partir del estado de la técnica.

Las bacterias corineformes que producen L-triptófano, poseen típicamente una antranilato sintasa resistente a la retroalimentación o respectivamente desensibilizada. Por el concepto de "antranilato sintasa resistente a la retroalimentación" se entienden unas antranilato sintasas que, en comparación con la forma silvestre, tienen una sensibilidad más pequeña frente a la inhibición (de 5 % a 10 %, de 10 % a 15 % o de 10 % a 20 %) por triptófano o 5-fluorotriptófano (Matsui y colaboradores, Journal of Bacteriology 169 (11): 5330 - 5332 (1987)) o por compuestos análogos similares. Los genes o respectivamente alelos, que codifican estas antranilato sintasas desensibilizadas, son designados como alelos trpEFBR. Ejemplos de tales mutantes o respectivamente alelos se describen, por ejemplo, en los documentos US 6180373 y EP 0338474.

Los mutantes obtenidos muestran, en comparación con la cepa de partida o respectivamente con la cepa parental empleada, una segregación o respectivamente una producción aumentadas del aminoácido deseado en un proceso de fermentación.

Es un objeto del invento asimismo un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido OpcA de la glucosa-6fosfato deshidrogenasa, que está caracterizado porque la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 del polipéptido tiene los siguientes aminoácidos:

a): L-histidina en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos,

b): L-asparagina en la posición 219 de la secuencia de aminoácidos,

c): L-serina en la posición 233 de la secuencia de aminoácidos, y

d): L-histidina en la posición 261 de la secuencia de aminoácidos.

El polinucleótido conforme al invento se puede aislar a partir de un mutante conforme al invento.

Además, para la mutagénesis del gen opcA se pueden emplear ciertos métodos in vitro. En el caso de la utilización de métodos in vitro, unos polinucleótidos aislados, que contienen un gen opcA de una bacteria corineforme, de manera preferida el gen de tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum que se ha descrito en el estado de la técnica, son sometidos a un tratamiento mutágeno.

En el caso de los polinucleótidos aislados se puede tratar por ejemplo del ADN total aislado o respectivamente del ADN cromosomal aislado o también de unos materiales amplificados del gen opcA, que se produjeron con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Tales materiales amplificados son designados también como productos de la PCR; el concepto de "fragmento de ácido nucleico" es asimismo habitual. Unas instrucciones para realizar la amplificación de secuencias de ADN con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa las encontrará un experto en la especialidad, entre otros, en el manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (Síntesis de oligonucleótidos: una aproximación práctica) (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) y en la cita de

Newton y Graham: PCR (editorial Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994). Asimismo es posible, introducir el gen opcA que debe de ser mutagenizado, primeramente en un vector, por ejemplo en un bacteriofago o en un plásmido.

Unos métodos adecuados para realizar la mutagénesis in vitro son, entre otros, el tratamiento con hidroxilamina según Miller (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Un breve curso de genética bacteriana. Un manual de laboratorio y un manual para Escherichia coli y bacterias relacionadas con ella), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992), la utilización de oligonucleótidos mutágenos (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger (Tecnología genética para principiantes) editorial Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993 y R. M. Horton: PCR-mediated Recombination and Mutagenesis (Recombinación y mutagénesis mediadas por PCR), Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995) y el empleo de una reacción en cadena de la polimerasa mediando utilización de una polimerasa de ADN, que tiene una alta tasa de errores. Una tal polimerasa de ADN es, por ejemplo, la polimerasa de ADN Mutazyme (estuche para mutagénesis GeneMorph PCR, n° 600550) de la entidad Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.).

Instrucciones y recopilaciones adicionales acerca de la producción de mutaciones in vivo o in vitro se pueden tomar del estado de la técnica y de los libros de texto conocidos de genética y de biología molecular, tales como por ejemplo el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik" (Genética molecular), 6a edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995)), el de Winnacker ("Gene und Klone" (Genes y clones), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann ("Allgemeine Genetik" (Genética general), editorial Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Un objeto del invento es además un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido OpcA, que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 con una longitud de 319 aminoácidos y que contiene los siguientes

aminoácidos

a): L-histidina en la posición 107

b): L-asparagina en la posición 219

c): L-serina en la posición 233, y

d): L-histidina en la posición 261.

Un objeto del invento es además un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido OpcA, que contiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 98 hasta 270 de la SEQ ID NO: 6 o a las posiciones 83 hasta 285 de la SEQ ID NO: 6 o a las posiciones 63 hasta 305 de la SEQ ID NO: 6 o a las posiciones 38 hasta 315 de la SEQ ID NO: 6 o a las posiciones 8 hasta 315 de la SEQ ID NO: 6 o a las posiciones 2 hasta 315 de la SEQ ID NO: 6 o a las posiciones 2 hasta 317 de la SEQ ID NO: 6 o a las posiciones 2 hasta 319 de la SEQ ID NO: 6. De manera muy especialmente preferida, la longidud del polipéptido codificado abarca los 319 aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

Un objeto del invento es además un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido OpcA, que está caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido se compone de la SEQ ID NO: 6, en la que

c) en la posición 233 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-serina, y

y que abarca una secuencia de nucleótidos, que es idéntica a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido, que es obtenible mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediando utilización del par de cebadores, cuyas secuencias de nucleótidos abarcan en cada caso por lo menos 15 nucleótidos consecutivos, que se escogen a partir de la secuencia de nucleótidos, que se encuentra entra las posiciones 1 y 334 de la SEQ ID NO: 3 y a partir de la secuencia complementaria de nucleótidos, que se encuentra entre las posiciones 1.600 y 1.292 de la SEQ ID NO: 3. Un ejemplo de un adecuado par de cebadores se expone en las SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12. Como material de partida (ARN de molde) se prefiere un ADN cromosomal de bacterias corineformes, que han sido tratadas en particular con un agente mutágeno. Se prefiere especialmente el ADN cromosomal del género Corynebacterium y se prefiere muy especialmente el de la especie Corynebacterium glutamicum.

Además, es un objeto del invento un polinucleótido aislado, que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos complementaria con la SEQ ID NO: 5 o 7, y que codifica un polipéptido OpcA, cuya secuencia de aminoácidos se compone de la SEQ ID NO: 6, en la que

c) en la posición 233 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-serina, y

Instrucciones para realizar la hibridación de ácidos nucleicos o respectivamente de polinucleótidos, las puede encontrar un experto en la especialidad, entre otros, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" (Guía para usuarios del sistema DIG para la hibridación en filtro) de la entidad Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en la cita de Liebl y colaboradores (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). La hibridación tiene lugar en condiciones rigurosas, es decir, que sólo se forman unos híbridos, en los que la sonda, es decir un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos complementaria a las SEQ ID NO: 5, 7 o 9 y la secuencia diana, es decir los polinucleótidos que han sido tratados o respectivamente identificados con la sonda, son idénticas por lo menos en un 90 %. Es conocido que la rigurosidad de la hibridación, inclusive las etapas de lavado, puede ser influida o respectivamente determinada mediante variación de la composición del tampón, de la temperatura y de la concentración de sales. La reacción de hibridación se lleva a cabo en general con una rigurosidad relativamente baja en comparación con las etapas de lavado (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Reino Unido, 1996).

Para la reacción de hibridación se puede emplear, por ejemplo, un tampón correspondiente al tampón 5x SSC, a una temperatura de aproximadamente 50°C - 68°C. En este caso, unas sondas se pueden hibridar también con unos polinucleótidos, que tienen una identidad de menos que un 90 % con la secuencia de nucleótidos de la sonda empleada. Tales híbridos son menos estables y son eliminados mediante lavado en condiciones rigurosas. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante disminución de la concentración de sales hasta 2x SSC y eventualmente a continuación hasta 0,5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995), ajustándose una temperatura de aproximadamente 50°C - 68°C, aproximadamente 52°C - 68°C, aproximadamente 54°C -68°C, aproximadamente 56°C - 68°C, aproximadamente 58°C - 68°C, aproximadamente 60°C - 68°C, aproximadamente 62°C -68°C, aproximadamente 64°C -68°C y aproximadamente 66°C -68°C. Se prefieren los intervalos de temperaturas de aproximadamente 64°C - 68°C o aproximadamente 66°C - 68°C. Eventualmente es posible disminuir la concentración de sales hasta una concentración correspondiente a 0,2x SSC o 0,1x SSC. Eventualmente, el tampón SSC contiene dodecilsulfato de sodio (SDS) en una concentración de 0,1 %. Mediante un aumento escalonado de la temperatura de hibridación en escalones de aproximadamente 1 - 2°C, desde 50°C hasta 68°C, se pueden aislar unos fragmentos de polinucleótidos, que poseen una identidad de por lo menos un 90 % o de por lo menos un 91 %, de manera preferida de por lo menos un 92 % o por lo menos un 93 % o por lo menos un 94 % o por lo menos un 95 % o por lo menos un 96 %, y de manera especialmente preferida de por lo menos un 97 % o por lo menos un 98 % o por lo menos un 99 % con la secuencia

o respectivamente con la secuencia complementaria de la sonda empleada, y que codifican un polipéptido OpcA, que contiene el intercambio de aminoácidos conforme al invento. La secuencia de nucleótidos del polinucleótido obtenido de esta manera se determina con métodos conocidos. Otras instrucciones para realizar la hibridación son obtenibles en el mercado en forma de los denominados estuches (por ejemplo el DIG Easy Hyb de la entidad Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, n° de catálogo 1603558). Las secuencias de nucleótidos obtenidas de esta manera codifican unos polipéptidos OpcA, que son idénticos en por lo menos un 90 %, de manera preferida en por lo menos un 92 % o por lo menos un 94 % o por lo menos un 96 %, y de manera muy especialmente preferida en por lo menos un 97 % o por lo menos un 98 % o por lo menos un 99 % con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 2, que contienen cuatro intercambios de aminoácidos conformes al invento.

Un objeto del invento es además un polinucleótido aislado, que codifica el polipéptido de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, escogiéndose la secuencia de aminoácidos del polipéptido entre el conjunto que se compone de

a) la SEQ ID NO: 6, en la que

en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina

en la posición 219 se encuentra L-asparagina

en la posición 233 se encuentra L-serina y

en la posición 261 se encuentra L-histidina

b) la SEQ ID NO: 6, en la que, aparte de las mencionadas mutaciones, se encuentran como máximo

5 intercambios conservativos de aminoácidos y

c) la SEQ ID NO: 6, en la que, aparte de las mencionadas mutaciones, se encuentran como máximo

5 inserciones o supresiones.

c) en la posición 233 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-serina,

d) en la posición 261 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina, Un objeto del invento es además un polinucleótido aislado

y que abarca una secuencia de nucleótidos, que además es idéntica por lo menos en un 90 %, de manera preferida por lo menos en un 92 % o por lo menos en un 94 % o por lo menos en un 96 %, y de manera muy especialmente preferida por lo menos en un 97 % o por lo menos en un 98 % o por lo menos en un 99 % a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.

Un ejemplo de un polinucleótido, que codifica un polipéptido OpcA conforme al invento, y que posee una secuencia de nucleótidos, que es idéntica por lo menos en un 99 % A la SEQ ID NO: 5, se expone en la SEQ ID NO: 7. La secuencia de nucleótidos de este alelo opcA posee, adicionalmente a los intercambios de nucleótidos de timina por citosina en la posición 319, de adenina por citosina en la posición 657, de citosina por timina en la posición 697 y de timina por citosina en la posición 781 (véase la SEQ ID NO: 5), los intercambios de nucleótidos de citosina por timina en la posición 402, de timina por citosina en la posición 600, y de guanina por citosina en la posición 648 (véase la SEQ ID NO: 7). La formulación "de guanina por citosina en la posición 648" - y formulaciones comparables significa(n) que la nucleobase guanina, que está presente en la posición 648 en la secuencia de tipo silvestre de la región codificadora (véase la SEQ ID NO: 1) ha sido reemplazada por citosina (véase la SEQ ID NO: 7).

