ES2382363T3 - Procedimiento para la producción de l-aminoácidos mediante mutantes del gen glta que codifica la citrato sintasa - Google Patents

Abstract

Polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido, que abarca la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, realizándose que el L-ácido aspártico en la posición de la secuencia de aminoácidos es reemplazado por L-valina y realizándose que el polipéptido posee una actividad de citrato sintasa.

Description

Procedimiento para la producción de L-aminoácidos mediante mutantes del gen gltt que codifica la citrato sintasa

Son objeto del invento unos nuevos polinucleótidos, que codifican un polipéptido con una actividad de citrato sintasa, unas bacterias, que contienen a éstos, y un procedimiento para la producción de aminoácidos mediando utilización de estas bacterias.

Estado de la técnica

Los aminoácidos encuentran utilización en la medicina humana, en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y muy especialmente en la nutrición de animales.

Es conocido el hecho de que ciertos aminoácidos pueden ser producidos por fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular de Corynebacterium glutamicum. A causa de la gran importancia, se está trabajando constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de producción. Unos mejoramientos de los procedimientos pueden concernir a unas medidas técnicas de fermentación tales como p.ej. las de agitación y abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos, tal como p.ej. la concentración de azúcares durante la fermentación, o el tratamiento para dar la forma del producto mediante p.ej. una cromatografía con intercambio de iones o las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho.

Para el mejoramiento de las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se utilizan unos métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen unas cepas, que son resistentes a unos antimetabolitos o que son auxótrofas para unos metabolitos importantes para regulación y que producen los aminoácidos. Un antimetabolito conocido es el compuesto análogo a lisina S-(2-amino-etil)-L-cisteína (AEC).

Desde hace algunos años se emplean asimismo unos métodos de la técnica de ADN recombinante para el mejoramiento de las cepas del género Corynebacterium que producen L-aminoácidos, en particular de Corynebacterium glutamicum, mediante el recurso de que se amplifican unos genes individuales para la biosíntesis de los aminoácidos ramificados, y se investiga la repercusión sobre la producción de aminoácidos.

Unos artículos recopilativos acerca de la biología, la genética y la biotecnología de Corynebacterium glutamicum se encuentran en la obra "Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Manual de Corynebacterium glutamicum) (coordinadores de edición: L. Eggeling y M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis, 2005), en la edición especial del Journal of Biotechnology (coordinador de edición jefe: A. Pühler) con el título "A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology" (Una nueva era en la biotecnología de Corynebacterium glutamicum) (Journal of Biotechnolgy 104/1-3, (2003)) y en la obra de T. Scheper (coordinador administrativo) "Microbial Production of L-Amino Acids" (Producción microbiana de L-aminoácidos) (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, Editorial Springer, Berlín, Alemania, 2003) .

La secuencia de nucleótidos del genoma de Corynebacterium glutamicum ha sido descrita por Ikeda y Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003)), en el documento de patente europea EP 1 108 790 y en la cita de Kalinowski y colaboradores (Journal of Biotechnolgy 104/1-3, (2003)).

La secuencia de nucleótidos del genoma de Corynebacterium efficiens ha sido descrita por Nishio y colaboradores (Genome Research. 13 (7), 1572-1579 (2003)).

Las secuencias de nucleótidos de los genomas de Corynebacterium glutamicum y de Corynebacterium efficiens son accesibles asimismo en el Banco de Datos del National Center for Biotechnology Information (Centro nacional para información de biotecnología) (NCBI) de la National Library of Medicine (Biblioteca nacional de medicina) (Bethesda, MD, EE.UU.), en el DNA Data Bank of Japan (Banco de datos de ADN de Japón) (DDBJ, Mishima, Japón) o en el Banco de datos de secuencias de nucleótidos de los European Molecular Biologies Laboratories (Laboratorios europeos de biologia molecular) (EMBL, Heidelberg, Alemania o respectivamente Cambridge, Reino Unido).

La secuencia de tipo silvestre, conocida a partir del estado de la técnica, de la región codificadora del gen gltA de Corynebacterium glutamicum se representa en la SEQ ID NO: 1 en la parte descriptiva de la presente solicitud de patente. En las SEQ ID NO: 3 y 25 se representan además de esto las secuencias que están situadas corriente arriba y corriente abajo de la región codificadora. La secuencia de aminoácidos del polipéptido GltA codificado (la citrato sintasa) se reproduce de manera correspondiente en las SEQ ID NO: 2, 4 y 26.

Misión del invento

Los autores del invento se han planteado la misión de poner a disposición unas nuevas medidas técnicas para realizar una mejorada producción de L-aminoácidos, de manera preferida de L-lisina, L-valina y L-isoleucina, de manera especialmente preferida de L-lisina.

Descripción del invento

Un objeto del invento es un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, habiendo sido reemplazado el L-ácido aspártico en la posición 5 de la secuencia de aminoácidos por L-valina y poseyendo el polipéptido una actividad de citrato sintasa (n° de EC 4.1.3.7). Eventualmente, el polipéptido contiene uno o varios intercambios conservativos de aminoácidos, permaneciendo la actividad de citrato sintasa del polipéptido esencialmente inalterada por los intercambios conservativos de aminoácidos.

Por el concepto de "aminoácidos proteinógenos" se entienden los aminoácidos, que se presentan en proteínas naturales, es decir en proteínas de microorganismos, plantas, animales y seres humanos. A éstos pertenecen en particular unos L-aminoácidos, escogidos entre el conjunto que se compone de L-ácido aspártico, L-asparagina, Ltreonina, L-serina, L-ácido glutámico, L-glutamina, glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptófano, L-prolina y L-arginina.

Los conceptos de polipéptido y proteína son utilizados como sinónimos.

Además, son un objeto del invento unos vectores y unas bacterias, de manera preferida de los géneros Corynebacterium y Escherichia, de manera especialmente preferida de las especies Corynebacterium glutamicum y Escherichia coli, que contienen el mencionado polinucleótido o que habían sido producidos mediando utilización del mencionado polinucleótido.

Finalmente, son un objeto del invento unas bacterias, de manera preferida de los géneros Corynebacterium y Escherichia, de manera especialmente preferida de las especies Corynebacterium glutamicum y Escherichia coli, que han sido transformadas con el mencionado vector.

El concepto de "transformación" abarca todos los métodos para realizar la transferencia de polinucleótidos, en particular de un ADN, a una bacteria deseada. A éstos pertenecen, entre otros, la utilización de un ADN aislado en el caso de la transformación, la electrotransformación o respectivamente la electroporación, la transferencia mediante contacto con las células tal como en el caso de la conjugación o la transferencia de ADN mediante bombardeo con partículas.

Otro aspecto adicional del invento se refiere a una bacteria, en particular a una bacteria recombinante, del género Corynebacterium, que contiene un polinucleótido, que codifica un polipéptido con una actividad de citrato sintasa, que abarca la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, estando contenida la L-valina en la posición 5 de la secuencia de aminoácidos. Eventualmente, el polipéptido contiene uno o varios intercambios conservativos de aminoácidos, permaneciendo la actividad de citrato sintasa del polipéptido esencialmente inalterada por los intercambios conservativos de aminoácidos.

Otro aspecto del invento se refiere a un procedimiento para la producción de L-aminoácidos, de manera preferida de L-lisina, L-valina y L-isoleucina, de manera especialmente preferida de L-lisina, caracterizado porque abarca las siguientes etapas.

a) fermentación de las bacterias recombinantes conformes al invento del género Corynebacterium glutamicum en un medio nutritivo adecuado, y

b) acumulación del L-aminoácido en el medio nutritivo o en las células de las bacterias.

Por el concepto de "L-aminoácidos" se entienden los aminoácidos proteinógenos.

Cuando en lo sucesivo se mencione la L-lisina o lisina, por este concepto se piensa no sólo en las bases, sino también en las sales, tales como p.ej. monohidrocloruro de L-lisina o sulfato de L-lisina.

En el caso de las bacterias del género Corynebacterium se prefieren las cepas que segregan L-aminoácidos, que se basan en las siguientes especies:

Corynebacterium efficiens, tal como, por ejemplo, la cepa DSM44549,

Corynebacterium glutamicum, tal como, por ejemplo, la cepa ATCC13032,

Corynebacterium thermoaminogenes tal como, por ejemplo, la cepa FERM BP-1539, y

Corynebacterium ammoniagenes, tal como, por ejemplo, la cepa ATCC6871,

prefiriéndose muy especialmente la especie Corynebacterium glutamicum.

Algunos representantes de la especie Corynebacterium glutamicum son conocidos dentro del estado de la técnica también por otras denominaciones. A éstas pertenecen, por ejemplo:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium lilium DSM20137, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, y Brevibacterium divaricatum ATCC14020.

Unos representantes conocidos de cepas del género Corynebacterium, que segregan aminoácidos, son, por ejemplo, las cepas que producen L-lisina:

Corynebacterium glutamicum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) descrita en el documento EP 0 358 940, Corynebacterium glutamicum MH20-22B (= DSM16835) descrita en la cita de Menkel y colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)), Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= Ferm BP-7382) descrita en el documento EP 1 108 790, Corynebacterium glutamicum DSM16834 descrita en el documento (PCT/EP2005/012417), Corynebacterium glutamicum DSM17119 descrita en el documento (PCT/EP2006/060851), Corynebacterium glutamicum DSM17223 descrita en el documento (PCT/EP2006/062010), Corynebacterium glutamicum DSM16937 descrita en el documento (PCT/EP2005/057216), y Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP-3304) descrita en el documento de patente de los EE.UU. US 5.250.423;

o las cepas que producen L-valina:

Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763 descrita en el documento US 5.188.948, Brevibacterium lactofermentum FERM BP-3007 descrita en el documento US 5.521.074, Corynebacterium glutamicum FERM BP-3006 descrita en el documento US 5.521.074, y Corynebacterium glutamicum FERM BP-1764 descrita en el documento US 5.188.948;

o las cepas que producen L-isoleucina:

Brevibacterium flavum FERM-BP 759 descrita en el documento US 4.656.135, Corynebacterium glutamicum FERM-BP 757 descrita en el documento US 4.656.135, Brevibacterium flavum FERM-BP 760 descrita en el documento US 4.656.135, Corynebacterium glutamicum FERM-BP 758 descrita en el documento US 4.656.135, Brevibacterium flavum FERM BP-2215 descrita en el documento US 5.705. 370, y Brevibacterium flavum FERM BP-2433 descrita en el documento US 5.705. 370.

Se encuentran datos acerca de la clasificación taxonómica de las cepas de este conjunto de bacterias, entre otros lugares, en las citas de Seiler (Journal of General Microbiology, 129, 1433-1477 (1983)), de Kämpfer y Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), de Liebl y colaboradores (International Journal of Systematic Bacteriology, 41, 255-260 (1991)) y en el documento US 5.250.434.

Las cepas con la denominación "ATCC" se pueden adquirir de la American Type Culture Collection (Colección americana de cultivos tipos) (Manassas, VA, EE.UU.). Las cepas con la denominación "DSM" se pueden adquirir de la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares) (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Las cepas con la denominación "FERM" se pueden adquirir del National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Instituto nacional de ciencia y tecnología industrial avanzada (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japón). La cepa de Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539) se describe en el documento US-A 5.250.434.

Para la producción de los polinucleótidos conformes al invento se pueden utilizar procedimientos clásicos de mutagénesis in vivo con unas poblaciones celulares de bacterias del género Corynebacterium mediando utilización de sustancias mutágenas tales como, por ejemplo, la N-metil-N'-nitro-N-nitroso-guanidina (MNNG), o de luz ultravioleta. Unos métodos de mutagénesis se describen, por ejemplo, en la obra "Manual of Methods for General Bacteriology" (Manual de métodos de bacteriología general) (de Gerhard y colaboradores (coordinadores de edición), American Society for Microbiology, Washington, DC, EE.UU., 1981) o en la cita de Tosaka y colaboradores (Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978), o en la cita de Konicek y colaboradores (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988).

A partir de la población de células mutagenizadas se sacan y multiplican aquellos mutantes, que necesitan L-ácido glutámico o ácido cítrico, para poder crecer sobre un agar mínimo o cuyo crecimiento sobre un agar mínimo es mejorado por adición de L-ácido glutámico o respectivamente de ácido cítrico. Asimismo es posible, partiendo de los mutantes que necesitan L-ácido glutámico o respectivamente ácido cítrico, aislar los denominados revertantes, que no necesitan ni L-ácido glutámico ni respectivamente ácido cítrico para su crecimiento. Estos mutantes auxótrofos para L-ácido glutámico o respectivamente ácido cítrico o respectivamente sus revertantes son investigados a continuación. Los detalles técnicos acerca del aislamiento de mutantes con una actividad defectuosa de citrato sintasa se pueden consultar, por ejemplo, en la cita de Shiio y colaboradores (Agricultural and Biological Chemistry 46(1), 101-107 (1982)).

A continuación, a partir de los mutantes se pone a disposición o respectivamente se aísla un ADN, y con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR = acrónimo de Polymerase chain reaction), mediando utilización de unos pares de cebadores, que permiten la amplificación del gen gltA o respectivamente del alelo gltA, se sintetiza y aísla el correspondiente polinucleótido.

A este fin, se pueden se pueden escoger unos pares de cebadores arbitrarios a partir de la secuencia de nucleótidos que se encuentra corriente arriba y corriente abajo de la región codificadora y de la secuencia de nucleótidos complementaria con aquélla (véanse las SEQ ID NOs:3 y 25). Un cebador de un par de cebadores comprende en este caso de manera preferida por lo menos 15, por lo menos 18, por lo menos 20, por lo menos 21 o por lo menos 24 nucleótidos consecutivos, escogidos entre la secuencia de nucleótidos que se encuentra entre las posiciones 1 y

1.000 de la SEQ ID NO:25. El segundo cebador correspondiente de un par de cebadores comprende por lo menos 15, por lo menos 18, por lo menos 20, por lo menos 21 o por lo menos 24 nucleótidos consecutivos, escogidos a partir de la secuencia complementaria de nucleótidos entre las posiciones 3.314 y 2.312 de la SEQ ID NO:25.