Un objeto del invento es además un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido OpcA, que abarca la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 inclusive una prolongación junto al terminal de N o C en por lo menos un (1) aminoácido. Esta prolongación no es de más que 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 ó 2 aminoácidos o respectivamente restos de aminoácidos.

Un objeto del invento es además un polinucleótido aislado, que abarca la secuencia de nucleótidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 5 o 7.

Un objeto del invento es finalmente un polinucleótido aislado, que contiene el alelo opcA del mutante DM1825.

Un objeto del invento es además un polinucleótido aislado, que abarca una parte de la región codificadora de un alelo opcA conforme al invento, abarcando el polinucleótido aislado en cualquier caso la parte de la región codificadora que contiene los cuatro intercambios de aminoácidos conformes al invento. El concepto de "la parte de la región codificadora" significa que o bien el codón de inicio (típicamente ATG o GTG), o el último codón codificador (en el presente caso GTC correspondientemente a las posiciones 955 -957 de la SEQ ID NO: 5), o los dos, están ausentes en el polinucleótido aislado.

Se prefieren unas moléculas de ácidos nucleicos, que codifican por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 98 hasta 270 de la SEQ ID NO: 6, o por lo menos correspondiente a las posiciones 83 hasta 285 de la SEQ ID NO: 6, o por lo menos correspondiente a las posiciones 63 hasta 305 de la SEQ ID NO: 6, o por lo menos correspondiente a las posiciones 38 hasta 315 de la SEQ ID NO: 6, o por lo menos correspondiente a las posiciones 8 hasta 315 de la SEQ ID NO: 6.

El marco de lectura, que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 98 hasta 270 de la SEQ ID NO: 6 se representa asimismo como la SEQ ID NO: 15. La SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia de aminoácidos codificada por este marco de lectura. La posición 10 en la SEQ ID NO: 16 corresponde a la posición 107 de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10. La posición 122 en la SEQ ID NO: 16 corresponde a la posición 219 de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10. La posición 136 en la SEQ ID NO: 16 corresponde a la posición 233 de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ó 10. La posición 164 en la SEQ ID NO: 16 corresponde a la posición 261 de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ó

10.

Se prefieren muy especialmente unas moléculas de ácidos nucleicos, que abarcan por lo menos una secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 292 hasta 810 de las SEQ ID NO: 5 ó 7, o por lo menos una secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 247 hasta 855 de las SEQ ID NO: 5 ó 7, o por lo menos una secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 187 hasta 915 de las SEQ ID NO: 5 ó 7, o por lo menos una secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 112 hasta 948 de las SEQ ID NO: 5 ó 7, o por lo menos una secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 22 hasta 948 de las SEQ ID NO: 5 ó 7.

El marco de lectura correspondiente a las posiciones 292 hasta 810 de la SEQ ID NO: 5 se representa como la SEQ ID NO: 15. La correspondiente secuencia de aminoácidos codificada se representa como la SEQ ID NO: 16. El marco de lectura correspondiente a las posiciones 292 hasta 810 de la SEQ ID NO: 7 se representa como la SEQ ID NO: 17. La correspondiente secuencia de aminoácidos codificada se representa como la SEQ ID NO: 18.

Los marcos de lectura conformes al invento pueden contener, además de esto, una o varias mutaciones, que dan lugar como máximo a cinco intercambios conservativos de aminoácidos. De manera preferida, las mutaciones dan lugar a como máximo un 4 %, como máximo un 2 % o como máximo un 1 % de intercambios conservativos de aminoácidos. Además, los marcos de lectura conformes al invento pueden contener una o varias mutaciones mudas. De manera preferida, los marcos de lectura conformes al invento contienen como máximo un 4 % y de manera especialmente preferida como máximo un 2 % hasta como máximo un 1 % de mutaciones mudas.

Los polinucleótidos aislados conformes al invento pueden ser utilizados para producir unas cepas recombinantes de microorganismos que, en comparación con la cepa de partida -o respectivamente con la cepa parental -, entregan de manera mejorada aminoácidos al medio circundante o los acumulan en el interior de las células.

Un método propagado para la incorporación de mutaciones en genes de bacterias corineformes es el del intercambio de alelos, que se conoce también bajo la designación "reemplazo de genes" (en inglés "gene replacement"). En el caso de este procedimiento, un fragmento de ADN, que contiene la mutación interesante, es transferido a la cepa deseada de una bacteria corineforme y la mutación es incorporada mediante por lo menos dos sucesos de recombinación o respectivamente dos sucesos de cruzamiento (en inglés "cross over") en el cromosoma de la cepa deseada o respectivamente la secuencia de un gen que está presente en la respectiva cepa, se intercambia por la secuencia mutada.

Este método fue utilizado por Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991) para incorporar un alelo lysA, que llevaba una supresión, en el cromosoma de C. glutamicum en lugar del gen de tipo silvestre. De igual manera, se incorporó un alelo lysA, que llevaba una inserción, en el cromosoma de C. glutamicum en lugar del gen de tipo silvestre. Este método fue empleado por Schäfer y colaboradores (Gene 145, 69-73 (1994)) para incorporar una supresión en el operón hom-thrB de C. glutamicum. Este método fue empleado por Nakagawa y colaboradores (documento EP 1108790) y Ohnishi y colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 217-223 (2002)) para incorporar diferentes mutaciones partiendo de alelos aislados en el cromosoma de C. glutamicum. De esta manera, Nakagawa y colaboradores consiguieron incorporar una mutación designada como Val59Ala en el gen para la homoserina deshidrogenasa (hom), una mutación designada como Thr311Ile en el gen para la aspartato cinasa (lysC o respectivamente ask), una mutación designada como Pro458Ser en el gen para la piruvato carboxilasa (pyc) y una mutación designada como Ala213Thr en el gen para la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa designado como gen zwf de C. glutamicum.

Para un procedimiento conforme al invento se puede utilizar un polinucleótido conforme al invento, que abarca toda la región codificadora, tal como se expone por ejemplo en las SEQ ID NO: 5 ó 7, o que abarca una parte de la región codificadora, tal como, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos, que codifica por lo menos la secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 98 hasta 270 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, y que se representan como las SEQ ID NO: 15 y 17. La parte de la región codificadora correspondiente por lo menos a las SEQ ID NO: 15 ó 17 tiene una longitud de ≥ 519 nucleobases. Se prefieren aquellas partes de la región codificadora, que tienen una longitud de ≥ 747 nucleobases, tales como, por ejemplo, unas moléculas de ácidos nucleicos que codifican por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 63 hasta 305 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8. Se prefieren muy especialmente aquellas partes de la región codificadora, cuya longitud es de ≥ 834 nucleobases, tales como por ejemplo unas moléculas de ácidos nucleicos que codifican por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 38 hasta 315 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8.

El fragmento de ADN, que contiene la mutación interesante, se presenta en el caso de este método típicamente dentro de un vector, en particular un plásmido, que preferiblemente no es replicado o lo es sólo de un modo restringido por la cepa que debe de ser provista de la mutación. Como anfitrión auxiliar o intermedio, en el que es replicable el vector, se utiliza por lo general una bacteria del género Escherichia, de manera preferida de la especie Escherichia coli.

Ejemplos de tales vectores de plásmidos son los vectores pK*mob y pK*mobsacB, tales como, por ejemplo pK18mobsacB, descritos por Schäfer y colaboradores (Gene 145, 69-73 (1994)) y los vectores descritos en los documentos de solicitudes de patentes europeas WO 02/070685 y WO 03/014362. Éstos son replicativos en Escherichia coli, pero no en bacterias corineformes. Se adecuan especialmente unos vectores, que contienen un gen que actúa de un modo dominante negativo condicional, tal como, por ejemplo, el gen sacB (gen de la levano sucrasa) de, por ejemplo, Bacillus, o el gen galK (gen de la galactosa cinasa) de, por ejemplo, Escherichia coli. (Por el concepto de "un gen, que actúa de un modo dominante negativo condicional" se entiende un gen, que en determinadas condiciones es desventajoso, por ejemplo tóxico, para el anfitrión, pero que en otras condiciones no tiene repercusiones negativas sobre el anfitrión que lleva el gen). Éstas hacen posible la selección en cuanto a unos sucesos de recombinación, en los que el vector es eliminado desde el cromosoma. Además, por Nakamura y colaboradores (documento US-A-6.303.383) se describió un plásmido sensible frente a la temperatura para bacterias corineformes, que sólo se puede replicar a unas temperaturas situadas por debajo de 31°C.

El vector es transferido a continuación por conjugación, por ejemplo según el método de Schäfer (Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)) o por transformación, por ejemplo según el método de Dunican y Shivnan

(Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989) o según el método de Thierbach y colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)) a la bacteria corineforme. Eventualmente, la transferencia del ADN se puede alcanzar también mediante un bombardeo con partículas.

Después de una recombinación homóloga por medio de un primer suceso de cruzamiento, que da lugar a una integración, y de un segundo adecuado suceso de cruzamiento, que da lugar a una excisión en el gen diana o respectivamente en la secuencia diana, se consigue la introducción de la mutación y se obtiene una bacteria recombinante.

Para realizar la identificación y la caracterización de las cepas obtenidas, se pueden emplear, entre otros, los métodos de la hibridación por transferencia de borrón Southern, la reacción en cadena de la polimerasa, la determinación de las secuencias, el método de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia ("Fluorescence Resonance Energy Transfer", FRET) (Lay y colaboradores Clinical Chemistry 43, 2262-2267 (1997) o métodos de la enzimología.

Un objeto adicional de la descripción es, de modo correspondiente, un procedimiento para la producción de una bacteria corineforme, en el que

(a): se transfiere un polinucleótido conforme al invento a una bacteria corineforme

(b): el gen opcA, que está presente en el cromosoma de la bacteria corineforme, que codifica una secuencia de aminoácidos con L-tirosina en la posición 107, L-lisina en la posición 219, L-prolina en la posición 233 y L-tirosina en la posición 261, se intercambia por el polinucleótido procedente de a),

(c): se multiplica y reproduce la bacteria corineforme obtenida de acuerdo con las etapas a) y b).

De esta manera se obtiene una bacteria corineforme recombinante que, en lugar del gen opcA de tipo silvestre, contiene un (1) alelo opcA conforme al invento.

Otro procedimiento para la producción de un microorganismo consiste en que

a) se transfiere un polinucleótido conforme al invento, que contiene un polipéptido opcA, a un microorganismo,

b) se replica el polinucleótido en el microorganismo, y

c) se multiplica y reproduce el microorganismo obtenido de acuerdo con las etapas a) y b).

De esta manera se obtiene un microorganismo recombinante, que contiene por lo menos una (1) copia o varias copias de un polinucleótido conforme al invento, que codifica un polipéptido OpcA, el cual está caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido tiene uno o varios de los aminoácidos, que se escogen entre el conjunto que se compone de:

a) L-histidina en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos,

b) L-asparagina en la posición 219 de la secuencia de aminoácidos,

c) L-serina en la posición 233 de la secuencia de aminoácidos, y

d) L-histidina en la posición 261 de la secuencia de aminoácidos.

Otros objetos del invento son de modo correspondiente, anfitriones o respectivamente células anfitrionas, de manera preferida microorganismos, de manera especialmente preferida bacterias corineformes y bacterias del género Escherichia, que contienen los polinucleótidos conformes al invento. Asimismo, son objeto del invento unos microorganismos, que se habían producido mediando utilización de los polinucleótidos aislados. Tales microorganismos o bacterias se designan también como microorganismos recombinantes o bacterias recombinantes. De igual manera, son un objeto del invento unos vectores que contienen los polinucleótidos conformes al invento. Finalmente, son asimismo un objeto del invento unos anfitriones que contienen estos vectores.

Los polinucleótidos aislados conformes al invento pueden ser utilizados asimismo para conseguir una sobreexpresión de los polipéptidos codificados por ellos.

Por el concepto de "sobreexpresión" se entiende por lo general un aumento de la concentración o de la actividad intracelular de un ácido ribonucleico, de una proteína o de una enzima. En el caso del presente invento, se

sobreexpresan unos alelos opcA o respectivamente unos polinucleótidos, que codifican los polipéptidos OpcA conformes al invento.

Es conocido que mediante unas enzimas propias del anfitrión - las denominadas aminopeptidasas - se pueden separar aminoácidos N-terminales, en particular la metionina N-terminal, desde el polipéptido formado.

El mencionado aumento de la concentración o de la actividad de un producto génico se puede conseguir, por ejemplo, mediante el recurso de que el número de copias de los correspondientes polinucleótidos se aumenta en por lo menos una copia.

Un método ampliamente propagado para el aumento del número de copias consiste en que el correspondiente gen o alelo se incorpora en un vector, de manera preferida un plásmido, que es replicado por una bacteria corineforme. Unos vectores de plásmidos adecuados son por ejemplo el pZ1 (Menkel y colaboradores, Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) o los vectores pSELF descritos por Tauch y colaboradores (Journal of Biotechnoloy 99, 79-91 (2002). Un artículo recopilativo sobre el tema de plásmidos en Corynebacterium glutamicum se encuentra en la cita de Tauch y colaboradores (Journal of Biotechnolgy 104, 27-40 (2003)).

Otro método propagado para la consecución de una sobreexpresión es el procedimiento de la amplificación cromosomal de genes. En el caso de este método, por lo menos una copia adicional del gen o alelo interesante se introduce en el cromosoma de una bacteria corineforme.

En una forma de realización, tal como se ha descrito por ejemplo en la cita de Reinscheid y colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) para el operón hom-thrB, un plásmido, que no se replica en C. glutamicum, el cual contiene el gen interesante, se transfiere a una bacteria corineforme. Después de una recombinación homóloga, mediante un suceso de cruzamiento, la cepa resultante contiene por lo menos dos copias del correspondiente gen o respectivamente alelo.

En otra forma de realización, que se describe en los documentos WO 03/040373 y de solicitud de patente de los EE.UU. US-2003-0219881-A1, una o varias copia(s) del gen interesante se introduce(n) mediante por lo menos dos sucesos de cruzamiento en un sitio deseado del cromosoma de C. glutamicum. De esta manera se incorporó, por ejemplo, una copia de un alelo lysC, que codifica una aspartato cinasa insensible para L-lisina, en el gen gluB de C. glutamicum.

En otra forma de realización, que se describe en los documentos WO 03/014330 y US-2004-0043458-A1, mediante por lo menos dos sucesos de recombinación se incorpora en el sitio natural por lo menos otra copia más del gen interesante, de manera preferida en una disposición en tandem con respecto al gen o alelo que ya está presente. De esta manera se consiguió por ejemplo una duplicación en tandem de un alelo lysCFBR junto al sitio natural del gen lysC.

Otro método para la consecución de una sobreexpresión consiste en unir el correspondiente gen o respectivamente alelo de un modo funcional (en inglés "operably linked") con un promotor o respectivamente una casete de expresión. Unos promotores adecuados para Corynebacterium glutamicum se describen, a modo de ejemplo, en el artículo recopilativo de Patek y colaboradores (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003). Además, se pueden utilizar los promotores T3, T7, SP6, M13, lac, tac y trc, que son suficientemente conocidos, y que han sido descritos en las citas de Amann y colaboradores (Gene 69(2), 301-315 (1988)) y Amann y Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)). Un tal promotor puede ser introducido, por ejemplo, corriente arriba de la región codificadora de un alelo opcA conforme al invento, típicamente a una distancia de aproximadamente 1 - 500 o 1 - 334 nucleótidos desde el codón de inicio, de una bacteria corineforme recombinante. Un tal promotor se puede introducir naturalmente asimismo corriente arriba del alelo opcA de un mutante conforme al invento. Además, es posible unir un polinucleótido aislado conforme al invento, que codifica una variante conforme al invento del polipéptido OpcA, con un promotor, e incorporar la unidad de expresión obtenida en un plásmido, que se replica extracromosomalmente, o en el cromosoma de una bacteria corineforme.

Además de esto, se pueden mutar las regiones de promotor y regulación, o el sitio de fijación a ribosomas, que se encuentra corriente arriba del gen estructural. Por medio de unas medidas para la prolongación de la duración de vida del ARNm (ARN mensajero) se mejora asimismo la expresión. Además, mediante evitación de la degradación de la proteína enzimática se puede reforzar asimismo la actividad enzimática. Alternativamente, se puede conseguir además una sobreexpresión del correspondiente gen o alelo mediante una modificación de la composición del medio y mediante la realización del cultivo.

Mediante las medidas de sobreexpresión se aumenta la actividad o concentración de la correspondiente proteína por lo general por lo menos en un 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 %, como máximo hasta un 1.000 % o 2.000 %, referido a la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida o respectivamente en la cepa parental. Por el concepto de "un microorganismo de partida" o de "una cepa parental" se entiende un microorganismo, en el que se llevan a cabo las medidas del invento.

La concentración de la proteína se puede determinar en el gel por medio de una separación de proteínas en un gel uni- o bidimensional (de 1 y 2 dimensiones) y de una subsiguiente identificación óptica de la concentración de proteínas con un correspondiente software de evaluación. Un método habitual para la preparación de los geles para proteínas en el caso de bacterias corineformes y para la identificación de las proteínas lo constituye el modo de proceder descrito por Hermann y colaboradores (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001). La concentración de las proteínas se puede determinar asimismo mediante una hibridación por transferencia de borrón Western con un anticuerpo que es específico para la proteína que debe de ser detectada (Sambrook y colaboradores, Molecular cloning: a laboratory manual. 2a edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) y una subsiguiente evaluación óptica con un correspondiente software para la determinación de la concentración (Lohaus y Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2.630-2.647 (1999)).

De modo correspondiente, son objeto del invento unos procedimientos para la sobreexpresión de los polipéptidos OpcA conformes al invento. Un procedimiento conforme al invento para la sobreexpresión consiste, entre otras cosas, en que se aumenta el número de copias de un polinucleótido conforme al invento, que codifica una variante del polipéptido OpcA conforme al invento, en por lo menos una (1) o varias copias. Otro procedimiento conforme al invento consiste en que se une un promotor funcional con un polinucleótido.

Son objeto del invento además unos microorganismos que tienen en el interior de sus células una concentración aumentada de un polipéptido OpcA conforme al invento. Eventualmente, estos microorganismos poseen una actividad aumentada de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en el interior de sus células.

Adicionalmente, para realizar la producción mejorada de L-aminoácidos puede ser ventajoso sobreexpresar en los mutantes o en las cepas recombinantes conformes al invento una o varias enzimas de la respectiva ruta de biosíntesis, de la glicolisis, de las reacciones anapleróticas, del ciclo del ácido cítrico, del ciclo del fosfato de pentosa, de la exportación de aminoácidos, y eventualmente unas proteínas reguladoras. La utilización de genes endógenos es preferida por lo general.

Por el concepto de "genes endógenos" o de "secuencias endógenas de nucleótidos" se entienden los genes o respectivamente las secuencias de nucleótidos o alelos, que están presentes en la población de una especie.

Así, para la producción de L-lisina se puede(n) sobreexpresar uno o varios de los genes, que se escogen entre el conjunto que se compone de

•: un gen dapA, que codifica la dihidrodipicolinato sintasa, tal como por ejemplo el gen dpaA de tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito en el documento EP 0 197 335,

•: un gen zwf, que codifica una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, tal como por ejemplo el gen zwf de tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito en los documentos de solicitud de patente japonesa JP-A-09224661 y de solicitud de patente europea EP-A-1108790,

•: el alelo zwf de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito en el documento US-2003-0175911-A1, que codifica una proteína, en la que, por ejemplo, la L-alanina en la posición 243 de la secuencia de aminoácidos ha sido reemplazada por L-treonina, o en la que el ácido L-aspártico ha sido reemplazado en la posición 245 por L-serina,

•: un gen pyc, que codifica una piruvato carboxilasa, tal como, por ejemplo, el gen pyc del tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum, que se describe en los documentos de solicitud de patente alemana DE-A198 31609 y EP 1108790,

•: el alelo pyc de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito en el documento EP 1 108 790, que codifica una proteína, en la que la L-prolina en la posición 458 de la secuencia de aminoácidos ha sido reemplazada por L-serina,

•: el alelo pyc de Corynebacterium glutamicum, que se describe en el documento WO 02/31158, que codifica unas proteínas, que llevan de acuerdo con la reivindicación 1 uno o varios de los intercambios de aminoácidos, escogidos entre el conjunto que se compone de ácido L-glutámico en la posición 153 reemplazado por ácido L-aspártico, L-alanina en la posición 182 reemplazada por L-serina, L-alanina en la posición 206 reemplazada por L-serina, L-histidina en la posición 227 reemplazada por L-arginina, L-alanina en la posición 452 reemplazada por glicina y ácido L-aspártico en la posición 1.120 reemplazado por ácido L-glutámico (la Figura 2A del documento WO 02/31158 indica dos diferentes posiciones de partida para la piruvato carboxilasa, que se diferencian en una longitud correspondiente a 17 aminoácidos. De modo correspondiente, la posición 153 de acuerdo con la reivindicación 1 del documento WO 02/31158 corresponde a la posición 170 de la Fig. 2A del documento 02/31158, la posición 182 de acuerdo con la reivindicación 1 corresponde a la posición 199 de la Fig. 2A, la posición 206 de acuerdo con la reivindicación 1 corresponde a la posición 223 de la Fig. 2A, la posición 227 de acuerdo con la

reivindicación 1 corresponde a la posición 244 de la Fig. 2A, la posición 452 de acuerdo con la reivindicación 1 corresponde a la posición 469 de la Fig. 2A, la posición 1.120 de acuerdo con la reivindicación 1 corresponde a la posición 1.137 de la Fig. 2B. En la Figura 2A del documento WO 02/31158 se indica además un intercambio de aminoácidos de A (alanina) por G (glicina) en la posición

472. La posición 472 de la proteína con la secuencia MTA en el extremo terminal de N corresponde a la posición 455 de la proteína con la secuencia MST en el extremo terminal de N de acuerdo con la Fig. 2A. En la Fig. 2B del documento WO 02/31158 se indica además un intercambio de aminoácidos de D (ácido aspártico) por E (ácido glutámico) en la posición 1.133 de la proteína con la MTA en el extremo terminal de N),

•: un gen lysC que codifica una aspartato cinasa, tal como por ejemplo el gen lysC de tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito como la SEQ ID NO: 281 en el documento EP-A-1108790 (véanse también los números de acceso AX120085 y 120365) y el que se ha descrito como la SEQ ID NO: 25 en el documento WO 01/00843 (véase el número de acceso AX063743),

•: un alelo lysCFBR que codifica una variante de la aspartato cinasa resistente a la retroalimentación, en particular correspondiente a la Tabla 1,

•: un gen lysE que codifica una proteína exportadora de lisina, tal como por ejemplo el gen lysE del tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito en el documento DE-A-195 48 222,

•: el gen zwa1 del tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína Zwa1 (documento US 6.632.644).