Unas instrucciones e informaciones acerca de la PCR las encuentra un experto en la especialidad, por ejemplo, en el manual "PCR-Strategies" (Estrategias de PCR) (Innis, Felfand y Sninsky, Academic Press, Inc., 1995), en el manual de Diefenbach y Dveksler "PCR Primer - a laboratory manual" (Cebadores de PCR - un manual de laboratorio) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995), en el manual de Gait "Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach" (Síntesis de oligonucleótidos: un enfoque práctico) (IRL Press, Oxford, Reino Unido 1984) y en la cita de Newton y Graham "PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994).

Otras instrucciones adicionales acerca de la PCR se encuentran, por ejemplo, en el documento de solicitud de patente internacional WO 06/100177 en las páginas 15 hasta 17.

En otra etapa de trabajo se determina luego la secuencia de nucleótidos del polinucleótido. Ésta se puede determinar, por ejemplo, según el procedimiento de rotura de cadenas de Sanger y colaboradores (Proceedings of the National Academies of Sciences, EE.UU., 74, 5463-5467 (1977)) con las modificaciones indicadas por Zimmermann y colaboradores (Nucleic Acids Research 18, páginas 1067 y siguientes (1990)).

El polipéptido codificado por esta secuencia de nucleótidos se puede analizar luego en lo que respecta a la secuencia de aminoácidos. Para esto, la secuencia de nucleótidos se introduce en un programa para la traducción de una secuencia de ADN en una secuencia de aminoácidos. Unos programas adecuados son, por ejemplo, el programa "Patentin", que es obtenible en las oficinas de patentes, por ejemplo, en la Oficina de patentes de los EE.UU. (USPTO), o la herramienta de traducción "Translate Tool", que está disponible en el Servidor ExPASy Proteomics en el world wide web (internet) (Gasteiger y colaboradores, Nucleic Acids Research 31, 3784-3788 (2003)).

Asimismo es posible producir el polinucleótido conforme al invento, que en lo sucesivo será designado también como el alelo gltA conforme al invento, por métodos de genética in vitro.

Unos métodos adecuados para realizar la mutagénesis in vitro son, entre otros, el tratamiento con hidroxilamina según Miller (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Un breve curso de genética bacteriana. Un manual de laboratorio y un manual para Escherichia coli y bacterias relacionadas con ella), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992),

o el empleo de una reacción en cadena de la polimerasa mediando utilización de una polimerasa de ADN que tiene una alta tasa de errores. Una tal polimerasa de ADN es, por ejemplo, la polimerasa de ADN Mutazyme (estuche para mutagénesis GeneMorph PCR, n° 600550) de la entidad Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.). Además, se pueden emplear oligonucleótidos mutágenos, tales como los que se describen en las citas de T. A. Brown (Gentechnologie für Einsteiger (Tecnología genética para principiantes) editorial Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) y de R. M. Horton (PCR-mediated Recombination and Mutagenesis (Recombinación y mutagénesis mediadas por PCR), Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995). Asimismo, se puede emplear el método descrito por Papworth y colaboradores ((Strategies 9(3), 3-4 (1996)) mediando utilización del estuche para mutagénesis dirigida a un sitio de cambio rápido (en inglés "Quik Change Site-directed Mutagenesis Kit" de la entidad Stratagene (La Jolla, California, EE.UU.).

Métodos para la determinación de la actividad de citrato sintasa se pueden consultar en las citas de Eikmanns y colaboradores (Microbiology 140: 1817 -1828 (1994)) y de Shiio y colaboradores (Agricultural and Biological Chemistry 46(1), 101-107 (1982)).

Además, es posible sobreexpresar el alelo conforme al invento de la citrato sintasa en Corynebacterium glutamicum

o en Escherichia coli, por ejemplo, con el fin de producirlo a continuación en una forma purificada o respectivamente aislada.

De esta manera se aisló un polinucleótido, que tiene la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID NO:5. El polipéptido codificado por este polinucleótido se representa en las SEQ ID NO:6 y 8. Él contiene L-valina en lugar de L-ácido aspártico en la posición 5 de la secuencia de aminoácidos.

Se encontró, que la cepa ATCC13032, cuando ella, en lugar del gen gltA de tipo silvestre, está provista del alelo gltA conforme al invento, que codifica la citrato sintasa de acuerdo con la SEQ ID NO:6 (ATCC13032::gltA D5V), en comparación con la cepa ATCC13032 de tipo silvestre, que contiene la citrato sintasa de acuerdo con la SEQ ID NO:2, tiene una actividad enzimática disminuida aproximadamente en un 40 % hasta como máximo aproximadamente en un 90 %, de manera preferida una actividad enzimática disminuida aproximadamente en un 70 % hasta como máximo aproximadamente en un 90 %.

Es conocido el hecho de que unos intercambios conservativos de aminoácidos sólo modifican insignificantemente la actividad enzimática. De manera correspondiente, un objeto del invento son también unos polinucleótidos, que codifican unos polipéptidos con una actividad de citrato sintasa, que contienen, adicionalmente a los intercambios de aminoácidos conformes al invento en la posición 5 de la secuencia de aminoácidos, uno (1) o varios intercambio(s) conservativo(s) de aminoácidos, que no modifica(n) esencialmente a la actividad enzimática. Es decir, que ella permanece en lo esencial inalterada. El concepto de "esencialmente no modificada" o respectivamente "en lo esencial inalterada" significa, en este contexto, que la actividad de citrato sintasa del polipéptido es modificada en como máximo un 20 %, de manera preferida en como máximo un 10 % y de manera especialmente preferida en como máximo un 5 % hasta en como máximo un 2 %, en comparación con la actividad de citrato sintasa del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO:10 o la SEQ ID NO:6, de manera preferida la SEQ ID NO:6.

Para un ensayo experimental, el gen gltA de la cepa ATCC 13032 se reemplaza por el alelo gltA, que codifica un polipéptido que contiene el intercambio de aminoácidos conforme al invento en la posición 5 y uno o varios intercambio(s) conservativo(s) de aminoácidos. A continuación, se cultiva la cepa, se produce un extracto celular y se determina la actividad de citrato sintasa. Como referencia se determina la actividad de citrato sintasa en la cepa ATCC13032::gltA D5V.

En lugar de la cepa ATCC13032 se pueden emplear también unas cepas, que segregan L-lisina de Corynebacterium glutamicum, que contienen la región codificadora del gen gltA de tipo silvestre, inclusive las secuencias de nucleótidos situadas corriente arriba, correspondientemente a la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1 y 2.064 de la SEQ ID NO:3, que de manera preferida contienen la SEQ ID NO:3. Unas cepas adecuadas son, por ejemplo, la DSM16833 que se ha descrito en el documento PCT/EP2005/012417, la DSM13994, que se ha descrito en el documento de solicitud de patente europea EP 1.239.040 A2 o la DSM17576, que se ha descrito en el documento de solicitud de patente alemana DE 102005045301. En estas cepas, mediante intercambio de alelos se puede(n) introducir la(s) correspondiente(s) mutación (mutaciones) en la región codificadora del gen gltA.

Asimismo, es posible purificar los polipéptidos y llevar a cabo los ensayos comparativos en los polipéptidos purificados.

La enzima citrato sintasa (n° de EC 4.1.3.7) cataliza la reacción de condensación de un oxalacetato y de acetil-CoA, formándose como productos de reacción ácido cítrico y la coenzima A (CoA). En la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (Enciclopedia de Kyoto de genes y genomas) (KEGG, Kanehisa Laboratory, Bioinformatics Center, Institute for Chemical Research, Kyoto University, Japón) a esta enzima se le asigna el n° de EC 2.3.3.1.

En el caso de los L-aminoácidos aromáticos se habla de intercambios conservativos, cuando la L-fenil-alanina, el Ltriptófano y la L-tirosina se intercambian entre sí. En el caso de los L-aminoácidos hidrófobos, se habla de intercambios conservativos, cuando la L-leucina, la L-isoleucina y la L-valina se intercambian entre sí. En el caso de los L-aminoácidos polares se habla de intercambios conservativos, cuando la L-glutamina y la L-asparagina se intercambian entre sí. En el caso de los aminoácidos de carácter básico se habla de intercambios conservativos, cuando la L-arginina, la L-lisina y la L-histidina se intercambian entre sí. En el caso de los L-aminoácidos de carácter ácido se habla de intercambios conservativos, cuando el L-ácido aspártico y el L-ácido glutámico se intercambian entre sí. En el caso de los L-aminoácidos que contienen grupos hidroxilo, se habla de intercambios conservativos cuando la L-serina y la L-treonina se intercambian entre sí.

De manera preferida, el polipéptido contiene a lo sumo dos (2), a lo sumo tres (3), a lo sumo cuatro (4) o a lo sumo cinco (5) intercambios conservativos de aminoácidos, adicionalmente al intercambio conforme al invento en la posición 5 de la SEQ ID NO:2.

Es conocido que la metionina situada en un extremo, es eliminada en el caso de la síntesis de proteínas por unas enzimas propias del anfitrión, las denominadas aminopeptidasas.

Los polinucleótidos aislados, que codifican la variante conforme al invento de la citrato sintasa, o unas partes de ésta, se pueden utilizar para producir unas cepas recombinantes del género Corynebacterium, de manera especialmente preferida de Corynebacterium glutamicum, que contienen el intercambio de aminoácidos conforme al invento en la posición 5 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la citrato sintasa, y que, en comparación con la cepa de partida o respectivamente parental, entregan L-aminoácidos de manera mejorada al medio circundante o los acumulan en el interior de las células.

De manera preferida, se utilizan aquellas cepas de partida, que ya poseen la capacidad de segregar por lo menos 1 g/l, de manera preferida por lo menos 5 g/l, de manera especialmente preferida por lo menos 10 g/l del L-aminoácido deseado al medio nutritivo circundante.

Un método propagado para la incorporación de mutaciones en genes de bacterias del género Corynebacterium, en particular de la especie Corynebacterium glutamicum, es el del intercambio de alelos, que se conoce también bajo la denominación de "reemplazo de genes" (en inglés "gene replacement"). En el caso de este procedimiento, un fragmento de ADN, que contiene la mutación que interesa, es transferido a la cepa deseada y la mutación es incorporada mediante por lo menos dos sucesos de recombinación o respectivamente dos sucesos de cruzamiento (en inglés "cross over") en el cromosoma de la cepa deseada, o respectivamente la secuencia de un gen presente en la respectiva cepa, se intercambia por la secuencia mutada.

El fragmento de ADN, que contiene la mutación que interesa, se presenta en el caso de este método típicamente dentro de un vector, en particular de un plásmido, que preferiblemente no es replicado o lo es sólo de un modo restringido por la cepa que debe de ser provista de la mutación, es decir en condiciones selectas de cultivación. Como anfitrión auxiliar o intermedio, en el que es replicable el vector, se utiliza por lo general una bacteria del género Escherichia, de manera preferida de la especie Escherichia coli.

Ejemplos de tales vectores de plásmidos son los vectores pK*mob y pK*mobsacB, tales como, por ejemplo el pk18mobsacB, descritos por Schäfer y colaboradores (Gene 145, 69-73 (1994)) y los vectores descritos en losdocumentos WO 02/070685 y WO 03/014362. Éstos son capaces de replicarse en Escherichia coli, pero no en Corynebacterium. Se adecuan especialmente unos vectores, que contienen un gen que actúa de un modo dominante negativo condicional, tal como, por ejemplo, el gen sacB (gen de la levano sucrasa) de, por ejemplo, Bacillus, o el gen galK (gen de la galactosa cinasa) de, por ejemplo, Escherichia coli. Por el concepto de "un gen, que actúa de un modo dominante negativo condicional" se entiende un gen, que en determinadas condiciones es desventajoso, por ejemplo tóxico, para el anfitrión, pero que en otras condiciones no tiene repercusiones negativassobre el anfitrión que lleva el gen. Éstos hacen posible la selección en cuanto a unos sucesos de recombinación, en los que el vector es eliminado desde el cromosoma.

Además, por Nakamura y colaboradores (documento US 6.303.383) se describió un plásmido sensible frente a la temperatura para Corynebacterium, que sólo se puede replicar a unas temperaturas situadas por debajo de 31°C. Asimismo, éste también se puede emplear para las medidas técnicas del invento.

El vector es transferido a continuación por conjugación, por ejemplo según el método de Schäfer (Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)) o por transformación, por ejemplo según el método de Dunican y Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) o según el método de Thierbach y colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)) a la Corynebacterium. Eventualmente, la transferencia del ADN se puede alcanzar también mediante métodos balísticos (p.ej. un bombardeo con partículas).

Después de una recombinación homóloga por medio de un primer suceso de cruzamiento, que conduce a una integración, y de un segundo adecuado suceso de cruzamiento que da lugar a una escisión en el gen diana o respectivamente en la secuencia diana, se consigue la incorporación de la mutación y se obtiene una bacteria recombinante. Por el concepto de "gen diana" se designa a un gen, en el que se debe de efectuar el intercambio deseado.

Para realizar la identificación y la caracterización de las cepas obtenidas, se pueden emplear, entre otros, los métodos de la hibridación por transferencia de borrón Southern, de la reacción en cadena de la polimerasa, de la determinación de secuencias, el método de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (en inglés "Fluorescence Resonance Energy Transfer", (FRET)) (Lay y colaboradores Clinical Chemistry 43, 2262-2267 (1997)

o los métodos de la enzimología.

Este método fue utilizado por Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991) para incorporar un alelo lysA, que llevaba una supresión, y un alelo lysA, que llevaba una inserción, en el cromosoma de C. glutamicum en lugar del gen de tipo silvestre.

Este método fue empleado por Nakagawa y colaboradores (documento EP 1108790) y por Ohnishi y colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 217-223 (2002)) para incorporar diferentes mutaciones partiendo de los alelos o respectivamente polinucleótidos aislados en el cromosoma de C. glutamicum. De esta manera, Nakagawa y colaboradores consiguieron incorporar una mutación designada como Val59Ala en el gen de la homoserina deshidrogenasa (hom), una mutación designada como Thr311Ile en el gen de la aspartato cinasa (lysC

o respectivamente ask), una mutación designada como Pro458Ser en el gen de la piruvato carboxilasa (pyc) y una mutación designada como Ala213Thr en el gen de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf) de C. glutamicum.