Además, para la producción de L-lisina puede ser ventajoso, junto a la utilización de los alelos del gen opcA conformes al invento, debilitar o desconectar simultáneamente uno o varios genes endógenos, que se escogen entre el conjunto que se compone de

•: un gen pgi, que codifica una glucosa-6-fosfato isomerasa, tal como, por ejemplo, el gen pgi de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito en los documentos US 6.586.214 y US 6.465.238,

•: un gen hom, que codifica una homoserina deshidrogenasa, tal como, por ejemplo, el gen hom de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito en el documento EP-A-0131171,

•: un gen thrB, que codifica la homoserina cinasa, tal como, por ejemplo, el gen thrB de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito por Peoples y colaboradores (Molecular Microbiology 2 (1988): 63 - 72)) y

•: un gen pfkB, que codifica la fosfofructocinasa, tal como, por ejemplo, el gen pfkB de Corynebacterium glutamicum descrito en el documento WO 01/00844 (secuencia n° 57).

El concepto de "debilitamiento" describe en este contexto la disminución o desconexión de la actividad intracelular de una o varias enzima(s) (proteína(s)) en un microorganismo, que es (son) codificada(s) por el correspondiente ADN, mediante el recurso de que, por ejemplo, se utiliza un promotor débil o se utiliza un gen o respectivamente alelo, que codifica una correspondiente enzima con una baja actividad o respectivamente se desactiva el correspondiente gen o la correspondiente enzima (proteína) y eventualmente se combinan estas medidas.

Mediante las medidas del debilitamiento se reduce la actividad o concentración de la correspondiente proteína por lo general en un 0 hasta 75 %, un 0 hasta 50 %, un 0 hasta 25 %, un 0 hasta 10 % o un 0 hasta 5 % de la actividad o concentración de la proteína de tipo silvestre, o respectivamente de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.

Como mutaciones para la producción de un debilitamiento entran en consideración transiciones, transversiones, inserciones y supresiones de por lo menos un (1) par de bases o respectivamente nucleótido. En dependencia del efecto del intercambio de aminoácidos, provocado por la mutación, sobre la actividad enzimática, se habla de mutaciones en un sentido erróneo (en inglés "missense mutations") o de mutaciones sin sentido (en inglés "nonsense mutations”). La mutación en un sentido erróneo conduce a un intercambio de un aminoácido dado en una proteína por otro distinto, tratándose en particular de un intercambio no conservativo de aminoácidos. De esta manera, se perjudica la capacidad de funcionar o respectivamente la actividad de la proteína y se reduce a un valor de 0 a 75 %, de 0 a 50 %, de 0 a 25 %, de 0 a 10 % o de 0 a 5 %. La mutación sinsentido da lugar a un codón de interrupción en la región codificadora del gen, y, por consiguiente, a una interrupción prematura de la traducción. Las inserciones o supresiones de por lo menos un par de bases en un gen dan lugar a unas mutaciones por desplazamiento del marco de lectura (en inglés "frame shift mutations"), que dan lugar a que sean incorporados unos aminoácidos erróneos, o a que la traducción se interrumpa prematuramente. Si como consecuencia de la mutación resulta un codón de interrupción en la región codificadora, entonces esto da lugar asimismo a una interrupción prematura de la traducción.

Las instrucciones para la producción de tales mutaciones pertenecen al estado de la técnica y se pueden deducir de los libros de texto conocidos de genética y biología molecular tales como por ejemplo el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik" (Genética molecular), 6a edición, editorial Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), del de Winnacker ("Gene und Klone" (Genes y clones), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o del de Hagemann ("Allgemeine Genetik" (Genética general), editorial Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986). Otras medidas adicionales se describen en el estado de la técnica.

Las bacterias corineformes aisladas, que se obtienen por medio de estas medidas, muestran una segregación aumentada en comparación con la cepa de partida empleada o respectivamente con la cepa parental, de la producción del aminoácido deseado en un proceso de fermentación.

Por el concepto de "bacterias aisladas" se han de entender los mutantes y las bacterias recombinantes aislados/as o respectivamente producidos/as conformes al invento, que contienen un alelo opcA, que codifica un polipéptido OpcA conforme al invento.

El rendimiento de las bacterias aisladas o respectivamente del proceso de fermentación mediando utilización de las mismas en lo que respecta a uno o varios de los parámetros escogidos entre el conjunto que se compone de la concentración del producto (producto por volumen), del rendimiento del producto (producto formado por fuente de carbono consumida) y la formación del producto (producto formado por volumen y tiempo) o también de otros parámetros del proceso y combinaciones de éstos, es mejorado en por lo menos un 0,5 %, por lo menos un 1 %, por lo menos un 1,5 % o por lo menos un 2 %, referido a la cepa de partida o respectivamente a la cepa parental o respectivamente al proceso de fermentación mediando utilización de las mismas.

Las bacterias corineformes aisladas, conformes al invento, se pueden cultivar continuamente -tal como se ha descrito por ejemplo en el documento PCT/EP2004/008882 -o discontinuamente en el procedimiento batch (cultivación por tandas) o en el procedimiento fed batch (procedimiento de afluencia) o en el procedimiento fed batch repeated (procedimiento de afluencia repetida) con el fin de efectuar la producción de L-aminoácidos. Una recopilación acerca de métodos conocidos de cultivación se describe en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Técnica de bioprocesos 1. Introducción en la técnica de los bioprocesos] (editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Biorreactores y disposiciones periféricas] (editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo que se ha de utilizar, debe de satisfacer de una manera apropiada las exigencias de las respectivas cepas. Unas descripciones de medios de cultivo de diferentes microorganismos están contenidas en el manual “Manual of Methods for General Bacteriology” [Manual de métodos para la bacteriología general] de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., EE.UU., 1981). Los conceptos de medio de cultivo y de medio de fermentación o respectivamente de medio se pueden intercambiar recíprocamente.

Como fuente de carbono se pueden utilizar azúcares e hidratos de carbono, tales como p.ej. glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, soluciones que contienen sacarosa procedentes de la producción de remolacha azucarera o de caña de azúcar, almidones, materiales hidrolizados de almidones y celulosas, aceites y grasas, tales como por ejemplo aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos, tales como por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, tales como por ejemplo glicerol, metanol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como por ejemplo ácido acético. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o como una mezcla.

Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, tales como peptonas, un extracto de levadura, un extracto de carne, un extracto de malta, agua de maceración de maíz, harina de soja y urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar individualmente o como una mezcla.

Como fuente de fósforo se pueden utilizar ácido fosfórico, dihidrógeno-fosfato de potasio o hidrógeno-fosfato de dipotasio o bien las correspondientes sales que contienen sodio.

El medio de cultivo debe de contener además unas sales, por ejemplo en forma de cloruros o sulfatos de metales, tales como por ejemplo sodio, potasio, magnesio, calcio y hierro, tales como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, de manera adicional a las sustancias arriba mencionadas se pueden emplear unas sustancias esenciales para el crecimiento, tales como aminoácidos, por ejemplo, homoserina, y vitaminas, por ejemplo, tiamina, biotina o ácido pantoténico. Al medio de cultivo se le pueden añadir adicionalmente unos adecuados compuestos precursores del respectivo aminoácido.

Las mencionadas sustancias empleadas de partida se pueden añadir al cultivo en forma de una tanda única o se pueden alimentar de una manera apropiada durante la cultivación.

Para realizar el control del pH del cultivo se emplean de un modo apropiado compuestos de carácter básico, tales

como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o respectivamente agua amoniacal, o compuestos de carácter ácido, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. El pH se ajusta por lo general a un valor de 6,0 hasta 9,0, de manera preferida de 6,5 hasta 8. Para la represión del desarrollo de espuma se pueden emplear agentes antiespumantes, tales como por ejemplo ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Para la conservación de la estabilidad de los plásmidos, se pueden añadir al medio unas apropiadas sustancias que actúan de un modo selectivo, por ejemplo antibióticos. Con el fin de mantener unas condiciones aerobias, se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno, tales como por ejemplo aire. La utilización de unos líquidos, que están enriquecidos con peróxido de hidrógeno, es asimismo posible. Eventualmente, la fermentación se realiza a sobrepresión, por ejemplo a una presión de 0,03 a 0,2 MPa. La temperatura del cultivo está situada normalmente en 20ºC hasta 45ºC y de manera preferida en 25ºC hasta 40ºC. En el caso del procedimiento batch, la cultivación se prosigue durante tanto tiempo hasta que se haya formado una cantidad máxima de los aminoácidos deseados. Esta meta se alcanza normalmente en el transcurso de 10 horas hasta 160 horas. En el caso de los procedimientos continuos son posibles unos períodos de tiempo de cultivación más largos.

Unos adecuados medios de fermentación se describen, entre otros, en los documentos US 6.221.636, US 5.840.551, US 5.770.409, US 5.605.818, US 5.275.940 y US 4.224.409.

Unos métodos para la determinación de L-aminoácidos se conocen a partir del estado de la técnica. El análisis se puede efectuar, por ejemplo, tal como se ha descrito en la cita de Spackman y colaboradores (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) mediante una cromatografía con intercambio de aniones con una subsiguiente derivatización con ninhidrina, o se puede efectuar mediante una HPLC (cromatografía de fase líquida de alto rendimiento) de fase inversa (en inglés "reversed phase HPLC) tal como se ha descrito en la cita de Lindroth y colaboradores (Analytical Chemistry (1979) 51: 1.167-1.174).

Un objeto del invento es de modo correspondiente un procedimiento para la producción de un L-aminoácido en el que

a) se fermenta una bacteria corineforme aislada en un medio adecuado, conteniendo la bacteria un gen que codifica un polipéptido OpcA conforme al invento, y

b) se enriquece el L-aminoácido en el caldo de fermentación o en las células de la bacteria corineforme aislada.

El caldo de fermentación producido de esta manera se recoge a continuación y de manera preferida se transforma ulteriormente para dar un producto sólido o líquido.

Por el concepto de "un caldo de fermentación" se entiende un medio de fermentación, en el que se había cultivado un microorganismo durante un determinado período de tiempo y a una cierta temperatura. El medio de fermentación o respectivamente los medios empleados durante la fermentación contiene/contienen todas las sustancias o respectivamente los componentes, que aseguran una multiplicación del microorganismo y una formación del aminoácido deseado.

Al finalizar la fermentación, el caldo de fermentación resultante contiene de modo correspondiente: a) la biomasa del microorganismo, que ha resultado como consecuencia de la multiplicación (reproducción) de las células del microorganismo, b) el aminoácido deseado, que se ha fromado en el transcurso de la fermentación, c) los productos secundarios orgánicos, que se han formado en el transcurso de la fermentación, y d) los componentes, que no se han consumido por la fermentación, del medio de fermentación/de los medios de fermentación empleado/empleados

o respectivamente de las sustancias empleadas, tales como, por ejemplo, vitaminas tales como biotina, aminoácidos tales como homoserina, o sales tales como sulfato de magnesio.