Para la incorporación de la mutación conforme al invento en el gen gltA dentro del cromosoma mediante un intercambio de alelos se puede utilizar un polinucleótido, que codifica una secuencia de aminoácidos, que contiene el intercambio de aminoácidos conforme al invento en la posición 5 de la SEQ ID NO:2, tal como se representa en la SEQ ID NO:10, y que posee corriente arriba y corriente abajo de ésta una secuencia de nucleótidos con una longitud de en cada caso por lo menos aproximadamente 51 (véanse también las SEQ ID NO:11 y 12), de manera preferida en cada caso por lo menos aproximadamente 101 o respectivamente 102, (véanse también las SEQ ID NO:13 y 14), de manera especialmente preferida en cada caso por lo menos aproximadamente 201 nucleobases (véanse también las SEQ ID NO:15 y 16) y de manera muy especialmente preferida en cada caso por lo menos aproximadamente 500 o respectivamente 498 nucleobases (véanse también las SEQ ID NO:17 y 18) escogidas a partir de la SEQ ID NO:9. La longitud máxima de la secuencia de nucleótidos situada corriente arriba y corriente abajo de la mutación se sitúa por lo general en aproximadamente 500, aproximadamente 750, aproximadamente 1.000, aproximadamente

1.500 o aproximadamente 2.000 hasta 2.100 nucleobases. La secuencia de nucleótidos situada corriente arriba de la mutación abarca, por ejemplo, la secuencia situada entre las posiciones 1 y 762 de la SEQ ID NO:9 o la secuencia situada entre las posiciones 1 y 1.012 de la SEQ ID NO:25. La secuencia de nucleótidos situada corriente abajo de la mutación abarca, por ejemplo, la secuencia situada entre las posiciones 766 y 2.814 de la SEQ ID NO:9, o la secuencia situada entre las posiciones 1.016 y 3.314 de la SEQ ID NO:25. La longitud total del polinucleótido empleado para el intercambio de alelos se sitúa de manera correspondiente en como máximo aproximadamente 1.000, como máximo aproximadamente 1.500, como máximo aproximadamente 2.000, como máximo aproximadamente 3.000 o como máximo aproximadamente 4.000 hasta 4.200 nucleobases.

De manera correspondiente, es un objeto del invento un polinucleótido, que abarca una secuencia de nucleótidos, que desde la posición 1 hasta la 39 contiene la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 1 hasta 39 de la SEQ ID NO:11, y desde la posición 40 hasta la 105 contiene una secuencia de nucleótidos, que codifica una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:12, estando contenida L-valina en la posición 5.

En este contexto, los datos sobre las posiciones 1 hasta 39 de la SEQ ID NO:11 corresponden a los datos sobre las posiciones 712 hasta 750 de la SEQ ID NO:9. Los datos sobre las posiciones 40 hasta 105 de las SEQ ID NO:11 corresponden a los datos sobre las posiciones 751 hasta 816 de la SEQ ID NO:9.

En una forma preferida de realización, el polinucleótido abarca la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:11, realizándose que el codón correspondiente a las posiciones 52 hasta 54 codifica L-valina.

En una forma de realización especialmente preferida, el polinucleótido abarca la secuencia de nucleótidos desde la posición 712 hasta la 816 de la SEQ ID NO:7.

Correspondientemente, es un objeto del invento, además, un polinucleótido, que abarca una secuencia de nucleótidos, que desde la posición1 hasta la 89 contiene la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 1 hasta 89 de la SEQ ID NO:13 y desde la posición 90 hasta la 206 contiene una secuencia de nucleótidos, que codifica la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:14, estando contenida L-valina en la posición 5.

En este contexto, los datos sobre las posiciones 1 hasta 89 de la SEQ ID NO:13 corresponden a los datos sobre las posiciones 662 hasta 750 de la SEQ ID NO:9. Los datos sobre las posiciones 90 hasta 206 de la SEQ ID NO:13 corresponden a los datos sobre las posiciones 751 hasta 867 de la SEQ ID NO:9.

En una forma preferida de realización, el polinucleótido abarca la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:13, realizándose que el codón correspondiente a las posiciones 102 hasta 104 codifica L-valina.

En una forma de realización especialmente preferida, el polinucleótido abarca la secuencia de nucleótidos desde la posición 662 hasta la 867 de la SEQ ID NO:7.

Un objeto del invento es de manera correspondiente, finalmente, un polinucleótido que abarca una secuencia de nucleótidos, que desde la posición 1 hasta la 189 contiene la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 1 hasta 189 de la SEQ ID NO:15, y desde la posición 190 hasta la 405 contiene una secuencia de nucleótidos, que codifica la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:16, estando contenida L-valina en la posición 5.

En este contexto, los datos sobre las posiciones 1 hasta 189 de la SEQ ID NO:15 corresponden a los datos sobre las posiciones 562 hasta 750 de la SEQ ID NO:9. Los datos sobre las posiciones 190 hasta 405 de la SEQ ID NO:15 corresponden a los datos sobre las posiciones 751 hasta 966 de la SEQ ID NO:9.

En una forma preferida de realización, el polinucleótido abarca la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:15, realizándose que el codón correspondiente a las posiciones 202 hasta 204 codifica L-valina.

En una forma especialmente preferida de realización, el polinucleótido abarca la secuencia de nucleótidos desde la posición 562 hasta la 966 de la SEQ ID NO:7.

De manera correspondiente es objeto del invento, finalmente, también un polinucleótido que abarca una secuencia de nucleótidos, que desde la posición 1 hasta la 488 contiene la secuencia de nucleótidos 1 hasta 488 de la SEQ ID NO:17, y desde la posición 489 hasta la 1.001 contiene una secuencia de nucleótidos, que codifica la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:18, estando contenida L-valina en la posición 5.

En este contexto, los datos sobre las posiciones 1 hasta 488 de la SEQ ID NO:17 corresponden a los datos sobre las posiciones 263 hasta 750 de la SEQ ID NO:9. Los datos sobre las posiciones 489 hasta 1.001 de la SEQ ID NO:15 corresponden a los datos sobre las posiciones 751 hasta 1.263 de la SEQ ID NO:9.

En una forma preferida de realización, el polinucleótido abarca la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:17, realizándose que el codón correspondiente a las posiciones 501 hasta 503 codifica L-valina.

En una forma especialmente preferida de realización, el polinucleótido abarca la secuencia de nucleótidos desde la posición 263 hasta la 1.263 de la SEQ ID NO:7.

En una forma muy especialmente preferida de realización, el polinucleótido abarca la secuencia de nucleótidos desde la posición 9 hasta la 1.687 de la SEQ ID NO:31.

Un objeto del invento son asimismo unos vectores, de manera preferida unos plásmidos, que contienen los polinucleótidos mencionados.

Un objeto del invento son asimismo unas bacterias, de manera preferida del género Escherichia, de manera especialmente preferida de la especie Escherichia coli, y del género Corynebacterium, de manera especialmente preferida de la especie Corynebacterium glutamicum, que contienen los mencionados vectores.

Un objeto del invento son asimismo unas cepas del género Corynebacterium, de manera preferida de la especie Corynebacterium glutamicum, que se habían producido mediando utilización de los polinucleótidos conformes al invento o mediando utilización de unos vectores, que contienen los polinucleótidos conformes al invento.

Asimismo, es posible incorporar el alelo gltA conforme al invento en otro lugar en el cromosoma de Corynebacterium glutamicum. En este caso, se puede tratar, por ejemplo, de los sitios o respectivamente genes aecD, ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, fda, gluA, gluB, gluC, gluD, luxR, luxS, lysR1, lysR2, lysR3, menE, mqo, pck, pgi y poxB, tal como se han descrito en el documento WO 03/04037. En este caso, se puede tratar, además, por ejemplo de unas regiones intergénicas, de un ADN de profagos, de fagos defectuosos y de componentes de fagos, tal como se han descrito en el documento WO 04/069996.

Las cepas recombinantes, obtenidas conforme al invento, muestran una segregación o respectivamente producción del aminoácido deseado en un proceso de fermentación, que ha sido aumentada en comparación con la cepa de partida empleada o respectivamente con la cepa parental,.

Las cepas de partida que segregan L-lisina, que son empleables para las medidas técnicas del invento, poseen, junto a otras propiedades, en particular la de una aspartato cinasa insensible frente a la lisina.

Por el concepto de "una aspartato cinasa insensible frente a la lisina" se entiende un polipéptido o respectivamente una proteína con una actividad de aspartato cinasa (n° de EC 2.7.2.4) que, en comparación con la forma silvestre, tiene una sensibilidad más pequeña frente a la inhibición por mezclas de lisina y treonina o por mezclas de AEC (aminoetilcisteína) y treonina, o por lisina a solas, o por AEC a solas. Tales aspartato cinasas son designadas también como aspartato cinasas resistentes o respectivamente desensibilizadas frente a la retroalimentación (en inglés "feed back"). Las secuencias de nucleótidos que codifican estas aspartato cinasas o respectivamente estas variantes de aspartato cinasas desensibilizadas son designadas también como alelos lysCFBR. En los bancos de datos públicos están disponibles informaciones sobre numerosos alelos lysCFBR. Algunos autores designan al gen lysC también como gen ask.

La región codificadora del gen lysC de tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum correspondiente al número de acceso AX756575 del banco de datos NCBI se representa en la SEQ ID NO:19 y el polipéptido codificado por este gen se representa en la SEQ ID NO:20. En la SEQ ID NO:21 se exponen además las secuencias de nucleótidos que están situadas corriente arriba del extremo 5' y corriente abajo del extremo 3' de la región codificadora. La SEQ ID NO:20 corresponde a la SEQ ID NO:22.

Las bacterias que segregan L-lisina, empleadas para las medidas técnicas del invento, disponen de manera preferida de un alelo lysC, que codifica una variante de la aspartato cinasa, que posee la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20, conteniendo ésta uno o varios intercambios de aminoácidos, escogidos entre el conjunto que se compone de:

a) LysC A279T (intercambio de L-alanina en la posición 279 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-treonina; véanse el documento US 5.688.671 y los números de acceso E06825, E06826, E08178 y 174588 hasta 174597),

b) LysC A279V (intercambio de L-alanina en la posición 279 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-valina; véanse el documento de solicitud de patente japonesa JP 6261766 y el número de acceso E08179),

c) LysC L297Q (intercambio de L-leucina en la posición 297 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por otro aminoácido proteinógeno, de manera preferida L-glutamina; véase el documento DE 102006026328).

d) LysC S301F (intercambio de L-serina en la posición 301 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-fenilalanina; véanse el documento US 6.844.176 y el número de acceso E08180),

e) LysC S301Y (intercambio de L-serina en la posición 301 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-tirosina, véanse la cita de Kalinowski y colaboradores (Molecular and General Genetics 224, 317-324 (1990)) y el número de acceso X57226),

f) LysC T308I (intercambio de L-treonina en la posición 308 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-isoleucina; véanse el documento JP 6-261766 y el número de acceso E08181),

g) LysC T311I (intercambio de L-treonina en la posición 311 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-isoleucina; véanse los documentos WO 00/63388 y US 6.893.848),

h) LysC S317A (intercambio de L-serina en la posición 317 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-alanina; véanse el documento US 5.688.671 y el número de acceso 174589),

i) LysC R320G (intercambio de L-arginina en la posición 320 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por glicina; véanse la cita de Jetten y colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) y el número de acceso L27125),

j) LysC G345D (intercambio de glicina en la posición 345 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-ácido aspártico; véanse la cita de Jetten y colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) y el número de acceso L16848),

k) LysC T380I (intercambio de L-treonina en la posición 380 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-isoleucina, véanse el documento WO 01/49854 y el número de acceso AX192358), y

l) LysC S381F (intercambio de L-serina en la posición 381 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-fenilalanina; véase el documento EP 0435132).

Se prefieren muy especialmente unas cepas, cuyas variantes de aspartato cinasa contienen el intercambio de aminoácidos LysC T311I o uno o varios de los intercambios de aminoácidos, escogidos entre el conjunto que se compone de LysC A279T, LysC L297Q, LysC S317A, LysC T380I y LysC S381F.

Naturalmente, es posible asimismo llevar a cabo primeramente la incorporación de la mutación conforme al invento en el gen gltA del cromosoma de una bacteria del género Corynebacterium, y a continuación incorporar una o varias de la(s) mutación (mutaciones) deseada(s) en el gen lysC de la correspondiente cepa.

En otra forma de realización, las aspartato cinasas descritas se presentan sobreexpresadas en la Corynebacterium, que contiene el intercambio de aminoácidos conforme al invento en el gen gltA.

Por el concepto de "sobreexpresión" se entiende por lo general un aumento de la concentración o actividad intracelular de un ácido ribonucleico, de una proteína o de una enzima en comparación con la cepa de partida (cepa parental) o con la cepa de tipo silvestre. Por el concepto de "una cepa de partida (cepa parental)" se entiende la cepa, en la que se había llevado a cabo la medida técnica del invento que conduce a la sobreexpresión.

El aumento de la concentración o de la actividad se puede conseguir, por ejemplo, mediante el recurso de que el número de copias de los correspondientes polinucleótidos se aumenta cromosomal o extracromosomalmente en por lo menos una copia.

Un método ampliamente propagado para el aumento del número de copias consiste en que el correspondiente polinucleótido se incorpora en un vector, de manera preferida en un plásmido, que es replicado por una bacteria corineforme. Unos vectores de plásmidos adecuados son por ejemplo el pZ1 (Menkel y colaboradores, Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) o los vectores pSELF descritos por Tauch y colaboradores (Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)). Un artículo recopilativo sobre el tema de “plásmidos en Corynebacterium glutamicum” se encuentra en la cita de Tauch y colaboradores (Journal of Biotechnolgy 104, 27-40 (2003)).

Además, como vectores se pueden emplear transposones, elementos de inserción (elementos IS) o fagos. Tales sistemas genéticos se describen, por ejemplo, en los documentos de patentes US 4.822.738, US 5.804.414 y US

5.804.414. De igual manera. se puede utilizar el elemento IS ISaB1 descrito en el documento WO 92/02627 o el transposón Tn 45 del plásmido pXZ10142 (citado en "Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Manual de Corynebacterium glutamicum) (coordinadores de edición: L. Eggeling y M. Bott)).

Otro método propagado para la consecución de una sobreexpresión es el procedimiento de la amplificación cromosomal de genes. En el caso de este método, por lo menos una copia adicional del polinucleótido que interesa se introduce en el cromosoma de una bacteria corineforme.

Tales procedimientos de amplificación se describen, por ejemplo, en los documentos WO 03/014330 ó WO 03/040373.

Otro método para la consecución de una sobreexpresión consiste en unir el correspondiente gen o respectivamente alelo en un modo funcional (en inglés "operably linked" es decir engarzado operativamente) con un promotor o respectivamente una casete de expresión. Unos promotores adecuados para Corynebacterium glutamicum se describen, por ejemplo, en la Fig. 1 del artículo recopilativo de Patek y colaboradores (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003)). De igual manera se pueden emplear las variantes del promotor de dapA, por ejemplo el promotor A25, descritas por Vasicova y colaboradores (Journal of Biotechnology 181, 6188-6191 (1999)). Además, se puede utilizar el promotor de gap de Corynebacterium glutamicum (documento EP 06007373). Finalmente se pueden utilizar los promotores de T3, T7, SP6, M13, lac, tac y trc, que son suficientemente conocidos, y que han sido descritos en las citas de Amann y colaboradores (Gene 69(2), 301-315 (1988)) y de Amann y Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)). Un promotor de este tipo puede ser introducido, por ejemplo, corriente arriba del respectivo gen, típicamente a una distancia de aproximadamente 1 - 500 nucleobases desde el codón de inicio.

Mediante las medidas técnicas de sobreexpresión se aumenta la actividad o la concentración del correspondiente polipéptido por lo general por lo menos en un 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 %, como máximo hasta en un 1.000 % o 2.000 %, referido a la actividad o concentración del polipéptido en la cepa antes de realizarse la medida técnica que conduce a la sobreexpresión.

En otra forma de realización adicional, las bacterias conformes al invento del género Corynebacterium, que contienen de manera preferida además un polinucleótido, que codifica una variante de la aspartato cinasa insensible para lisina, poseen una o varias características, escogidas entre el conjunto que se compone de

a) un polinucleótido sobreexpresado (el gen dapA), que codifica una dihidrodipicolinato sintasa, (DapA, n° de EC 4.2.1.52)

b) un polinucleótido sobreexpresado (el gen asd), que codifica una aspartatosemialdehído deshidrogenasa (Asd, n° de EC 1.2.1.11),

c) un polinucleótido sobreexpresado (el gen lysA), que codifica una diaminopimelato descarboxilasa (LysA, n° de EC 4.1.1.20),

d) un polinucleótido sobreexpresado (el gen aat), que codifica una asparato aminotransferasa (Aat, n° de EC 2.6.1.1),

e) un polinucleótido sobreexpresado (el gen lysE), que codifica un polipéptido con una actividad de exportación de L-lisina (LysE, permeasa de eflujo de lisina),

f) una actividad desconectada o debilitada de la malato deshidrogenasa (Mdh, n° de EC 1.1.1.37),

g) una actividad desconectada o debilitada de la malato quinona oxidorreductasa (Mqo, n° de EC 1.1.99.16),

h) un polinucleótido sobreexpresado, que codifica una piruvato carboxilasa (Pyc, n° de EC 6.4.1.1), y

i) una actividad desconectada o debilitada de la subunidad E1p del complejo de la piruvato deshidrogenasa (AceE, n° de EC 1.2.4.1).

Las características a) hasta g) son especialmente preferidas.

Para realizar la sobreexpresión de los genes o respectivamente polinucleótidos expuestos, se pueden utilizar los genes conocidos dentro del estado de la técnica, por ejemplo, los denominados genes de tipo silvestre de Escherichia coli (Blattner y colaboradores, Science 277(5), 1453-1462 (1997)), de Bacillus subtilis (Kunst y colaboradores, Nature 390 (6657), 249-256 (1997)), de Bacillus licheniformis (Veith y colaboradores, Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 7 (4), 204-211 (2004)), de Mycobacterium tuberculosis (Fleischmann y colaboradores, Journal of Bacteriology 1841, 5479-5490 (2004)), de Mycobacterium bovis (Garnier y colaboradores, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (13), 7877-7882 (2003)), de Streptomyces coeliclor (Redenbach y colaboradores, Molecular Microbiology 21 (1), 77-96 (1996)), de Lactobacillus acidophilus (Altermann y colaboradores, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102 (11), 3906-3912 (2005)), de Lactobacillus johnsonii (Pridmore y colaboradores, Proceedings of National Academy of Sciences U.S.A. 101 (8), 2512-2517 (2004)), de Bifidobacterium longum (Schell y colaboradores, Proceedings of National Academy of Sciences U.S.A. 99 (22), 14422-14427 (2002)), y de Saccharomyces cerevisiae. Los genomas de las formas de tipo silvestre de estas bacterias se presentan en una forma secuenciada y anotada. De manera preferida, se utilizan los genes o respectivamente polinucleótidos endógenos del género Corynebacterium, de manera especialmente preferida de la especie Corynebacterium glutamicum.

Por el concepto de "genes o respectivamente polinucleótidos endógenos" se entienden los marcos de lectura abiertos (ORF), los genes o alelos o respectivamente sus polinucleótidos, que están presentes en la población de una especie.

El gen dapA de Corynebacterium glutamicum cepa ATCC13032 se describe, por ejemplo, en el documento EP

0.197.335. Para la sobreexpresión del gen dapA de Corynebacterium glutamicum se pueden emplear además, entre otras, las mutaciones MC20 y MA16 del promotor de dapA, tal como se han descrito en el documento US 6.861.246.

El gen asd de Corynebacterium glutamicum cepa ATCC21529 se ha descrito, por ejemplo, en el documento US

6.927.046.

El gen lysA de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 (Brevibacterium lactofermentum) se ha descrito, por ejemplo, en el documento US 6.090.597.

El gen aat de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 se ha descrito, por ejemplo, en la cita de Kalinowski y colaboradores (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 5-25 (2003); véase también el número de acceso NC_006958). Allí, él es designado como gen aspC. En el documento US 6.004.773, un gen que codifica una aspartato aminotransferasa es designado como gen aspB. Marienhagen y colaboradores (Journal of Bacteriology 187 (22), 7639-7646 (2005) designan al gen aat como gen aspT.

El gen lysE de Corynebacterium glutamicum R127 se ha descrito, por ejemplo en el documento US 6.858.406. En el caso de la cepa R127 se trata de un mutante con defecto de restricción de ATCC13032 (Liebl y colaboradores, FEMS Microbiology Letters 65, 299-304 (1989)). De igual manera, se puede emplear el gen lysE de la cepa ATCC13032 utilizado en el documento US 6.861.246.

El gen pyc de Corynebacterium glutamicum de la cepa ATCC 13032 se ha descrito, por ejemplo, en los documentos WO 99/18228 y WO 00/39305. Además, se pueden utilizar unos alelos del gen pyc tal como se han descrito, por ejemplo, en el documento US 6.965.021. Las piruvato carboxilasas descritas en este documento de patente poseen uno o varios de los intercambios de aminoácidos, escogidos entre el conjunto que se compone de: Pyc E153D (intercambio de L-ácido glutámico en la posición 153 por L-ácido aspártico), Pyc A182S (intercambio de L-alanina en la posición 182 por L-serina), Pyc A206S (intercambio de L-alanina en la posición 206 por L-serina), Pyc H227R (intercambio de L-histidina en la posición 227 por L-arginina), Pyc A455G (intercambio de L-alanina en la posición 455 por glicina) y Pyc D1120E (intercambio de L-ácido aspártico en la posición 1.120 por L-ácido glutámico). De igual manera se puede utilizar el alelo pyc descrito en el documento EP 1.108.790, que codifica una piruvato carboxilasa, que contiene el intercambio de aminoácidos Pyc P458S (intercambio de L-prolina en la posición 458 por L-serina).

Por el concepto de "una actividad desconectada o debilitada" se entiende la disminución o la desconexión de la actividad o concentración intracelular de una o varias enzimas o respectivamente proteínas en un microorganismo, que es (son) codificada(s) por el correspondiente polinucleótido o respectivamente ADN.

Para la producción de una cepa, en la que se ha desconectado la actividad intracelular de un polipéptido deseado, se incorpora una supresión o inserción de por lo menos una (1) nucleobase, de manera preferida de una (1) o de dos (2) nucleobases, en la región codificadora del correspondiente gen. Igualmente es posible suprimir un (1) o también varios codón (codones) dentro de la región codificadora. Estas medidas técnicas conducen a un desplazamiento del marco de lectura (en inglés "frame shift mutations"), y por consiguiente típicamente a la síntesis de un polipéptido incapaz de funcionar. De igual manera actúa la introducción de un mutación sin sentido (en inglés "nonsense mutation") por transversión o transición de por lo menos una (1) nucleobase dentro de la región codificadora. A causa del codón de interrupción resultante, se llega a una interrupción prematura de la traducción. Las medidas técnicas mencionadas se llevan a cabo de manera preferida en la región situada entre el codón de inicio y el penúltimo codón codificador, de manera especialmente preferida en la parte del terminal 5' de la región codificadora, que codifica el terminal de N del polipéptido. Si se designa a la longitud total de un polipéptido (medida como el número de los L-aminoácidos unidos por medios químicos) con 100 %, entonces - dentro del marco del presente invento – al extremo terminal de N del polipéptido pertenece la parte de la secuencia de aminoácidos que, calculada a partir del aminoácido inicial L-formil-metionina, contiene un 80 % de los siguientes L-aminoácidos,.

Unas medidas genéticas para realizar la desconexión de la malato quinona oxidorreductasa (Mqo) se han descrito, por ejemplo, en el documento US 7.094.106.

Unas medidas genéticas para realizar la desconexión de la malato deshidrogenasa (Mdh) se han descrito, por ejemplo, en el documento WO 02/02778.

Unas medidas genéticas para realizar la desconexión de la subunidad E1p (AceE) del complejo de la piruvato deshidrogenasa se han descrito, por ejemplo, en el documento EP 06119615 y en la cita de Schreiner y colaboradores (Journal of Bacteriology 187(17), 6005-6018 (2005)).

Asimismo, mediante adecuados intercambios de aminoácidos es posible disminuir la propiedad catalítica del correspondiente polipéptido.

En el caso de la malato quinona oxidorreductasa (Mqo), esto se puede conseguir, tal como se ha descrito en el documento WO 06/077004, produciendo o respectivamente utilizando unos alelos del gen mqo, que codifican una variante de Mqo, que posee la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24 y uno o varios intercambios de aminoácidos escogidos entre el conjunto que se compone de

a) el intercambio de la L-serina en la posición 111 por otro aminoácido proteinógeno, de manera preferida por L-fenilalanina o L-alanina, y

b) el intercambio de la L-alanina en la posición 201 por otro aminoácido proteinógeno, de manera preferida por L-serina.

Se prefieren muy especialmente unas cepas que contienen un alelo mqo, que codifica una variante de la Mqo, que posee la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24, estando contenida L-fenilalanina en la posición 111.

Mediante las medidas técnicas de la desconexión o del debilitamiento, se disminuye la actividad o concentración de la correspondiente proteína por lo general en 0 hasta 75 %, en 0 hasta 50 %, en 0 hasta 25%, en 0 hasta 10 % o en 0 hasta 5 % de la actividad o concentración de la proteína de tipo silvestre, o respectivamente de la actividad o concentración de la proteína en la cepa de partida o respectivamente en la cepa parental.

El rendimiento de las bacterias producidas conforme al invento del género Corynebacterium o respectivamente del proceso de fermentación mediando utilización de las mismas en lo que respecta a uno o varios de los parámetros, escogidos entre el conjunto que se compone de la concentración de un L-aminoácido (L-aminoácido formado por volumen), del rendimiento de un L-aminoácido (L-aminoácido formado por fuente de carbono consumida), de la formación de un L-aminoácido (L-aminoácido formado por volumen y tiempo) y de la formación específica de un Laminoácido (L-aminoácido formado por masa celular seca o respectivamente biomasa seca y tiempo, o Laminoácido formado por proteína celular y tiempo) o también otros parámetros de procesos y otras combinaciones de éstos, se aumenta en por lo menos 0,5 %, por lo menos 1 %, por lo menos 1,5 % o por lo menos 2 %, referido a la cepa de partida o respectivamente a la cepa parental o respectivamente al proceso de fermentación mediando utilización de las mismas.

Las bacterias del género Corynebacterium, producidas conforme al invento, se pueden cultivar continuamente - tal como se ha descrito por ejemplo en el documento PCT/EP2004/008882 - o discontinuamente en el procedimiento batch (cultivación por tandas) o en el procedimiento fed batch (procedimiento de afluencia) o en el procedimiento fed batch repeated (procedimiento de afluencia repetida) con el fin de efectuar la producción de los L-aminoácidos deseados. Una recopilación de tipo general acerca de métodos conocidos de cultivación se describe en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Técnica de bioprocesos 1. Introducción en la técnica de los bioprocesos] (editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Biorreactores y disposiciones periféricas] (editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo o respectivamente medio de fermentación que se ha de utilizar, debe de satisfacer de una manera apropiada las exigencias de las respectivas cepas. Unas descripciones de medios de cultivo de diferentes microorganismos están contenidas en el manual “Manual of Methods for General Bacteriology” [Manual de métodos para la bacteriología general] de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., EE.UU., 1981). Los conceptos de medio de cultivo y de medio de fermentación y respectivamente de medio se pueden intercambiar recíprocamente.