A los productos secundarios orgánicos pertenecen unas sustancias, que son producidas por los microorganismos empleados al realizar la fermentación del respectivo L-aminoácido deseado y que son segregadas eventualmente. Entre éstos se cuentan L-aminoácidos, que en comparación con el aminoácido deseado constituyen menos que un 30 %, 20 % o 10 %. A éstos pertenecen además ácidos orgánicos, que llevan de uno a tres grupos carboxilo, tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido málico o ácido fumárico. Finalmente, a éstos pertenecen también azúcares tales como, por ejemplo, trehalosa.

Unos típicos caldos de fermentación, que son adecuados para finalidades industriales, tienen un contenido de aminoácidos de 40 g/kg a 180 g/kg o de 50 g/kg a 150 g/kg. El contenido de biomasa (como biomasa secada) es por lo general de 20 a 50 g/kg.

En el caso del aminoácido L-lisina, dentro del estado de la técnica se conocen esencialmente cuatro diferentes formas de productos.

Un conjunto de productos que contienen L-lisina, abarca unas soluciones concentradas, acuosas, de carácter alcalino, de L-lisina purificada (documento de patente europea EP-B-0534865). Otro conjunto, tal como el que se

describe por ejemplo en los documentos US 6.340.486 y US 6.465.025, abarca unos concentrados acuosos, de carácter ácido, que contienen una biomasa, de caldos de fermentación que contienen L-lisina. El conjunto más conocido de productos sólidos abarca unas formas pulverulentas o cristalinas de L-lisina purificada o respectivamente pura, que se presenta típicamente en forma de una sal tal como, por ejemplo, el monohidrocloruro de L-lisina. Otro conjunto de formas sólidas de productos se describe, por ejemplo, en el documento EP-B-0533039. La forma de producto allí descrita contiene, junto a L-lisina, la mayor parte de las sustancias empleadas, que se han utilizado durante la producción fermentativa y que no se han consumido, y eventualmente la biomasa del microorganismo empleado con una proporción de > 0 % -100 %.

Correspondientemente a las diferentes formas de productos, se conocen los más diversos procedimientos, en los cuales el L-aminoácido se recoge a partir del caldo de fermentación, se aísla o purifica, con el fin de producir el producto que contiene el L-aminoácido, o el L-aminoácido purificado.

Para la producción de L-aminoácidos puros, sólidos, se aplican en lo esencial los métodos de la cromatografía con intercambio de iones eventualmente mediando utilización de carbón activado y los métodos de cristalización. En el caso de la lisina se obtiene de esta manera la correspondiente base o una correspondiente sal, tal como, por ejemplo, el monohidrocloruro de lisina (Lys-HCl) o el sulfato de lisina (Lys2-H2SO4).

En el caso de la lisina, en el documento EP-B-0534865 se describe un procedimiento para la producción de soluciones acuosas, de carácter básico, que contienen L-lisina, a partir de caldos de fermentación. En el caso de los procedimientos allí descritos, la biomasa procedente del caldo de fermentación se separa y desecha. Mediante una base tal como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio o amonio, se ajusta un valor del pH comprendido entre 9 y

11. Los componentes minerales (sales inorgánicas) se separan, después de haber concentrado y enfriado, mediante cristalización a partir del caldo, y, o bien se utilizan como un abono fertilizante o se desechan.

En el caso de los procedimientos para la producción de lisina mediando utilización de las bacterias conformes al invento, se prefieren aquellos procedimientos, en los que se obtienen unos productos que contienen componentes del caldo de fermentación. Éstos se utilizan en particular como aditivos para piensos de animales.

Según sean los requisitos, la biomasa se puede eliminar total o parcialmente a partir del caldo de fermentación, mediante ciertos métodos de separación tales como por ejemplo los de la centrifugación, la filtración, la decantación o una combinación de éstos, o se puede dejar completamente en éste. Eventualmente, la biomasa o respectivamente el caldo de fermentación que contiene la biomasa, se desactiva durante una adecuada etapa de procedimiento, por ejemplo, mediante un tratamiento térmico (calentamiento) o mediante adición de un ácido.

Los componentes químicos de la biomasa son, entre otros, la envoltura de las células, por ejemplo, el peptidoglicano y el arabinogalactano, la proteína o respectivamente el polipéptido, por ejemplo el polipéptido de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, lípidos y fosfolípidos y ácidos nucleicos (ADN y ARN), por ejemplo unos polinucleótidos que contienen la mutación conforme al invento. Como consecuencia de las medidas de desactivación y/o de las otras etapas adicionales del procedimiento (por ejemplo, las de acidificación, desecación por atomización, granulación, etc.), los ácidos nucleicos se presentan típicamente en forma de fragmentos con una longitud de, entre otras, ≥40 -60 pb (acrónimo de "pares de bases"), >60 - 80 pb, >80 - 100 pb, >100 - 200 pb, >200 - 300 pb, >300 - 400 pb, >400 - 500 pb, >500 - 750 pb, >750 -1.000 pb, >1.000 - 1.250 pb, >1.250 - 1.500 pb, >1.500 - 1.750 pb, >1.750

2.000 pb, >2.000 - 2.500 pb, >2.500 - 3.000 pb, >3.000 - 4.000 pb, >4.000 - 5.000 pb.

En un modo de proceder, la biomasa se elimina totalmente o casi totalmente, de tal manera que en el producto producido no permanece nada (0 %) o como máximo un 30 %, como máximo un 20%, como máximo un 10 %, como máximo un 5 %, como máximo un 1 % o como máximo un 0,1 % de la biomasa. En otro modo de proceder, la biomasa no se elimina o se elimina sólo en pequeñas proporciones, de tal manera que la totalidad (el 100 %) o más de un 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 99,9 % de la biomasa permanece en el producto producido. En un procedimiento conforme al invento, se elimina de modo correspondiente la biomasa en unas proporciones de ≥ 0 % hasta ≤ 100 %.

Finalmente, el caldo de fermentación obtenido después de la fermentación, se puede ajustar a un valor ácido del pH, antes o después de la eliminación total o parcial de la biomasa, con un ácido inorgánico tal como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico, o con un ácido orgánico, tal como, por ejemplo, ácido propiónico (documento de patente británica GB 1.439.728 o documento EP 1 331 220). Asimismo es posible acidificar el caldo de fermentación con la biomasa que está contenida completamente (documentos US 6.340.486 o US 6.465.025). Finalmente, el caldo se puede estabilizar también mediante una adición de bisulfito de sodio (NaHSO3, documento de patente británica GB 1.439.728) o de otra sal, tal como, por ejemplo, una sal de amonio, de un metal alcalino o de un metal alcalino-térreo del ácido sulfuroso.

Al realizar la separación de la biomasa, se eliminan de manera eventual parcial o totalmente los materiales sólidos orgánicos o inorgánicos que están contenidos en la biomasa. Los productos secundarios orgánicos, que están disueltos en el caldo de fermentación, y los componentes disueltos, que no se han consumido, del medio de fermentación (es decir, las sustancias empleadas) permanecen en el producto por lo menos parcialmente (> 0 %), de

manera preferida por lo menos en un 25 %, de manera especialmente preferida por lo menos en un 50 % y de manera muy especialmente preferida por lo menos en un 75 %. Eventualmente, ellos permanecen en el producto también totalmente (en un 100 %) o casi totalmente, es decir en > 95 % o en > 98 %. En este sentido, el concepto de "base del caldo de fermentación" significa que un producto contiene por lo menos una parte de los componentes del caldo de fermentación.

A continuación, al caldo se le substrae el agua con métodos conocidos, tales como por ejemplo con ayuda de un evaporador rotatorio, un evaporador de capa fina, un evaporador de película descendente, mediante ósmosis inversa o mediante nanofiltración, o respectivamente él es espesado o concentrado. Este caldo de fermentación concentrado se puede elaborar seguidamente mediante métodos de la liofilización, la desecación por atomización, la granulación por atomización o mediante procedimientos de otro tipo, tal como, por ejemplo, en una capa fluidizada circulante, tal como se ha descrito en el documento PCT/EP2004/006655, para dar unos productos capaces de corrimiento, en particular para dar un polvo finamente dividido o de manera preferida un granulado de granos gruesos. Eventualmente, el producto deseado se puede aislar a partir del granulado obtenido mediante tamizado o separación del polvo.

Asimismo, es posible secar el caldo de fermentación directamente, es decir, sin ninguna concentración previa, mediante desecación por atomización o granulación por atomización.

Por el concepto de "capaz de corrimiento" se entienden unos polvos que salen sin obstáculos desde una serie de recipientes de vidrio de salida, que tienen unos orificios de salida de diferentes tamaños, y por lo menos desde elrecipiente con el orificio de 5 mm (milímetros) (Klein: Seifen, Öle, Fette, Wachse (Jabones, aceites, grasas, ceras), 94, 12 (1968)).

Por el concepto de "finamente dividido" se entiende un polvo con una proporción predominante (> 50 %) de un tamaño de granos con diámetros de 20 a 200 μm.

Por el concepto de "de granos gruesos" se entiende un producto con una proporción predominante (> 50 %) de un tamaño de granos con diámetros de 200 a 2.000 μm.

La determinación de los tamaño de los granos se puede llevar a cabo con los métodos de la espectrometría por difracción de rayos láser. Los correspondientes métodos se describen en el libro de texto "Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis" [Medición del tamaño de partículas en la práctica de laboratorio] de R. H. Müller y R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) o en el libro de texto "Introduction to Particle Technology" [Introducción en la tecnología de partículas] de M. Rhodes, editorial Wiley & Sons (1998)).

El polvo capaz de corrimiento, finamente dividido, puede ser transformado, a su vez, mediante apropiados procedimientos de compactación o de granulación, en un producto de granos gruesos, bien capaz de corrimiento, almacenable y ampliamente exento de polvo.

El concepto de "exento de polvo" significa, que el producto contiene solamente unas pequeñas proporciones (< 5 %) con unos tamaños de granos con diámetros por debajo de 100 μm.

El concepto de "almacenable", dentro del sentido de este invento, significa que un producto se puede almacenar durante por lo menos un (1) año o más tiempo, de manera preferida por lo menos durante 1,5 años o más tiempo, de manera especialmente preferida durante dos (2) años o más tiempo, en un entorno seco y frío, sin que aparezca una pérdida esencial (< 5 %) del respectivo aminoácido.

Otro objeto del invento es, de modo correspondiente, un procedimiento para la producción de un producto que contiene un L-aminoácido, de manera preferida L-lisina o L-triptófano, de manera preferida un aditivo para piensos de animales, a partir de caldos de fermentación, que está caracterizado por las etapas de

a) cultivación y fermentación de una bacteria corineforme, que segrega un L-aminoácido, que contiene por lo menos un alelo opcA, que codifica un polipéptido OpcA conforme al invento, en un medio de fermentación,

b) eliminación de la biomasa, que se forma durante la fermentación, en una proporción de 0 a 100 % en peso, y

c) desecación del caldo de fermentación obtenido de acuerdo con a) y/o b), con el fin de obtener el producto en la deseada forma de polvo o granulado,

añadiéndose eventualmente antes de la etapa b) o c) un ácido, que se escoge entre el conjunto que se compone de ácido sulfúrico, ácido fosfórico o ácido clorhídrico.