Como fuente de carbono se pueden utilizar azúcares e hidratos de carbono, tales como p.ej. glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, soluciones que contienen sacarosa procedentes de la producción de remolacha azucarera o de caña de azúcar, almidones, materiales hidrolizados de almidones y celulosas, aceites y grasas, tales como por ejemplo aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, ácidos grasos, tales como por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, tales como por ejemplo glicerol, metanol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como por ejemplo ácido acético o ácido láctico. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o como una mezcla.

Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, tales como peptonas, un extracto de levadura, un extracto de carne, un extracto de malta, agua de maceración de maíz, harina de soja y urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar individualmente o como una mezcla.

Como fuente de fósforo se pueden utilizar ácido fosfórico, dihidrógeno-fosfato de potasio o hidrógeno-fosfato de dipotasio o bien las correspondientes sales que contienen sodio.

El medio de cultivo debe de contener además unas sales, por ejemplo en forma de cloruros o sulfatos de metales, tales como por ejemplo sodio, potasio, magnesio, calcio y hierro, tales como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, de manera adicional a las sustancias arriba mencionadas se pueden emplear unas hormonas del crecimiento o fitohormonas esenciales, tales como aminoácidos, por ejemplo homoserina, y vitaminas, por ejemplo tiamina, biotina o ácido pantoténico.

Las mencionadas sustancias de partida empleadas se pueden añadir al cultivo en forma de una tanda única o se pueden alimentar de una manera apropiada durante la cultivación.

Para realizar el control del pH del cultivo se emplean de un modo apropiado compuestos de carácter básico, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o respectivamente agua amoniacal, o compuestos de carácter ácido, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. El pH se ajusta por lo general a un valor de 6,0 hasta 9,0, de manera preferida de 6,5 hasta 8. Para la represión del desarrollo de espuma se pueden emplear agentes antiespumantes, tales como por ejemplo ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Para la conservación de la estabilidad de los plásmidos, se pueden añadir al medio unas apropiadas sustancias que actúan de un modo selectivo, por ejemplo antibióticos. Con el fin de mantener unas condiciones aerobias, se incorporan en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno, tales como por ejemplo aire. La utilización de unos líquidos que están enriquecidos con peróxido de hidrógeno, es asimismo posible. Eventualmente, la fermentación se realiza a una sobrepresión, por ejemplo a una presión de 0,03 a 0,2 MPa. La temperatura del cultivo está situada normalmente en 20ºC hasta 45ºC y de manera preferida en 25ºC hasta 40ºC. En el caso del procedimiento batch, la cultivación se prosigue durante tanto tiempo hasta que se haya formado una cantidad máxima del L-aminoácido deseado. Esta meta se alcanza normalmente en el transcurso de 10 horas hasta 160 horas. En el caso de los procedimientos contínuos son posibles unos períodos de tiempo de cultivación más largos. Debido a la actividad de las bacterias se llega a un enriquecimiento (una acumulación) del L-aminoácido en el medio de fermentación y/o en las células de las bacterias.

Ejemplos de adecuados medios de fermentación se encuentran, entre otros lugares, en los documentos US 5.770.409, US 5.840.551 y US 5.990.350 o 5.275.940.

Unos métodos para la determinación de L-aminoácidos se conocen a partir del estado de la técnica. El análisis se puede efectuar, por ejemplo, tal como se ha descrito en la cita de Spackman y colaboradores (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) mediante una cromatografía con intercambio de aniones con una subsiguiente derivatización con ninhidrina, o se puede efectuar mediante una HPLC (cromatografía de fase líquida de alto rendimiento) de fase inversa (en inglés "reversed phase HPLC) tal como se ha descrito en la cita de Lindroth y colaboradores (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

Un objeto del invento es, como consecuencia de esto, también un procedimiento para la producción de un Laminoácido caracterizado porque, se llevan a cabo las siguientes etapas:

a) fermentación de las bacterias conformes al invento en un medio nutritivo adecuado,

b) acumulación del L-aminoácido en el medio nutritivo o en las células de las mencionadas bacterias.

A esto le sigue por lo general la recogida (en inglés "collecting") del L-aminoácido acumulado en el medio nutritivo o respectivamente en el caldo de fermentación o en las células de las bacterias, con el fin de acceder a un producto sólido o líquido.

Por el concepto de "un caldo de fermentación" se entiende un medio de fermentación o respectivamente un medio nutritivo, en el que se había cultivado un microorganismo durante un cierto período de tiempo y a una determinada temperatura. El medio de fermentación o respectivamente los medios empleados durante la fermentación contiene(n) todas las sustancias o respectivamente los componentes, que aseguran una multiplicación del microorganismo y una formación del aminoácido deseado.

Al finalizar la fermentación, el caldo de fermentación resultante contiene de modo correspondiente: a) la biomasa (masa celular) del microorganismo, que ha resultado como consecuencia de la multiplicación de las células del microorganismo, b) el L-aminoácido deseado, que se ha formado en el transcurso de la fermentación, tal como Llisina, L-valina o L-isoleucina, c) los productos secundarios orgánicos, formados en el transcurso de la fermentación, y d) los componentes, que no se han consumido por la fermentación, del medio de fermentación empleado o respectivamente de las sustancias de partida empleadas, tales como, por ejemplo, vitaminas tales como biotina, aminoácidos tales como homoserina, o sales tales como sulfato de magnesio.

A los productos secundarios orgánicos pertenecen unas sustancias, que son producidas por los microorganismos empleados al realizar la fermentación eventualmente junto al respectivo compuesto químico orgánico, y que son segregadas eventualmente. A éstas pertenecen también azúcares tales como, por ejemplo, trehalosa.

En el caso de los aminoácidos L-valina y L-isoleucina se prefieren un aislamiento y una purificación, por ejemplo mediando utilización de uno o varios procedimientos, escogidos entre el conjunto que se compone de procedimientos cromatográficos, procedimientos de cristalización y utilización de carbón activo, de tal manera que se obtengan unos productos ampliamente puros, por ejemplo unos que tienen una pureza de � 90 % en peso o de

� 95 % en peso.

En el caso del aminoácido L-lisina, dentro del estado de la técnica se conocen en lo esencial cuatro diferentes formas del producto.

Un conjunto de productos que contienen L-lisina, abarca unas soluciones alcalinas acuosas concentradas de una Llisina purificada (documento de patente europea EP-B-0534865). Otro conjunto adicional, tal como el que se ha descrito por ejemplo en los documentos US 6.340.486 y US 6.465.025, abarca unos concentrados acuosos, ácidos, que contienen una biomasa, de caldos de fermentación que contienen L-lisina. El conjunto más conocido de productos sólidos abarca unas formas pulverulentas o cristalinas de L-lisina purificada o respectivamente pura, que se presenta típicamente en forma de una sal tal como, por ejemplo, el monohidrocloruro de L-lisina. Otro conjunto de formas sólidas de productos se describe, por ejemplo, en el documento EP-B-0533039. La forma de producto allí descrita contiene, junto a L-lisina, la mayor parte de las sustancias empleadas, utilizadas durante la producción por fermentación y no consumidas, y eventualmente la biomasa del microorganismo empleado con una proporción de > 0 % - 100 %.

Correspondientemente a las diferentes formas de productos, se conocen los más diversos procedimientos, en los cuales la L-lisina se recoge a partir del caldo de fermentación, se aísla o se purifica, con el fin de producir el producto que contiene la L-lisina o la L-lisina purificada.

Para la producción de una L-lisina pura, sólida, se usan en lo esencial los métodos de la cromatografía con intercambio de iones eventualmente mediando utilización de carbón activo y los métodos de cristalización. De esta manera se obtiene la correspondiente base o una correspondiente sal, tal como, por ejemplo, el monohidrocloruro de lisina (Lys-HCl) o el sulfato de lisina (Lys2-H2SO4).

En el documento EP-B-0534865 se describe un procedimiento para la producción de soluciones acuosas de carácter básico, que contienen L-lisina, a partir de caldos de fermentación. En el caso del procedimiento allí descrito, la biomasa procedente del caldo de fermentación se separa y desecha. Mediante una base, tal como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio o amonio, se ajusta un valor del pH comprendido entre 9 y 11. Los componentes minerales (las sales inorgánicas) se separan, después de haber concentrado y enfriado, mediante cristalización a partir del caldo y, o bien se utilizan como un abono fertilizante o se desechan.

En el caso de los procedimientos para la producción de lisina mediando utilización de las bacterias conformes al invento, se prefieren aquellos procedimientos, en los que se obtienen unos productos que contienen algunoscomponentes del caldo de fermentación. Éstos se utilizan en particular como aditivos para piensos de animales.

Según sea el requisito, la biomasa se puede eliminar total o parcialmente a partir del caldo de fermentación, mediante unos métodos de separación tales como, por ejemplo, los de la centrifugación, la filtración, la decantación o una combinación de éstos, o se puede dejar completamente en éste. Eventualmente, la biomasa o respectivamente el caldo de fermentación que contiene la biomasa, se desactiva durante una adecuada etapa de procedimiento, por ejemplo mediante un tratamiento térmico (calentamiento) o mediante adición de un ácido.

En un modo de procedimiento, la biomasa se elimina totalmente o casi totalmente, de tal manera que en el producto producido no permanezca nada (0 %) o a lo sumo permanezca 30 %, a lo sumo 20 %, a lo sumo 10 %, a lo sumo 5 %, a lo sumo 1 % o a lo sumo 0,1 % de la biomasa. En otro modo de proceder, la biomasa no se elimina o se elimina sólo en pequeñas proporciones, de tal manera que la totalidad (el 100 %) o más de 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 99,9 % de la biomasa permanezca en el producto producido. En un procedimiento conforme al invento, se elimina de modo correspondiente la biomasa en unas proporciones de � 0 % hasta : 100 %.

Finalmente, el caldo de fermentación obtenido después de la fermentación, antes o después de la eliminación total o parcial de la biomasa, se puede ajustar a un valor ácido del pH con un ácido inorgánico tal como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico, o con un ácido orgánico tal como, por ejemplo, ácido propiónico (documento de patente británica GB 1.439.728 o documento EP 1 331 220). Igualmente, es posible acidificar el caldo de fermentación con la biomasa que está contenida completamente. Finalmente, el caldo se puede estabilizar también mediante una adición de bisulfito de sodio (NaHSO3, documento GB 1.439.728) o de otra sal, tal como, por ejemplo, una sal de amonio, de un metal alcalino o de un metal alcalino-térreo del ácido sulfuroso.

Al realizar la separación de la biomasa, se eliminan eventualmente de manera parcial o total los materiales sólidos orgánicos o inorgánicos contenidos en la biomasa. Los productos secundarios orgánicos disueltos en el caldo de fermentación, y los componentes disueltos, que no se han consumido, del medio de fermentación (es decir, las sustancias de partida empleadas) permanecen en el producto por lo menos parcialmente (> 0 %), de manera preferida por lo menos en un 25 %, de manera especialmente preferida por lo menos en un 50 % y de manera muy especialmente preferida por lo menos en un 75 %. Eventualmente, éstos permanecen en el producto también totalmente (en un 100 %) o casi totalmente, es decir en > 95 % o en > 98 % o en más que 99 %. Si un producto, en este sentido, contiene por lo menos una parte de los componentes del caldo de fermentación, esto se parafrasea también con el concepto de "producto constituido sobre la base del caldo de fermentación”.

A continuación, al caldo se le substrae el agua con métodos conocidos, tal como p.ej. con ayuda de un evaporador rotatorio, de un evaporador de capa fina, de un evaporador de película descendente, mediante una ósmosis inversa

o mediante una nanofiltración, o respectivamente éste es espesado o concentrado. Este caldo de fermentación concentrado se puede elaborar a continuación mediante métodos de la liofilización, de la desecación por atomización, de la granulación por atomización o mediante procedimientos de otros tipos, tal como, por ejemplo, en una capa fluidizada circulante, según el documento PCT/EP2004/006655, para dar unos productos capaces de corrimiento, en particular para dar un polvo finamente dividido o de manera preferida un granulado de grano grueso. Eventualmente, a partir del granulado obtenido mediante un tamizado o una separación del polvo se puede aislar un producto deseado.

Asimismo, es posible secar el caldo de fermentación directamente, es decir sin ninguna concentración previa, mediante una desecación por atomización o una granulación por atomización.

Por el concepto de "capaz de corrimiento" se entienden unos polvos que salen sin obstáculos desde una serie de recipientes de salida de vidrio, que tienen unos orificios de salida de diferentes tamaños, y por lo menos desde elrecipiente con el orificio de 5 mm (milímetros) (Klein: Seifen, Öle, Fette, Wachse (Jabones, aceites, grasas, ceras), 94, 12 (1968)).

Por el concepto de "finamente dividido" se entiende un polvo con una proporción predominante (> 50 %) de un tamaño de granos con diámetros de 20 a 200 μm.

Por el concepto de "de grano grueso" se entiende un producto con una proporción predominante (> 50 %) de un tamaño de granos con diámetros de 200 a 2.000 μm.

La determinación de los tamaños de los granos se puede llevar a cabo con los métodos de la espectrometría por difracción de rayos láser. Los correspondientes métodos se describen en el libro de texto "Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis" [Medición del tamaño de partículas en la práctica de laboratorio] de R. H. Müller y R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) o en el libro de texto "Introduction to Particle Technology" [Introducción en la tecnología de partículas] de M. Rhodes, editorial Wiley & Sons (1998)).

El polvo finamente dividido, capaz de corrimiento, puede ser transformado, a su vez, mediante apropiados procedimientos de compactación o de granulación, en un producto de grano grueso, bien capaz de corrimiento, almacenable y ampliamente exento de polvo.

El concepto de "exento de polvo" significa, que el producto contiene solamente unas pequeñas proporciones (< 5 %) de unos tamaños de granos con diámetros situados por debajo de 100 μm.

El concepto de "almacenable", dentro del sentido de este invento, significa que un producto se puede almacenar durante por lo menos un (1) año o más tiempo, de manera preferida por lo menos durante 1,5 años o más tiempo, de manera especialmente preferida durante dos (2) años o más tiempo, en un entorno seco y frío, sin que aparezca una pérdida esencial (como máximo 5 %) del respectivo aminoácido.

Otro objeto adicional del invento es un procedimiento, que se ha descrito en cuanto a sus trazos fundamentales en el documento DE 102006016158, y en el que el caldo de fermentación, obtenido mediando utilización de los microorganismos conformes al invento, a partir del que se había separado la biomasa eventualmente de manera total o parcial, se sigue elaborando, mediante el recurso de que se lleva a cabo un procedimiento que abarca por lo menos las siguientes etapas:

a) se disminuye el valor del pH, mediante una adición de ácido sulfúrico, a 4,0 hasta 5,2, en particular a 4,9 hasta 5,1, y se ajusta una relación molar de sulfato/L-lisina de 0,85 a 1,2, de manera preferida de 0,9 a 1,0, de manera especialmente preferida de > 0,9 a < 0,95 en el caldo, eventualmente mediante adición de otro o de varios otros compuesto(s), que contiene(n) sulfato y

b) la mezcla así obtenida se concentra mediante substracción de agua, y eventualmente se granula,

llevándose a cabo eventualmente antes de la etapa a) una o dos de las siguiente(s) medida(s) técnica(s):

c) medición de la relación molar de sulfato/L-lisina para la determinación de la cantidad requerida de compuesto(s), que contiene(n) sulfato, d) adición de un compuesto que contiene sulfato, escogido entre el conjunto que se compone de sulfato de amonio, hidrógeno-sulfato de amonio y ácido sulfúrico en unas correspondientes relaciones.

Eventualmente, además, antes de la etapa b) se añade además una sal del ácido sulfuroso, de manera preferida un hidrógeno-sulfito de un metal alcalino, de manera especialmente preferida un hidrógeno-sulfito de sodio en una concentración de 0,01 a 0,5 % en peso, de manera preferida de 0,1 a 0,3 % en peso, de manera especialmente preferida de 0,1 a 0,2 % en peso, referida al caldo de fermentación.

Como compuestos que contienen sulfato, preferidos dentro del sentido de las etapas de procedimiento más arriba mencionadas, se han de mencionar en particular sulfato de amonio y/o hidrógeno-sulfato de amonio o unas correspondientes mezclas de amoníaco y ácido sulfúrico y el ácido sulfúrico propiamente dicho.

La relación molar de sulfato/L-lisina V se calcula según la fórmula: V = 2 x [SO42-] / [L-lisina]. Esta fórmula toma en cuenta el hecho de que el anión de SO42-, o respectivamente el ácido sulfúrico, es bivalente. Una relación V = 1 significa que se presenta una Lys2-H2SO4 compuesta estequiométricamente, mientras que en el caso de una relación V = 0,9 se encuentra una deficiencia de sulfato de un 10 %, y en el de una relación de V = 1,1 se encuentra un exceso de sulfato de un 10 %.

Al realizar la granulación o compactación es ventajoso el empleo de unas usuales sustancias auxiliares orgánicas o inorgánicas, o respectivamente de unos vehículos, tales como almidones, gelatinas, derivados de celulosas o sustancias similares, tales como las que encuentran utilización usualmente en la elaboración de alimentos o de piensos como agentes aglutinantes, gelificantes o espesantes, o de otras sustancias tales como por ejemplo ácidos silícicos, silicatos (documento EP0743016A) y estearatos.

Además, es ventajoso tratar con unos aceites a la superficie de los granulados obtenidos, tal como se ha descrito en el documento WO 04/054381. Como aceites se pueden utilizar aceites minerales, aceites vegetales o mezclas de aceites vegetales. Ejemplos de tales aceites son aceite de soja, aceite de oliva o mezclas de aceite de soja y de lecitina. De igual manera, también se adecuan aceites de siliconas, poli(etilenglicoles) o una hidroxietil-celulosa. Mediante el tratamiento de las superficies con los aceites mencionados, se consiguen una resistencia aumentada a la abrasión del producto y una disminución de la proporción de polvo fino. El contenido de aceite en el producto es de 0,02 a 2,0 % en peso, de manera preferida de 0,02 a 1,0 % en peso, y de manera muy especialmente preferida de 0,2 a 1,0 % en peso, referido a la cantidad total del aditivo para piensos.

Se prefieren unos productos con una proporción de 97 % en peso con un tamano de granos con unos diámetros de 100 a 1.800 μm o con una proporción de 95 % en peso con un tamano de granos con unos diámetros de 300 a

1.800 μm. La proporción de polvo fino, es decir de partículas con un tamaño de granos < 100 μm, se sitúa de manera preferida en > 0 a 1 % en peso, - de manera especialmente preferida en como máximo 0,5 % en peso -.

Alternativamente, el producto se puede extender también sobre un material de soporte o vehículo orgánico o inorgánico, que es conocido y usual en la elaboración de piensos, tal como, por ejemplo, ácidos silícicos, silicatos, materiales molidos, salvados, harinas, almidones, azúcares u otros, y/o se puede mezclar y estabilizar con usuales agentes espesantes o aglutinantes. Unos correspondientes ejemplos de uso y los procedimientos para esto se describen en la bibliografía (Die Mühle + Mischfuttertechnik (El molino + la técnica de piensos mixtos) 132 (1995) 49, página 817).

Finalmente, el producto, también, mediante unos procedimientos de revestimiento (en inglés "coating") con unos agentes formadores de películas tales como por ejemplo carbonatos metálicos, ácidos silícicos, silicatos, alginatos, estearatos, almidones, gomas y éteres de celulosa, tal como se han descrito en el documento de patente alemana DE-C-4100920, se puede llevar a un estado, en el que él es estable frente a la digestión por estómagos de animales, en particular por el estómago de rumiantes.

Para el ajuste de una concentración deseada de L-lisina en el producto, según sea el requisito, la L-lisina se puede añadir durante el procedimiento en forma de un concentrado o eventualmente de una sustancia ampliamente pura orespectivamente de una de sus sales, en una forma líquida o sólida. Éste y ésta se pueden añadir individualmente o como unas mezclas al caldo de fermentación obtenido o concentrado, o también durante el proceso de desecación o granulación.

Otro objeto del invento es un procedimiento para la producción de un producto sólido que contiene lisina, tal como el que se ha descrito en sus rasgos fundamentales en el documento de solicitud de patente de los EE,UU, US 20050220933, y que comprende la elaboración del caldo de fermentación obtenido mediando utilización de los microorganismos conformes al invento, en las siguientes etapas:

a) filtración del caldo de fermentación, de manera preferida con un filtro de membrana, de tal manera que se obtengan un lodo que contiene una biomasa, y un material filtrado,

b) aumento de la concentración del material filtrado, preferiblemente de tal manera que se obtenga un contenido de materiales sólidos de 48 a 52 % en peso,

c) granulación del concentrado obtenido en la etapa b), de manera preferida a una temperatura de 50°C a 62°C, y

d) revestimiento del granulado obtenido en c) con uno o varios de los agentes de revestimiento (en inglés "coating agent(s)").

Para el revestimiento en la etapa d) se utilizan de manera preferida unos agentes de revestimiento, escogidos entre el conjunto que se compone de

d1) la biomasa obtenida en la etapa a),

d2) un compuesto que contiene L-lisina, de manera preferida escogido entre el conjunto que se compone de hidrocloruro de L-lisina o sulfato de L-lisina,

d3) una sustancia exenta esencialmente de L-lisina con un contenido de L-lisina < 1 % en peso, de manera preferida < 0,5 % en peso, de manera preferida escogida entre el conjunto que se compone de un almidón, un carragenano, un agar, ácidos silícicos, silicatos, materiales molidos, salvados y harinas, y

d4) una sustancia repelente del agua, que se escoge de manera preferida entre el conjunto que se compone de aceites, poli(etilenglicoles) y parafinas líquidas.

Mediante las medidas técnicas correspondientes a las etapas d1) hasta d4), en particular d1) hasta d3), el contenido de L-lisina se ajusta a un valor deseado.

En el caso de la producción de unos productos que contienen L-lisina, la relación de los iones se ajusta preferentemente de tal manera, que la relación molar de iones, se establezca de modo correspondiente a la siguiente fórmula 2 x [SO42-] + [Cl-] - [NH4+] - [Na+] - [K+] -2x [Mg2+] -2x [Ca2+] / [L-Lys] como de 0,68 a 0,95, de manera preferida de 0,68 a 0,90, tal como ha sido descrito por Kushiki y colaboradores en el documento US 20030152633.

En el caso de la lisina, el producto sólido constituido sobre la base del caldo de fermentación, producido de esta manera, tiene un contenido de lisina (en forma de la base de lisina) de 10 % en peso a 70 % en peso o de 20 % en peso a 70 % en peso, de manera preferida de 30 % en peso a 70 % en peso y de manera muy especialmente preferida de 40 % en peso a 70 % en peso, referido a la masa seca del producto. Asimismo, son posibles unos contenidos máximos de la base de lisina de 71 % en peso, 72 % en peso o 73 % en peso.

El contenido de agua del producto sólido, que contiene L-lisina, es de hasta 5 % en peso, de manera preferida de hasta 4 % en peso, y de manera especialmente preferida de menos que 3 % en peso.

Ejemplo 1

Secuenciación del gen gltA de la cepa DM678 La cepa de Corynebacterium glutamicum DM678 (documento US 6.861.246) es una cepa de producción de lisina, que había sido desarrollada mediante mutagénesis y escrutinio. Ella es auxótrofa para L-treonina y sensible a Lmetionina. La cepa fue presentada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania) como DSM12866.

A partir de la cepa DM678 se aisló un ADN cromosomal con el método de Eikmanns y colaboradores (Microbiology

140: 1817 - 1828 (1994)). Con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa se amplificó un segmento de ADN, que llevaba el gen gltA. Para esto se utilizaron como cebadores los siguientes oligonucleótidos:

gltA_XL-A1 (SEQ ID NO: 27): 5’ tgagttctattggcgtgacc 3’

gltA_XL-E1 (SEQ ID NO: 28): 5’ ttcgccaacgatgatgtcag 3’

Los cebadores expuestos fueron sintetizados por la entidad MWG Biotech (Ebersberg, Alemania). Ellos hacen posible la amplificación de un segmento de ADN con una longitud de aproximadamente 1,8 kb (kilobases), que lleva el gen gltA. El cebador gltA_XL-A1 se fija a la región que corresponde a las posiciones 490 hasta 509 de la cadena complementaria a la SEQ ID NO: 3 (y a la SEQ ID NO:7). El cebador gltA-XL-E1 se fija a la región que corresponde a las posiciones 2.266 hasta 2.247 de la cadena de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 (y la SEQ ID NO:7).

La reacción de PCR se llevó a cabo con la polimerasa de ADN Phusion High Fidelity (de New England Biolabs, Francfort, Alemania). La tanda de reacción se formuló según los datos del fabricante y contenía, en el caso de un volumen total de 50 μl, 10 μl del tampón 5 x Phusion HF suministrado conjuntamente, desoxinucleósido-trifosfatos en una concentración de en cada caso 200 μM, cebadores en una concentración de 0,5 μM, aproximadamente 50 ng de un ADN de molde y 2 unidades de la polimerasa Phusion. Mediante adición de H2O se ajustó el volumen a 50 μl.

La tanda de PCR se sometió en primer lugar a una desnaturalización introductoria a 98°C durante 30 segundos. Después de esto, repitiéndose 35x (veces), siguieron una etapa de desnaturalización a 98°C durante 20 segundos, una etapa para la fijación de los cebadores al ADN dispuesto previamente a 60°C durante 20 segundos y la etapa de extensión para la prolongación de los cebadores a 72°C durante 60 segundos. Después de la etapa de extensión final durante 5 minutos a 72°C, la tanda de PCR se sometió a una electroforesis en gel de agarosa (con 0,8 % de agarosa). Un fragmento de ADN con una longitud de aproximadamente 1,8 kb se identificó, se aisló a partir del gel y se purificó mediando utilización del estuche QIAquick Gel Extraction Kit de la entidad Qiagen (Hilden, Alemania).

La secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN amplificado o respectivamente del producto de la PCR fue determinada por la entidad Agowa (Berlín, Alemania).

La secuencia de nucleótidos de la región codificadora del alelo gltA de la cepa DM678 contiene en la posición 14 la nucleobase timina. El gen del tipo silvestre (véase la SEQ ID NO: 1) contiene en esta posición la nucleobase adenina. Esta transversión de adenina-timina conduce a un intercambio de aminoácidos, de aspartato por valina, en la posición 5 de la resultante secuencia de aminoácidos. Esta mutación se designa en lo sucesivo como gltAD5V. El alelo gltAD5V se representa en la SEQ ID NO:5, la secuencia de aminoácidos de la proteína, que se establece con ayuda del programa PatentIn, se representa en la SEQ ID NO:6.

Ejemplo 2

Construcción del vector de intercambio pk18mobsacB_gltAD5V

Con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa se amplificó un fragmento de ADN, que contiene una parte de la "región corriente arriba" del gen gltA así como una parte de la región codificadora, que contiene la mutación gltAD5V. Como molde se utilizó el ADN cromosomal de DM678 obtenido en el Ejemplo 1. Como cebadores para la PCR se escogieron los siguientes oligonucleótidos:

gltA_1.p (SEQ ID NO: 29): 5’ CCGTCGACAATAGCCTGAA 3’

gltA_2.p (SEQ ID NO: 30): 5’ CC-GAATTC-TTCGAGCATCTCCAGAAC 3’

Ellos fueron sintetizados por la entidad MWG Biotech (Ebersberg, Alemania) y hacen posible la amplificación de un segmento de ADN con una longitud de aproximadamente 1,7 kb (kilobases), que contiene 832 pb de la región corriente arriba y los nucleótidos 1-855 pb del gen gltA procedente de DM678.

El cebador gltA_1.p se fija a la región que corresponde a las posiciones 169 hasta 187 de la cadena complementaria a la SEQ ID NO:25. Los nucleótidos 9 hasta 26 del cebador gltA_2.p se fijan a la región que corresponde a las posiciones 1.855 hasta 1.838 de la cadena de acuerdo con la SEQ ID NO:25. Además, el cebador gltA_1.p contiene el sitio de corte natural de la enzima de restricción SaII y el cebador gltA_2.p contiene la secuencia del sitio de corte de la enzima de restricción EcoRI, que están marcados por subrayado en la secuencia de nucleótidos arriba representada.