De manera preferida, a continuación de la etapa a) o b) se elimina agua a partir del caldo de fermentación, que contiene el L-aminoácido (proceso de aumento de concentración).

Al realizar la granulación o compactación es ventajoso el empleo de unas usuales sustancias coadyuvantes orgánicas o inorgánicas, o respectivamente de unos vehículos tales como almidones, gelatinas, derivados de celulosas o sustancias similares, tales como las que encuentran utilización usualmente en la elaboración de alimentos o de piensos como agentes aglutinantes, gelificantes o espesantes, o de otras sustancias tales como por ejemplo ácidos silícicos, silicatos (documento EP0743016A) y estearatos.

Además, es ventajoso proveer de aceites a la superficie de los granulados obtenidos, tal como se ha descrito en el documento WO 04/054381. Como aceites se pueden utilizar aceites minerales, aceites vegetales o mezclas de aceites vegetales. Ejemplos de tales aceites son aceite de soja, aceite de oliva, mezclas de aceite de soja y de lecitina. De igual manera, también se adecuan aceites de siliconas, poli(etilenglicoles) o una hidroxietil-celulosa. Mediante el tratamiento de las superficies con los aceites mencionados, se consigue una resistencia aumentada a la abrasión del producto y una disminución de la proporción de polvo fino. El contenido de aceite en el producto es de 0,02 a 2,0 % en peso, de manera preferida de 0,02 a 1,0 % en peso, y de manera muy especialmente preferida de 0,2 a 1,0 % en peso, referido a la cantidad total del aditivo para piensos.

Se prefieren unos productos con una proporción de ≥ 97 % en peso con un tamaño de granos con unos diámetros de 100 a 1.800 μm o con una proporción de ≥ 95 % en peso con un tamaño de granos con unos diámetros de 300 a

1.800 μm. La proporción de polvo fino, es decir de partículas con un tamaño de granos < 100 μm, se sitúa de manera preferida en > 0 a 1 % en peso, - de manera especialmente preferida como máximo en 0,5 % en peso -.

Alternativamente, el producto se puede extender también sobre un material de vehículo orgánico o inorgánico, que es conocido en la elaboración de piensos, tal como, por ejemplo, ácidos silícicos, silicatos, materiales molidos, salvados, harinas, almidones, azúcares u otros, y/o se puede mezclar y estabilizar con usuales agentes espesantes

o aglutinantes. Unos correspondientes ejemplos de aplicación y procedimientos se describen en la bibliografía (Die Mühle + Mischfuttertechnik (El molino + la técnica de piensos mixtos) 132 (1995) 49, página 817).

Finalmente, el producto se puede llevar a un estado, en el que él sea estable frente a la digestión por estómagos de animales, en particular por estómagos de rumiantes, también mediante procedimientos de revestimiento (en inglés "coating") con agentes formadores de películas tales como por ejemplo carbonatos metálicos, ácidos silícicos, silicatos, alginatos, estearatos, almidones, gomas y éteres de celulosa, tal como se ha descrito en el documento DEC-4100920.

Para el ajuste de una concentración deseada de aminoácidos en el producto, según sean los requisitos, el respectivo aminoácido se puede añadir durante el procedimiento en forma de un concentrado o eventualmente de una sustancia ampliamente pura o respectivamente de su sal, en una forma líquida o sólida. Éstos se pueden añadir individualmente o como unas mezclas al caldo de fermentación, o también durante el proceso de desecación o granulación.

En el caso de la lisina, al realizar la producción de unos productos que contienen lisina, la relación de los iones se ajusta de manera preferida de tal modo que la relación de iones, correspondientemente a la siguiente fórmula,

resulte ser de 0,68 a 0,95, de manera preferida de 0,68 a 0,90, tal como se ha descrito por Kushiki y colaboradores en el documento US 20030152633.

En el caso de la lisina, el producto sólido constituido sobre la base del caldo de fermentación, producido de esta manera, tiene un contenido de lisina (como la base de lisina) de 10 % en peso a 70 % en peso o de 20 % en peso a 70 % en peso, de manera preferida de 30 % en peso a 70 % en peso y de manera muy especialmente preferida de 40 % en peso a 70 % en peso, referido a la masa seca del producto. Asimismo, son posibles unos contenidos máximos de la base de lisina de 71 % en peso, 72 % en peso o 73 % en peso.

En el caso de un aminoácido eléctricamente neutro tal como el L-triptófano, el producto sólido producido de esta manera, sobre la base del caldo de fermentación, tiene un contenido de aminoácido de por lo menos 5 % en peso, 10 % en peso, 20 % en peso, 30 % en peso, y como máximo de 50 % en peso, 60 % en peso, 70 % en peso, 80 % en peso, 90 % en peso o hasta de 95 % en peso.

El contenido de agua del producto sólido es de hasta 5 % en peso, de manera preferida de hasta 4 % en peso, y de manera especialmente preferida de menos que 3 % en peso.

Un mutante de Corynebacterium glutamicum con la denominación DM1797, que contiene el intercambio de aminoácidos lysC T311I en la aspartato cinasa, fue depositado el 28 de octubre de 2004 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania) como DSM 16833.

El mutante Corynebacterium glutamicum DM1825 conforme al invento, que contiene L-histidina en la posición 107, L-lisina en la posición 219, L-prolina en la posición 233 y L-tirosina en la posición 261 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido OpcA, se depositó el 5 de abril de 2005 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania) como DSM 17223.

Ejemplo 1

Mutagénesis de la cepa DM1797 que produce L-lisina

La cepa Corynebacterium glutamicum DM1797 se empleó como cepa de partida para la mutagénesis con N-metil-N'nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG). La cepa DM1797 es un mutante de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 resistente a la aminoetilcisteína y se ha depositado bajo la denominación DSM16833 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania).

La cepa DM1797 se cultivó en 10 ml del caldo LB-Bouillon (de Merck, Darmstadt, Alemania), que estaban contenidos en un matraz Erlenmeyer con una capacidad de 100 ml, durante 24 horas, a 33°C y 200 rpm, en un sacudidor rotatorio del tipo Certomat BS-1 (B. Braun Biotech International, Melsungen, Alemania). A continuación, el cultivo se separó por centrifugación, el sedimento se volvió a suspender en 10 ml de una solución al 0,9 % de NaCl, la suspensión obtenida se separó otra vez por centrifugación y el sedimento obtenido se recogió en 10 ml de una solución al 0,9 % de NaCl. 5 ml de esta suspensión de células se trataron con 400 μg/ml de MNNG durante 15 minutos a 30°C y a 200 rpm en un sacudidor (véase más arriba). A continuación, la tanda de mutagénesis se separó por centrifugación y el sedimento se recogió en 10 ml de tiosulfato de Na al 2 % en un tampón de NaCl al 0,9 % (pH = 6,0). La suspensión de células se diluyó a continuación en las relaciones de 1:1.000, 1:10.000 y 1:100.000 con una solución al 0,9 % de NaCl, y unos partes alícuotas se sembraron en placas sobre un agar de corazón y cerebro (de Merck, Darmstadt, Alemania). De esta manera se aislaron aproximadamente 2.500 mutantes.

Ejemplo 2

Ensayo de rendimimiento de los mutantes de la cepa DM1797

Los mutantes obtenidos en el Ejemplo 1 se cultivaron en un medio nutritivo adecuado para la producción de lisina y se determinó el contenido de lisina en el material sobrenadante del cultivo.

Para esto, los clones se multiplicaron primeramente sobre placas de agar de corazón y cerebro (de Merck, Darmstadt, Alemania) durante 24 horas a 33°C. Partiendo de estos cultivos en placas de agar, se inoculó en cada caso un cultivo previo (10 ml del medio en un matraz Erlenmeyer con una capacidad de 100 ml). Como medio para el cultivo previo se utilizó el medio MM. El cultivo previo se incubó durante 24 horas a 33°C y 240 rpm en un sacudidor. A partir de este cultivo previo se inoculó un cultivo principal, de tal manera que la DO (densidad óptica) (a 660 nm) inicial del cultivo principal fue de 0,1 DO. Para el cultivo principal se utilizó asimismo el medio MM.

Medio MM CSL 5 g/l MOPS 20 g/l glucosa (autoclavada por separado) 50 g/l Sales: (NH4)2SO4) 25 g/l KH2PO4 0,1 g/l MgSO4 * 7 H2O 1,0 g/l CaCl2 * 2 H2O 10 mg/l FeSO4 * 7 H2O 10 mg/l MnSO4 *H2O 5,0 mg/l biotina (filtrada en condiciones estériles) 0,3 mg/l tiamina * HCl (filtrada en condiciones estériles) 0,2 mg/l CaCO3 25 g/l

El CSL (Corn Steep Liquor = líquido de maceración de maíz), el MOPS (ácido morfolinopropanosulfónico) y la solución salina se ajustaron a pH 7 con agua amoniacal y se autoclavaron. A continuación se añadieron las soluciones esterilizadas de substrato y de vitaminas así como el CaCO3 autoclavado seco.

La cultivación se efectuó en volúmenes de 10 ml, que estaban contenidos en matraces Erlenmeyer , con una capacidad de 100 ml, provistos de obstáculos. La temperatura fue de 33°C, el número de revoluciones fue de 250 rpm y la humedad del aire fue de 80 %.

Después de 24 horas se determinó la densidad óptica (DO) a una longitud de onda de medición de 660 nm con el Biomek 1000 (de Beckmann Instruments GmbH, Munich). La cantidad de lisina formada se determinó con un analizador de aminoácidos de la entidad Eppendorf Biotronik (Hamburgo, Alemania) mediante una cromatografía con intercambio de iones y una derivatización posterior en columna con detección por ninhidrina. Un mutante, que se

distinguía por una formación aumentada de lisina, se designó como DM1825. Tabla 1

Cepa: DO (660) Lisina-HCl (g/l)

DM1797: 12,3 3,5

DM1825: 12,2 3,7

Ejemplo 3

Secuenciación del gen opcA del mutante DM1825

A partir del clon DM1825, con ayuda del método de Eikmanns y colaboradores (Microbiology 140: 1817 -1828 (1994)) se aisló un ADN cromosomal. Con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa se amplificó un fragmento de ADN, que lleva el gen opcA. Para esto se utilizarón los siguientes oligonucleótidos como cebadores.

opcA-A1 (SEQ ID NO: 11): 5' cacctggcgc aggccataat 3'

opcA-E1 (SEQ ID NO: 12): 5' cgcgtgcgcg tactacatca 3'

Los cebadores representados fueron sintetizados por la entidad MWG Biotech (Ebersberg, Alemania). Ellos hacen posible la amplificación de un fragmento de ADN con una longitud de aproximadamente 1,05 kb (kilobases), que lleva el gen opcA. El cebador opcA-A1 se fija a la región que corresponde a las posiciones 302 hasta 321 de la cadena complementaria a la SEQ ID NO: 3. El cebador opcA-E1 se fija a la región que corresponde a las posiciones

1.335 hasta 1.316 de la cadena de acuerdo con la SEQ ID NO: 3.

La reacción de PCR se llevó a cabo con la polimerasa de ADN Phusion High Fidelity (de New England Biolabs, Francfort, Alemania). La tanda de reacción se formuló según los datos del fabricante y contenía, con un volumen total de 50 μl, 10 μl del tampón 5 x Phusion HF suministrado conjuntamente, desoxinucleósido-trifosfatos en una concentración de en cada caso 200 μM, un cebador en una concentración de 0,5 μM, aproximadamente 50 ng de ADN de molde y 2 unidades de la polimerasa Phusion. Mediante adición de H2O se ajustó el volumen a 50 μl.