La reacción de PCR se llevó a cabo con la polimerasa de ADN Phusion High Fidelity (de New England Biolabs, Francfort, Alemania). La tanda de reacción tenía la composición arriba descrita. La PCR se llevó a cabo tal como se ha indicado más arriba. La secuencia de nucleótidos del material amplificado con una longitud de aproximadamente 1,7 kb se representa en la SEQ ID NO:31.

El material amplificado se trató con las endonucleasas de restricción SAII y EcoRI y se identificó mediante una electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 %. A continuación, él fue aislado a partir del gel y purificado con el estuche QIAquick Gel Extraction Kit de la entidad Qiagen.

El fragmento de ADN purificado de esta manera contiene la mutación gltAD5V descrita y posee unos extremos compatibles con un ADN cortado con SaII o respectivamente con EcoRI (el fragmento gltAD5V o respectivamente gltA en la Figura 1). A continuación, él fue clonado en el vector pK18mobsacB movilizable, que ha sido descrito por Schäfer y colaboradores (Gene 145, 69-73 (1994)), con el fin de hacer posible un intercambio de alelos o respectivamente de mutaciones. Para esto, el pK18mobsacB fue digerido con las enzimas de restricción EcoRI y SaII, y los extremos fueron desfosforilados con una fosfatasa alcalina (Alkaline Phosphatase, de Boehringer Mannheim, Alemania). El vector producido de esta manera se mezcló con el fragmento gltAD5V y la tanda se trató con el estuche Ready-To-Go T4 DNA Ligase Kit (de Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemania).

A continuación, la cepa de E. coli S17-1 (Simon y colaboradores, Bio/Technologie 1: 784-791, 1993) se transformó con la tanda de ligación (Hanahan, In. DNA cloning. A practical approach, tomo 1, IRL-Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). La selección en cuanto a células portadoras del plásmido se efectuó por siembra en placas de la tanda de transformación sobre un agar LB (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: a laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), que había sido suplementado con 25 mg/l de kanamicina.

El ADN de plásmido fue aislado a partir de un transformante con ayuda del estuche QIAprep Spin Miniprep Kit de la entidad Qiagen (Hilden, Alemania) y fue comprobado mediante una disociación por restricción con las enzimas SaII y EcoRI y una subsiguiente electroforesis en gel de agarosa. El plásmido fue denominado pK18mobsacB_gltAD5V y se ha representado en la Figura 1.

Ejemplo 3

Incorporación de la mutación gltAD5V en la cepa Corynebacterium glutamicum DM1797

La mutación gltAD5V debe de ser incorporada en la cepa Corynebacterium glutamicum DM1797. La cepa DM1797 es un mutante resistente a aminoetil-cisteína de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 y se describe en el documento PCT/EP/2005/012417. Ella ha sido presentada bajo la denominación DSM16833 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania).

El vector pK18mobsacB_gltAD5V descrito en el Ejemplo 2 fue transferido por conjugación a la cepa DM1797 de C. glutamicum de acuerdo con el protocolo de Schäfer y colaboradores (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)). El vector no se puede replicar de manera autónoma en DM1797 y permanece conservado en la célula solamente cuando él se presenta integrado en el cromosoma como consecuencia de un suceso de recombinación. La selección de unos transconjugantes, es decir de unos clones con el pK18mobsacB_gltAD5V integrado, se efectuó mediante siembra en placas de la tanda de transformación sobre un agar LB, que había sido suplementado con 25 mg/l de kanamicina y 50 mg/l de ácido nalidíxico. Los transconjugantes resistentes a la kanamicina fueron extendidos como un frote a continuación sobre placas de un agar LB suplementado con kanamicina (25 mg/l), y fueron incubados durante 24 horas a 33°C. Para realizar la selección de mutantes, en los que, como consecuencia de un segundo suceso de recombinación, había tenido lugar la escisión del plásmido, los clones fueron cultivados durante 30 horas de un modo no selectivo en un medio LB líquido, a continuación fueron extendidos como un frote sobre un agar LB, que había sido suplementado con sacarosa al 10 % y fueron incubados durante 24 horas a 33°C.

El plásmido pK18mobsacB_gltAD5V, al igual que el plásmido de partida pK18mobsacB, contiene, junto al gen de resistencia a kanamicina, una copia del gen sacB que codifica la levano sucrasa de Bacillus subtilis. La expresión del gen sacB, que es inducible por sacarosa, conduce a la formación de la levano sucrasa, que cataliza la síntesis del producto levano que es tóxico para C. glutamicum. Sobre un agar LB suplementado con sucrosa (= sacarosa) crecen por lo tanto sólo aquellos clones, en los que el pK18mobsacB_gltAD5V integrado había sido escindido como consecuencia de un segundo suceso de recombinación. En dependencia de la situación del segundo suceso de recombinación en lo que respecta al sitio de la mutación, tiene lugar en el caso de la escisión el intercambio de alelos o respectivamente la incorporación de la mutación, o la copia original permanece en el cromosoma del anfitrión.

A continuación se buscó un clon, en el que se había efectuado el intercambio deseado, es decir la incorporación de la mutación gltAD5V. Para esto, a partir de 10 clones con el fenotipo "crecimiento en presencia de sacarosa" y "ausencia de crecimiento en presencia de kanamicina", se determinó la secuencia del gen gltA. De esta manera se identificó un clon, que lleva la mutación gltAD5V. Esta cepa fue denominada como C. glutamicum DM1797_ gltAD5V.

Ejemplo 4

Producción de L-lisina

La cepa DM1797_gltAD5V obtenida en el Ejemplo 3 y la cepa de partida DM1797 se cultivaron en un medio nutritivo adecuado para la producción de lisina y se determinó el contenido de lisina en el material sobrenadante del cultivo.

Para esto, los clones se multiplicaron primeramente sobre unas placas de agar de corazón y cerebro (de Merck, Darmstadt, Alemania) durante 24 horas a 33°C. Partiendo de estos cultivos sobre placas de agar, se inoculó en cada caso un cultivo previo (10 ml del medio en un matraz Erlenmeyer con una capacidad de 100 ml). Como medio para el cultivo previo se utilizó el medio MM. Los cultivos previos se incubaron durante 24 horas a 33°C y 240 rpm sobre un dispositivo sacudidor. A partir de estos cultivos previos se inoculó en cada caso un cultivo principal, de tal manera que la DO (densidad óptica) inicial (a 660 nm) del cultivo principal fuese de 0,1 DO. Para los cultivos principales se utilizó asimismo el medio MM.

Medio MM CSL 5 g/l MOPS 20 g/l glucosa (autoclavada por separado) 50 g/l

Sales: (NH4)2SO4) 25 g/l KH2PO4 0,1 g/l MgSO4 * 7 H2O 1,0 g/l CaCl2 * 2 H2O 10 mg/l FeSO4 * 7 H2O 10 mg/l MnSO4 * H2O 5,0 mg/l biotina (filtrada en condiciones estériles) 0,3 mg/l tiamina * HCl (filtrada en condiciones estériles) 0,2 mg/l CaCO3 25 g/l

El CSL (acrónimo de Corn Steep Liquor = líquido de maceración de maíz), el MOPS (ácido morfolinopropanosulfónico) y la solución de sales se ajustaron a un pH de 7 con agua amoniacal y se autoclavaron. A continuación se añadieron las soluciones estériles de substrato y de vitaminas así como el CaCO3 autoclavado en seco.

La cultivación se efectuó en unos volúmenes de 10 ml, que estaban contenidos en matraces Erlenmeyer con una capacidad de 100 ml, provistos de obstáculos. La temperatura fue de 33°C, el número de revoluciones fue de 250 rpm y la humedad del aire fue de 80 %.

Después de 48 horas se determinó la densidad óptica (DO) a una longitud de onda de medición de 660 nm con el instrumento Biomek 1000 (de Beckmann Instruments GmbH, Munich). La cantidad de lisina formada se determinó con un dispositivo analizador de aminoácidos de la entidad Eppendorf Biotronik (Hamburgo, Alemania) mediante una cromatografía con intercambio de iones y una derivatización posterior en columna con detección por ninhidrina.

Tabla 1

Cepa

DO (660) Lisina-HCl (g/l)

DM1797

11,9 4,8

DM1797_glTAD5V

11,2 5,3

Ejemplo 5

Incorporación de la mutación gltAD5V en la cepa Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763

La mutación gltAD5V debe de ser incorporada en la cepa Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763. La cepa FERM BP-1763 es una productora de valina resistente al ácido micofenólico (documento US-A-5.188.948). Ella es auxótrofa para L-isoleucina y L-metionina.

El vector pK18mobsacB_gltAD5V descrito en el Ejemplo 2 fue transferido por conjugación a la cepa FERM BP-1763 de acuerdo con el protocolo de Schäfer y colaboradores (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990). El vector no se puede replicar de manera autónoma en FERM BP-1763 y permanece conservado en la célula solamente cuando él se presenta integrado en el cromosoma como consecuencia de un suceso de recombinación. La selección de unos transconjugantes, es decir de unos clones con el pK18mobsacB_gltAD5V integrado, se efectuó mediante siembra en placas de la tanda de conjugación sobre un agar LB, que había sido suplementado con 25 mg/l de kanamicina y 50 mg/l de ácido nalidíxico. Los transconjugantes resistentes a la kanamicina fueron extendidos como un frote a continuación sobre placas de un agar LB suplementado con kanamicina (25 mg/l), y fueron incubados durante 24 horas a 33°C. Para realizar la selección de mutantes, en los que, como consecuencia de un segundo suceso de recombinación, había tenido lugar la escisión del plásmido, los clones fueron cultivados durante 30 horas de un modo no selectivo en un medio LB líquido, a continuación fueron extendidos como un frote sobre un agar LB, que había sido suplementado con sacarosa al 10 %, y fueron incubados durante 24 horas a 33°C.

El plásmido pK18mobsacB_gltAD5V, al igual que el plásmido de partida pK18mobsacB, contiene junto al gen de resistencia a kanamicina una copia del gen sacB que codifica la levano sucrasa de Bacillus subtilis. La expresión del gen sacB, que es inducible por sacarosa, conduce a la formación de la levano sucrasa, que cataliza la síntesis del producto levano que es tóxico para C. glutamicum. Sobre un agar LB suplementado con sacarosa crecen por lo tanto sólo aquellos clones, en los que el pK18mobsacB_gltAD5V integrado se ha escindido como consecuencia de un segundo suceso de recombinación. En dependencia de la situación del segundo suceso de recombinación en lo que respecta al sitio de la mutación, tiene lugar en el caso de la escisión el intercambio de alelos o respectivamente la incorporación de la mutación, o la copia original permanece en el cromosoma del anfitrión..

A continuación se buscó un clon, en el que se había efectuado el intercambio deseado, es decir la incorporación de la mutación gltAD5V. Para esto, a partir de 10 clones con el fenotipo "crecimiento en presencia de sacarosa" y "ausencia de crecimiento en presencia de kanamicina", se determinó la secuencia del gen gltA. De esta manera se identificó un clon, que lleva la mutación gltAD5V. Esta cepa fue denominada como C. glutamicum FERM BP-1763_ gltAD5V.

Ejemplo 6

Producción de L-valina

La cepa FERM BP_1763_gltAD5V obtenida en el Ejemplo 5 y la cepa de partida FERM BP-1763 se cultivaron en un medio nutritivo adecuado para la producción de valina y se determinó el contenido de valina en el material sobrenadante del cultivo.

Para esto, los clones se multiplicaron primeramente sobre placas de agar de corazón y cerebro (de Merck, Darmstadt, Alemania) durante 24 horas a 33°C. Partiendo de estos cultivos en placas de agar, se inoculó en cada caso un cultivo previo (10 ml del medio en un matraz Erlenmeyer con una capacidad de 100 ml).

El medio CgIII (2,5 g/l de NaCl, 10 g/l de bacto-peptona, 10 g/l del extracto Bacto-Yeast, pH 7,4, 20 g/l de glucosa (autoclavada por separado) se utilizó para los cultivos previos. Los cultivos previos se incubaron durante 24 horas a 33°C y 240 rpm en un dispositivo sacudidor. A partir de estos cultivos previos se inoculó en cada caso un cultivo principal, de tal manera que la DO inicial (a 660 nm) del cultivo principal fue de 0,1 DO. Para el cultivo principal se utilizó asimismo el medio MM.

Medio MM CSL 5 g/l MOPS 20 g/l glucosa (autoclavada por separado) 50 g/l

Sales: (NH4)2SO4) 25 g/l KH2PO4 0,1 g/l MgSO4 * 7 H2O 1,0 g/l CaCl2 * 2 H2O 10 mg/l FeSO4 * 7 H2O 10 mg/l MnSO4 * H2O 5,0 mg/l isoleucina (filtrada en condiciones estériles) 0,1 g/l metionina (filtrada en condiciones estériles) 0,1 g/l leucina (filtrada en condiciones estériles) 0,1 g/l tiamina * HCl (filtrada en condiciones estériles) 0,2 mg/l CaCO3 25 g/l El CSL (líquido de maceración de maíz), el MOPS (ácido morfolinopropanosulfónico) y la solución de sales se ajustaron a pH 7 con agua amoniacal y se autoclavaron. A continuación, se añadieron las soluciones estériles de substrato y de vitaminas así como el CaCO3 autoclavado en seco.

La cultivación se efectuó en volúmenes de 10 ml, que estaban contenidos en matraces Erlenmeyer con una capacidad de 100 ml, provistos de obstáculos. La temperatura fue de 33°C, el número de revoluciones fue de 250 rpm y la humedad del aire fue de 80 %.

Después de 48 horas se determinó la densidad óptica (DO) a una longitud de onda de medición de 660 nm con el Biomek 1000 (de Beckmann Instruments GmbH, Munich). La cantidad de valina formada se determinó con un dispositivo analizador de aminoácidos de la entidad Eppendorf Biotronik (Hamburgo, Alemania) mediante una cromatografía con intercambio de iones y una derivatización posterior en columna con detección por ninhidrina.