La tanda de PCR se sometió en primer lugar a una desnaturalización introductoria a 98°C durante 30 segundos. Después de esto, repitiéndose 35x (veces), siguieron una etapa de desnaturalización a 98°C durante 20 segundos, una etapa para la fijación del cebador al ADN dispuesto previamente a 60°C durante 20 segundos y la etapa de extensión para la prolongación del cebador a 72°C durante 60 segundos. Después de la etapa final de extensión durante 5 minutos a 72°C, la tanda de PCR se sometió a una electroforesis en gel de agarosa (agarosa al 0,8 %). Un fragmento de ADN con una longitud de aproximadamente 1,85 kb se identificó, se aisló a partir del gel y se purificó mediando utilización del estuche QIAquick Gel Extraction Kit de la entidad Qiagen (Hilden, Alemania).

La secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN amplificado o respectivamente del producto de la PCR fue determinada por la entidad Agowa (Berlín, Alemania). La secuencia obtenida de la región codificadora del alelo opcA se representa en la SEQ ID NO: 7. La secuencia de aminoácidos de la proteína glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que se establece con ayuda del programa Patentin, se representa en la SEQ ID NO: 8.

La secuencia de nucleótidos de la región codificadora del alelo opcA del mutante DM1825 contiene en la posición 319 citosina, en la posición 657 citosina, en la posición 697 timina y en la posición 781 citosina (véase la SEQ ID NO: 5). El gen del tipo silvestre (véase la SEQ ID NO: 1) contiene en la posición 319 timina, en la posición 657 adenina, en la posición 697 citosina y en la posición 781 timina. Estos intercambios de las nucleobases conducen a intercambios de aminoácidos en las posiciones 107, 219, 233 y 261 de la secuencia de aminoácidos resultante (compárense las SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6). Estas mutaciones se designan a continuación como opcAY107H, opcAK219N, opcAP233S y opcAY261H. Además, el alelo opcA de DM1825 contiene todavía otros tres intercambios adicionales de nucleótidos en las posiciones 402, 600 y 648 (véase la SEQ ID NO: 7), que no conducen a ningún intercambio de aminoácidos ("mutaciones mudas").

Ejemplo 4

Construcción del vector de intercambio pk18mobsacB_opcAaa4ex

Con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa se amplificó un fragmento que contiene la región codificadora del alelo opcA, que lleva las mutaciones opcAY107H, opcAK219N, opcAP233S y opcAY261H. Como molde se utilizó el ADN cromosomal obtenido en el Ejemplo 3. Como cebadores se escogieron los oligonucleótidos opcA-A1 (SEQ ID NO: 11) y opcA-E1 (SEQ ID NO: 12) empleados en el Ejemplo 3.

La reacción de PCR se llevó a cabo con la polimerasa de ADN Phusion High-Fidelity (de New England Biolabs, Francfort, Alemania). La tanda de reacción tenía la composición arriba mencionada. La PCR se llevó a cabo tal

como se ha descrito más arriba, con una excepción: la etapa de extensión a 72°C, que se repite 35 veces, se llevó a cabo en cada caso solamente durante 30 segundos.

El fragmento de ADN amplificado, con una longitud de aproximadamente 1,05 kb, que lleva la región codificadora del gen opcA de DM1825, se ligó con el estuche Zero Blunt® TOPO Kit de la entidad Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, EE.UU.) en el vector pCR®Blunt II-TOPO. A continuación, la cepa de E. coli Top10 (Grant y colaboradores, Proceedings of the National Academy of Sciences EE.UU, 87 (1990) 4645-4649) se transformó con la tanda de ligación según los datos del fabricante del estuche (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). La selección de las células portadoras de plásmidos se efectuó por siembra en placas de la tanda de transformación sobre un agar LB (de Merck, Darmstadt, Alemania), que había sido suplementado con 25 mg/l de kanamicina. El ADN de plásmido fue aislado a partir de un transformante con ayuda del estuche QIAprep Spin Miniprep Kit de la entidad Qiagen (Hilden, Alemania) y fue comprobado por tratamiento una vez con la enzima de restricción BamHI y una vez con la enzima de restricción EcoRI, con una subsiguiente electroforesis en gel de agarosa (al 0,8 %). El plásmido fue designado como pCRII_opcAaa4ex y se ha representado en la Figura 1.

El plásmido fue tratado con la endonucleasa de restricción EcoRI y separado por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 %. El fragmento con un tamaño de aproximadamente 1,05 kb, que había sido disociado y separado de esta manera, se aisló a continuación a partir del gel y se purificó con el estuche QIAquick Gel Extraction Kit de la entidad Qiagen.

El fragmento de ADN purificado de esta manera contiene las mutaciones descritas en el gen opcA y posee unos extremos compatibles con EcoRI (fragmento opcAaa4ex). A continuación, él fue incorporado en el vector pK18mobsacB movilizable, descrito por Schäfer y colaboradores (Gene 145, 69-73 (1994), con el fin de hacer posible un intercambio de alelos o respectivamente de mutaciones. Para esto, el pK18mobsacB fue digerido con la enzima de restricción EcoRI y los extremos fueron desfosforilados con una fosfatasa alcalina (Alkaline Phosphatase, de Boehringer Mannheim, Alemania). El vector producido de esta manera se mezcló con el fragmento opcAaa4ex y la tanda se trató con el estuche Ready-To-Go T4 DNA Ligase Kit (de Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemania).

A continuación, la cepa de E. coli S17-1 (Simon y colaboradores, Bio/Technologie 1: 784-791, 1993) se transformó con la tanda de ligación (Hanahan, In. DNA cloning. A practical Approach, tomo 1, IRL-Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). La selección en cuanto a células portadoras de plásmidos se efectuó por siembra en placas de la tanda de transformación sobre agar LB (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), que había sido suplementado con 25 mg/l de kanamicina.

El ADN de plásmido fue aislado a partir de un transformante con ayuda del estuche QIAprep Spin Miniprep Kit de la entidad Qiagen (Hilden, Alemania) y fue comprobado mediante disociación por restricción, en cada caso una vez con la enzima BamHI y una vez con la enzima EcoRI, y una subsiguiente electroforesis en gel de agarosa. El plásmido fue denominado pK18mobsacB_opcAaa4ex y se ha representado en la Figura 2.

Ejemplo 5

Incorporación de las mutaciones opcAY107H, opcAK219N, opcAP233S y opcAY261H en la cepa DM1797

El vector pK18mobsacB_opcAaa4ex descrito en el Ejemplo 4 fue transferido por conjugación a la cepa DM1797 de

C. glutamicum de acuerdo con el protocolo de Schäfer y colaboradores (Journal of Microbiology 172: 1.663-1.666 (1990)). El vector no se puede replicar de manera autónoma en DM1797y sólo permanece conservado en la célula cuando él se presenta integrado en el cromosoma como consecuencia de un suceso de recombinación. La selección de unos transconjugantes, es decir de clones con el pK18mobsacB_opcAaa4ex integrado, se efectuó mediante siembra en placas de la tanda de transformación sobre un agar LB, que había sido suplementado con 25 mg/l de kanamicina y 50 mg/l de ácido nalidíxico. Los transconjugantes resistentes frente a kanamicina fueron extendidos como un frote a continuación sobre placas de agar LB suplementadas con kanamicina (25 mg/l), y se incubaron durante 24 horas a 33°C. Para realizar la selección de mutantes, en los que los que, como consecuencia de un segundo suceso de recombinación, había tenido lugar la excisión del plásmido, los clones fueron cultivados durante 30 horas de un modo no selectivo en un medio LB líquido, a continuación fueron extendidos como un frote sobre agar LB, que había sido suplementado con sacarosa al 10 % y fueron incubados durante 24 horas a 33°C.

El plásmido pK18mobsacB_opcAaa4ex, al igual que el plásmido de partida pK18mobsacB, junto al gen de resistencia a kanamicina, contiene una copia del gen sacB que codifica la levano sucrasa de Bacillus subtilis. La expresión del gen sacB, que es inducible por sacarosa, da lugar a la formación de la levano sucrasa, que cataliza la síntesis del producto levano, que es tóxico para C. glutamicum. Sobre un agar LB suplementado con sucrosa (= sacarosa) crecen por lo tanto sólo aquellos clones, en los que el pK18mobsacB_opcAaa4ex integrado se ha excindido como consecuencia de un segundo suceso de recombinación. En dependencia de la localización del segundo suceso de recombinación en lo que respecta al sitio de la mutación tiene lugar una excisión del intercambio de alelos o respectivamente de la incorporación de la mutación, o la copia original permanece en el cromosoma del anfitrión.

A continuación se buscó un clon, en el que se había efectuado el intercambio deseado, es decir la incorporación de las mutaciones opcAY107H, opcAK219N, opcAP233S y opcAY261H. Para esto, a partir de 20 clones con el fenotipo "crecimiento en presencia de sacarosa" y "ausencia de crecimiento en presencia de kanamicina", se determinó la

5 secuencia del gen opcA. De esta manera se identificó un clon, que lleva las mutaciones opcAY107H, opcAK219N, opcAP233S y opcAY261H. Esta cepa fue denominada como C. glutamicum DM1797_opcAaa4ex.

Ejemplo 6

Comparación del rendimiento de la cepa DM1797_opcAaa4ex con la cepa de partida DM1797.

10 El ensayo de rendimiento se llevó a cabo tal como se ha descrito en el Ejemplo 2. La cepa DM1797_opcAaa4ex mostró, en comparación con la DM1797, una segregación aumentada de lisina, similar a la de la DM1825 (véase la Tabla 1).

15 Breve descripción de las Figuras: Figura 1: mapa del plásmido pCRII_opcAaa4ex Figura 2: mapa del plásmido pK18mobsacB_opcAaa4ex

Las abreviaturas y las denominaciones que se utilizan tienen los siguientes significados. En el caso de la indicación 20 del número de pares de bases (pbs) se trata de unos valores aproximados, que se obtienen dentro del marco de la reproducibilidad de las mediciones.

pUC origen de la replicación pUC Kan: gen de resistencia a kanamicina

25 EcoRI: sitio de corte de la enzima de restricción EcoRI BamHI: sitio de corte de la enzima de restricción BamHI opcA: fragmento de ADN clonado, que contiene la región codificadora del alelo opcA del mutante

DM1825 sacB: gen sacB 30 RP4-mob: región mob con el origen de la replicación para la transferencia (oriT) oriV: origen de la replicación V

Protocolo de secuencias:

<110> Degussa AG

<120> Alelos del gen opcA de bacterias corineformes 5

<130> 050109BT

<160> 20

10 <170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 960

<212> ADN 15 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (957) 20 <223> gen opcA de tipo silvestre

<400> 1

5: <210> <211> <212> <213> 2 319 PRT Corynebacterium glutamicum

<400>: 2

<210> 3

<211> 1600

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (335) .. (1291) 10 <223> gen opcA de tipo silvestre

<400> 3

<210> 4

<211> 319

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 4 <210> 5

<211> 960

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222>: (1) .. (957) 10 <223> alelo opcA

<220>

<221> mutación

<222>: (319) .. (319) 15 <223> transición T -> C

<220>

<221> mutación

<222>: (657) .. (657) 20 <223> transversión T -> C

<220>

<221> mutación

<222>: (697) .. (697) 25 <223> transición C -> T

<220>

<221> mutación

<222>: (781) .. (781) 30 <223> transición T -> C

<400> 5

5: <210> <211> <212> <213> 6 319 PRT Corynebacterium glutamicum

<400>: 6

5: <210> <211> <212> <213> 7 960 ADN Corynebacterium glutamicum

10: <220> <221> <222> <223> CDS (1) .. (957) alelo opcA

15: <220> <221> <222> <223> mutación (319) .. (319) transición T -> C

20: <220> <221> <222> <223> mutación (402) .. (402) transición C -> T

<220>

<221>: mutación

<222>: (600) .. (600)

<223>: transición T -> C

5

<220>

<221>: mutación

<222>: (648) .. (648)

<223>: transversión G -> C

10

<220>

<221>: mutación

<222>: (657) .. (657)

<223>: transversión A -> C

15

<220>

<221>: mutación

<222>: (697) .. (697)

<223>: transición C -> T

20

<220>

<221>: mutación

<222>: (781) .. (781)

<223>: transición T -> C

25

<400>: 7

5: <210> <211> <212> <213> 8 319 PRT Corynebacterium glutamicum

<400>: 8

<210> 9

<211> 1600

<212> ADN 5 <213> Corynebacteriurn glutamicum

<220>

<221> CDS

<222>: (335) .. (1291) 10 <223> alelo opcA

<220>

<221> mutación

<222>: (653) .. (653) 15 <223> transición T -> C

<220>

<221> mutación

<222>: (736) .. (736) 20 <223> transición C -> T

<220>

<221> mutación

<222>: (934) .. (934) 25 <223> transición T -> C

<220>

<221> mutación

<222>: (982) .. (982) 30 <223> transversión G -> C

<220>

<221> mutación

<222>: (991) .. (991) 35 <223> transversión A -> C

<220>

<221> mutación

<222>: (1.031) .. (1.031) 40 <223> transición C -> T

<220>

<221> mutación

<222>: (1.115) .. (1.115) 45 <223> transición T -> C

<400> 9

<210> 10

<211> 319

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum 5

<220>

<221> característica variada

<222> (1) .. (20)

<223> cebador opcA-A1

<400> 11 cacctggcgc aggccataat 20

<210> 12 15 <211> 20

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> característica variada

<222> (1) .. (20)

<223> cebador opcA-E1

<400> 12 25 cgcgtgcgcg tactacatca 20

<210> 13

<211> 20

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> característica variada

<222> (1) .. (20) 35 <223> cebador opcA-int1

<400> 13 acggacctgt cgctgacaag 20

<210> 14

<211> 20

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

45 <220>

<221> característica variada

<222> (1) .. (20)

<223> cebador opcA-int2

<400> 14 cggattccgg catctctac 20

<210> 15

<211> 519 55 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (519)

<223> marco de lectura

<220>

<221> mutación 65 <222> (28) .. (28)

<223> C en la posición 28 corresponde a C en la posición 319 de la SEQ ID NO: 5 <220>

<221> mutación

<222>: (366) .. (366) 5 <223> C en la posición 366 corresponde a C en la posición 657 de la SEQ ID NO: 5

<220>

<221> mutación

<222>: (406) .. (406) 10 <223> T en la posición 406 corresponde a T en la posición 697 de la SEQ ID NO: 5

<220>

<221> mutación

<222>: (490) .. (490) 15 <223> C en la posición 490 corresponde a C en la posición 781 de la SEQ ID NO: 5

<400> 15

<210> 16

<211> 173

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 16

5: <210> <211> <212> <213> 17 519 ADN Corynebacterium glutamicum

10: <220> <221> <222> <223> CDS (1) .. (519) marco de lectura

15: <220> <221> <222> <223> mutación (28) .. (28) C en la posición 28 corresponde a C en la posición 319 de la SEQ ID NO: 7

20: <220> <221> <222> <223> mutación (111) .. (111) T en la posición 111 corresponde a T en la posición 402 de la SEQ ID NO: 7

25: <220> <221><222> <223> mutación (309) .. (309) C en la posición 309 corresponde a C en la posición 600 de la SEQ ID NO: 7

30: <220> <221> <222> <223> mutación (357) .. (357) C en la posición 357 corresponde a C en la posición 648 de la SEQ ID NO: 7

35: <220> <221> <222> <223> mutación (366) .. (366) C en la posición 366 corresponde a C en la posición 657 de la SEQ ID NO: 7

40: <220> <221> <222> <223> mutación (406) .. (406) T en la posición 406 corresponde a T en la posición 697 de la SEQ ID NO: 7

45: <220> <221> <222> <223> mutación (490) .. (490) C en la posición 490 corresponde a C en la posición 781 de la SEQ ID NO: 7

<400>: 17

5: <210> <211> <212> <213> 18 173 PRT Corynebacterium glutamicum

<400>: 18

5: <210> <211> <212> <213> 19 1263 ADN Corynebacterium glutamicum

10: <220> <221> <222> <223> CDS (1) .. (1263) gen lysC de tipo silvestre

<400>: 19

5: <210> <211> <212> <213> 20 421 PRT Corynebacterium glutamicum

<400>: 20

Claims

REIVINDICACIONES

1. Mutantes aislados de bacterias corineformes, que contienen un gen, que codifica el polipéptido glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, realizándose que la secuencia de aminoácidos del polipéptido se escoge entre el conjunto que se compone de

a) la SEQ ID NO: 6, en la que en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina, en la posición 219 se encuentra L-asparagina, en la posición 233 se encuentra L-serina y en la posición 261 se encuentra L-histidina,

b) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 intercambios conservativos de aminoácidos, y

c) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 inserciones o supresiones.
2.

Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizados porque en el caso de las bacterias corineformes se trata de una bacteria que se escoge entre el conjunto que se compone de Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, y Corynebacterium aminogenes.
3.

Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizados porque se trata de Corynebacterium glutamicum.
4.

Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizados porque se trata de bacterias que segregan L-aminoácidos.
5.

Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizados porque se trata de bacterias corineformes que segregan L-lisina o L-triptófano.
6.

Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizados porque el gen abarca una secuencia de nucleótidos, que es idéntica a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido, que es obtenible mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediando utilización de un ADN obtenido a partir de una bacteria corineforme y mediando utilización de un par de cebadores, que se compone de un primer cebador, que abarca por lo menos 15 nucleótidos consecutivos, que se escogen a partir de la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1 y 334 de la SEQ ID NO: 3, y de un segundo cebador, que abarca por lo menos 15 nucleótidos consecutivos, que se escogen a partir de la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1.600 y 1.292 de la SEQ ID NO: 3.
7.

Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizados porque el gen abarca una secuencia de nucleótidos, que es idéntica por lo menos en un 90 % a las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7.
8.

Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con las reivindicaciones 6 y 7, caracterizados porque el gen abarca la secuencia de nucleótidos, que es idéntica en un 100 % a la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7.
9.

Polinucleótido aislado, que codifica el polipéptido de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, realizándose que la secuencia de aminoácidos del polipéptido se escoge entre el conjunto que se compone de

a) la SEQ ID NO: 6, en la que en la posición 107 de la secuencia de aminoácidos se encuentra L-histidina, en la posición 219 se encuentra L-asparagina, en la posición 233 se encuentra L-serina y en la posición 261 se encuentra L-histidina,

b) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 intercambios conservativos de aminoácidos, y

c) la SEQ ID NO: 6, encontrándose, además de las mencionadas mutaciones, como máximo 5 inserciones o supresiones.
10. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque es idéntico a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido, que se obtiene mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediando utilización de un ADN obtenido a partir de una bacteria corineforme y mediando utilización de un par de cebadores, que se compone de un primer cebador, que abarca por lo menos 15 nucleótidos consecutivos, que se escogen a partir de la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1 y 334 de la SEQ ID NO: 3, y de un segundo cebador, que abarca por lo menos 15 nucleótidos consecutivos que se escogen a partir de la secuencia complementaria de nucleótidos situada entre las posiciones 1.600 y 1.292 de la SEQ ID NO: 3.
11. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO: 5, comprendiendo las condiciones rigurosas una etapa de lavado con un tampón que corresponde a 2xSSC a una temperatura de 52°C a 68°C.

10 12. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 9, estando el polinucleótido caracterizado porque abarca una secuencia de nucleótidos, que es idéntica por lo menos en un 90 % a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7.
13. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque el polinucleótido abarca una 15 secuencia de nucleótidos, que es idéntica por lo menos en un 96 % a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:
5.
14. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque se abarcan las secuencias de

nucleótidos SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7. 20
15. Polinucleótido aislado, caracterizado porque codifica por lo menos un marco de lectura con una secuencia de aminoácidos que corresponde a las posiciones 98 hasta 270 de la SEQ ID NO: 6.
16. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque contiene una o varias 25 mutaciones mudas.
17. Polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado porque abarca por lo menos la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 292 hasta 810 de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7.

30 18. Un microorganismo recombinante, que contiene el polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 9 hasta 17, o que se había producido mediante su utilización.
19. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque se trata de una bacteria

corineforme o de una bacteria del género Escherichia coli. 35
20. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado porque en el caso de la bacteria corineforme se trata del género Corynebacterium.
21.

Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizado porque en el caso de la 40 bacteria del género Corynebacterium se trata de la especie Corynebacterium glutamicum.
22. Un vector, que contiene el polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 9 hasta 17.
23.

Un microorganismo recombinante, que contiene el vector de acuerdo con la reivindicación 22. 45
24. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizado porque se trata de una bacteria corineforme o de una bacteria del género Escherichia.
25. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizado porque en el caso de la 50 bacteria corineforme se trata del género Corynebacterium.
26. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 25, caracterizado porque en el caso de la bacteria del género Corynebacterium se trata de la especie Corynebacterium glutamicum.

55 27. Bacteria corineforme recombinante, que contiene en su cromosoma un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9, realizándose que se sobreexpresa el mencionado polinucleótido mediante unión con un promotor.
28. Procedimiento para la producción de un L-aminoácido, caracterizado porque se fermenta una bacteria

corineforme aislada de acuerdo con las reivindicaciones 1-8, 18-21, 23-27 en un medio adecuado. 60
29. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 28, caracterizado porque se aísla o recoge el L-aminoácido deseado.
30. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque se purifica el L-aminoácido deseado. 65
31.

Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 28 hasta 30, caracterizado porque el L-aminoácido deseado se aísla o se recoge en común con los componentes del caldo de fermentación y/o con la biomasa (> 0 a 100 %).
32.

Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 28, caracterizado porque

5 a) la biomasa se elimina a partir del caldo de fermentación en una proporción de 0 a 100 %, y

b) a partir del caldo obtenido de esta manera se produce un producto que está esencialmente seco y conformado, mediante un método que se escoge entre el conjunto que se compone de granulación, 10 compactación, desecación por atomización y extrusión.
33. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado porque, antes o después de la etapa a), al caldo de fermentación se le añade un ácido que se escoge entre el conjunto que se compone de ácido sulfúrico, ácido clorhídrico y ácido fosfórico.
34. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 32, caracterizado porque a partir del caldo, que se ha obtenido antes o después de la etapa a), se elimina el agua.
35. Procedimiento de acuerdo con la etapa 32, caracterizado porque el producto conformado obtenido en o durante 20 la etapa b) es rociado con un aceite.
36. La cepa DM 1825 de Corynebacterium glutamicum depositada bajo el n° DSM 17223 en la DSMZ (Braunschweig).

Figura 1: Plásmido pCRII_opcAaa4ex Figura 2: Plásmido pK18mobsacB_opcAaa4ex