Tabla 2

Cepa

DO (660) Valina (g/l)

FERM BP-1763

8,4 11,9

FERM BP-1763_dltAD5V

7,8 12,6

Breve descripción de la Figura:

Figura 1: Mapa del plásmido pK18mobsacB_gltAD5V

Las abreviaturas y denominaciones utilizadas tienen los siguientes significados. En el caso del dato de los números de pares de bases (pbs) se trata de unos valores aproximados, que se obtienen dentro del marco de la reproducibilidad de las mediciones.

Kan:

gen de resistencia a la kanamicina

SaII:

sitio de corte con la enzima de restricción SalI

EcoRI:

sitio de corte con la enzima de restricción EcoRI

gltA:

fragmento de ADN clonado, que contiene la mutación gltAD5V

sacB:

gen sacB

RP4-mob:

región mob con el origen de la replicación para la transferencia (oriT)

oriV:

origen de la replicación V

Protocolo de secuencias:

<110> Degussa AG

<120> Procedimiento para la producción de L-aminoácidos

<130> 200600351

<160> 31

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 1314

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1311)

<223> gen de tipo silvestre gltA

<220>

<221> característica variada

<222> (13)..(15)

<400> 1

<210> 2

<211> 437

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 2

<210> 3

<211> 2814 5 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>

característica variada 10 <222> (1)..(750)

<223> secuencia situada corriente arriba de la región codificadora

<220>

<221>

CDS 15 <222> (751)..(2061)

<223> gen gltA de tipo silvestre

<220>

<221>

característica variada 20 <222> (763)..(765)

<220>

<221> característica variada

<222> (2062)..(2814)

<223> secuencia situada corriente arriba de la región codificadora

<400> 3

<210> 4

<211> 437

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 4

<210> 5

<211> 1314 5 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(1311)

<223> alelo gltA

<220>

<221>

característica variada 15 <222> (13)..(15)

<220>

<221> mutación

<222> (14)..(14) 20 <223> transversión A > T

<400> 5

<210> 6

<211> 437

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 6

<210> 7

<211> 2814 5 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> característica variada 10 <222> (1)..(750)

<223> secuencia situada corriente arriba de la secuencia codificadora <220>

<221> CDS

<222> (751)..(2061)

<223> alelo gltA 5

<220>

<221> característica variada

<222> (763)..(765)

10 <220>

<221> mutación

<222> (764)..(764)

<223> transversión A > T

15 <220>

<221> característica variada

<222> (2062)..(2814)

<223> secuencia situada corriente arriba de la región codificadora

20 <400> 7

<210> 8

<211> 437

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 8

<210> 9

<211> 2814 5 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>

característica variada 10 <222> (1)..(750)

<223> secuencia situada corriente arriba de la secuencia codificadora

<220>

<221>

CDS 15 <222> (751)..(2061)

<223> alelo gltA

<220>

<221>

característica variada 20 <222> (763)..(765)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221>

característica variada 25 <222> (2062)..(2814)

<223> secuencia situada corriente arriba de la región codificadora

<400> 9

<210> 10

<211> 437 5 <212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> característica variada 10 <222> (5)..(5)

<223> el “Xaa” en el lugar 5 representa Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, ó Phe.

<400> 10 15

<210> 11

<211> 105

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (40)..(105)

5 <220>

<221> característica variada

<222> (52)..(54)

<223> n es a, c, g, ó t

<400> 11 10

<210> 12

<211> 22 15 <212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> característica variada 20 <222> (5)..(5)

<223> el “Xaa” en el lugar 5 representa Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, ó Phe.

<400> 12

<210> 13

<211> 206

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum 30 <220>

<221> CDS

<222> (90)..(206)

<220>

<221> característica variada 35 <222> (102)..(104)

<223> n es a, c, g, ó t

<400> 13

40 <210> 14

<211> 39

<212> PRT 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> característica variada

<222> (5)..(5)

10 <223> el “Xaa” en el lugar 5 representa Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, or Phe.

<400> 14 <210> 16

<210> 15

<211> 405

<212> ADN

20

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (190)..(405)

25

<220>

<221> característica variada

<222> (202)..(204)

<223> n es a, c, g, ó t

30

<400> 15

<211> 72 5 <212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> característica variada 10 <222> (5)..(5)

<223> el “Xaa” en el lugar 5 representa Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, ó Phe.

<400> 16 15

<210> 17

<211> 1001 20 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS 25 <222> (489)..(1001)

<220>

<221> característica variada

<222> (501)..(503)

<223> n es a, c, g, ó t

<400> 17

<210> 18 10 <211> 171

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<220> 15 <221> característica variada

<222> (5)..(5)

<223> el “Xaa” en el lugar 5 representa Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, ó Phe.

<400> 18

<210> 19

<211> 1263 10 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS 15 <222> (1)..(1263)

<223> gen lysC de tipo silvestre

<400> 19

<210> 20

<211> 421

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 20

<210> 21

<211> 2266

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum 5

<220>

<221> característica variada

<222> (1)..(500)

<223>

secuencia situada corriente arriba de la secuencia codificadora 10

<220>

<221> CDS

<222> (501)..(1763)

<223>

región codificadora del gen lysC de tipo silvestre 15

<220>

<221> característica variada

<222> (1764)..(2266)

<223>

secuencia de nucleótidos situada corriente abajo de la región codificadora 20

<400> 21

<210> 22

<211> 421

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 22

<210> 23

<211> 1503

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1500) 10 <223> gen mqo de tipo silvestre

<400> 23

<210> 24

<211> 500

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 24

<210> 25

<211> 3314

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> característica variada

<222> (1)..(1000)

<223> secuencia situada corriente arriba de la secuencia codificadora

<220>

<221> CDS

<222> (1001)..(2311)

<223> gen gltA de tipo silvestre

<220>

<221> característica variada

<222> (1013)..(1015)

<220>

<221> característica variada

<222> (2312)..(3314)

<223> secuencia situada corriente abajo de la región codificadora

<400> 25

<210> 26

<211> 437

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 26

<210> 27

<211> 20 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador gltA-XL-A1 10

<400> 27 tgagttctat tggcgtgacc 20

<210> 28 15 <211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

20 <220>

<223> cebador gltA-XL-E1 <400> 28 ttcgccaacg atgatgtcag 20

<210> 29

<211> 19

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador gltA_1.p

<400> 29 ccgtcgacaa tagcctgaa 19

<210> 30

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador gltA_2.p

<400> 30 ccgaattctt cgagcatctc cagaac 26

<210> 31

<211> 1695

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> característica variada

<222> (1)..(2)

<223> secuencia CC

<220>

<221> característica variada

<222> (3)..(8)

<223> sitio de corte por restricción para SalI

<220>

<221> característica variada

<222> (9)..(832)

<223> secuencia situada corriente arriba de la secuencia codificadora

<220>

<221> CDS

<222> (833)..(1687)

<223> parte N-terminal de la región codificadora

<220>

<221> mutación

<222> (847)..(847)

<223> transversion A > T

<220>

<221> característica variada

<222> (1688)..(1693)

<223> sitio de corte por restricción para EcoRI

<220>

<221> característica variada

<222> (1694)..(1695)

<223> secuencia GG

<400> 31

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido, que abarca la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, realizándose que el L-ácido aspártico en la posición 5 de la secuencia de aminoácidos es reemplazado por L-valina y realizándose que el polipéptido posee una actividad de citrato sintasa.

2. 2.

   El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido contiene desde uno hasta a lo sumo cinco intercambios conservativos de aminoácidos, permaneciendo la actividad de citrato sintasa del polipéptido inalterada en comparación con la actividad de citrato sintasa del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO:6.

3. 3.

   El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1-2, caracterizado porque el polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:5.

4. 4.

   Polinucleótido aislado, que abarca una secuencia de nucleótidos, que desde la posición1 hasta la 39 contiene la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 1 hasta 39 de la SEQ ID NO:11, y desde la posición 40 hasta la 105 contiene una secuencia de nucleótidos, que codifica la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:12, estando contenida L-valina en la posición 5, y el polinucleótido es utilizable para la introducción de la mutación en el gen gltA de acuerdo con la SEQ ID NO:1 en el cromosoma mediante un intercambio de alelos.

5. 5.

   El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque él abarca la secuencia de nucleótidos desde la posición 263 hasta la 1.263 de la SEQ ID NO:7.

6. 6.

   Vector, que contiene un polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 5.

7. 7.

   Bacteria, que ha sido transformada con el vector de acuerdo con la reivindicación 6.

8. 8.

   La bacteria de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque se trata de una bacteria del género Corynebacterium o Escherichia, de manera preferida de Corynebacterium glutamicum o Escherichia coli.

9. 9.

   Bacteria del género Corynebacterium, de manera preferida Corynebacterium glutamicum, que contiene un polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 5.

10. 10.

    Bacteria recombinante del género Corynebacterium que contiene un polinucleótido, que codifica un polipéptido con una actividad de citrato sintasa, que abarca la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, estando contenida L-valina en la posición 5 de la secuencia de aminoácidos.

11. 11.

    La bacteria recombinante del género Corynebacterium de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque el polipéptido contiene desde uno hasta a lo sumo cinco intercambios conservativos de aminoácidos, permaneciendo la actividad de citrato sintasa del polipéptido inalterada en comparación con la actividad de citrato sintasa del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO:6.

12. 12.

    La bacteria recombinante del género Corynebacterium de acuerdo con las reivindicaciones 10 hasta 11, caracterizada porque el polinucleótido posee la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:5.

13. 13.

    La bacteria recombinante del género Corynebacterium de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 8 hasta 12, caracterizada porque ella contiene un polinucleótido, que codifica un polipéptido con una actividad de aspartato cinasa, que abarca la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20, y que contiene uno o varios de los intercambios de aminoácidos escogidos entre el conjunto que se compone de

    a) un intercambio de L-alanina en la posición 279 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-treonina (LysC A279T), b) un intercambio de L-alanina en la posición 279 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-valina (LysC A279V), c) un intercambio de L-leucina en la posición 297 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-glutamina (LysC L297Q), d) un intercambio de L-serina en la posición 301 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-fenilalanina (LysC S301F), e) un intercambio de L-serina en la posición 301 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-tirosina (LysC S301Y), f) un intercambio de L-treonina en la posición 308 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-isoleucina (LysC T308I), g) un intercambio de L-treonina en la posición 311 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-isoleucina (LysC T311I), h) un intercambio de L-serina en la posición 317 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-alanina (LysC S317A),

    i) un intercambio de L-arginina en la posición 320 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por glicina (LysC R320G), j) un intercambio de glicina en la posición 345 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-ácido aspártico (LysC G345D), k) un intercambio de L-treonina en la posición 380 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-isoleucina (LysC T380I), y l) un intercambio de L-serina en la posición 381 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO:20 por L-fenilalanina (lysC S381F).

14. 14.

    La bacteria recombinante del género Corynebacterium de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizada porque se sobreexpresa el polinucleótido, que codifica un polipéptido con una actividad de aspartato cinasa.

15. 15.

    La bacteria recombinante del género Corynebacterium de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 8 hasta 14, caracterizada porque ella contiene adicionalmente una o varias de las características, escogidas entre el conjunto que se compone de

    a) un polinucleótido sobreexpresado, que codifica una dihidrodipicolinato sintasa (DapA), b) un polinucleótido sobreexpresado, que codifica una aspartatosemialdehído deshidrogenasa (Asd), c) un polinucleótido sobreexpresado, que codifica una diaminopimelato descarboxilasa (LysA), d) un polinucleótido sobreexpresado, que codifica una asparato aminotransferasa (Aat), e) un polinucleótido sobreexpresado, que codifica un polipéptido con una actividad de exportación de Llisina (LysE), f) una actividad desconectada o debilitada de la malato deshidrogenasa (Mdh), g) una actividad desconectada o debilitada de la malato-quinona oxidorreductasa (Mqo), h) un polinucleótido sobreexpresado, que codifica una piruvato carboxilasa (Pyc), e i) una actividad desconectada o debilitada de la subunidad E1p del complejo de la piruvato deshidrogenasa (AceE)), de manera preferida

    contiene todas las características a) hasta g).

16. 16.

    La bacteria recombinante del género Corynebacterium de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 10 hasta 15, caracterizada porque se trata de Corynebacterium glutamicum.

17. 17.

    Procedimiento para la producción de un L-aminoácido, de manera preferida L-lisina, L-valina o L-isoleucina, de manera especialmente preferida L-lisina, caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes etapas:

    a) fermentación de las bacterias del género Corynebacterium de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 8 hasta 16 en un medio nutritivo adecuado, y b) acumulación del L-aminoácido en el medio nutritivo o en las células de las bacterias mencionadas.

18. 18.

    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque se recoge el L-aminoácido y/o porque se aísla y purifica el L-aminoácido.

19. 19.

    Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 17 o 18, caracterizado porque unos componentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa permanecen en su totalidad o en porciones (> 0 a 100 %) en el producto final.

20. 20.

    Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 17 hasta 19, caracterizado porque se trata de un procedimiento por tandas, de un procedimiento de afluencia o de un procedimiento contínuo.

21. 21.

    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque cuando en el caso del L-aminoácido se trate de L-lisina, se substrae agua desde un caldo de fermentación que contiene L-lisina, y se obtiene un producto con un contenido de agua de como máximo 5 % en peso, o porque se concentra primeramente un caldo de fermentación que contiene L-lisina, y a continuación se seca por atomización o se granula por atomización.

22. 22.

    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque cuando en el caso del L-aminoácido se trate de L-lisina, se llevan a cabo las siguientes etapas

    a) se disminuye el valor del pH a 4,0 hasta 5,2 mediante la adición de ácido sulfúrico, y en el caldo se ajusta una relación molar de sulfato/L-lisina de 0,85 a 1,2, eventualmente mediante adición de otros compuestos adicionales que contienen sulfato, en particular de sulfato de amonio y/o hidrógeno-sulfato de amonio o ácido sulfúrico y amoníaco en las correspondientes relaciones y b) la mezcla así obtenida se concentra mediante substracción de agua, y eventualmente se granula.

    Figura 1: