KR101337165B1 - 코리네형 박테리아의 ｒｅｌ 유전자의 대립유전자 - Google Patents

코리네형 박테리아의 ｒｅｌ 유전자의 대립유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 GTP-피로포스페이트 키나제 (EC 번호 2.7.6.5)의 변이체를 코딩하는 코리네형 박테리아의 rel 유전자의 돌연변이체 및 대립유전자, 및 상기 대립유전자를 함유하는 박테리아를 사용해서 아미노산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
코리네형 박테리아, rel 유전자, 대립유전자.

Description

코리네형 박테리아의 ＲＥＬ 유전자의 대립유전자 {ALLELES OF THE REL GENE OF CORYNEFORM BACTERIA}
본 발명은 GTP-피로포스페이트 키나제 (EC 번호 2.7.6.5)의 변이체를 코딩하는 코리네형(coryneform) 박테리아의 rel 유전자의 돌연변이체 및 대립유전자, 및 상기 대립유전자를 보유하는 박테리아를 사용해서 아미노산, 특히 L-리신, L-트립토판, L-프롤린, L-발린, L-이소류신 및 L-호모세린을 제조하는 방법에 관한 것이다.
배경 기술
아미노산은 인간 의학, 제약 산업, 식품 산업 및 특히 동물 영양에서 적용된다.
아미노산은 코리네형 박테리아, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰의 균주의 발효에 의해 제조되는 것으로 알려져 있다. 큰 중요성으로 인해, 아미노산 제조 방법을 개선시키는 것에 대한 지속적인 노력이 기울여지고 있다. 이러한 방법은 예를 들어 교반 및 산소 공급과 같은 발효 관련 수단, 또는 예를 들어 발효 동안 슈가 농도와 같은 영양 배지의 조성 또는 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물 형태에 대한 처리 또는 미생물 자체의 고유의 수행 특성 면에서 개선될 수 있다.
이들 미생물의 수행 특성은 돌연변이유발법, 돌연변이체의 선별 및 선택 방법을 적용함으로써 개선된다. 이러한 방식으로 얻어진 균주는 항대사산물에 대해 내성을 나타내거나 또는 조절상 중요한 대사산물에 대해 영양요구성이며, 아미노산을 생산한다. 공지된 항대사산물은 리신 유사체인 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 (AEC)이다.
유사하게 본 발명에 앞서 오랫 동안 재조합 DNA 기술 방법은 개별 아미노산 생합성 유전자를 증폭시키고 아미노산 생산에 대한 효과를 연구함으로써 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량시킬 목적으로 사용되어 왔다.
코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체는 몇년전 완전히 서열화되었다 [Kalinowski et al., Journal of Biotechnology 104, 5-25 (2003)]. 마찬가지로 코리네박테리움 에피시엔스의 염색체가 기존에 서열화되었다 [Nishio et al., Genome Res. 13 (7), 1572-1579 (2003)].
상응하는 서열 정보는 공개 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 적합한 데이터베이스로는 예를 들어 유러피언 몰레큘라 바이올러지스 래버러토리즈(European Molecular Biologies Laboratories)(EMBL, Heidelberg, Germany and Cambridge, UK)의 데이터베이스, 내셔널 센터 포 바이오테크놀러지 인포메이션(National Center for Biotechnology Information)(NCBI, Bethesda, MD, USA)데이터베이스, 스위스 인스티튜트 오브 바이오인포매틱스(Swiss Institute of Bioinformatics)(Swissprot, Geneva, Switzerland)의 데이터베이스, 프로틴 인포메이션 리소스 데이터베이스(Protein Information Resource Database)(PIR, Washington, DC, USA) 및 DNA 데이터 뱅크 오브 재팬(DNA Data Bank of Japan) (DDBJ, 1111 Yata, Mishima, 411-8540, Japan)이 있다.
유전학에 대한 개요에 있어서, 코리네박테리움의 대사 및 기술적 중요성은 문헌들 [Ikeda, by Pfefferle et al. and by Mueller and Huebner in the book "Microbial Production of L-Amino Acids" (Advances in Biochemical Engineering 79, (2003), Springer Verlag, Berlin, Germany, Editor: T. Scheper), in the special edition "A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology" of the Journal of Biotechnology (Volume 104 (1-3), 2003, Editor: A. Puehler and T. Tauch) and in the "Handbook of Corynebacterium glutamicum (Editors: L. Eggeling and M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA, 2005)]에서 확인될 것이다.
코리네박테리움 글루타미쿰의 GTP-피로포스페이트 키나제를 코딩하는 rel 유전자의 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 접근가능하며, 특히 내셔널 라이브러리 오브 메디신(National Library of Medicine)(Bethesda, MD, USA)의 내셔널 센터 포 바이오테크놀러지 인포메이션(NCBI)의 데이터베이스에서 접근 번호 AF038651로 이용할 수 있다. 또한, 상기 서열은 특허 출원 EP1108790에서 서열 1824로 찾을 수 있다.
문헌 [Wehmeier et al. (Microbiology 144, 1853-1862 (1998))]은 특히 rel 유전자에서 결실을 보유하는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 돌연변이체에 대한 유전적, 미생물학적 및 생화학적 연구에 대하여 보고한다.
더 명확히 하고자 하면, 서열 1은 NCBI 데이터베이스의 정보에 따른 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰의 GTP-피로포스페이트 키나제를 코딩하는 rel 유전자 ("야생형 유전자")의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, 서열 2 및 4는 그로부터 유도된 코딩된 GTP-피로포스페이트 키나제의 아미노산 서열을 나타낸다. 또한, 서열 3은 상류 및 하류에 위치한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 서열 2 및 4에 따른 아미노산 서열은 위치 262에서 글리신을 포함한다. EP　1　108　790에 개시된 야생형 GTP-피로포스페이트 키나제의 아미노산 서열은 위치 262에서 L-글루탐산을 포함한다. EP　1　108　790에 따른 야생형 rel 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열 21에 나타나 있다. 서열 22는 코딩된 아미노산 서열을 나타낸다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 아미노산, 특히 L-리신, L-트립토판, L-프롤린, L-발린, L-이소류신 및 L-호모세린의 제조를 개선하기 위한 신규 수단을 제공하는 것이다.
본 발명은 바람직하게는 아미노산을 분비하고 GTP-피로포스페이트 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 L-프롤린 이외의 단백질성(proteinogenic) 아미노산 중 하나가 아미노산 서열의 위치 38 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에 존재하는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 코리네형 박테리아의 생성 또는 단리된 돌연변이체에 관한 것이다. L-프롤린을 L-류신으로 치환하는 것이 바람직하다.
코리네형 박테리아 중에서, 코리네박테리움 속이 바람직하다. 코리네박테리움 속에서, 하기 종들이 바람직하며:
코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens)(균주 타입 DSM44549),
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)(균주 타입 ATCC13032),
코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes)(예를 들어 균주 FERM BP-1539), 및
코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)(균주 타입 ATCC6871),
코리네박테리움 글루타미쿰 종이 매우 특히 바람직하다.
또한 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 몇가지 대표적인 것은 다른 종 명칭으로 선행기술에 공지되어 있다. 이들로는 예를 들어 하기 것들을 들 수 있다:
코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870,
코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium) DSM20137,
코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) ATCC17965,
브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067,
브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869,
브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020, 및
마이크로박테리움 암모니아필룸(Brevibacterium ammoniaphilum) ATCC15354.
코리네박테리움 글루타미쿰에 대해서는 용어 "마이크로코커스 글루타미쿠스(Micrococcus glutamicus)"가 또한 사용되어 왔다.
본 발명의 수단을 위해 사용된 코리네형 박테리아의 균주는 바람직하게는 세포에서 목적하는 아미노산을 농축시키는 능력 또는 상기 아미노산을 주변의 영양 배지로 분비 및 축적시키는 능력을 이미 갖고 있다. 이를 위해 하기에서는 "제조하다"라는 용어가 또한 언급된다. 특히, 사용된 코리네형 박테리아의 균주는 = (최대) 120 시간, = 96 시간, = 48　시간, = 36 시간, = 24 시간 또는 = 12 시간 내에 세포 또는 영양 배지에서 = (적어도) 0.25 g/l, = 0.5 g/l, = 1.0 g/l, = 1.5 g/l, = 2.0 g/l, = 4 g/l 또는 =　10　g/l의 목적하는 아미노산을 농축시키거나 축적시키는 능력을 갖는다. 상기 균주는 돌연변이유발 및 선별, 재조합 DNA 기술, 또는 이들 방법의 조합에 의해 생성된 것일 수 있다.
코리네형 박테리아의 L-리신-생산 또는 -분비 균주의 공지된 대표적인 것의 예로는 하기와 같은 것들이 있다:
EP 0 358 940에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 DM58-1/pDM6 (= DSM4697),
문헌 [Menkel et al. (Applied and Environmental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)]에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 MH20-22B (= DSM16835),
EP 1 108 790에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 AHP-3 (= Ferm BP-7382),
US 4,275,157에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 NRRL B-11474, 및
US 5,250,423에 기재된 코리네박테리움 써모아미노게네스 AJ12521 (= FERM BP-3304).
코리네형 박테리아의 L-트립토판-생산 또는 -분비 균주의 공지된 대표적인 것의 예로는 하기와 같은 것들이 있다:
US 5,563,052에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 K76 (=Ferm BP-1847),
US 5,605,818에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 BPS13 (=Ferm BP-1777), 및
US 5,235,940에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 Ferm BP-3055.
코리네형 박테리아의 L-프롤린-생산 또는 -분비 균주의 공지된 대표적인 것의 예로는 하기와 같은 것들이 있다:
US 4,224,409에 기재된 브레비박테리움 락토퍼멘툼 NRRL B-11421,
US 4,224,409에 기재된 브레비박테리움 플라붐 NRRL B-11422,
US 5,294,547에 기재된 브레비박테리움 플라붐 FERM BP-2214,
US 4,224,409에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 NRRL B-11423,
US 4,444,885에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21157,
US 4,444,885에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21158,
US 4,444,885에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21159,
US 4,444,885에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21355, 및
US 4,224,409에 기재된 마이크로박테리움 암모니아필룸 NRRL B-11424.
코리네형 박테리아의 L-발린-생산 또는 -분비 균주의 공지된 대표적인 것의 예로는 하기와 같은 것들이 있다:
US 5,188,948에 기재된 브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM BP-1763,
US 5,521,074에 기재된 브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM BP-3007,
US 5,521,074에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM BP-3006, 및
US 5,188,948에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM BP-1764.
코리네형 박테리아의 L-이소류신-생산 또는 -분비 균주의 공지된 대표적인 것의 예로는 하기와 같은 것들이 있다:
US 4,656,135에 기재된 브레비박테리움 플라붐 FERM BP-759,
US 5,294,547에 기재된 브레비박테리움 플라붐 FERM BP-2215, 및
US 4,656,135에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM BP-758.
코리네형 박테리아의 L-호모세린-생산 또는 분비 -균주의 공지된 대표적인 것의 예로는 하기와 같은 것들이 있다:
US 3,189,526에 기재된 마이크로코커스 글루타미쿠스(Micrococcus glutamicus) ATCC 14296 및
US 3,189,526에 기재된 마이크로코커스 글루타미쿠스(Micrococcus glutamicus) ATCC 14297.
상기 박테리아 군의 균주의 분류학적 분류에 대한 정보는 특히 문헌들 [Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983)), Kinoshita (1985, Glutamic Acid Bacteria, p115-142. In: Demain and Solomon (ed), Biology of Industrial Microorganisms. The Benjamin/Cummins Publishing Co., London, UK), Kaempfer and Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991)) 및 US-A-5,250,434]에서 찾을 수 있다.
"ATCC"로 표시된 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(Manassas, VA, USA)으로부터 얻을 수 있다. "DSM"으로 표시된 균주는 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)(DSMZ, Brunswick, Germany)으로부터 얻을 수 있다. "NRRL"로 표시된 균주는 애그리컬츄럴 리서치 서비스 페이턴트 컬쳐 콜렉션(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)(ARS, Peoria, Illinois, US)으로부터 얻을 수 있다. "FERM"으로 표시된 균주는 내셔널 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀러지(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan)로부터 얻을 수 있다.
유전자는 화학적으로 폴리뉴클레오티드이다. 이에 대한 다른 용어는 핵산이다. rel 유전자에 의해 코딩되며 GTP-피로포스페이트 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드는 또한 선행기술에서 "GTP 디포스포키나제", "구아노신 3',5'-폴리포스페이트 신타제" 또는 "엄격 인자"로서 언급된다 (예를 들어, 가네히사 래버러토리, 바이오인포매틱스 센터, 인스티튜트 포 케미컬 리서치(Kanehisa Laboratory, Bioinformatics Center, Institute for Chemical Research)(Kyoto University, Japan)의 KEGG 데이터베이스 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)를 참조한다).
그의 EC 번호는 IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) 명명법에 따르면 2.7.6.5.이다.
상기 폴리펩티드는 하기 반응을 촉매한다:
ATP + GTP → AMP + 구아노신　3'-디포스페이트　5'-트리포스페이트 (GDP는 또한 GTP를 대신하여 기질로서 사용됨).
단백질성 아미노산이라는 용어는 일반적으로 천연 단백질, 즉 미생물, 식물, 동물 및 인간의 단백질에서 발생하는 아미노산을 의미한다. 그러나, 본 발명에 있어서, 단백질성 아미노산은 L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-쓰레오닌, L-세린, L-글루탐산, L-글루타민, 글리신, L-알라닌, L-시스테인, L-발린, L-메티오닌, L-이소류신, L-류신, L-티로신, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-리신, L-트립토판, L-프롤린 및 L-아르기닌으로 이루어진 L-아미노산의 군을 의미한다. L-아미노산은 또한 L-호모세린을 포함한다.
본 발명의 돌연변이체는 바람직하게는 상기 단백질성 아미노산, 특히 L-리신, L-트립토판, L-프롤린, L-발린, L-이소류신 또는 L-호모세린을 분비한다. 아미노산이라는 용어는 또한 그의 염, 예를 들어 아미노산 L-리신의 경우 리신 모노하이드로클로라이드 또는 리신 술페이트를 포함한다.
추가로 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지며 L-프롤린 이외의 상기 언급한 단백질성 아미노산 중 하나가 위치 38에 존재하는 폴리펩티드를 코딩하는 rel 대립유전자를 포함하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이다. L-프롤린을 L-류신으로 교환하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열의 위치 38에 상응하는 위치에서 L-프롤린 이외의 단백질성 아미노산 중 하나, 그러나 바람직하게는 L-류신을 포함하고 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 rel 대립유전자를 포함하며, 이 유전자는 각 프라이머의 뉴클레오티드 서열이 서열 3 또는 서열 7의 위치 1 내지 750 사이의 뉴클레오티드 서열 및 서열 3 또는 서열 7의 위치 3800 내지 3031 사이의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이다. 적합한 프라이머 쌍의 한 예는 서열 19 및 서열 20에 기재되어 있다. 바람직한 출발 물질 ("템플레이트" DNA)은 특히 돌연변이원으로 처리된 코리네형 박테리아의 염색체 DNA이다. 코리네박테리움 속의 염색체 DNA가 특히 바람직하며, 코리네박테리움 글루타미쿰 종의의 것이 매우 특히 바람직하다.
또한 본 발명은 760개의 L-아미노산에 상응하는 길이를 갖는 아미노산 서열을 포함하고 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지며 L-프롤린 이외의 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-류신이 위치 38에 존재하는 폴리펩티드를 코딩하는 rel 대립유전자를 포함하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이다.
또한 본 발명은 아미노산 서열의 위치 19 내지 57에서 서열 6 또는 8의 위치 19 내지 57에 상응하는 아미노산 서열을 포함하며 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 rel 대립유전자를 포함하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이다. 바람직하게는, 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 107 또는 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 207 또는 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 407 또는 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 607 또는 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 707 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 707 또는 서열 6 또는 8 의 위치 9 내지 757 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 757 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 758 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 759에 상응하는 아미노산 서열을 포함하며, L-글루탐산은 임의로 위치 262에 존재한다. 760개의 아미노산을 포함하는 코딩된 폴리펩티드의 길이가 매우 특히 바람직하다.
또한 본 발명은 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 아미노산 서열의 위치 38 또는 상응하는 위치에서 L-프롤린(L-류신으로 치환되는 것이 바람직함) 이외의 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하며, 그의 아미노산 서열이 서열 6 또는 서열 8의 아미노산 서열과 90％ 이상, 바람직하게는 92％ 이상 또는 94％ 이상 또는 96％ 이상, 매우 특히 바람직하게는 97％ 이상 또는 98％ 이상 또는 99％ 이상 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 rel 대립유전자를 포함하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이다. L-글루탐산은 서열 6 또는 서열 8의 위치 262에 임의로 함유된다.
또한 본 발명은 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 아미노산 서열의 위치 38 또는 상응하는 위치에서 L-프롤린(L-류신으로 치환되는 것이 바람직함) 이외의 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하며, 또한 그의 뉴클레오티드 서열이 서열 5의 뉴클레오티드 서열과 90％ 이상, 바람직하게는 92％ 이상 또는 94％ 이상 또는 96％ 이상, 매우 특히 바람직하게는 97％ 이상 또는 98％ 이상 또는 99％ 이상 동일한 것인, rel 대립유전자를 포함하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이다. 아데닌은 위치 785에서 임의로 존재한다.
보존적 아미노산 치환은 효소 활성을 단지 유의하지 않게 변화시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 돌연변이체에 존재하며 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 rel 대립유전자는 서열 6 또는 서열 8에 나타낸 아미노산 서열 이외에 하나 (1) 또는 그보다 많은 보존적 아미노산 치환(들)을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 바람직하게는 2개 (2) 이하, 3개 (3) 이하, 4개 (4) 이하 또는 5개 (5) 이하의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. L-글루탐산은 임의로 서열 6 또는 서열 8의 위치 262에 존재한다.
방향족 아미노산의 경우, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 서로 치환하는 경우에 치환은 보존적인 것으로 언급된다. 소수성 아미노산의 경우, 류신, 이소류신 및 발린을 서로 치환하는 경우에 치환은 보존적인 것으로 언급된다. 극성 아미노산의 경우, 글루타민 및 아스파라긴을 서로 치환하는 경우에 치환은 보존적인 것으로 언급된다. 염기성 아미노산의 경우, 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 서로 치환하는 경우에 치환은 보존적인 것으로 언급된다. 산성 아미노산의 경우, 아스파르트산 및 글루탐산을 서로 치환하는 경우에 치환은 보존적인 것으로 언급된다. 히드록실기-함유 아미노산의 경우, 세린 및 쓰레오닌을 서로 치환하는 경우에 치환은 보존적인 것으로 언급된다.
본 발명을 수행하는 동안, 클러스탈(Clustal) 프로그램 [Thompson et al., Nucleic Acids Research 22, 4637-4680 (1994)]을 사용해서 아미노산 서열을 비교한 결과, 예를 들어 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 스트렙토마이세스 코엘리클로르(Streptomyces coeliclor), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis), 코리네박테리움 에피시엔스 및 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 다양한 박테리아의 GTP-피로포스페이트 키나제의 아미노산 서열이 서열 Ser-Gly-Asp/Glu-Pro-Tyr-Ile-Thr/Ile-His-Pro-Leu-Ala-Val로 이루어진 서열 모티프, 서열 Ala-Ala/Gly-Leu-Leu-His-Asp-Thr-Val-Glu-Asp-Thr로 이루어진 서열 모티프, 및 또한 서열 Thr-Pro-Val-Asp-Phe-Ala-Tyr-Ala-Val-His-Thr-Glu-Val-Gly-His-Arg로 이루어진 서열 모티프를 포함하는 것으로 밝혀졌다. "Asp/Glu", "Thr/Ile" 및 "Ala/Gly"라는 용어는 "Asp 또는 Glu" 또는 "Thr 또는 Ile" 또는 "Ala 또는 Gly"가 상응하는 위치에 존재함을 의미한다.
따라서, GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 Ser-Gly-Asp/Glu-Pro-Tyr-Ile-Thr/Ile-His-Pro-Leu-Ala-Val, Ala-Ala/Gly-Leu-Leu-His-Asp-Thr-Val-Glu-Asp-Thr 및 Thr-Pro-Val-Asp-Phe-Ala-Tyr-Ala-Val-His-Thr-Glu-Val-Gly-His-Arg로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하며 아미노산 서열의 위치 38 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에서 L-프롤린 이외의 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-류신을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 rel 대립유전자를 포함하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체가 바람직하다.
아미노산 서열 모티프 Ser-Gly-Asp/Glu-Pro-Tyr-Ile-Thr/Ile-His-Pro-Leu-Ala-Val은 예를 들어 각각 서열 2 또는 4 또는 각각 서열 6 또는 8에서 위치 73으로부터 84까지 존재한다. 아미노산 서열 모티프 Ala-Ala/Gly-Leu-Leu-His-Asp-Thr-Val-Glu-Asp-Thr은 예를 들어 각각 서열 2 또는 4 또는 각각 서열 6 또는 8에서 위치 100으로부터 110까지 존재한다. 아미노산 서열 모티프 Thr-Pro-Val-Asp-Phe-Ala-Tyr-Ala-Val-His-Thr-Glu-Val-Gly-His-Arg는 예를 들어 각각 서열 2 또는 4 또는 각각 서열 6 또는 8에서 위치 437부터 452까지 존재한다.
마지막으로, 본 발명은 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 각각 서열 6 또는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하며 L-글루탐산이 임의로 위치 262에 존재하는 폴리펩티드를 코딩하는 rel 대립유전자를 포함하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이다.
아미노펩티다제라고 불리는 숙주 고유의 효소는 단백질 합성 동안 말단의 메티오닌을 제거하는 것으로 알려져 있다.
"아미노산 서열의 위치 38에 상응하는 위치" 또는 "아미노산 서열의 위치 38에 필적하는 위치"라는 용어는, 코딩된 폴리펩티드의 N-말단 영역 (서열 6 또는 8의 위치 38을 기준으로 함)에서 아미노산을 코딩하는 코돈의 삽입 또는 결실이 표시된 위치 및 표시된 길이를 삽입의 경우 형식적으로 1 단위 증가시키거나 또는 결실의 경우 1 단위 감소시킨다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 서열 6 또는 8의 위치 4에서 아미노산 L-글루탐산을 코딩하는 GAG 코돈의 결실은 L-류신을 위치 38로부터 위치 37로 이동시킨다. 이후, 표시된 길이는 759 아미노산이 된다. 동일한 방식으로, 코딩된 폴리펩티드의 C-말단 영역 (위치 38을 기준으로 함)에서 아미노산을 코딩하는 코돈의 삽입 또는 결실은 나타낸 길이를 삽입의 경우 형식적으로 1 단위 증가시키거나 또는 결실의 경우 1 단위 감소시킨다. 상기 필적하는 위치는 클러스탈 프로그램 또는 MAFFT 프로그램을 이용해서 정렬 형태의 아미노산 서열을 비교함으로써 쉽게 확인할 수 있다.
이러한 종류의 삽입 및 결실은 본질적으로 효소 활성에 영향을 주지 않는다. "본질적으로 영향을 주지 않는"이란 상기 언급한 변이체의 효소 활성이 각각 서열 6 또는 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 (L-글루탐산은 임의로 위치 262에 존재함)의 활성과 10％ 이하, 7.5％ 이하, 5％ 이하, 2.5％ 이하 또는 1％ 이하 만큼 차이가 남을 의미한다.
따라서 본 발명은 각각 하나 이상의 삽입(들) 또는 결실(들)을 포함하는 서열 6 또는 8의 폴리펩티드 변이체 (L-글루탐산은 임의로 위치 262에 존재함)를 코딩하는 rel 대립유전자에 관한 것이다. 폴리펩티드는 바람직하게는 아미노산 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하의 아미노산 삽입 또는 결실을 포함한다.
상기 언급된 서열 모티프인 Ser-Gly-Asp/Glu-Pro-Tyr-Ile-Thr/Ile-His-Pro-Leu-Ala-Val, Ala-Ala/Gly-Leu-Leu-His-Asp-Thr-Val-Glu-Asp-Thr 및 Thr-Pro-Val-Asp-Phe-Ala-Tyr-Ala-Val-His-Thr-Glu-Val-Gly-His-Arg는 바람직하게는 이러한 삽입/결실에 의해 파괴되지 않는다.
본 발명의 돌연변이체는 코리네형 박테리아의 세포 집단에 대해 돌연변이원 물질, 예를 들어 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG), 에틸 메탄술포네이트 (EMS), 5-브로모우라실 또는 자외선광을 이용하는 전형적인 생체내 돌연변이유발 방법에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 방법은 예를 들어 문헌 [Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al. (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981)] 또는 문헌 [Tosaka et al. (Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978))] 또는 문헌 [Konicek et al. (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988))]에 기재되어 있다. MNNG를 사용하는 전형적인 돌연변이유발법은 50 내지 500 mg/l 또는 최대 1 g/l의 더 높은 농도, 5.5 내지 7.5의 pH에서 1 내지 30분의 인큐베이션 시간을 포함한다. 이러한 조건하에, 생존가능한 세포의 수는 대략 50％ 내지 90％ 또는 대략 50％ 내지 99％ 또는 대략 50％ 내지 99.9％ 만큼 또는 그보다 많이 감소된다.
돌연변이체 또는 세포는 돌연변이유발된 세포 집단으로부터 제거되어 증식된다. 추가의 단계에서, 적합한 영양 배지를 사용하는 회분식 배양에서 아미노산, 바람직하게는 L-리신, L-트립토판, L-프롤린, L-발린, L-이소류신 또는 L-호모세린을 분비하는 상기 돌연변이체 또는 세포의 능력을 연구하는 것이 바람직하다. 적합한 영양 배지 및 검정 조건은 특히 US 6,221,636, US 5,840,551, US 5,770,409, US 5,605,818, US 5,275,940 및 US 4,224,409에 기재되어 있다. 예를 들어 문헌 [Zimmermann et al. (VDI Berichte No. 1841, VDI-Verlag, Duesseldorf, Germany 2004, 439-443)] 또는 문헌 [Zimmermann (Chemie Ingenenieur Technik 77 (4), 426-428 (2005))]에 기재된 바와 같은 적합한 로봇 시스템을 사용하는 경우, 다수의 돌연변이체를 단시간내에 연구할 수 있다. 일반적으로, 3000개 이하, 10,000개 이하, 30,000개 이하 또는 60,000개 이하의 돌연변이체, 적절한 경우 그보다 많은 돌연변이체가 연구된다. 모(parent) 균주 또는 돌연변이유발되지 않은 출발 균주에 비해 영양 배지 또는 세포의 내부로 증가된 양의 아미노산을 분비하는 돌연변이체는 이러한 방식으로 확인된다. 이러한 돌연변이체로는 예를 들어 아미노산 분비가 0.5％ 이상 증가된 돌연변이체를 들 수 있다.
이어서, 돌연변이체의 DNA를 제공하거나 또는 그로부터 단리하고, rel 유전자 또는 본 발명의 rel 대립유전자 또는 본 발명의 위치 38에서의 돌연변이의 증폭을 허용하는 프라이머 쌍을 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 상응하는 폴리뉴클레오티드를 합성한다. 아미노산을 증가된 양으로 분비하는 돌연변이체로부터 DNA를 단리하는 것이 바람직하다.
이를 위해 본 발명의 돌연변이의 상류 및 하류에 위치하는 뉴클레오티드 서열 및 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열로부터 임의의 프라이머 쌍을 선택할 수 있다. 프라이머 쌍의 프라이머는 본원에서 바람직하게는 서열 3 또는 서열 7의 위치 1 내지 861 사이의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상, 18개 이상, 20개 이상, 21개 이상 또는 24개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 프라이머 쌍의 상응하는 제2 프라이머는 서열 3 또는 서열 7의 위치 3800 내지 865의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상, 18개 이상, 20개 이상, 21개 이상 또는 24개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 코딩 영역의 증폭이 필요한 경우, 프라이머 쌍은 바람직하게는 서열 3 또는 서열 7의 위치 1 내지 750 사이의 뉴클레오티드 서열 및 서열 3 또는 서열 7의 위치 3800 내지 3031 사이의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택된다.
예를 들어 서열 11 및 13에 나타낸 바와 같은 코딩 영역의 일부의 증폭이 필요한 경우, 프라이머 쌍은 바람직하게는 서열 3 또는 서열 7의 위치 751 내지 804 사이 또는 위치 1 내지 804 사이의 뉴클레오티드 서열 및 서열 3 또는 서열 7의 위치 3030 내지 922 사이 또는 3800 내지 922 사이의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택된다. 적합한 프라이머 쌍의 예로는 서열 19 및 서열 20하에 나타낸 rel_XL_A1 및 rel_X_E1 프라이머 쌍이 있다. 또한, 프라이머에는 제한 효소에 대한 인식 부위, 비오틴기 또는 선행기술에 기술된 바와 같은 추가의 액세서리가 제공될 수 있다. 프라이머의 전체 길이는 일반적으로 뉴클레오티드 30개, 40개, 50개 또는 60개를 초과하지 않는다.
일반적으로, 열안정성 DNA 폴리머라제는 PCR에 의한 증폭을 통해 먼저 도입된 DNA, 예를 들어 염색체 DNA (템플레이트 DNA)로부터 본 발명의 rel 대립유전자와 같은 선택된 서열을 증폭시킴으로써 폴리뉴클레오티드를 제조하는데 사용된다. 이러한 종류의 DNA 폴리머라제의 예로는, 특히 퀴아젠(Qiagen)(Hilden, Germany)사에서 판매하는 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)의 Taq 폴리머라제, 특히 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)(Frankfurt, Germany)에서 판매하는 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis)의 Vent 폴리머라제, 또는 스트라타진(Stratagene)(La Jolla, USA)사에서 판매하는 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)의 Pfu 폴리머라제가 있다. 교정-판독(proof-reading) 활성을 갖는 폴리머라제가 바람직하다. 교정-판독 활성은 이러한 폴리머라제가 잘못 혼입된 뉴클레오티드를 인식하여 재개된 중합에 의해 오류를 교정할 수 있음을 의미한다 [Lottspeich and Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany (1998)]. 교정-판독 활성을 갖는 폴리머라제의 예로는 Vent 폴리머라제 및 Pfu 폴리머라제가 있다.
반응 혼합물에서의 조건은 제조자에 의해 제공된 정보에 따라 설정된다. 폴리머라제는 일반적으로는 통상적으로 pH 7.5-9.3에서 10-100 mM Tris/HCl 및 6-55 mM KCl의 농도를 갖는 일반적인 완충액과 함께 제조자에 의해 제공된다. 제조자에 의해 제공된 완충액 중에 염화마그네슘이 존재하지 않는다면, 염화마그네슘을 0.5-10 mM의 농도로 첨가한다. 또한, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트가 반응 혼합물에 0.1-16.6 mM의 농도로 첨가된다. 최종 농도 0.1-3 μM의 프라이머 및 템플레이트 DNA는 최적의 경우 102 내지 105의 카피수로 반응 혼합물 중에 먼저 도입된다. 또한 106 내지 107의 카피수를 이용할 수도 있다. 적절한 폴리머라제를 2-5 단위의 양으로 반응 혼합물에 첨가한다. 전형적인 반응 혼합물은 20-100 ㎕의 부피를 갖는다.
반응에 첨가될 수 있는 추가의 첨가물로는 소 혈청 알부민, 트윈(Tween) 20, 젤라틴, 글리세롤, 포름아미드 또는 DMSO (Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA 1995)가 있다.
전형적인 PCR 프로필은 3개의 상이한, 연속적으로 반복되는 온도 단계들로 이루어진다. 처음에, 반응은 먼저 도입된 DNA를 변성시키기 위해 4 내지 10분 동안 온도를 92℃ 내지 98℃로 상승시킴으로써 개시된다. 이후, 먼저 도입된 DNA를 대략 92℃ 내지 98℃에서 10 내지 60초 동안 변성시키는 단계에 이어서 특정 온도에서 10 내지 60초 동안 프라이머를 먼저 도입된 DNA와 결합시키는 단계를 반복하는데, 상기 특정 온도는 상기 프라이머 ("어닐링 온도")에 따라 달라지며 경험에 의하면 50℃ 내지 60℃이고 각 프라이머 쌍에 대해 개별적으로 계산될 수 있다. 당업자라면 이에 관한 상세한 정보를 문헌 [Rychlik et al. (Nucleic Acids Research 18 (21): 6409-6412)]에서 찾을 수 있다. 이후, 폴리머라제에 따라 통상적으로 73℃ 내지 67℃, 바람직하게는 72℃ 내지 68℃의 범위에서 폴리머라제에 대하여 각 경우에 나타낸 최적 활성에서 먼저 도입된 프라이머를 연장하는 합성 단계 ("연장")를 수행한다. 이러한 연장 단계의 지속시간은 폴리머라제의 성능 및 증폭될 PCR 생성물의 길이에 따라 달라진다. 전형적인 PCR에서, 상기 단계에는 0.5 내지 8분, 바람직하게는 2 내지 4분이 소요된다. 이러한 3개의 단계를 30 내지 35회, 적절한 경우 50회까지 반복한다. 4 내지 10분의 최종 "연장" 단계로 반응이 종결된다. 이러한 방식으로 제조된 폴리뉴클레오티드는 앰플리콘(amplicon)이라 지칭되며; 핵산 단편이라는 용어가 유사하게 사용된다.
당업자라면 PCR에 대한 추가의 지침 및 정보를 예를 들어 문헌 ["PCR-Strategies" (Innis, Felfand and Sninsky, Academic Press , Inc., 1995)], 문헌 [Diefenbach and Dveksler "PCR Primer - a laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)], 문헌 [Gait "Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, UK, 1984)] 및 문헌 [Newton and Graham "PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)]에서 찾을 수 있다.
이어서, 뉴클레오티드 서열을 예를 들어 문헌 [Zimmermann et al. (Nucleic Acids Research 18, 1067pp (1990))]에 따라 변형된 문헌 [Sanger et al. (Proceedings of the National Academies of Sciences, U.S.A., 74, 5463-5467 (1977))]의 연쇄 종결 방법에 의해 결정하고, 이 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 특히 아미노산 서열과 관련하여 분석한다. 이를 위해, DNA 서열을 아미노산 서열로 번역하는 프로그램에 뉴클레오티드 서열을 진입시킨다. 적합한 프로그램의 예로는 특허청들, 예를 들면 미국특허청(USPTO)으로부터 얻을 수 있는 "페이턴트인(Patentin)" 프로그램, 또는 월드 와이드 웹(World Wide Web)의 ExPASy 프로테오믹스 서버(Proteomics Server) 상에서 이용가능한 "트랜슬레이트 툴(Translate Tool)"이 있다 [Gasteiger et al., Nucleic Acids Research 31, 3784-3788 (2003)].
이러한 방식으로, 아미노산 서열의 위치 38 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에서 L-프롤린 이외의 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하고 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 rel 대립유전자를 갖는 돌연변이체가 확인된다. L-류신으로 치환하는 것이 바람직하다.
적절한 경우 돌연변이체의 완전한 염색체를 결정한다. 이러한 결정은 문헌 [Margulies et al. (Nature, 437(7057): 376-380 (2005))] 및 문헌 [Velicer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 103(21), 8107-8112 (2006))]에 기재된 방법을 이용하는 것을 포함할 수 있으며, 이는 당업자에게 "피로-서열화(pyro-sequencing)"라는 표현으로 공지되어 있고, 완전한 게놈을 신속하게 서열화할 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기 단계들에 의해 얻어질 수 있는 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이다:
a) 아미노산을 분비할 수 있는 코리네형 박테리아를 돌연변이유발제로 처리하는 단계,
b) 상기 a)에서 생성된 돌연변이체를 단리 및 증식시키는 단계,
c) 바람직하게는 돌연변이체가 a)에서 사용된 코리네형 박테리아보다 0.5％ 이상 더 많은 아미노산을 배지에서 분비하거나 또는 세포 내부에서 축적하는 능력을 결정하는 단계,
d) 상기 b)에서 얻어진 돌연변이체의 핵산을 제공하는 단계,
e) 서열 3 또는 서열 7의 위치 1 내지 861, 바람직하게는 1 내지 750 사이의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열 3 또는 서열 7의 위치 3800 내지 865, 바람직하게는 3800 내지 3031 사이의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 상기 d)로부터의 핵산의 폴리머라제 연쇄 반응을 이용해서 핵산 분자 (각각 앰플리콘 또는 핵산 단편)를 제조하는 단계,
f) 상기 e)에서 얻어진 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 및 코딩된 아미노산 서열을 결정하는 단계,
g) 적절한 경우 상기 f)에서 결정된 아미노산 서열을 서열 6 또는 8과 비교하며, 여기서 L-글루탐산은 임의로 위치 262에 존재하는 것인 단계, 및
h) 위치 38 또는 필적하는 위치에서 L-프롤린 이외의 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-류신을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돌연변이체를 확인하는 단계.
이러한 방식으로 생성된 돌연변이체는 전형적으로 상기 기재된 rel 대립유전자를 한 (1) 카피 포함한다.
서열 5는 예를 들어 본 발명의 돌연변이체의 rel 대립유전자의 코딩 영역을 나타낸다. 야생형 유전자의 코딩 영역은 서열 1로 나타낸다. 서열 1은 위치 112에 핵염기 시토신, 위치 113에 핵염기 시토신 및 위치 114에 핵염기 구아닌을 포함한다. 따라서, 서열 1은 위치 112 내지 114에 아미노산 L-프롤린을 코딩하는 CCG 코돈을 포함한다. 서열 5는 위치 113에 핵염기 티민을 포함한다. 이러한 시토신에서 티민으로의 전이는 위치 112 내지 114에 아미노산 L-류신을 코딩하는 CTG 코돈을 생성한다.
또한, 각각 서열 5 및 7에 기재된 뉴클레오티드 서열은 돌연변이 유발 처리에 의해 발생한 추가의 염기 치환을 포함할 수 있지만, 이는 변경된 아미노산 서열에 의해 발현되지는 않는다. 이러한 돌연변이는 또한 당업자에게 침묵 또는 중립 돌연변이로 지칭된다. 마찬가지로, 이러한 침묵 돌연변이는 상기 돌연변이 유발 처리에 이용된 코리네형 박테리아에 이미 존재할 수 있다.
바람직하게는 돌연변이 유발에 사용된 코리네형 박테리아는 그 주변의 영양 배지 또는 발효 브로쓰에서 목적하는 아미노산을 분비하거나 세포의 내부에서 이를 축적하는 능력을 이미 갖고 있다.
L-리신-생산 코리네형 박테리아는 전형적으로 피드백-내성 또는 탈감작화 아스파테이트 키나제를 갖는다. 피드백-내성 아스파테이트 키나제는 리신과 쓰레오닌의 혼합물 또는 AEC (아미노에틸시스테인)과 쓰레오닌의 혼합물 또는 리신 단독 또는 AEC 단독에 의한 억제에 대해 야생형에 비해 덜 민감성인 아스파테이트 키나제 (LysC)를 의미한다. 이들 탈감작화 아스파테이트 키나제를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자는 또한 lysCFBR 대립유전자로 지칭된다. 선행기술은 수많은 lysCFBR 대립유전자를 개시하며 이들은 야생형 단백질과 비교할 때 아미노산 치환을 갖는 아스파테이트 키나제 변이체를 코딩한다. 서열 9는 NCBI 데이터베이스의 기탁 번호 AX756575에 상응하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 lysC 유전자의 코딩 영역을 기재하며, 서열 10은 이 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 기재한다.
본 발명의 방법에 사용되는 L-리신-생산 코리네형 박테리아는 바람직하게는 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 아스파테이트 키나제 변이체를 코딩하는 lysC 대립유전자를 가지며, 상기 서열은 하기 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다:
LysC A279T (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 279에서 L-알라닌이 L-쓰레오닌으로 대체됨; US 5,688,671 및 기탁 번호 E06825, E06826, E08178 및 I74588 내지 I74597 참조),
LysC A279V (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 279에서 L-알라닌이 L-발린으로 대체됨, JP 6-261766 및 기탁 번호 E08179 참조),
LysC L297Q (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 297에서 L-류신이 L-글루타민으로 대체됨; DE 102006026328 참조),
LysC S301F (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 301에서 L-세린이 L-페닐알라닌으로 대체됨; US 6,844,176 및 기탁 번호 E08180 참조),
LysC S301Y (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 301에서 L-세린이 L-티로신으로 대체됨, 문헌 [Kalinowski et al., Molecular and General Genetics 224, 317-324 (1990)] 및 기탁 번호 X57226 참조),
LysC T308I (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 308에서 L-쓰레오닌이 L-이소류신으로 대체됨; JP 6-261766 및 기탁 번호 E08181 참조)
LysC T311I (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 311에서 L-쓰레오닌이 L-이소류신으로 대체됨; WO 00/63388 및 US 6,893,848 참조),
LysC S317A (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 317에서 L-세린이 L-알라닌으로 대체됨; US 5,688,671 및 기탁 번호 I74589 참조),
LysC R320G (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 320에서 L-아르기닌이 글리신으로 대체됨; 문헌 [Jetten et al., Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)] 및 기탁 번호 L27125 참조),
LysC G345D (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 345에서 글리신이 L-아스파르트산으로 대체됨; 문헌 [Jetten et al., Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)] 및 기탁 번호 L16848 참조),
LysC T380I (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 380에서 L-쓰레오닌이 L-이소류신으로 대체됨; WO 01/49854 및 기탁 번호 AX192358 참조), 및
LysC S381F (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 381에서 L-세린이 L-페닐알라닌으로 대체됨; EP 0435132 참조).
lysCFBR 대립유전자 lysC T311I (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 311에서 쓰레오닌이 이소류신으로 대체됨), 및 A279T (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 279에서 알라닌이 쓰레오닌으로 대체됨), S381F (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 381에서 세린이 페닐알라닌으로 대체됨) 및 S317A (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 317에서 세린이 알라닌으로 대체됨)의 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 lysCFBR 대립유전자가 특히 바람직하다.
lysCFBR 대립유전자 lysC T311I (서열 10에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 311에서 쓰레오닌이 이소류신으로 대체됨)이 매우 특히 바람직하다.
균주 DSM 16833 (WO 06/063660)은 아미노산 치환 T311I를 포함하는 아스파테이트 키나제 단백질을 코딩하는 lysCFBR 대립유전자를 갖는다.
균주 NRRL B-11474 (US 4,275,157)는 아미노산 치환 A279T 및 S381F를 포함하는 아스파테이트 키나제 단백질을 코딩하는 lysCFBR 대립유전자를 갖는다.
상기 기재된 방식으로, 균주 ATCC 16833으로부터 출발하여, L-류신이 아미노산 서열의 위치 38에 존재하는 폴리펩티드를 코딩하는 rel 대립유전자를 보유하는 DM1915로 지칭된 돌연변이체가 단리되었다. 돌연변이체 DM1915의 rel 대립유전자의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 5로 기재되고, 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 각각 서열 6 또는 8로 기재된다.
또한, 선행기술로부터 공지된 특성을 보유하는 L-리신-분비 코리네형 박테리아를 사용하는 것도 가능하다.
L-트립토판-생산 코리네형 박테리아는 전형적으로 피드백-내성 또는 탈감작화 안트라닐레이트 신타제를 보유한다. 피드백-내성 안트라닐레이트 신타제 (TrpE) 라는 용어는 트립토판 또는 5-플루오로트립토판에 의한 억제에 대해 야생형에 비해 민감성이 적어도 5 내지 10％, 또는 적어도 10％ 내지 15％, 또는 적어도 10％ 내지 20％ 덜한 안트라닐레이트 신타제 (문헌 [Matsui et al., Journal of Bacteriology 169 (11): 5330 - 5332(1987)]), 또는 비슷한 유사체를 의미한다. 이들 탈감작화 안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자는 또한 trpEFBR 대립유전자로 지칭된다. 이러한 종류의 돌연변이체 및 대립유전자의 예는 예를 들어 US 6180373 및 EP0338474에 기재되어 있다.
L-프롤린-생산 코리네형 박테리아는 특히 아미노산 위치 149 또는 필적하는 위치에 글리신 이외의 단백질성 아미노산, 바람직하게는 L-아스파르트산을 갖는 γ-글루타밀 키나제 (ProB)를 갖는다 (WO06066758).
L-발린-생산 코리네형 박테리아는 전형적으로 "피드백"-내성 또는 탈감작화 아세토락테이트 신타제 (아세토히드록시산 신타제; EC 번호 2.2.1.6)를 갖는다.
"피드백"-내성 아세토락테이트 신타제는 L-발린, L-이소류신 및 L-류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 L-발린에 의한 억제에 대해 야생형에 비해 덜 민감성인 아세토락테이트 신타제를 의미한다.
코리네박테리움의 아세토락테이트 신타제 (IlvB, IlvN)는 ilvB 유전자에 의해 코딩되는 "큰" 서브유닛 및 ilvN 유전자에 의해 코딩되는 "작은" 서브유닛으로 이루어진다 (문헌 [Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175(17), 5595-5603 (1993)]). WO 05/003357 및 문헌 [Elisakova et al., Applied and Environmental Microbiology 71(1):207-13 (2005)]에서는 아세토락테이트 신타제에게 L-발린, L-이소류신 및 L-류신에 대한 내성을 부여하는 IlvN 서브유닛의 변이체에 대해 보고하였다. 한 변이체의 아미노산 서열은 위치 21에 L-이소류신 대신에 L-아스파르트산을 포함하고 (IlvN I21D), 위치 22에 L-이소류신 대신에 L-페닐알라닌을 포함한다 (IlvN I22F). 두번째 변이체의 아미노산 서열은 위치 20에 글리신 대신에 L-아스파르트산을 포함하고 (IlvN G20D), 위치 21에 L-이소류신 대신에 L-아스파르트산을 포함하고 (IlvN I21D), 위치 22에 L-이소류신 대신에 L-페닐알라닌을 포함한다 (IlvN I22F).
L-이소류신-생산 코리네형 박테리아는 전형적으로 "피드백"-내성 또는 탈감작화 쓰레오닌 데히드라타제 (= 쓰레오닌 데아미나제)를 갖는다.
"피드백"-내성 쓰레오닌 데히드라타제는 L-이소류신에 의한 억제에 대해 야생형에 비해 덜 민감성인 쓰레오닌 데히드라타제 (EC 번호 4.3.1.19)를 의미한다. 이 탈감작화 쓰레오닌 데히드라타제를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자는 또한 ilvAFBR 대립유전자로 지칭된다.
서열 17은 NCBI 데이터베이스의 기탁 번호 L01508 및 NC_006958에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 ilvA 유전자의 코딩 영역을 나타내며, 서열 18은 이 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 나타낸다.
US 6,107,063 및 문헌 [Morbach et al., Applied and Environmental Microbiology 61 (12), 4315-4320 (1995)]에 기재된 쓰레오닌 데히드라타제 변이체는 하기 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다:
IlvA M199V (서열 18에 따른 코딩된 쓰레오닌 데히드라타제 단백질의 위치 199에서 L-메티오닌이 L-발린으로 대체됨; US 6,107,063 참조),
IlvA A257G (서열 18에 따른 코딩된 쓰레오닌 데히드라타제 단백질의 위치 257에서 L-알라닌이 L-아르기닌으로 대체됨; US 6,107,063 참조),
IlvA H278R (서열 18에 따른 코딩된 쓰레오닌 데히드라타제 단백질의 위치 278에서 L-히스티딘이 L-아르기닌으로 대체됨; US 6,107,063 참조),
IlvA V323A (서열 18에 따른 코딩된 쓰레오닌 데히드라타제 단백질의 위치 323에서 L-발린이 L-알라닌으로 대체됨; 모바하(Morbach) 등의 문헌 참조),
IlvA L351S (서열 18에 따른 코딩된 쓰레오닌 데히드라타제 단백질의 위치 351에서 L-류신이 L-세린으로 대체됨; US 6,107,063 참조),
IlvA D378G (서열 18에 따른 코딩된 쓰레오닌 데히드라타제 단백질의 위치 378에서 L-아스파르트산이 글리신으로 대체됨; 모바하(Morbach) 등의 문헌 참조)
얻어진 돌연변이체는 사용된 출발 균주 또는 모 균주에 비해 발효 공정에서 목적하는 아미노산의 분비 또는 생산의 증가를 나타낸다.
마찬가지로, 본 발명은 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 아미노산 서열의 위치 38 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에서 L-프롤린(바람직하게는 L-류신으로 치환됨) 이외의 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 돌연변이체로부터 단리될 수 있다.
또한, rel 유전자의 돌연변이 유발을 위한 시험관내 방법을 이용하는 것이 가능한다. 시험관내 방법의 사용은 코리네형 박테리아의 rel 유전자, 바람직하게는 선행 기술에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 유전자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 돌연변이원을 처리하는 것을 포함한다.
단리된 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 단리된 전체 DNA 또는 염색체 DNA이거나, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)의 도움으로 제조된 rel 유전자의 증폭산물일 수 있다. 이러한 앰플리콘은 또한 PCR 생성물로 지칭된다. 폴리머라제 연쇄 반응의 도움으로 DNA 서열을 증폭시키는 지침은 특히 문헌 [Gait: Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984)] 및 [Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)]을 통해 당업자가 확인할 수 있다. 마찬가지로, 돌연변이될 rel 유전자가 벡터, 예를 들어 박테리오파지 또는 플라스미드로 먼저 도입되도록 하는 것이 가능하다.
시험관내 돌연변이 유발에 적합한 방법은 특히 문헌 [Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and OxyRated Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992]에 따라 히드록실아민으로 처리, 돌연변이원 올리고뉴클레오티드의 이용 (문헌 [T. A. Brown: Gentechnologie fuer Einsteiger [Genetic engineering for beginners], Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993] 및 [R. M. Horton: PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis, Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995)]) 및 오류율이 높은 DNA 폴리머라제를 사용한 폴리머라제 연쇄 반응의 이용이다. 이러한 DNA 폴리머라제의 예는 스트라타젠(Stratagene, 미국 캘리포니아주 라호야 소재)의 뮤타자임(Mutazyme) DNA 폴리머라제 (젠모르프(GeneMorph) PCR 돌연변이 유발 키트, No. 600550)이다.
생체내 또는 시험관내 돌연변이 발생에 대한 추가의 지침 및 고찰은 선행 기술에서 확인할 수 있고, 유전학 및 분자생물학 교재, 예를 들어 나이퍼스(Knippers) 교재 ("Molekulare Genetik", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), 위나커(Winnacker) 교재 ("Gene and Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990) 또는 하게만(Hagemann) 교재 ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986)로부터 공지되어 있다.
본 발명은 또한 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고 L-프롤린 이외의 단백질성 아미노산 중 하나가 상기 아미노산 서열의 위치 38에 존재하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
L-류신으로 치환하는 것이 바람직하다. L-글루탐산은 서열 2의 위치 262에 임의로 함유된다.
또한 본 발명은 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 760개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 포함하고 L-프롤린 이외의 단백질성 L-아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-류신이 위치 38에 존재하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또한 본 발명은 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고아미노산 서열의 위치 19 내지 57에서 각각 서열 6 또는 8의 위치 19 내지 57에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 바람직하게는 각각 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 107 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 207 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 407 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 607 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 707 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 707 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 757 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 757 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 758 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 759에 상응하는 아미노산을 포함하며, L-글루탐산은 임의로 위치 262에 존재한다. 코딩된 폴리펩티드의 길이는 매우 특히 바람직하게는 760개의 아미노산을 포함한다.
또한 본 발명은 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 아미노산 서열의 위치 38 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에서 L-프롤린 이외의 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-류신을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하며, 각 프라이머의 뉴클레오티드 서열이 서열 3 또는 서열 7의 위치 1 내지 861, 바람직하게는 위치 1 내지 750 사이의 뉴클레오티드 서열, 및 서열 3 또는 서열 7의 위치 3800 내지 865, 바람직하게는 위치 3800 내지 3031 사이의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이러한 종류의 적합한 프라이머 쌍의 한 예는 서열 19 및 서열 20에 나타나 있다. 바람직한 출발 물질 (템플레이트 DNA)은 코리네형 박테리아의 염색체 DNA, 특히 돌연변이원으로 처리된 것이다. 코리네박테리움 속의 염색체 DNA가 특히 바람직하고, 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 염색체 DNA가 매우 특히 바람직하다.
본 발명은 또한 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 아미노산 서열의 위치 38 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에서 L-프롤린 이외의 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-류신을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하며, 엄격 조건하에 서열 5에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
핵산 또는 폴리뉴클레오티드의 혼성화에 대한 지침은 특히 뵈링거 만하임 게엠베하(Boehringer Mannheim GmbH)의 문헌 ["The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" (Mannheim, Germany, 1993)] 및 리블(Liebl) 등의 문헌 [International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)]을 통해 당업자가 확인할 수 있다. 상기 혼성화는 엄격 조건하에 수행되며, 즉 프로브, 즉 서열 5에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 표적 서열, 즉 상기 프로브로 처리되거나 그로 확인되는 폴리뉴클레오티드가 90％ 이상 동일한 혼성체만이 형성된다. 세척 단계를 비롯한 혼성화의 엄격성은 완충 조성물, 온도 및 염 농도의 변화에 의해 영향을 받거나 그에 의해 결정되는 것으로 알려져 있다. 혼성화 반응은 일반적으로 세척 단계에 비해 비교적 낮은 엄격 조건하에 수행된다 (문헌 [Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996]).
예를 들어 혼성화 반응을 위해 대략 50℃ 내지 68℃의 온도에서 5x SSC 완충액에 상응하는 완충액을 이용할 수 있다. 이 경우, 프로브는 또한 사용된 프로브의 뉴클레오티드 서열과 90％ 미만의 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있다. 이러한 혼성체는 덜 안정하며, 엄격 조건하에 세척함으로써 제거된다. 이는 예를 들어 염 농도를 2x SSC로 낮추고, 적절한 경우 후속적으로 0.5x SSC로 낮추고 (독일 만하임 소재의 뵈링거 만하임의 문헌 ["The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" (1995)]), 온도를 대략 50℃ 내지 68℃, 대략 52℃ 내지 68℃, 대략 54℃ 내지 68℃, 대략 56℃ 내지 68℃, 대략 58℃ 내지 68℃, 대략 60℃ 내지 68℃, 대략 62℃ 내지 68℃, 대략 64℃ 내지 68℃, 대략 66℃ 내지 68℃로 설정함으로써 달성될 수 있다. 대략 64℃ 내지 68℃, 또는 대략 66℃ 내지 68℃의 온도 범위가 바람직하다. 적절한 경우, 염 농도를 0.2x SSC 또는 0.1x SSC에 상응하는 농도로 낮추는 것도 가능하다. SSC 완충액은 적절한 경우 0.1％ 농도의 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)를 포함한다. 혼성화 온도를 50℃에서 68℃로 대략 1℃ 내지 2℃씩 점진적으로 상승시킴으로써, 사용된 프로브의 서열 또는 상보적 서열과 90％ 이상 또는 91％ 이상, 바람직하게는 92％ 이상 또는 93％ 이상 또는 94％ 이상 또는 95％ 이상 또는 96％ 이상, 매우 특히 바람직하게는 97％ 이상 또는 98％ 이상 또는 99％ 이상의 동일하고, 본 발명의 아미노산 치환을 포함하고 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 단리할 수 있다. 이러한 방식으로 수득한 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 혼성화에 대한 추가의 지침은 "키트" 형태로 상업적으로 이용가능하다 (예를 들어, 로체 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics GmbH, 독일 만하임 소재)로부터의 DIG Easy Hyb, 카탈로그 번호 1603558). 이러한 방식으로 수득한 뉴클레오티드 서열은 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 각각 서열 6 또는 서열 8의 아미노산 서열과 90％ 이상, 바람직하게는 92％ 이상 또는 94％ 이상 또는 96％ 이상, 매우 특히 바람직하게는 97％ 이상 또는 98％ 이상 또는 99％ 이상의 동일하고 본 발명의 아미노산 치환을 포함하며 L-글루탐산이 임의로 위치 262에 존재하는 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명은 또한 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 아미노산 서열의 위치 38 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에서 L-프롤린(L-류신으로 치환되는 것이 바람직함) 이외의 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하고 또한 각각 서열 6 또는 서열 8의 아미노산 서열과 90％ 이상, 바람직하게는 92％ 이상 또는 94％ 이상 또는 96％ 이상, 매우 특히 바람직하게는 97％ 이상 또는 98％ 이상 또는 99％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며 L-글루탐산이 임의로 위치 262에 존재하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 아미노산 서열의 위치 38 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에서 L-프롤린(L-류신으로 치환되는 것이 바람직함) 이외의 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하며 또한 서열 5의 뉴클레오티드 서열과 90％ 이상, 바람직하게는 92％ 이상 또는 94％ 이상 또는 96％ 이상, 매우 특히 바람직하게는 97％ 이상 또는 98％ 이상 또는 99％ 이상 동일하고 아데닌이 임의로 위치 785에 존재하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또한, GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 아미노산 서열의 위치 38 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에서 L-프롤린 이외의 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-류신을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하며 Ser-Gly-Asp/Glu-Pro-Tyr-Ile-Thr/Ile-His-Pro-Leu-Ala-Val, Ala-Ala/Gly-Leu-Leu-His-Asp-Thr-Val-Glu-Asp-Thr 및 Thr-Val-Asp-Phe-Ala-Tyr-Ala-Val-His-Thr-Glu-Val-Gly-His-Arg로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 모티프 또는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 바람직하다.
"Asp/Glu", "Thr/Ile" 및 "Ala/Gly"라는 용어는 "Asp 또는 Glu", "Thr 또는 Ile" 및 "Ala 또는 Gly"가 상응하는 위치에 존재함을 의미한다.
본 발명은 또한 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 각각 서열 6 또는 8의 아미노산 서열을 포함하며 L-글루탐산이 임의로 위치 262에 존재하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 코딩된 폴리펩티드는 적절한 경우 하나 이상의 보존적 아미노산 치환(들)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명은 또한 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 각각 서열 6 또는 8의 아미노산 서열을 포함하며 N 또는 C 말단에서 하나 (1) 이상의 아미노산의 연장부를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이 연장부는 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 또는 2개 이하의 아미노산 또는 아미노산 잔기를 포함한다. L-글루탐산은 임의로 각각 서열 6 또는 8의 위치 262에 함유된다.
마지막으로 본 발명은 또한 각각 서열 6 또는 8의 폴리펩티드 변이체로서 L-글루탐산이 임의로 위치 262에 존재하고 하나 이상의 삽입 또는 결실을 포함하는 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 rel 대립유전자에 관한 것이다. 바람직하게는, 이들은 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하의 아미노산 삽입 또는 결실을 포함한다. 바람직하게는, 서열 모티프 Ser-Gly-Asp/Glu-Pro-Tyr-Ile-Thr/Ile-His-Pro-Leu-Ala-Val 및/또는 Ala-Ala/Gly-Leu-Leu-His-Asp-Thr-Val-Glu-Asp-Thr and/or Thr-Pro-Val-Asp-Phe-Ala-Tyr-Ala-Val-His-Thr-Glu-Val-Gly-His-Arg는 이러한 삽입/결실에 의해 방해받지 않는다.
본 발명은 또한 서열 5 또는 서열 7에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하며 아데닌이 임의로 서열 5의 위치 785 또는 서열 7의 위치 1535에 존재하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 마지막으로 돌연변이체 DM1915의 rel 대립유전자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
추가로 본 발명은 본 발명의 rel 대립유전자의 코딩 영역의 일부를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 임의의 경우에서 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 38에서 아미노산 치환을 포함하는 코딩된 영역의 일부를 포함한다.
보다 특히, 서열 2의 위치 19 내지 57에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나 또는 서열 2의 위치 9 내지 107에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나 또는 서열 2의 위치 9 내지 207에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나 또는 서열 2의 위치 9 내지 407에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나 또는 서열 2의 위치 9 내지 607에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나 또는 서열 2의 위치 9 내지 707에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나 또는 서열 2의 위치 2 내지 707에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나 또는 서열 2의 위치 9 내지 757에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나 또는 서열 2의 위치 2 내지 757에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나 또는 서열 2의 위치 2 내지 758에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나 또는 서열 2의 위치 2 내지 759에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하며 L-프롤린 이외의 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-류신이 서열 2의 38에 상응하는 위치에 존재하는 핵산 분자 또는 DNA 단편이 포함된다. L-글루탐산은 서열 2의 위치 262에 임의로 존재한다.
서열 2에 상응하는 위치 19 내지 57의 아미노산 서열(L-프롤린 이외의 단백질성 아미노산의 하나(Xaa)가 아미노산 서열의 38에 상응하는 위치에 존재함)을 하나 이상 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 리딩 프레임의 예가 하기에 기재되어 있다:
Figure 112009029246400-pct00001
마찬가지로, 이는 서열 11로 기재된다. 이 리딩 프레임에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열 12로 기재된다. 서열 12에서 위치 20은 각각 서열 2, 4, 6 또는 8의 위치 38에 상응한다.
각각 서열 6 또는 8의 위치 19 내지 57에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 107에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 207에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 407에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 607에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 707에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 707에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 9 내지 757에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 757에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 758에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열 또는 각각 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 759에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열 (L-글루탐산이 임의로 위치 262에 존재함)을 코딩하는 핵산 분자가 바람직하다.
각각 서열 6 또는 8의 위치 19 내지 57에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 리딩 프레임의 예는 이하에 기재되어 있다:
Figure 112009029246400-pct00002
마찬가지로, 상기 리딩 프레임은 서열 13으로 기재된다. 서열 14는 이 리딩 프레임에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 14에서 위치 20은 각각 서열 2, 4, 6 또는 8의 위치 38에 상응한다.
서열 7의 위치 805 내지 921에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 7의 위치 655 내지 1071에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 7의 위치 355 내지 1371에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 7의 위치 55 내지 2671에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 7의 위치 1 내지 2725에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 아데닌이 임의로 위치 1535에 존재하는 핵산 분자가 매우 특히 바람직하다.
또한, 예를 들어 뉴클레오티드 서열로 서열 11 및 13에 및 코딩된 아미노산 서열의 형태로 서열 12 및 서열 14에 나타낸 바와 같은 본 발명의 리딩 프레임은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 생성시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는 돌연변이는 4％ 이하, 2％ 이하 또는 1％ 이하의 보존적 아미노산 치환을 생성시킨다. 본 발명의 리딩 프레임은 또한 하나 이상의 침묵 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 리딩 프레임은 4％ 이하, 특히 바람직하게는 2％ 이하, 1％ 이하의 침묵 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 미생물의 재조합 균주의 제조에 사용될 수 있으며, 이는 출발 또는 모 균주에 비해 개선된 방식으로 주변 배지로 아미노산을 방출하거나 또는 세포의 내부에 아미노산을 축적시킨다.
코리네형 박테리아의 유전자로 돌연변이를 도입하기 위해 널리 보급된 방법은 대립유전자 치환 방법이며, 이는 또한 "유전자 교체"라고 지칭되기도 한다. 이 방법에서는, 관심 돌연변이를 포함하는 DNA 단편을 코리네형 박테리아의 목적하는 균주로 전달하여, 2회 이상의 재조합 사건 또는 교차 사건에 의해 상기 돌연변이를 목적하는 균주의 염색체로 도입시키거나 또는 관련 균주에서 유전자의 서열을 돌연변이된 서열로 교체한다.
문헌 [Schwarzer and Puehler, Biotechnology 9, 84-87 (1991)]에서는 이 방법을 이용하여 씨. 글루타미쿰의 염색체에 야생형 유전자 대신에 결실을 품고 있는 lysA 대립유전자를 도입하고, 삽입을 품고 있는 lysA 대립유전자를 도입하였다. 문헌 [Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994)]에서는 이 방법을 이용하여 씨. 글루타미쿰의 hom-thrB 오페론에 결실을 도입하였다. 나까가와(Nakagawa) 등의 EP 1108790 및 문헌 [Ohnishi et al., Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 217-223 (2002)]에서는 이 방법을 이용하여 단리된 대립유전자로부터 출발하여 다양한 돌연변이를 씨. 글루타미쿰의 염색체에 도입하였다. 나까가와(Nakagawa) 등은 이 방법을 이용하여 Val59Ala로 지칭되는 돌연변이를 호모세린 데히드로게나제 유전자 (hom)에, Thr311Ile로 지칭되는 돌연변이를 아스파테이트 키나제 유전자 (각각 lysC 및 ask)에, Pro458Ser로 지칭되는 돌연변이를 피루베이트 카르복실라제 유전자 (pyc)에, Ala213Thr로 지칭되는 유전자를 씨. 글루타미쿰 균주의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 유전자 (zwf)에 도입하는데 성공하였다.
본 발명의 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있으며, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 서열 5에 도시된 전체 코딩 영역을 포함하거나, 상기 코딩 영역의 일부, 예를 들어 각각 서열 6 또는 8의 위치 19 내지 57에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하며 서열 11 및 13으로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 서열 11 및 13에 상응하는 코딩 영역의 일부는 길이가 117개 이상의 핵염기이다. 바람직한 서열 7의 일부는 위치 1071 내지 665의 사이의 서열 또는 위치 1371 내지 355 사이의 하나 이상의 서열을 포함하며, 따라서 뉴클레오티드 407 또는 1017개의 길이를 갖는다.
서열 15는 코딩 영역의 일부를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 예를 나타낸다.
상기 방법에서, 관심 돌연변이를 포함하는 DNA 단편은 전형적으로 벡터, 특히 플라스미드에 존재하며, 이는 바람직하게는 상기 돌연변이가 제공된 균주에 의해 단지 제한적으로 복제되거나 전혀 복제되지 않는다. 벡터가 복제될 수 있는 보조 또는 중간 숙주로서 사용되는 것은 일반적으로 에세리키아 속의 박테리아, 바람직하게는 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 종의 박테리아이다.
이러한 종류의 플라스미드 벡터의 예는 문헌 [Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994)]에 기재된 pK*mob 및 pK*mobsacB 벡터, 예를 들어 pK18mobsacB, 및 WO 02/070685 및 WO 03/014362에 기재된 벡터이다. 이들은 에세리키아 콜라이에서는 복제되나, 코리네형 박테리아에서는 그렇지 않다. 특히 적합한 벡터는 조건부로 부정적인 우성 효과를 갖는 유전자, 예를 들어 바실러스(Bacillus)의 sacB 유전자 (레반수크라제 유전자), 또는 에세리키아 콜라이의 galK 유전자 (갈락토스 키나제 유전자)를 포함하는 것이다. (조건부로 부정적인 우성 효과를 갖는 유전자는 특정 조건하에 숙주에게 불리한, 예를 들어 독성이지만, 다른 조건하에서는 그 유전자를 품고 있는 숙주에게 전혀 부정적인 작용을 갖지 않는 유전자를 의미한다.) 이는 벡터가 염색체로부터 제거되는 재조합 사건을 위해 선택하는 것을 가능하게 한다. 또한, 나까무라(Nakamura) 등의 US-A-6,303,383에서는 31℃ 미만에서만 복제할 수 있는 코리네형 박테리아를 위한 온도-민감성 플라스미드를 기재하였다.
그 후, 벡터는 접합에 의해, 예를 들어 문헌 [Schaefer et al., Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)]에 기재된 방법에 의해, 또는 형질변형에 의해, 예를 들어 문헌 [Dunican and Shivnan, Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)]에 기재된 방법, 또는 문헌 [Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)]에 기재된 방법에 의해 코리네형 박테리아로 전달된다. 적절한 경우 DNA는 또한 입자 충격에 의해 전달될 수 있다.
돌연변이의 도입은 통합을 유발하는 제1 교차 사건, 및 표적 유전자 또는 표적 서열에서 절제를 유발하는 적합한 제2 교차 사건에 의한 상동성 재조합 후에 달성됨으로써 재조합 박테리아를 생성시킨다.
생성된 균주는 특히 써던 블롯팅 혼성화, 폴리머라제 연쇄 반응, 서열 결정, 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 방법 (문헌 [Lay et al. Clinical Chemistry 43, 2262-2267 (1997)]) 또는 효소학적 방법을 이용해서 확인 및 특성화할 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로
a) 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 코리네형 박테리아로 전달하는 단계,
b) 코리네형 박테리아의 염색체에 존재하고 아미노산 서열의 위치 38 또는 필적하는 위치에 L-프롤린을 가진 아미노산 서열을 코딩하는 GTP-피로포스페이트 키나제 유전자를, 상기 아미노산 서열의 위치 38 또는 필적하는 위치에서 다른 단백질성 L-아미노산, 바람직하게는 L-류신을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 상기 a)로부터의 폴리뉴클레오티드로 대체하는 단계, 및
c) 상기 단계 a) 및 b)에서 수득한 코리네형 박테리아를 증식시키는 단계를 포함하는 코리네형 박테리아의 제조 방법에 관한 것이다.
이러한 방식으로, 야생형 rel 유전자 대신에 본 발명의 하나(1)의 rel 대립유전자를 포함하는 재조합 코리네형 박테리아가 수득된다.
미생물의 제조를 위한 본 발명의 추가의 방법은
a) GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 미생물에 전달하는 단계,
b) 상기 미생물에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제시키는 단계, 및
c) 상기 단계 a) 및 b)에서 수득한 미생물을 증식시키는 단계
를 포함한다.
이러한 방식으로, 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 38 또는 필적하는 위치에 L-프롤린(L-류신으로 치환하는 것이 바람직함) 이외의 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하는 GTP-피로포스페이트 키나제를 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 적어도 한 (1) 카피 또는 여러 카피로 포함하는 재조합 미생물이 수득된다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 또는 숙수 세포, 바람직하게는 미생물, 특히 바람직하게는 코리네형 박테리아 및 에세리키아 속의 박테리아에 관한 것이다. 마찬가지로, 본 발명은 단리된 폴리뉴클레오티드를 사용하여 제조된 미생물에 관한 것이다. 이러한 미생물 또는 박테리아는 또한 재조합 미생물 또는 재조합 박테리아로 지칭된다. 동일한 방식으로, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 마지막으로, 마찬가지로 본 발명은 이들 벡터를 보유하는 숙주에 관한 것이다.
본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 마찬가지로 이들에 의해 코딩된 폴리펩티드의 과발현을 달성하는데 이용될 수 있다.
일반적으로 과발현은 리보핵산, 단백질 또는 효소의 세포내 농도 또는 활성의 증가를 의미한다. 본 발명의 경우, 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 38에서 L-프롤린(L-류신으로 치환되는 것이 바람직함) 이외의 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하는 GTP-피로포스페이트 키나제를 코딩하는 rel 대립유전자 또는 폴리뉴클레오티드가 과발현된다. 숙주에 대해 내인성인 효소 - "아미노펩티다제" -는 제조된 폴리펩티드로부터 N-말단 아미노산, 특히 N-말단 메티오닌을 절단할 수 있는 것으로 알려져 있다. 유전자 생성물의 농도 또는 활성의 이러한 증가는 예를 들어 상응하는 폴리뉴클레오티드의 카피수를 한 카피 이상 증가시킴으로써 달성될 수 있다.
카피수를 증가시키기 위해 널리 이용되는 방법은 적절한 유전자 또는 대립유전자를 벡터, 바람직하게는 코리네형 박테리아에 의해 복제되는 플라스미드에 도입하는 것을 포함한다. 적합한 플라스미드 벡터의 예는 pZ1 (문헌 [Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554]) 또는 pSELF 벡터 (문헌 [Tauch et al., Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)])이다. 코리네박테리움 글루타미쿰 내의 플라스미드에 대한 검토사항은 문헌 [Tauch et al., Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)]에서 찾을 수 있다.
과발현을 달성하기 위한 다른 통상적인 방법은 염색체 유전자 증폭 방법이다. 이 방법에서는, 추가의 한 카피 이상의 관심 유전자 또는 대립유전자를 코리네형 박테리아의 염색체에 삽입하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 예를 들어 hom-thrB 오페론에 대해 문헌 [Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)]에 기재된 바와 같이, 씨. 글루타미쿰에서는 복제되지 않으며 관심 유전자를 포함하는 플라스미드를 코리네형 박테리아에 전달한다. 교차 사건에 의한 상동성 재조합 이후 생성된 균주는 2 카피 이상의 해당 유전자 또는 대립유전자를 포함한다.
다른 실시양태에서, WO 03/040373 및 US-2003-0219881-A1에 기재된 바와 같이, 2회 이상의 재조합 사건에 의해 한 카피 이상의 관심 유전자를 씨. 글루타미쿰의 염색체 내의 목적하는 부위로 삽입한다. 예를 들어 이러한 방식으로, L-리신-비민감성 아스파테이트 키나제를 코딩하는 한 카피의 lysC 대립유전자를 씨. 글루타미쿰의 gluB 유전자에 도입시켰다.
추가의 실시양태에서, WO 03/014330 및 US-2004-0043458-A1에 기재된 바와 같이, 2회 이상의 재조합 사건에 의해 추가의 한 카피 이상의 관심 유전자를 이미 존재하는 유전자 또는 대립유전자의 천연 유전자좌 바람직하게는 종열(tandem) 정렬로 도입시킨다. 예를 들어 이러한 방식으로, lysCFBR 대립유전자의 종열 중복을 천연 lysC 유전자의 유전자좌에서 달성하였다.
과발현을 달성하는 다른 방법은 적절한 유전자 또는 대립유전자를 프로모터 또는 발현 카세트에 기능적으로 연결 (작동가능하게 연결)하는 것으로 이루어진다. 코리네박테리움 글루타미쿰을 위한 적합한 프로모터의 예는 문헌 [Patek et al., Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003)]에 기재되어 있다. 유사한 방식으로, 문헌 [Vasicova et al., Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)]에 기재된 dapA 프로모터의 변이체, 예를 들어 프로모터 A25를 사용할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 gap 프로모터를 사용하는 것도 가능하다 (EP 06007373). 마지막으로, 문헌 [Amann et al., Gene 69(2), 301-315 (1988)] 및 [Amann and Brosius, Gene 40(2-3), 183-190 (1985)]에 기재되어 있는 널리 공지된 프로모터 T3, T7, SP6, M13, lac, tac 및 trc를 사용할 수 있다. 이러한 프로모터는 재조합 코리네형 박테리아의 rel 대립유전자의 상류, 전형적으로는 출발 코돈으로부터 대략 1 내지 500개 뉴클레오티드 거리에 삽입될 수 있으며, 상기 대립유전자는 천연적으로 위치 38에 존재하는 아미노산 L-프롤린 대신에 다른 단백질성 아미노산을 포함하는 단백질을 코딩한다. 마찬가지로, 이러한 유형의 프로모터는 본 발명의 돌연변이체의 rel 대립유전자의 코딩 역역의 상류에 천연적으로 삽입될 수 있다. 또한, GTP-피로포스페이트 키나제의 본 발명의 변이체를 코딩하는 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 프로모터에 연결하여, 얻어진 발현 단위를 여분의 염색체 복제 플라스미드로 또는 코리네형 박테리아의 염색체로 도입하는 것이 가능하다.
구조 유전자의 상류에 위치하는 리보솜 결합 부위 또는 프로모터 및 조절 영역을 돌연변이시키는 것 또한 가능하다. 마찬가지로 mRNA의 수명을 연장시키는 수단은 발현을 개선시킨다. 마찬가지로 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 효소 활성이 증진된다. 또는, 배지의 조성 및 배양 과정을 변경함으로써 해당 유전자 또는 대립유전자를 과발현시킬 수 있다.
과발현은 일반적으로 해당 단백질의 활성 또는 농도를 출발 미생물 또는 모 균주에서의 단백질 활성 또는 농도를 기준으로 적어도 10％, 25％, 50％, 75％, 100％, 150％, 200％, 300％, 400％ 또는 500％, 최대 1000％ 또는 2000％까지 증가시킨다. 출발 미생물 또는 모 균주는 본 발명의 방법이 수행되는 미생물이다.
단백질의 농도는 1-차원 및 2-차원 단백질을 겔 분별화하고, 후속적으로 상기 겔에서 적절한 평가 소프트웨어를 이용하여 단백질 농도를 광학적으로 확인함으로써 측정할 수 있다. 코리네형 박테리아의 경우에 단백질 겔의 제조 및 상기 단백질의 확인에 통상적인 방법은 문헌 [Hermann et al., Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)]에 기재된 절차이다. 마찬가지로, 단백질 농도는 검출할 단백질에 대해 특이적인 항체를 이용하는 웨스턴 블롯 혼성화를 수행하고 (문헌 [Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]), 후속적으로 농도를 측정하기 위한 적절한 소프트웨어를 사용하여 광학적으로 평가함으로써 측정될 수 있다 (문헌 [Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 38: 2630-2647 (1999)]).
따라서, 본 발명은 본 발명의 GTP-피로포스페이트 키나제를 과발현시키는 방법에 관한 것이다. 과발현을 위한 본 발명의 한 방법은 특히 코딩된 아미노산 서열의 위치 38 또는 상응하는 위치에서 L-프롤린 이외의 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하는 GTP-피로포스페이트 키나제 변이체를 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 카피수를 적어도 한 (1) 카피 또는 여러 카피로 증가시키는 것을 포함한다. 본 발명의 추가의 방법은 상기 폴리뉴클레오티드에 프로모터를 기능적으로 연결시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 그들의 세포 내에서 본 발명의 GTP-피로포스페이트 키나제 변이체의 농도 또는 활성이 증가된 미생물에 관한 것이다.
추가로, L-아미노산의 생산을 증가시키기 위해, 본 발명의 돌연변이체 또는 재조합 균주에서 여러 유전자를 과발현시키는 것이 유리할 수 있다. 일반적으로, 내인성 유전자를 사용하는 것이 바람직하다.
"내인성 유전자" 또는 "내인성 뉴클레오티드 서열"은 한 종의 집단 내에 존재하는 유전자 또는 뉴클레오티드 서열 또는 대립유전자를 의미한다.
따라서, L-리신을 제조하기 위해서는, 하기 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현시키는 것이 가능하다:
* 디히드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 dapA 유전자 (DapA, EC 번호 4.2.1.52), 예를 들어 EP 0 197 335에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 dapA 유전자,
* 디아미노피멜레이트 데카르복실라제를 코딩하는 lysA 유전자 (LysA, EC 번호 4.1.1.20), 예를 들어 US 6,090,597에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 lysA 유전자 ATCC13869,
* 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 zwf 유전자 (Zwf, EC 번호 1.1.1.49), 예를 들어 JP-A-09224661 및 EP-A-1108790에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 zwf 유전자,
* US-2003-0175911-A1에 기재된 바와 같이 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하고, 예를 들어 아미노산 서열의 위치 243의 L-알라닌이 L-쓰레오닌으로 교체되거나, 위치 245의 L-아스파르트산이 L-세린으로 교체된 코리네박테리움 글루타미쿰의 zwf 대립유전자,
* 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 pyc 유전자 (Pyc, EC 번호 6.4.1.1), 예를 들어 DE-A-198 31 609 및 EP 1108790에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 pyc 유전자,
* EP 1 108 790에 기재된 바와 같이 피루베이트 카르복실라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하며, 아미노산 서열의 위치 458의 L-프롤린이 L-세린으로 교체된 코리네박테리움 글루타미쿰의 pyc 대립유전자,
* WO 02/31158, 특히 EP1325135B1에 기재된 바와 같이 피루베이트 카르복실라제 활성을 가진 단백질을 코딩하고, 위치 1의 L-발린이 L-메티오닌으로 교체, 위치 153의 L-글루탐산이 L-아스파르트산으로 교체, 위치 182의 L-알라닌이 L-세린으로 교체, 위치 206의 L-알라닌이 L-세린으로 교체, 위치 227의 L-히스티딘이 L-아르기닌으로 교체, 위치 455의 L-알라닌이 글리신으로 교체, 및 위치 1120의 L-아스파르트산이 L-글루탐산으로 교체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 보유하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 pyc 대립유전자,
* 아스파테이트 키나제를 코딩하는 lysC 유전자 (LysC, EC 번호 2.7.2.4), 예를 들어 EP-A-1108790에서 서열 281로 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 lysC 유전자 (기탁 번호 AX120085 및 120365 또한 참조) 및 WO 01/00843에서 서열 25로 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 lysC 유전자 (기탁 번호 AX063743 참조),
* 피드백-내성 아스파테이트 키나제 변이체를 코딩하는 lysCFBR 대립유전자, 특히 표 1에 따른 것,
* 리신 익스포트 단백질을 코딩하는 lysE 유전자 (LysE), 예를 들어 DE-A-195 48 222에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 lysE 유전자,
* 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 aat 유전자 (Aat, EC 번호 2.6.1.1) (코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 aat 유전자는 예를 들어 문헌 [Kalinowski et al., Journal of Biotechnology 104 (1-3), 5 25 (2003)]에 기재되어 있다. 기탁 번호 NC_006958 또한 참조한다. 상기 문헌에서는 aspB 유전자로 지칭된다. US 6,004,773에서, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 aspC로 지칭된다. 문헌 [Marienhagen et al., Journal of Bacteriology 187 (22), 7693-7646 (2005)]에서는 aat 유전자가 aspT 유전자로 지칭된다.),
* Zwa1 단백질을 코딩하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 zwa1 유전자 (US 6,632,644).
또한, L-리신의 제조를 위해, 적절한 경우 상기 언급한 유전자 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 과발현과 동시에 본 발명의 rel 유전자의 대립유전자를 사용하는 것 이외에도, 하기 군으로부터 선택된 하나 이상의 내인성 유전자를 감쇠 또는 제거하는 것이 유리할 수 있다:
* 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제를 코딩하는 pgi 유전자 (Pgi, EC 번호 5.3.1.9), 예를 들어 US 6,586,214 및 US 6,465,238에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 pgi 유전자,
* 호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 hom 유전자 (Hom, EC 번호 1.1.1.3), 예를 들어 EP-A-0131171에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 hom 유전자,
* 호모세린 키나제를 코딩하는 thrB 유전자 (ThrB, EC 번호 2.7.1.39), 예를 들어 문헌 [Peoples et al., Molecular Microbiology 2 (1988): 63-72]에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 thrB 유전자,
* 포스포프럭토키나제를 코딩하는 pfkB 유전자 (PfkB, EC 번호 2.7.1.56), 예를 들어 WO 01/00844 (서열 57)에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 pfkB 유전자,
* 예를 들어 WO 02/02778에 기재된 말레이트 데히드로게나제를 코딩하는 mdh 유전자 (Mdh, EC 번호 1.1.1.37),
* 예를 들어 US 7,094,106 및 PCT/EP2005/057216에 기재된 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 mqo 유전자 (Mqo, EC 번호 1.1.99.16).
이와 관련하여, 용어 "감쇠"는 예를 들어 약한 프로모터를 이용하거나, 활성이 낮은 상응하는 효소를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 이용하거나, 또는 상응하는 유전자 또는 효소 (단백질)을 불활성화시키고, 적절한 경우, 이들을 조합함으로써, 미생물에서 상응하는 DNA에 의해 코딩되는 하나 이상의 효소 (단백질)의 세포내 활성을 감소 또는 제거하는 것을 기술한다.
감쇠를 달성하는 수단을 이용한 결과, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도는 일반적으로 야생형 단백질의 활성 또는 농도, 또는 출발 미생물에서의 단백질의 활성 또는 농도의 0 내지 75％, 0 내지 50％, 0 내지 25％, 0 내지 10％ 또는 0 내지 5％로 낮아진다.
감쇠를 발생시키는 돌연변이는 하나 (1) 이상의 염기쌍 또는 뉴클레오티드의 전이, 전좌, 삽입 및 결실이다. 돌연변이에 의해 초래되는 아미노산 치환이 효소 활성에 미치는 영향에 따라, 미스센스(missense) 돌연변이 또는 넌센스(nonsense) 돌연변이라고 한다. 미스센스 돌연변이는 단백질에서의 해당 아미노산이 또다른 것으로 대체되도록 하며, 상기 아미노산 대체는 특히 비-보존적 아미노산 치환을 구성한다. 이러한 치환은 단백질의 효율 또는 활성을 손상시키며, 이러한 효율 또는 활성을 0 내지 75％, 0 내지 50％, 0 내지 25％, 0 내지 10％ 또는 0 내지 5％의 값으로 감소시킨다. 넌센스 돌연변이는 유전자의 코딩 영역에서 정지 코돈을 유도하여, 그 결과 번역이 조기에 종결되도록 한다. 유전자에서의 하나 이상의 염기쌍의 삽입 또는 결실은 부정확한 아미노산이 혼입되게 하거나 번역이 조기에 종결되도록 하는, 틀이동 돌연변이를 초래한다. 상기 돌연변이의 결과로 코딩 영역에서 정지 코돈이 생성된다면, 이 코돈은 또한 번역이 조기에 종결되도록 한다. 상기 처치들은 바람직하게는 폴리펩티드의 N 말단을 코딩하는 코딩 영역의 5'-말단부에서 수행된다. 폴리펩티드의 총 길이 (화학적으로 연결된 L-아미노산의 개수로서 측정한 것)를 100％라 하면, 출발 아미노산 L-포르밀메티오닌으로부터 계수하는 경우 이후의 L-아미노산의 80％를 차지하는 아미노산 서열의 부분은 폴리펩티드의 N 말단에 속한다.
이러한 돌연변이를 발생시키는 것에 대한 추가의 지침은 선행기술에 속하며 공지된 문헌들 [Knippers, "Molekulare Genetik (Molecular Genetics)," 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995], 문헌 [Winnacker, "Gene and Klone (Genes and Clones)," VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990] 또는 문헌 [Hagemann, "Allgemeine Genetik (General Genetics)," Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986]에서 찾아볼 수 있다. 추가의 처치가 선행기술로 개시되어 있다.
유전자 발현을 특이적으로 감소시키기 위한 한 방법은 감쇠시킬 유전자를, 계량된 양의 IPTG (이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드)를 첨가함으로써 유도될 수 있는 프로모터, 예를 들어 trc 프로모터 또는 tac 프로모터의 조절하에 두는 것을 포함한다. 본원에서 적합한 벡터의 예는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 클로닝된 유전자를 IPTG-의존성 방식으로 발현시킬 수 있는 에세리키아 콜라이 발현 벡터 pXK99E (WO0226787; 부다페스트 조약에 따라 2001년 7월 31일자로 DSMZ (Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen (German collection of microorganisms and cell cultures); 독일 브라운슈바이크 소재)에 DH5alpha/pXK99E에서의 DSM14440으로서 기탁됨) 또는 pVWEx2 (문헌 [Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Juelich, Juel-3397, ISSN 0994-2952, Juelich, Germany (1997)])이다.
이러한 방법은, 예를 들어 특허 WO0226787에서 벡터 pXK99EdeaD의 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈으로의 통합에 의한 deaD 유전자의 발현 조절에, 또한 문헌 [Simic et al., Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327 (2002)]에서 벡터 pK18mobglyA'의 코리네박테리움 글루타미쿰으로의 통합에 의한 glyA 유전자의 발현 조절에 이용되었다.
유전자 발현을 특이적으로 감소시키는 또다른 방법은, 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 벡터를 표적 세포로 전달하여 비교적 긴 안티센스 RNA를 합성하는 것을 포함하는 안티센스 기술이다. 안티센스 RNA는 특정 mRNA의 상보적 절편에 결합하여 그의 안정성을 감소시키거나 또는 번역가능성을 차단할 수 있다. 당업자라면 문헌 [Srivastava et al., Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10): 4366 - 4371]에서 그 예를 찾아볼 수 있을 것이다.
본 발명의 처치에 의해 얻어지는 단리된 코리네형 박테리아는 발효 공정에서, 처음 이용된 출발 균주 또는 모 균주와 비교하였을 때 증가한 목적 아미노산의 분비 또는 생산을 보인다.
"단리된 박테리아"는 아미노산 서열의 위치 38에서 상기 기재된 아미노산 치환을 포함하며 GTP-피로포스페이트 키나제를 코딩하는 rel 대립유전자를 포함하는, 본 발명에 따라 단리되고 생산된 돌연변이체 및 재조합 박테리아, 특히 코리네형 박테리아인 것으로 이해된다.
단리된 박테리아 또는 그를 이용한 발효 공정의 수확량은 생성물 농도 (부피당 생성물), 생성물 수율 (소비된 탄소 공급원당 생산된 생성물) 및 생성물 생산율 (부피 및 시간당 생산된 생성물)을 포함하는 군으로부터 선택된 파라미터 또는 그외 다른 공정 파라미터 및 이들의 조합 중 하나 이상과 관련하여 출발 균주 또는 모 균주, 또는 그를 이용한 발효 공정을 기준으로 0.5％ 이상, 1％ 이상, 1.5％ 이상 또는 2％ 이상 개선된다.
본 발명의 단리된 코리네형 박테리아는 L-아미노산을 생산하기 위해, 예를 들어 PCT/EP2004/008882에 개시된 바와 같이 연속적으로, 또는 회분식 공정 (회분식 배양)으로 또는 유가식 또는 반복된 유가식 공정으로 불연속적으로 배양시킬 수 있다. 공지된 배양 방법에 대한 전반적인 개요는 문헌 [Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology)(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 문헌 [Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Bioreactors and Peripheral Equipment)(Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)]에서 찾아볼 수 있다.
이용할 배양 배지 또는 발효 배지는 주어진 균주의 요구를 적합하게 만족시켜야 한다. 여러 미생물의 배양 배지에 관한 설명은 미국 세균학회 (American Society for Bacteriology)에서 간행된 편람 [Manual of Methods for General Bacteriology] (미국 워싱턴 D.C., 1981)에 있다. 용어 "배양 배지", "발효 배지" 및 "공급 배지" 또는 "배지"는 상호 교환가능하다.
사용되는 탄소 공급원은 당류 및 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 수크로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 몰라시즈, 사탕무 또는 사탕수수 생성물로부터 유도된 수크로스-함유액, 전분, 전분 가수분해물 및 셀룰로스, 오일 및 지방류, 예를 들어 대두유, 해바라기유, 낙화생유 및 코코넛 지방, 지방산, 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산, 알콜류, 예를 들어 글리세롤, 메탄올 및 에탄올, 및 유기산, 예를 들어 아세트산일 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용가능하다.
사용되는 질소 공급원은 유기 질소-함유 화합물, 예컨대 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 우레아, 또는 무기 화합물, 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄일 수 있다. 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용가능하다.
사용되는 인 공급원은 인산, 인산 2수소 칼륨 또는 인산 수소 2칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염일 수 있다.
배양 배지는 또한 성장에 필요한 염을, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 철과 같은 금속의 클로라이드 또는 술페이트 형태로, 예를 들어 마그네슘 술페이트 또는 철 술페이트의 형태로 포함해야 한다. 마지막으로, 상기 언급한 물질들 이외에 아미노산, 예를 들어 호모세린, 및 비타민, 예를 들어 티아민, 비오틴 또는 판토텐산과 같은 필수 성장 인자가 사용될 수 있다. 또한, 각각의 아미노산의 적합한 전구체를 배양 배지에 첨가할 수 있다.
상기 언급된 물질들을 1회 혼합물 형태로 또는 적합한 방식으로 배양 중에 첨가할 수 있다.
배양물의 pH를 조절하기 위해서, 염기성 화합물, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수, 또는 산성 화합물, 예컨대 인산 또는 황산을 적합한 방식으로 이용한다. pH는 일반적으로 6.0 내지 9.0, 바람직하게는 6.5 내지 8의 값으로 조정된다. 포말 형성을 조절하기 위해서, 소포제, 예를 들어 지방산 폴리글리콜 에스테르를 이용할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해서, 선택적으로 작용하는 적합한 물질, 예를 들어 항생제를 배지에 첨가할 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위해서, 산소 또는 산소-함유 기체 혼합물, 예를 들어 공기를 배양물에 전달한다. 또한 과산화수소가 풍부화된 액체를 사용하는 것도 가능하다. 발효는 적절한 경우 양압(positive pressure), 예를 들어 0.03 내지 0.2 MPa의 압력으로 수행한다. 배양 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 회분식 공정에서, 배양은 목적 아미노산이 최대로 생성될 때까지 계속된다. 이러한 목적은 통상적으로 10시간 내지 160시간 이내에 달성된다. 연속식 공정에서는 보다 장시간의 배양이 가능하다.
적합한 발효 배지가, 특히 US 6,221,636, US 5,840,551, US 5,770,409, US 5,605,818, US 5,275,940, US 4,275,157 및 US 4,224,409에 개시되어 있다.
L-아미노산의 측정 방법은 선행기술에 개시되어 있다. 예를 들어 문헌 [Spackman et al., (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)]에 개시된 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서 닌하이드린 유도체화에 의해, 또는 문헌 [Lindroth et al., (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174)]에 개시된 바와 같이 역상 HPLC에 의해 분석할 수 있다.
따라서 본 발명은
a) GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 가지고 아미노산 서열 위치 38 또는 상응하는 위치에서 L-프롤린이 다른 단백질성 아미노산, 바람직하게는 L-류신으로 대체된 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 단리된 코리네형 박테리아를 적합한 배지에서 발효시키고,
b) L-아미노산이 단리된 코리네형 박테리아의 세포에 또는 발효 브로쓰에 축적되는 것을 포함하는 L-아미노산의 제조 방법에 관한 것이다.
이를 위해, 일반적으로는 영양 배지에 또는 발효 브로쓰에 및/또는 박테리아 세포에 축적된 L-아미노산을 수집하여 고체 또는 액체 생성물을 얻는다.
발효 브로쓰는 미생물이 특정 시간 동안 특정 온도에서 배양되는 발효 배지인 것으로 이해된다. 발효 배지, 및/또는 발효 중에 이용되는 배지는 미생물이 증식하도록 하고 목적 아미노산이 생성되도록 하는 모든 물질 또는 성분을 함유한다.
발효가 완료되면, 이에 따라 생성된 발효 브로쓰는 a) 미생물 세포의 증식 결과로서 생산된 미생물의 바이오매스 (세포 덩어리), b) 발효 중에 생성된 목적 아미노산, c) 발효 중에 생성된 유기 부산물, 및 d) 발효에 의해 소진되지 않은, 이용된 발효 배지 또는 첨가된 물질의 구성성분, 예를 들어 비오틴과 같은 비타민, 호모세린과 같은 아미노산 또는 마그네슘 술페이트와 같은 염을 포함한다.
유기 부산물은 적절한 경우 주어진 목적 L-아미노산 이외에 발효에 이용된 미생물에 의해 생산된 물질을 포함하고, 적절한 경우 분비된다. 이러한 부산물은 목적 아미노산에 비해 30％, 20％ 또는 10％ 미만의 양의 L-아미노산을 포함한다. 상기 부산물은 또한 1 내지 3개의 카르복실기를 갖는 유기산, 예를 들어 아세트산, 락트산, 시트르산, 말산 또는 푸마르산을 포함한다. 마지막으로 상기 부산물은 트레할로스와 같은 당류를 포함한다.
산업적 목적에 적합한 전형적인 발효 브로쓰는 보통 아미노산 함량이 30 g/kg 내지 200 g/kg 또는 40 g/kg 내지 175 g/kg 또는 50 g/kg 내지 150 g/kg이다. 바이오매스 함량 (무수 바이오매스로서)은 일반적으로 20 내지 50 g/kg이다. 일반적으로, (건조 바이오매스로서의) 바이오매스의 함량은 20 내지 50 g/kg이다.
아미노산 L-리신의 경우에는, 본질적으로는 4종의 상이한 생성물 형태가 선행기술에 개시되어 있다.
L-리신-함유 생성물의 한 그룹은 정제된 L-리신의 농축된 알칼리성 수용액을 포함한다 (EP-B-0534865). 예를 들어 US 6,340,486 및 US 6,465,025에 개시된 또다른 그룹은 L-리신-함유 발효 브로쓰의 산성 바이오매스-함유 수성 농축물을 포함한다. 고체 생성물의 가장 잘 공지된 그룹은 전형적으로는 염, 예를 들어 L-리신 모노하이드로클로라이드의 형태인 정제된 또는 순수한 L-리신의 분말 또는 결정질 형태를 포함한다. 고체 생성물 형태의 또다른 그룹은, 예를 들어 EP-B-0533039에 개시되어 있다. L-리신 이외에, 상기 특허에 개시된 생성물 형태는 발효 생산 동안 사용되지만 소진되지는 않은 첨가된 물질 대부분을 함유하고, 적절한 경우, 이용된 미생물의 바이오매스의 > 0％-100％를 포함한다.
아미노산 L-발린, L-이소류신, L-프롤린, L-트립토판 및 L-호모세린의 경우에, 선행기술에서 공지된 생성물 형태는 실질적으로 해당 아미노산을 정제된 형태 또는 순수한 형태 (= 95 중량％ 또는 = 98 중량％)로 함유하는 것들이다.
여러 생성물 형태에 상응하여, L-아미노산-함유 생성물 또는 정제된 L-아미노산을 제조하기 위해 L-아미노산을 발효 브로쓰로부터 수집하거나, 단리하거나 또는 정제하는 매우 다양한 방법들이 공지되어 있다.
상기 방법은 본질적으로, 고체 형태의 순수한 L-아미노산을 제조하는데 사용되는 결정화 방법 및 적절한 경우 활성탄을 사용하는 이온 교환 크로마토그래피법이다. 리신의 경우에는, 상응하는 염기 또는 상응하는 염, 예를 들어 모노하이드로클로라이드 (Lys-HCl) 또는 리신 술페이트 (Lys2-H2SO4)가 이러한 방법으로 얻어진다.
리신과 관련하여, EP-B-0534865에는 발효 브로쓰로부터 염기성 L-리신-함유 수용액을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 상기 문헌에서, 바이오매스는 발효 브로쓰로부터 제거되어 버려진다. 염기, 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화암모늄을 사용하여 pH를 9 내지 11로 조정한다. 농축 및 냉각 후, 무기 구성성분 (무기염)은 결정화에 의해 브로쓰로부터 제거되어 비료로 사용되거나 버려진다.
본 발명에 따른 박테리아를 사용하여 리신을 생산하는 방법의 경우, 이러한 방법을 이용해서 발효 브로쓰의 성분을 함유하는 생성물을 생산한다. 상기 생성물은 특히 동물 사료 첨가제로서 사용된다.
필요에 따라, 바이오매스는, 예를 들어 원심분리, 여과, 경사분리 또는 이들 방법의 조합과 같은 분리 방법에 의해 발효 브로쓰로부터 전체가 또는 부분적으로 제거될 수 있거나, 또는 모든 바이오매스가 발효 브로쓰 내에 남아있을 수 있다. 적절한 경우, 바이오매스 또는 바이오매스-함유 발효 브로쓰를 적합한 공정 단계 동안, 예를 들어 열처리 (가열) 또는 산의 첨가에 의해 불활성화시킨다.
바이오매스의 화학적 성분은, 특히 세포 외막, 예를 들어 펩티도글리칸 및 아라비노갈락탄, 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들어 GTP-피로포스페이트 키나제 폴리펩티드, 지질 및 인지질, 및 핵산 (DNA 및 RNA), 예를 들어 본 발명의 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 불활성화 처치 및/또는 다른 단계 (예를 들어 산성화, 분무 건조, 과립화 등)의 결과로서, 핵산은 전형적으로 특히 길이가 =40-60　bp, >60-80　bp, >80-100　bp, >100-200　bp, >200-300　bp, >300-400　bp, >400-500　bp, >500-750　bp, >750-1000　bp, >1000-1250　bp, >1250-1500　bp, >1500-1750　bp, >1750-2000　bp, >2000-2500　bp, >2500-3000　bp, >3000-4000　bp, >4000-5000　bp인 단편이다.
한 접근법에서, 바이오매스를 완전히 또는 사실상 완전히 제거하여, 제조된 생성물에 바이오매스가 존재하지 않거나 (0％) 또는 30％ 이하, 20％ 이하, 10％ 이하, 5％ 이하, 1％ 이하 또는 0.1％ 이하의 바이오매스가 남아 있도록 한다. 다른 접근법에서, 바이오매스를 제거하지 않거나, 또는 적은 양만을 제거하여, 제조된 생성물에 모든 바이오매스가 남아 있거나 (100％) 또는 70％, 80％, 90％, 95％, 99％ 또는 99.9％ 초과의 바이오매스가 남아 있도록 한다. 따라서, 본 발명의 한 방법에서, 바이오매스를 = 0％ 내지 = 100％의 비율로 제거한다.
마지막으로, 발효 후에 얻어진 발효 브로쓰를, 바이오매스의 완전한 또는 부분적 제거 전에 또는 그 후에, 무기산, 예를 들어 염산, 황산 또는 인산, 또는 유기산, 예를 들어 프로피온산 (GB 1,439,728 또는 EP 1 331 220)을 사용해서 산성 pH로 조정할 수 있다. 발효 브로쓰가 온전한 바이오매스를 함유하는 경우 발효 브로쓰를 산성화하는 것 또한 가능하다 (US 6,340,486 또는 US 6,465,025). 마지막으로, 브로쓰를 또한 나트륨 비술파이트 (NaHSO3, GB 1,439,728) 또는 다른 염, 예를 들어 아황산의 암모늄, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 첨가함으로써 안정화시킬 수 있다.
바이오매스를 제거하는 경우, 발효 브로쓰에 존재할 수 있는 유기 또는 무기 고체를 부분적으로 또는 완전히 제거한다. 발효 브로쓰에 용해된 유기 부산물, 및 발효 배지의 소진되지 않은 용해 성분 (첨가된 물질)은 적어도 부분적으로 (> 0％), 바람직하게는 25％ 이상, 특히 바람직하게는 50％ 이상, 매우 특히 바람직하게는 75％ 이상이 생성물에 남아있다. 적절한 경우, 이들 부산물 및 성분은 또한 생성물에 온전히 남아있거나 (100％), 또는 사실상 온전히, 즉 > 95％ 또는 > 98％로 남아있다. 이러한 의미에서, "발효 브로쓰를 기준으로"라는 어구는 생성물이 발효 브로쓰 성분의 적어도 일부를 포함한다는 것을 의미한다.
이어서, 공지된 방법, 예를 들어 회전식 증발기, 박막 증발기, 강하 경막 증발기를 이용하여, 역삼투에 의해, 또는 나노여과를 이용해서 브로쓰로부터 물을 제거하거나 또는 브로쓰를 증점시키거나 농축시킨다. 이렇게 농축된 발효 브로쓰를 이어서 동결 건조, 분무 건조, 분무 과립화를 이용하거나, 또는 예를 들어 PCT/EP2004/006655에 기재된 바와 같이 순환 유동층에서 다른 방법을 이용해서 유동성 생성물로, 특히 미립자 분말 또는 바람직하게는 굵은 과립으로 후처리할 수 있다. 목적 생성물을 적절한 경우 스크리닝 또는 분진 제거에 의해 생성 과립으로부터 단리시킨다.
발효 브로쓰를 직접, 즉 임의의 선행 농축 없이, 분무 건조 또는 분무 과립화에 의해 건조시키는 것 또한 가능하다.
"유동성"이란 여러 크기의 배출구를 갖는 일련의 유리 배출 용기로부터 방해받지 않는 상태로 배출되는, 즉 5　mm (밀리미터)의 구멍을 갖는 용기로부터 적어도 방해받지 않는 상태로 배출되는 분말을 의미하는 것으로 이해된다 (Klein: Seifen, Oele, Fette, Wachse [Soaps, Oils, Fats and Waxes] 94, 12 (1968)).
"미분된"이란 주로 (> 50％) 입자 크기가 직경 20 내지 200 ㎛인 분말을 의미한다.
"굵은"이란 주로 (> 50％) 입자 크기가 직경 200 내지 2000 ㎛인 생성물을 의미한다.
입자 크기는 레이저 회절 분광법을 이용해서 측정할 수 있다. 상응하는 방법이 문헌 ["Teilchengroeßenmessung in der Laborpraxis (Particle Size Measurement in Laboratory Practice)," R. H. Mueller and R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996)] 또는 문헌 ["Introduction to Particle Technology," M. Rhodes, Wiley & Sons (1998)]에 개시되어 있다.
유동성의 미분된 분말은 이어서 적합한 압착 또는 과립화 방법에 의해 굵고, 쉽게 유동되고, 보관가능하며, 분진이 거의 없는 생성물로 전환될 수 있다.
"분진이 없는"이라는 어구는 생성물이 입자 크기가 직경 100 ㎛ 미만인 것을 단지 적은 비율 (< 5％)로 함유한다는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, "보관가능한"이란 건조하고 냉각된 환경에서 적어도 1년 이상, 바람직하게는 적어도 1.5년 이상, 특히 바람직하게는 2년 이상 동안 주어진 아미노산의 어떠한 유의한 손실도 발생하지 않은 채로 (< 5％) 보관될 수 있는 생성물을 의미한다.
따라서 본 발명은 추가로
a) GTP-피로포스페이트 키나제 활성을 가지고 L-프롤린 이외의 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-류신이 위치 38 또는 필적하는 위치에 존재하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 rel 대립유전자를 포함하는 L-아미노산-분비 코리네형 박테리아를 발효 배지에서 배양 및 발효시키는 단계,
b) 발효시키는 동안 생성된 바이오매스의 0 내지 100 중량％를 제거하는 단계, 및
c) 상기 a) 및/또는 b)에 따라 얻어진 발효 브로쓰를 건조시켜 목적하는 분말 형태 또는 과립 형태의 생성물을 얻는 단계
를 특징으로 하며, 여기서 적절한 경우 황산, 인산 또는 염산의 군으로부터 선택된 산을 b) 또는 c) 단계 이전에 첨가하는 것인, L-아미노산, 바람직하게는 L-리신 또는 L-트립토판 함유 생성물, 바람직하게는 동물 사료 첨가제를 발효 브로쓰로부터 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 a) 또는 b) 단계 이후에 L-아미노산-함유 발효 브로쓰로부터 물을 제거한다 (농축).
추가로 본 발명은 DE 102006016158에 요약된 리신 술페이트-함유 생성물의 제조 방법에 관한 것이며, 이 방법은 본 발명의 미생물을 사용하여 얻어지며 바이오매스가 임의로는 완전히 또는 부분적으로 제거된 발효 브로쓰를 적어도 하기 단계들을 포함하는 공정을 수행함으로써 처리하는 것을 포함한다:
a) 황산을 첨가함으로써 pH를 4.0 내지 5.2, 특히 4.9 내지 5.1로 낮추고, 적절한 경우, 다른 또는 여러 종의 술페이트-함유 화합물(들)을 첨가함으로써 브로쓰에서 0.85 내지 1.2, 바람직하게는 0.9 내지 1.0, 특히 바람직하게는 > 0.9 내지 < 0.95의 술페이트/L-리신 몰비를 확립하는 단계,
b) 이러한 방식으로 얻어진 혼합물을 물을 제거함으로써 농축시키고 적절한 경우 과립화하는 단계.
적절한 경우, 단계 a) 이전에 하기 조치들 중 어느 하나 또는 둘 다를 수행한다:
c) 술페이트/L-리신의 몰비를 측정하여 술페이트-함유 화합물(들)의 필요량을 결정하는 단계,
d) 암모늄 술페이트, 암모늄 히드로겐 술페이트 및 황산의 군으로부터 선택된 술페이트-함유 화합물을 적절한 비율로 첨가하는 단계.
또한, 적절한 경우, 단계 b)에 앞서 아황산 염, 바람직하게는 알칼리 금속 히드로겐 술파이트, 특히 바람직하게는 나트륨 히드로겐 술파이트를 발효 브로쓰를 기준으로, 0.01 내지 0.5 중량％, 바람직하게는 0.1 내지 0.3 중량％, 특히 바람직하게는 0.1 내지 0.2 중량％의 농도로 첨가한다.
상기 언급한 단계들에 따른 바람직한 술페이트-함유 화합물로는 특히 암모늄 술페이트 및/또는 암모늄 히드로겐 술페이트 또는 상응하는 암모니아와 황산의 혼합물 및 황산 그 자체가 언급될 수 있다.
술페이트/L-리신의 몰비 V는 방정식: V = 2 x [SO4 2-] / [L-리신]에 따라 계산한다. 상기 방정식은 SO4 2- 음이온이 2가라는 사실을 고려한다. V = 1의 비율은 Lys2(SO4)가 화학량론적 조성을 가짐을 의미하지만, V = 0.9의 비율은 술페이트가 10％ 부족한 것이고 V = 1.1의 비율은 술페이트가 10％ 과잉임을 나타낸다.
과립화 또는 압착과 관련하여, 식품 또는 사료의 가공에서 결합제, 겔화제 또는 증점제로서 통상 사용되는 바와 같은 통상의 유기 또는 무기 보조 물질 또는 담체 물질, 예컨대 전분, 젤라틴, 셀룰로스 유도체 또는 유사 물질을 이용하거나, 또는 다른 물질, 예를 들어 규산, 실리케이트 (EP0743016A) 또는 스테아레이트를 이용하는 것이 유리하다.
생성된 과립의 표면에 WO 04/054381에 개시된 바와 같이 오일을 제공하는 것 또한 유리하다. 사용가능한 오일은 광유, 식물성 오일 또는 식물성 오일의 혼합물이다. 이러한 오일의 예로는 대두유, 올리브유, 대두유/레시틴 혼합물이 있다. 동일한 방식으로, 실리콘유, 폴리에틸렌 글리콜 또는 하이드록시에틸셀룰로스가 또한 적합하다. 표면을 상기 오일로 처리함으로써 생성물의 내마모성 증가 및 분진 함량의 감소를 달성한다. 생성물 내 오일 함량은 사료 첨가제의 총량을 기준으로 0.02 내지 2.0 중량％, 바람직하게는 0.02 내지 1.0 중량％, 매우 특히 바람직하게는 0.2 내지 1.0 중량％이다.
바람직한 생성물은 = 97 중량％의 함량으로 직경 100 내지 1800 ㎛의 입자 크기를 갖거나 또는 = 95 중량％의 함량으로 직경 300 내지 1800 ㎛의 입자 크기를 갖는다. 분진, 즉 입자 크기가 < 100 ㎛인 입자의 함량은 바람직하게는 > 0 내지 1 중량％이고, 특히 바람직하게는 0.5 중량％ 이하이다.
그러나, 별법으로, 생성물은 또한 사료의 가공에서 공지되어 있고 통상적인 유기 또는 무기 담체, 예를 들어 규산, 실리케이트, 제분용 곡식, 겨, 곡분, 전분, 당류 등에 흡수될 수 있고/있거나 통상적인 증점제 또는 결합제와 혼합되어 안정화될 수 있다. 이에 대한 적용 예 및 방법은 문헌 [Die Muehle + Mischfuttertechnik (The Grinding Mill + Mixed Feed Technology) 132 (1995) 49, page 817]에 개시되어 있다.
마지막으로, 생성물은 또한 DE-C-4100920에 개시된 바와 같이 막-형성제, 예를 들어 금속 탄산염, 규산, 실리케이트, 알기네이트, 스테아레이트, 전분, 고무 및 셀룰로스 에테르를 이용한 코팅 공정에 의해 동물의 위, 특히 반추동물의 위에 의한 소화에 안정한 상태가 될 수 있다.
생성물 내의 목적 아미노산 농도를 조정하기 위해서, 필요에 따라 공정 중에 적절한 아미노산을 농축물의 형태로, 또는 적절한 경우 대부분 순수한 물질 또는 그의 염을 액체 또는 고체 형태로 첨가할 수 있다. 이들은 개별적으로 또는 혼합물로서 생성된 발효 브로쓰 또는 농축된 발효 브로쓰에 첨가되거나, 또는 건조 과정 또는 과립화 공정 중에 첨가될 수 있다.
본 발명은 또한 기본적으로 US 20050220933에 요약된 바와 같은 고체 리신-함유 생성물의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기 단계들에서 본 발명의 미생물을 사용하여 얻어진 발효 브로쓰를 처리하는 것을 포함한다:
a) 발효 브로쓰를, 바람직하게는 막 필터로 여과하여 바이오매스-함유 슬러지 및 여과물을 얻는 단계,
b) 여과물을, 바람직하게는 48 내지 52 중량％의 고체 함량을 얻도록 농축시키는 단계,
c) b) 단계에서 얻어진 농축물을, 바람직하게는 50℃ 내지 62℃의 온도에서 과립화하는 단계, 및
d) 상기 c)에서 얻어진 과립을 하나 이상의 코팅제(들)로 코팅하는 단계.
상기 d) 단계에서의 코팅에 사용되는 코팅제는 바람직하게는
d1) a) 단계에서 얻어진 바이오매스,
d2) 바람직하게는 L-리신 하이드로클로라이드 또는 L-리신 술페이트로 이루어진 군으로부터 선택된 L-리신-함유 화합물,
d3) 바람직하게는 전분, 카라기난, 아가, 규산, 실리케이트, 곡물, 겨 및 곡분으로 이루어진 군으로부터 선택된, L-리신 함량이 < 1 중량％, 바람직하게는 < 0.5 중량％인 본질적으로 L-리신을 함유하지 않는 물질, 및
d4) 바람직하게는 오일, 폴리에틸렌 글리콜 및 액체 파라핀으로 이루어진 군으로부터 선택된 발수성 물질
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
리신의 경우에, 리신-함유 생성물의 제조 동안 이온의 비율을 쿠쉬키(Kushiki) 등의 US 20030152633에 개시된 바와 같이, 바람직하게는 하기 방정식에 따른 이온 당량비가 0.68 내지 0.95, 바람직하게는 0.68 내지 0.90의 값을 갖도록 조정한다 (몰농도가 "[]" 안에 주어짐):
2x[SO4 2-] + [Cl-] - [NH4 +] - [Na+] - [K+] - 2x[Mg2+] - 2x[Ca2+] / [L-Lys]
리신의 경우에, 이러한 방식으로 제조된 고체 발효 브로쓰 기재 생성물은 생성물의 건조 중량을 기준으로 (리신 베이스로서의) 리신 함량이 10 중량％ 내지 70 중량％ 또는 20 중량％ 내지 70 중량％, 바람직하게는 30 중량％ 내지 70 중량％, 매우 특히 바람직하게는 40 중량％ 내지 70 중량％이다. 71 중량％, 72 중량％ 또는 73 중량％의 리신 베이스의 최대 함량을 달성하는 것이 또한 가능하다.
전기적으로 중성인 아미노산, 예컨대 L-트립토판의 경우에, 이러한 방식으로 제조된 고체 발효 브로쓰 기재 생성물은 아미노산 함량이 5 중량％, 10 중량％, 20 중량％, 30 중량％ 이상 내지 최대 50 중량％, 60 중량％, 70 중량％, 80 중량％, 90 중량％ 이하 또는 95 중량％ 이하이다.
고체 생성물의 함수량은 5 중량％ 이하, 바람직하게는 4 중량％ 이하, 특히 바람직하게는 3 중량％ 미만이다.
따라서 본 발명은 하기 특징을 갖는 발효 브로쓰 기재의 L-리신-함유 사료 첨가제에 관한 것이다:
a) 10 중량％ 이상 내지 73 중량％ 이하의 (베이스로서의) 리신 함량,
b) 5 중량％ 이하의 함수량, 및
c) 발효 브로쓰 내에 존재하는 바이오매스의 적어도 0.1％에 상응하는 바이오매스 함량 (임의로 불활성화된 바이오매스는 본 발명의 코리네형 박테리아에 의해 형성됨).
따라서 본 발명은 또한 하기 특징을 갖는 발효 브로쓰 기재의 L-트립토판-함유 사료 첨가제에 관한 것이다:
a) 5 중량％ 이상 내지 95 중량％ 이하의 트립토판 함량,
b) 5 중량％ 이하의 함수량, 및
c) 발효 브로쓰 내에 존재하는 바이오매스의 적어도 0.1％에 상응하는 바이오매스 함량 (여기서, 임의로 불활성화된 바이오매스는 본 발명의 코리네형 박테리아에 의해 형성됨).
균주 MH20-22B는 2004년 10월 28일자로 DSMZ (Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen; German Collection of Microorganisms and Cell Cultures](독일 브룬스비크 소재)에 DSM 16833으로서 기탁되었다.
Rel 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 38에 L-류신을 포함하는, 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 돌연변이체 DM1915는 2006년 5월 15일자로 DSMZ에 DSM 18257로서 기탁되었다.
본 발명은 예시적 실시양태를 기초로 하기에서 더욱 상세히 설명된다.
실시예 1
L-리신-생산 균주 DM1797의 돌연변이 유발
코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DM1787을 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG)으로의 돌연변이 유발을 위한 모 균주로서 이용하였다. 균주 DM1797은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 아미노에틸시스테인-내성 돌연변이체이고 수탁번호 DSM16833으로서 DSMZ에 기탁되었다.
균주 DM1797을 100 ml 용량의 원뿔형 플라스크 내의 LB 브로쓰 (머크(Merck), 독일 다름슈타트 소재) 10 ml 중에서, 세르토매트(Certomat) BS-1형 (베. 브라운 바이오테크 인터내쇼날(B. Braun Biotech International), 독일 멜순겐 소재) 회전 진탕기에서 200 rpm으로 33℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 이어서 배양물을 원심분리에 의해 제거하고, 펠릿을 0.9％ NaCl 용액 10 ml에 재현탁시키고, 얻어진 현탁액을 원심분리에 의해 다시 제거하고, 얻어진 펠릿을 0.9％ NaCl 용액 10 ml에 녹였다. 상기 세포 현탁액 5 ml를 400 ㎍/ml의 MNNG로 진탕기 (상기 참조)에서 200 rpm으로 30℃에서 15분 동안 처리하였다. 이어서, 돌연변이유발 혼합물을 원심분리하고 펠릿을 0.9％ NaCl 완충액 (pH = 6.0) 중의 2％ 나트륨 티오술페이트 10 ml에 녹였다. 그 후에, 세포 현탁액을 0.9％ NaCl 용액으로 1:1000, 1:10,000 및 1:100,000의 비율로 희석시키고, 분취물을 뇌 심장 아가 (머크, 독일 다름슈타트 소재)에 플레이팅하였다. 대략 4500개의 돌연변이체가 이러한 방식으로 단리되었다.
실시예 2
균주 DM1797의 돌연변이체의 수확량 검정
실시예 1에서 얻어진 돌연변이체를 리신을 생산하는데 적합한 영양 배지에서 배양시키고 배양 상청액 중의 리신 함량을 측정하였다.
이를 위해, 클론을 우선 뇌 심장 아가 플레이트 (머크, 독일 다름슈타트 소재)에서 24시간 동안 33℃에서 성장시켰다. 상기 아가 플레이트 배양물로 출발하여, 각 경우에서 예비배양물을 접종시켰다 (100 ml 용량의 원뿔형 플라스크 내 배지 10 ml). 예비배양을 위해 사용한 배지는 MM 배지였다. 예비배양물을 진탕기에서 240 rpm으로 33℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이러한 예비배양물을 사용해서 주 배양물을 접종시켜, 주 배양물의 출발 OD (660 nm)가 0.1이 되도록 하였다. MM 배지는 또한 주 배양을 위해서도 사용되었다.
배지 MM
CSL 5 g/l
MOPS 20 g/l
글루코스 (별도로 오토클레이빙함) 50 g/l
염:
(NH4)2SO4 25 g/l
KH2PO4 0.1 g/l
MgSO4 * 7 H2O 1.0 g/l
CaCl2 * 2 H2O 10 mg/l
FeSO4 * 7 H2O 10 mg/l
MnSO4 * H2O 5.0 mg/l
비오틴 (멸균 여과됨) 0.3 mg/l
티아민 * HCl (멸균 여과됨) 0.2 mg/l
CaCO3 25 g/l
CSL (옥수수 침지액), MOPS (모르폴리노프로판술폰산) 및 염 용액을 수성 암모니아로 pH 7로 조정하고 오토클레이빙하였다. 멸균 기질 및 비타민 용액, 및 건조 상태로 오토클레이빙된 CaCO3을 첨가하였다.
배양은 배플을 갖춘 100 ml 용량의 원뿔형 플라스크에서 10 ml의 부피로 실시하였다. 온도는 33℃이고, 회전수는 250 rpm이고, 대기 습도는 80％였다.
24시간 후에, 660 nm의 측정 파장에서 광학 밀도 (OD)를 바이오메크(Biomek) 1000 (베크만 인스트루먼츠 게엠베하(Beckmann Instruments GmbH), 독일 뮌헨 소재)을 사용하여 측정하였다. 제조된 리신의 양을 에펜도르프-바이오트로니크(Eppendorf-BioTronik; 독일 함부르크 소재)사로부터의 아미노산 분석기를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피 및 닌하이드린으로의 검출에 의한 후-컬럼 유도체화에 의해 측정하였다. 리신 제조의 증가에 의해 식별되는 돌연변이체를 DM1915라고 하였다.
균주 OD (660) 리신-HCl (g/l)
DM1797 9.3 2.2
DM1915 9.2 2.4
실시예 3
돌연변이체 DM1915의 rel 대립유전자의 서열화
염색체 DNA를 문헌 [Eikmanns, et al., Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)]의 방법에 의해 클론 DM1915로부터 단리시켰다. 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 rel 유전자 또는 대립유전자를 보유하는 DNA 절편을 증폭시켰다. 씨. 글루타미쿰 rel 유전자의 공지된 서열 (EP1108790로부터의 서열 1824)로 인해, PCR을 위해 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드를 선택하였다:
rel_XL_A1 (서열 19):
5'gcgaattcta tcggatggaa catgaccg 3'
rel_XL_A2 (서열 20):
5' gcgaattcat gcggatgcca acaagatc 3'
상기 나타낸 프라이머는 MWG 바이오테크(Biotech) (독일 에버스베르크 소재)에 의해 합성된 것이고, PCR 반응은 문헌 [Innis et al., PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press]의 표준 PCR 방법에 따라 수행하였다. 상기 프라이머는 길이가 약 1.53 kb이고 rel 유전자 또는 대립유전자를 보유하는 DNA 절편의 증폭을 가능하게 하였다. 또한, 프라이머는 상기 나타낸 뉴클레오티드 서열에서 밑줄로 표시한 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제의 절단 부위에 대한 서열을 갖는다.
길이가 약 1.53 kb이고 균주 DM1915의 rel 대립유전자를 보유하는 증폭된 DNA 단편을 0.8％ 농도의 아가로스 겔에서의 전기영동에 의해 확인하고, 상기 겔로부터 단리시켜, 통상의 방법을 이용해서 정제하였다 (퀴아퀵(QIAquick) 겔 추출 키트, 퀴아젠(Qiagen), 독일 힐덴 소재).
증폭된 DNA 단편 또는 PCR 산물의 뉴클레오티드 서열을 아고바(Agowa; 독일 베를린 소재)에 의한 서열화에 의해 결정하였다. PCR 산물의 서열은 서열 15로 나타낸다. 코딩 영역의 서열은 또한 서열 5로 나타낸다. Patentin 프로그램을 이용하여 생성된 상응하는 GTP-피로포스페이트 키나제 단백질의 아미노산 서열은 서열 6으로 나타낸다.
균주 DM1915의 rel 대립유전자의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 5)의 위치 113에는 염기 티민이 위치한다. 야생형 유전자 (서열 1)의 상응하는 위치에는 염기 시토신이 위치한다.
균주 DM1915의 GTP-피로포스페이트 키나제 단백질의 아미노산 서열 (서열 6)의 위치 38에는 아미노산 류신이 위치한다. 야생형 단백질 (서열 2)의 상응하는 위치에는 아미노산 프롤린이 위치한다.
코딩 영역의 위치 113에 염기 티민을 포함하며, 이에 따라 아미노산 서열의 위치 38에 아미노산 류신을 포함하는 GTP-피로포스페이트 키나제 단백질을 코딩하는 rel 대립유전자를 이하에서는 rel P38L 대립유전자라고 한다. "rel P38L"이라는 명칭에서, P는 L-프롤린이고, L은 L-류신이고, 38은 아미노산 치환부위 위치를 나타낸다 (서열 2 및 6 참조).
Rel 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 38에 L-류신을 보유하는 코리네박테리움 글루타미쿰 돌연변이체 DM1915는 2006년 5월 15일자로 DSMZ (독일 브런즈윅 소재)에 DSM 18257로서 기탁되었다.
실시예 4
균주 DM1797의 rel 야생형 유전자의 rel P38L 대립유전자로의 치환
4.1 대체 벡터 pK18mobsacB_rel_P38L의 구성
길이가 약 1.53 kb이고 rel P38L 대립유전자를 갖고 있으며 PCR에 의해 제조되었고 실시예 3에 기재된 DNA 단편을 문헌 [Schaefer et al. (Gene, 14, 69-73 (1994))]에 개시된 sacB 시스템을 이용하여 치환 돌연변이 유발에 의해 실시예 1에 기재된 씨. 글루타미쿰 균주 DM1797의 염색체로 혼입하였다. 상기 시스템은 상동 재조합에 의해 달성되는 대립유전자 치환을 일으키고 이를 선택할 수 있도록 한다.
이러한 목적을 위해, 크기가 약 1.53 kb인 rel P38L 단편을 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI로 절단하고, 0.8％ 농도의 아가로스 겔에서의 전기영동에 의해 확인한 후에, 겔로부터 단리시켜 통상의 방법을 이용해서 정제하였다 (퀴아퀵 겔 추출 키트, 퀴아젠, 독일 힐덴 소재).
이동성 클로닝 벡터 pK18mobsacB를 EcoRI 제한 효소로 소화시키고, 말단을 알칼리성 포스파타제 (Alkaline Phosphatase, 베링거 만하임(Boehringer Mannheim), 독일 소재)를 이용하여 탈인산화하였다. 이러한 방식으로 제조된 벡터를 대략 1.53 kb의 rel P38L 단편과 혼합하고, 혼합물을 T4-DNA 리가제 (아머샴-파마시아(Amersham-Pharmacia), 독일 프라이부르크 소재)로 처리하였다.
이후, 이. 콜라이 균주 S17-1 (문헌 [Simon et al., Bio/Technology 1: 784-791, 1993])을 라이게이션 혼합물 (문헌 [Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989])로 형질전환시켰다. 형질전환 혼합물을 25 mg/l의 카나마이신이 보충된 LB 아가 (문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989])에 플레이팅함으로써 플라스미드-보유 세포를 선별하였다.
플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 퀴아젠의 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit)를 이용하여 단리시켜 효소 PstI로의 제한 절단 및 후속 아가로스 겔 전기영동으로 시험하였다. 플라스미드를 pK18mobsacB_rel P38L이라고 하고 도 1에 나타냈다.
4.2 대립유전자 치환
실시예 4.1에 언급된 벡터 pK18mobsacB_rel P38L를 문헌 [Schaefer et al. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990))]의 프로토콜에 따라 접합에 의해 씨. 글루타미쿰 균주 DM1797로 전달하였다. 상기 벡터는 DM1797에서 스스로 복제를 할 수 없으며 재조합 사건의 결과로서 염색체로 융합되는 경우에만 세포 내에서 유지된다. 피전달접합체, 즉 통합된 pK18mobsacB_rel P38L를 함유하는 클론은 접합 혼합물을 15 mg/l의 카나마이신 및 50 mg/l의 날리딕스산이 보충된 LB 아가 (문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor, New York, 1989])에 플레이팅함으로써 선별하였다. 카나마이신-내성 피전달접합체를 25 mg/l의 카나마이신이 함유된 LB 아가 플레이트 상으로 도말시키고 33℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 플라스미드가 제2 재조합 사건의 결과로서 절단된 돌연변이체를, LB 액체 배지에서 비선택적으로 클론을 30시간 동안 배양한 후에, 10％ 수크로스가 함유된 LB 아가 상에 도말하고 16시간 동안 인큐베이션함으로써 선별하였다.
플라스미드 pK18mobsacB_rel P38L은, 출발 플라스미드 pK18mobsacB와 마찬가지로, 카나마이신-내성 유전자 이외에 바실루스 수브틸리스(Bacillus subtilis)의 레반 수크라제를 코딩하는 sacB 유전자의 카피를 포함한다. 수크로스-유도성 발현은 씨. 글루타미쿰에 대해 독성인 생성물 레반의 합성을 촉매하는 레반 수크라제의 생성을 초래한다. 따라서, 통합된 pK18mobsacB_rel P38L가 제2 재조합 사건의 결과로서 절단된 클론만이 수크로스가 함유된 LB 아가 상에서 성장한다. 돌연변이 부위에 대한 제2 재조합 사건의 위치에 따라, 절단으로 대립유전자 치환 또는 돌연변이의 도입이 일어나거나, 또는 원래의 카피가 숙주의 염색체에 남아있다.
대략 40 내지 50개의 콜로니를 "수크로스 존재하의 성장" 및 "카나마이신 존재하에 성장 없음"의 표현형에 대해 시험하였다. P38L 돌연변이를 포함하는 rel 유전자의 영역을, "수크로스 존재하의 성장" 및 "카나마이신 존재하에 성장 없음"의 표현형을 갖는 4개의 콜로니에서, 서열화 프라이머 rel-2 (서열 3으로부터의 rel 유전자의 CDS의 상류 서열의 뉴클레오티드 서열 위치 695 내지 714에 상응함)로부터 시작해서 아고바 (독일 베를린 소재)사에 의해 서열화하여 rel P38L 대립유전자의 돌연변이가 염색체에 존재함을 확인하였다. 이를 위해, 사용된 프라이머 rel-2는 아고바에 의해 합성된 것이다:
rel-2:
5' ccg tca ttg tgg tca gag at 3'
이러한 방식으로, rel 유전자의 코딩 영역의 위치 113에 염기 티민을 포함하며 따라서 rel P38L 대립유전자를 갖는 클론을 확인하였다. 이 클론을 DM1797rel P38L 균주라 한다.
실시예 6
DM1797rel P38L 균주의 수확량의 DM1797 모 균주의 수확량과의 비교
실시예 5에서 얻어진 씨. 글루타미쿰 DM1797rel P38L 균주의 수확량 검정을 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 시험 결과를 표 2에 나타냈다.
균주 OD (660 nm) 리신 HCl (g/l)
DM1797 9.3 2.2
DM1797rel P38L 9.2 2.5
<도면의 간단한 설명>
도 1: 플라스미드 pK18mobsacB_rel P38L 맵.
사용된 약어 및 명칭은 하기 의미를 갖는다. 주어진 염기쌍 개수는 측정의 재현성 범위 내에서 얻어지는 근사치이다.
Kan: 카나마이신-내성 유전자
EcoRI: EcoRI 제한 효소의 절단 부위
PstI: PstI 제한 효소의 절단 부위
rel: rel P38L 대립유전자
sacB: sacB 유전자
RP4-mob: 전달을 위한 복제 시작점 (oriT)을 갖는 mob 영역
oriV: 복제 시작점 V
SEQUENCE LISTING <110> Evonik Degussa GmbH <120> Allele des rel-Gens aus coryneformen Bakterien <130> 200600725 <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2283 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(2280) <223> rel-Wildtyp-Gen <220> <221> misc_feature <222> (785)..(785) <223> Guanin <400> 1 atg agt ctg gag cgc aac aca caa aaa tct tcc atg ggt gtg cga agc 48 Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser 1 5 10 15 atg tca gcc agg ctt gcc cgc agc ctc aca gga aac cgc gtt cgc acc 96 Met Ser Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr 20 25 30 aac cct gtg ctg gat ccg ctg ctg agc atc cac cgg caa ttt cac cca 144 Asn Pro Val Leu Asp Pro Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro 35 40 45 cgc gcc gac gta caa gtg ttg gaa cgt gca tat gac acc gcg gaa cgt 192 Arg Ala Asp Val Gln Val Leu Glu Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Glu Arg 50 55 60 ctt cat gat ggt gtg att cga aaa tcg ggc gat ccg tat att acc cac 240 Leu His Asp Gly Val Ile Arg Lys Ser Gly Asp Pro Tyr Ile Thr His 65 70 75 80 ccg ttg gct gtc gcc acc atc gcc gcg gaa atc ggc atg gac acc acc 288 Pro Leu Ala Val Ala Thr Ile Ala Ala Glu Ile Gly Met Asp Thr Thr 85 90 95 acg ctc gtc gca gcc ttg ttg cat gac acg gtg gaa gac acc gac tac 336 Thr Leu Val Ala Ala Leu Leu His Asp Thr Val Glu Asp Thr Asp Tyr 100 105 110 tct ttg gac gat ctc acc cga gat ttc gga gaa gaa gtt gcc agg ctt 384 Ser Leu Asp Asp Leu Thr Arg Asp Phe Gly Glu Glu Val Ala Arg Leu 115 120 125 gtc gac ggt gtc acc aag ctc gac aaa gtc gca cta ggt gct gcc gcg 432 Val Asp Gly Val Thr Lys Leu Asp Lys Val Ala Leu Gly Ala Ala Ala 130 135 140 gag gcc gaa acg att cgc aaa atg atc gtc gcc atg agc cag gac ccc 480 Glu Ala Glu Thr Ile Arg Lys Met Ile Val Ala Met Ser Gln Asp Pro 145 150 155 160 cgc gtg ctg gtg att aaa gtg gcc gac cgt ttg cac aat atg cgc acc 528 Arg Val Leu Val Ile Lys Val Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr 165 170 175 atg cgg ttc ctg ccg ccg gaa aag caa gct aaa aaa gca cgc caa acc 576 Met Arg Phe Leu Pro Pro Glu Lys Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr 180 185 190 ctt gaa gtg att gct cct ttg gca cac cgc ctg ggc atg gcc agc gtg 624 Leu Glu Val Ile Ala Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Met Ala Ser Val 195 200 205 aaa tgg gaa ttg gaa gat cta tcc ttt gcc att ttg tac ccc aag aag 672 Lys Trp Glu Leu Glu Asp Leu Ser Phe Ala Ile Leu Tyr Pro Lys Lys 210 215 220 tac gaa gag atc gtg cgt ctt gtt gcc gac cgc gcg ccc tct aga gac 720 Tyr Glu Glu Ile Val Arg Leu Val Ala Asp Arg Ala Pro Ser Arg Asp 225 230 235 240 cgg tac ctc aaa gaa att att gat caa gtc acc ggt ggc ttg cgc gaa 768 Arg Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gln Val Thr Gly Gly Leu Arg Glu 245 250 255 aac aac atc gcg gca gga gtg ctt ggt cga cca aag cac tac tgg tct 816 Asn Asn Ile Ala Ala Gly Val Leu Gly Arg Pro Lys His Tyr Trp Ser 260 265 270 atc tat caa aag atg atc gtt cgc ggt cgt gat ttt gac gat att ttt 864 Ile Tyr Gln Lys Met Ile Val Arg Gly Arg Asp Phe Asp Asp Ile Phe 275 280 285 gat ctt gtt ggc atc cgc atc ctg gta gac aac gtg aac aac tgt tac 912 Asp Leu Val Gly Ile Arg Ile Leu Val Asp Asn Val Asn Asn Cys Tyr 290 295 300 gcc gcc atc ggt gtc gtg cac tcc ctg ttc aat gct ctg cct ggc cga 960 Ala Ala Ile Gly Val Val His Ser Leu Phe Asn Ala Leu Pro Gly Arg 305 310 315 320 ttc aaa gac tat att tca gcc ccg cgc ttc ggt gtc tac caa tcc ctg 1008 Phe Lys Asp Tyr Ile Ser Ala Pro Arg Phe Gly Val Tyr Gln Ser Leu 325 330 335 cac acc acc gtg atg gga cct ggc ggt aag cct ctg gaa gtt cag gca 1056 His Thr Thr Val Met Gly Pro Gly Gly Lys Pro Leu Glu Val Gln Ala 340 345 350 cgt acc cac gac atg cac tac aac gcc gaa ttc ggc att gca gcg cac 1104 Arg Thr His Asp Met His Tyr Asn Ala Glu Phe Gly Ile Ala Ala His 355 360 365 tgg cga tac aaa gaa acc aaa ggc agc cac agt ggc gag caa gcc gaa 1152 Trp Arg Tyr Lys Glu Thr Lys Gly Ser His Ser Gly Glu Gln Ala Glu 370 375 380 gtg gat caa atg gcg tgg atg cgc caa ctt ctg gac tgg caa aaa gaa 1200 Val Asp Gln Met Ala Trp Met Arg Gln Leu Leu Asp Trp Gln Lys Glu 385 390 395 400 gca gcc gac ccc aac gag ttc ctg gac agc ctg cgc tac gat ctg act 1248 Ala Ala Asp Pro Asn Glu Phe Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Asp Leu Thr 405 410 415 tcc aag cag atc ttc gtg ttc aca ccc aaa ggt gat gtg gtc aac ctg 1296 Ser Lys Gln Ile Phe Val Phe Thr Pro Lys Gly Asp Val Val Asn Leu 420 425 430 ccg gtg aac tcc acc ccg gtg gac ttc gcc tac gcg gtg cac acc gaa 1344 Pro Val Asn Ser Thr Pro Val Asp Phe Ala Tyr Ala Val His Thr Glu 435 440 445 gtg ggg cac cgc tgc atc ggc gcc aaa atc aac ggc aaa ctg gtc gct 1392 Val Gly His Arg Cys Ile Gly Ala Lys Ile Asn Gly Lys Leu Val Ala 450 455 460 ttg gaa acg aaa ctc aaa tcc ggc gat cgt gtt gaa gtc ttt acc tcc 1440 Leu Glu Thr Lys Leu Lys Ser Gly Asp Arg Val Glu Val Phe Thr Ser 465 470 475 480 aag gac caa aac gct ggc cca agt agg gga tgg caa gaa ttt gtt gtc 1488 Lys Asp Gln Asn Ala Gly Pro Ser Arg Gly Trp Gln Glu Phe Val Val 485 490 495 tca cct cgt gca aag gcc aag att cgc cag tgg ttt gcc aag gaa cga 1536 Ser Pro Arg Ala Lys Ala Lys Ile Arg Gln Trp Phe Ala Lys Glu Arg 500 505 510 cgc gaa gaa tac cta gaa gcc gga cgc gat gcg ctg gca gca gtt att 1584 Arg Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Gly Arg Asp Ala Leu Ala Ala Val Ile 515 520 525 cag cgt ggc ggc ctg cca atg cac cgc ttg ttc acc gcg tcc tcc atg 1632 Gln Arg Gly Gly Leu Pro Met His Arg Leu Phe Thr Ala Ser Ser Met 530 535 540 aag acg gtg gca aca gag ctg cac tac cca gat gta gat gcg ctc tac 1680 Lys Thr Val Ala Thr Glu Leu His Tyr Pro Asp Val Asp Ala Leu Tyr 545 550 555 560 aca gcc atc ggc tcc ggt tct gta tct gcg caa cac gta gtc aac cgt 1728 Thr Ala Ile Gly Ser Gly Ser Val Ser Ala Gln His Val Val Asn Arg 565 570 575 ctc atg gct atc ttt ggt gac gaa gaa gat gcc gaa gac gca ttg gtt 1776 Leu Met Ala Ile Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala Glu Asp Ala Leu Val 580 585 590 gca cgc acc cca ttc agc gag ctg gtc aac tcc cgt gcc acc acg gaa 1824 Ala Arg Thr Pro Phe Ser Glu Leu Val Asn Ser Arg Ala Thr Thr Glu 595 600 605 agc agc acc ggc atc ctg gtc gaa ggc agc cca gat gtc atg gct aag 1872 Ser Ser Thr Gly Ile Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Val Met Ala Lys 610 615 620 ctc gct aaa tgc tgt atg 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ttg gga tcc ctg atg aca cag ctg cgc aat gcc gaa gga gtg ttt gat 2256 Leu Gly Ser Leu Met Thr Gln Leu Arg Asn Ala Glu Gly Val Phe Asp 740 745 750 gtc tac cga gtg acc tcg ggt ggc tag 2283 Val Tyr Arg Val Thr Ser Gly Gly 755 760 <210> 2 <211> 760 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser 1 5 10 15 Met Ser Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr 20 25 30 Asn Pro Val Leu Asp Pro Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro 35 40 45 Arg Ala Asp Val Gln Val Leu Glu Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Glu Arg 50 55 60 Leu His Asp Gly Val Ile Arg Lys Ser Gly Asp Pro Tyr Ile Thr His 65 70 75 80 Pro Leu Ala Val Ala Thr Ile Ala Ala Glu Ile Gly Met Asp Thr Thr 85 90 95 Thr Leu Val Ala Ala Leu Leu His Asp Thr Val Glu Asp Thr Asp Tyr 100 105 110 Ser Leu Asp Asp Leu Thr Arg Asp Phe Gly Glu Glu Val Ala Arg Leu 115 120 125 Val Asp Gly Val Thr Lys Leu Asp Lys Val Ala Leu Gly Ala Ala Ala 130 135 140 Glu Ala Glu Thr Ile Arg Lys Met Ile Val Ala Met Ser Gln Asp Pro 145 150 155 160 Arg Val Leu Val Ile Lys Val Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr 165 170 175 Met Arg Phe Leu Pro Pro Glu Lys Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr 180 185 190 Leu Glu Val Ile Ala Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Met Ala Ser Val 195 200 205 Lys Trp Glu Leu Glu Asp Leu Ser Phe Ala Ile Leu Tyr Pro Lys Lys 210 215 220 Tyr Glu Glu Ile Val Arg Leu Val Ala Asp Arg Ala Pro Ser Arg Asp 225 230 235 240 Arg Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gln Val Thr Gly Gly Leu Arg Glu 245 250 255 Asn Asn Ile Ala Ala Gly Val Leu Gly Arg Pro Lys His Tyr Trp Ser 260 265 270 Ile Tyr Gln Lys Met Ile Val Arg Gly Arg Asp Phe Asp Asp Ile Phe 275 280 285 Asp Leu Val Gly Ile Arg Ile Leu Val Asp Asn Val Asn Asn Cys Tyr 290 295 300 Ala Ala Ile Gly Val Val His Ser Leu Phe Asn Ala Leu Pro Gly Arg 305 310 315 320 Phe Lys Asp Tyr Ile Ser Ala Pro Arg Phe Gly Val Tyr Gln Ser Leu 325 330 335 His Thr Thr Val Met Gly Pro Gly Gly Lys Pro Leu Glu Val Gln Ala 340 345 350 Arg Thr His Asp Met His Tyr Asn Ala 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acc tcc 1440 Leu Glu Thr Lys Leu Lys Ser Gly Asp Arg Val Glu Val Phe Thr Ser 465 470 475 480 aag gac caa aac gct ggc cca agt agg gga tgg caa gaa ttt gtt gtc 1488 Lys Asp Gln Asn Ala Gly Pro Ser Arg Gly Trp Gln Glu Phe Val Val 485 490 495 tca cct cgt gca aag gcc aag att cgc cag tgg ttt gcc aag gaa cga 1536 Ser Pro Arg Ala Lys Ala Lys Ile Arg Gln Trp Phe Ala Lys Glu Arg 500 505 510 cgc gaa gaa tac cta gaa gcc gga cgc gat gcg ctg gca gca gtt att 1584 Arg Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Gly Arg Asp Ala Leu Ala Ala Val Ile 515 520 525 cag cgt ggc ggc ctg cca atg cac cgc ttg ttc acc gcg tcc tcc atg 1632 Gln Arg Gly Gly Leu Pro Met His Arg Leu Phe Thr Ala Ser Ser Met 530 535 540 aag acg gtg gca aca gag ctg cac tac cca gat gta gat gcg ctc tac 1680 Lys Thr Val Ala Thr Glu Leu His Tyr Pro Asp Val Asp Ala Leu Tyr 545 550 555 560 aca gcc atc ggc tcc ggt tct gta tct gcg caa cac gta gtc aac cgt 1728 Thr Ala Ile Gly Ser Gly Ser Val Ser Ala Gln His Val Val Asn Arg 565 570 575 ctc atg gct atc ttt ggt gac gaa gaa gat gcc gaa gac gca ttg gtt 1776 Leu Met Ala Ile Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala Glu Asp Ala Leu Val 580 585 590 gca cgc acc cca ttc agc gag ctg gtc aac tcc cgt gcc acc acg gaa 1824 Ala Arg Thr Pro Phe Ser Glu Leu Val Asn Ser Arg Ala Thr Thr Glu 595 600 605 agc agc acc ggc atc ctg gtc gaa ggc agc cca gat gtc atg gct aag 1872 Ser Ser Thr Gly Ile Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Val Met Ala Lys 610 615 620 ctc gct aaa tgc tgt atg cca gtg cca gga gat gaa atc ttt gga ttc 1920 Leu Ala Lys Cys Cys Met Pro Val Pro Gly Asp Glu Ile Phe Gly Phe 625 630 635 640 gtc acc cgt ggt ggc ggt gtc tcc gta cac cga aca gac tgc acg aat 1968 Val Thr Arg Gly Gly Gly Val Ser Val His Arg Thr Asp Cys Thr Asn 645 650 655 gtg gaa aag ctc aaa gaa gag cca gaa cgc att gtc tcc gtc tcc tgg 2016 Val Glu Lys Leu Lys Glu Glu Pro Glu Arg Ile Val Ser Val Ser Trp 660 665 670 gct tcg gaa ggt caa ggt tca gta ttc tct gcc aca ctg cag ctt gaa 2064 Ala Ser Glu Gly Gln Gly Ser Val Phe Ser Ala Thr Leu Gln Leu Glu 675 680 685 gca ctt gat cgc gca ggc ctg ctc ttt gag ctc acc cgc gta atc aac 2112 Ala Leu Asp Arg Ala Gly Leu Leu Phe Glu Leu Thr Arg Val Ile Asn 690 695 700 gaa caa aag gtc tcc gtt acc gca atg aac tcc cat tgc tca gaa gac 2160 Glu Gln Lys Val Ser Val Thr Ala Met Asn Ser His Cys Ser Glu Asp 705 710 715 720 cgc gta gcc acc gtg cgc ttc acc ttt gcg gtc tct gac acc aag cag 2208 Arg Val Ala Thr Val Arg Phe Thr Phe Ala Val Ser Asp Thr Lys Gln 725 730 735 ttg gga tcc ctg atg aca cag ctg cgc aat gcc gaa gga gtg ttt gat 2256 Leu Gly Ser Leu Met Thr Gln Leu Arg Asn Ala Glu Gly Val Phe Asp 740 745 750 gtc tac cga gtg acc tcg ggt ggc tag 2283 Val Tyr Arg Val Thr Ser Gly Gly 755 760 <210> 6 <211> 760 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 6 Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser 1 5 10 15 Met Ser Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr 20 25 30 Asn Pro Val Leu Asp Leu Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro 35 40 45 Arg Ala Asp Val Gln Val Leu Glu Arg Ala Tyr Asp Thr Ala 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cac aat atg cgc acc atg cgg ttc ctg ccg ccg gaa aag 1302 Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr Met Arg Phe Leu Pro Pro Glu Lys 170 175 180 caa gct aaa aaa gca cgc caa acc ctt gaa gtg att gct cct ttg gca 1350 Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Val Ile Ala Pro Leu Ala 185 190 195 200 cac cgc ctg ggc atg gcc agc gtg aaa tgg gaa ttg gaa gat cta tcc 1398 His Arg Leu Gly Met Ala Ser Val Lys Trp Glu Leu Glu Asp Leu Ser 205 210 215 ttt gcc att ttg tac ccc aag aag tac gaa gag atc gtg cgt ctt gtt 1446 Phe Ala Ile Leu Tyr Pro Lys Lys Tyr Glu Glu Ile Val Arg Leu Val 220 225 230 gcc gac cgc gcg ccc tct aga gac cgg tac ctc aaa gaa att att gat 1494 Ala Asp Arg Ala Pro Ser Arg Asp Arg Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp 235 240 245 caa gtc acc ggt ggc ttg cgc gaa aac aac atc gcg gca gga gtg ctt 1542 Gln Val Thr Gly Gly Leu Arg Glu Asn Asn Ile Ala Ala Gly Val Leu 250 255 260 ggt cga cca aag cac tac tgg tct atc tat caa aag atg atc gtt cgc 1590 Gly Arg Pro Lys His Tyr Trp Ser Ile Tyr Gln Lys Met Ile Val Arg 265 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gtg cgc ttc acc 2934 Met Asn Ser His Cys Ser Glu Asp Arg Val Ala Thr Val Arg Phe Thr 715 720 725 ttt gcg gtc tct gac acc aag cag ttg gga tcc ctg atg aca cag ctg 2982 Phe Ala Val Ser Asp Thr Lys Gln Leu Gly Ser Leu Met Thr Gln Leu 730 735 740 cgc aat gcc gaa gga gtg ttt gat gtc tac cga gtg acc tcg ggt ggc 3030 Arg Asn Ala Glu Gly Val Phe Asp Val Tyr Arg Val Thr Ser Gly Gly 745 750 755 760 tag aggcctttag attgtgaaaa agccttgggc ttcaaccacc gtgtgttgac 3083 acggttttgg ggttggattt aacgctggaa attttactgc aatgaacgct ggaaagcagt 3143 agcgaaggtc aaaccagcgc tgaggacgcc aacgatgcca gtaataacga cgacgtaatc 3203 caaaatggtg tcagagtcaa tgtcagaaga tccgttggtg ctaccgtttc ttcttctacg 3263 gtgtcagcca cgtacacaac ctgtgctggt gcgacttctt cagcctgtgc aggaacggag 3323 atggaggttg ctgccattgc agcagctgtg ccgagtgcga cgaggggagt acgagaaaat 3383 agcttcattg ctaaacccct taggtttaaa tattcgaata cgaaagttac tttatgtgca 3443 ctttcaccat tgtgcaacta tatgtgcagg tcaaagctga tattttgcta agaaaagtgc 3503 aaagcgattc gagctgacgc gcagcccata tcgtcaaaaa atcctttgtg aatggtgatt 3563 cacaaaggat tagtcgcgta aggcggaaat tacttcagga aggaatccag cttggtactg 3623 aaggttaaaa tggtggttag tgcaccgatg actgctgtga tgatcttgat ccagttttcg 3683 atgttgtcag tgtcggaaga accgctggaa ggctcttcgc tggacgggtc ttcgttgaaa 3743 tcaaagttaa cgtaaacttc tgcttcaacg cctgcttcgt tcttggcaat gatcttt 3800 <210> 8 <211> 760 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 8 Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser 1 5 10 15 Met Ser Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr 20 25 30 Asn Pro Val Leu Asp Leu Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro 35 40 45 Arg Ala Asp Val Gln Val Leu Glu Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Glu Arg 50 55 60 Leu His Asp Gly Val Ile Arg Lys Ser Gly Asp Pro Tyr Ile Thr His 65 70 75 80 Pro Leu Ala Val Ala Thr Ile Ala Ala Glu Ile Gly Met Asp Thr Thr 85 90 95 Thr Leu Val Ala Ala Leu Leu His Asp Thr Val Glu Asp Thr Asp Tyr 100 105 110 Ser Leu Asp Asp Leu Thr Arg Asp Phe Gly Glu Glu Val Ala Arg Leu 115 120 125 Val Asp Gly Val Thr Lys Leu 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aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat 672 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg 720 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc 768 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att 816 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat 864 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa 912 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc 960 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 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Phe Gly Glu Glu Val Ala Arg Leu Val Asp Gly Val Thr Lys 120 125 130 ctc gac aaa gtc gca cta ggt gct gcc gcg gag gcc gaa acg att cgc 1088 Leu Asp Lys Val Ala Leu Gly Ala Ala Ala Glu Ala Glu Thr Ile Arg 135 140 145 150 aaa atg atc gtc gcc atg agc cag gac ccc cgc gtg ctg gtg att aaa 1136 Lys Met Ile Val Ala Met Ser Gln Asp Pro Arg Val Leu Val Ile Lys 155 160 165 gtg gcc gac cgt ttg cac aat atg cgc acc atg cgg ttc ctg ccg ccg 1184 Val Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr Met Arg Phe Leu Pro Pro 170 175 180 gaa aag caa gct aaa aaa gca cgc caa acc ctt gaa gtg att gct cct 1232 Glu Lys Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Val Ile Ala Pro 185 190 195 ttg gca cac cgc ctg ggc atg gcc agc gtg aaa tgg gaa ttg gaa gat 1280 Leu Ala His Arg Leu Gly Met Ala Ser Val Lys Trp Glu Leu Glu Asp 200 205 210 cta tcc ttt gcc att ttg tac ccc aag aag tac gaa gag atc gtg cgt 1328 Leu Ser Phe Ala Ile Leu Tyr Pro Lys Lys Tyr Glu Glu Ile Val Arg 215 220 225 230 ctt gtt gcc gac cgc gcg ccc tct aga gac cgg tac ctc 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290 <210> 17 <211> 1311 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(1308) <223> ilvA-Wildtyp-Gen <400> 17 atg agt gaa aca tac gtg tct gag aaa agt cca gga gtg atg gct agc 48 Met Ser Glu Thr Tyr Val Ser Glu Lys Ser Pro Gly Val Met Ala Ser 1 5 10 15 gga gcg gag ctg att cgt gcc gcc gac att caa acg gcg cag gca cga 96 Gly Ala Glu Leu Ile Arg Ala Ala Asp Ile Gln Thr Ala Gln Ala Arg 20 25 30 att tcc tcc gtc att gca cca act cca ttg cag tat tgc cct cgt ctt 144 Ile Ser Ser Val Ile Ala Pro Thr Pro Leu Gln Tyr Cys Pro Arg Leu 35 40 45 tct gag gaa acc gga gcg gaa atc tac ctt aag cgt gag gat ctg cag 192 Ser Glu Glu Thr Gly Ala Glu Ile Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln 50 55 60 gat gtt cgt tcc tac aag atc cgc ggt gcg ctg aac tct gga gcg cag 240 Asp Val Arg Ser Tyr Lys Ile Arg Gly Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln 65 70 75 80 ctc acc caa gag cag cgc gat gca ggt atc gtt gcc gca tct gca ggt 288 Leu Thr Gln Glu Gln Arg Asp Ala Gly Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly 85 90 95 aac cat gcc cag ggc gtg gcc tat gtg tgc aag tcc ttg ggc gtt cag 336 Asn His Ala Gln Gly Val Ala Tyr Val Cys Lys Ser Leu Gly Val Gln 100 105 110 gga cgc atc tat gtt cct gtg cag act cca aag caa aag cgt gac cgc 384 Gly Arg Ile Tyr Val Pro Val Gln Thr Pro Lys Gln Lys Arg Asp Arg 115 120 125 atc atg gtt cac ggc gga gag ttt gtc tcc ttg gtg gtc act ggc aat 432 Ile Met Val His Gly Gly Glu Phe Val Ser Leu Val Val Thr Gly Asn 130 135 140 aac ttc gac gaa gca tcg gct gca gcg cat gaa gat gca gag cgc acc 480 Asn Phe Asp Glu Ala Ser Ala Ala Ala His Glu Asp Ala Glu Arg Thr 145 150 155 160 ggc gca acg ctg atc gag cct ttc gat gct cgc aac acc gtc atc ggt 528 Gly Ala Thr Leu Ile Glu Pro Phe Asp Ala Arg Asn Thr Val Ile Gly 165 170 175 cag ggc acc gtg gct gct gag atc ttg tcg cag ctg act tcc atg ggc 576 Gln Gly Thr Val Ala Ala Glu Ile Leu Ser Gln Leu Thr Ser Met Gly 180 185 190 aag agt gca gat cac gtg atg gtt cca gtc ggc ggt ggc gga ctt ctt 624 Lys Ser Ala Asp His Val Met Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu Leu 195 200 205 gca ggt gtg gtc agc tac atg gct gat atg gca cct cgc act gcg atc 672 Ala Gly Val Val Ser Tyr Met Ala Asp Met Ala Pro Arg Thr Ala Ile 210 215 220 gtt ggt atc gaa cca gcg gga gca gca tcc atg cag gct gca ttg cac 720 Val Gly Ile Glu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Met Gln Ala Ala Leu His 225 230 235 240 aat ggt gga cca atc act ttg gag act gtt gat ccc ttt gtg gac ggc 768 Asn Gly Gly Pro Ile Thr Leu Glu Thr Val Asp Pro Phe Val Asp Gly 245 250 255 gca gca gtc aaa cgt gtc gga gat ctc aac tac acc atc gtg gag aag 816 Ala Ala Val Lys Arg Val Gly Asp Leu Asn Tyr Thr Ile Val Glu Lys 260 265 270 aac cag ggt cgc gtg cac atg atg agc gcg acc gag ggc gct gtg tgt 864 Asn Gln Gly Arg Val His Met Met Ser Ala Thr Glu Gly Ala Val Cys 275 280 285 act gag atg ctc gat ctt tac caa aac gaa ggc atc atc gcg gag cct 912 Thr Glu Met Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Ile Ile Ala Glu Pro 290 295 300 gct ggc gcg ctg tct atc gct ggg ttg aag gaa atg tcc ttt gca cct 960 Ala Gly Ala Leu Ser Ile Ala Gly Leu Lys Glu Met Ser Phe Ala Pro 305 310 315 320 ggt tct gtc gtg gtg tgc atc atc tct ggt ggc aac aac gat gtg ctg 1008 Gly Ser Val Val Val Cys Ile Ile Ser Gly Gly Asn Asn Asp Val Leu 325 330 335 cgt tat gcg gaa atc gct gag cgc tcc ttg gtg cac cgc ggt ttg aag 1056 Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Val His Arg Gly Leu Lys 340 345 350 cac tac ttc ttg gtg aac ttc ccg caa aag cct ggt cag ttg cgt cac 1104 His Tyr Phe Leu Val Asn Phe Pro Gln Lys Pro Gly Gln Leu Arg His 355 360 365 ttc ctg gaa gat atc ctg gga ccg gat gat gac atc acg ctg ttt gag 1152 Phe Leu Glu Asp Ile Leu Gly Pro Asp Asp Asp Ile Thr Leu Phe Glu 370 375 380 tac ctc aag cgc aac aac cgt gag acc ggt act gcg ttg gtg ggt att 1200 Tyr Leu Lys Arg Asn Asn Arg Glu Thr Gly Thr Ala Leu Val Gly Ile 385 390 395 400 cac ttg agt gaa gca tca gga ttg gat tct ttg ctg gaa cgt atg gag 1248 His Leu Ser Glu Ala Ser Gly Leu Asp Ser Leu Leu Glu Arg Met Glu 405 410 415 gaa tcg gca att gat tcc cgt cgc ctc gag ccg ggc acc cct gag tac 1296 Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Arg Leu Glu Pro Gly Thr Pro Glu Tyr 420 425 430 gaa tac ttg acc taa 1311 Glu Tyr Leu Thr 435 <210> 18 <211> 436 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 18 Met Ser Glu Thr Tyr Val Ser Glu Lys Ser Pro Gly Val Met Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ala Glu Leu Ile Arg Ala Ala Asp Ile Gln Thr Ala Gln Ala Arg 20 25 30 Ile Ser Ser Val Ile Ala Pro Thr Pro Leu Gln Tyr Cys Pro Arg Leu 35 40 45 Ser Glu Glu Thr Gly Ala Glu Ile Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln 50 55 60 Asp Val Arg Ser Tyr Lys Ile Arg Gly Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln 65 70 75 80 Leu Thr Gln Glu Gln Arg Asp Ala Gly Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly 85 90 95 Asn His Ala Gln Gly Val Ala Tyr Val Cys Lys Ser Leu Gly Val Gln 100 105 110 Gly Arg Ile Tyr Val Pro Val Gln Thr Pro Lys Gln Lys Arg Asp Arg 115 120 125 Ile Met Val His Gly Gly Glu Phe Val Ser Leu Val Val Thr Gly Asn 130 135 140 Asn Phe Asp Glu Ala Ser Ala Ala Ala His Glu Asp Ala Glu Arg Thr 145 150 155 160 Gly Ala Thr Leu Ile Glu Pro Phe Asp Ala Arg Asn Thr Val Ile Gly 165 170 175 Gln Gly Thr Val Ala Ala Glu Ile Leu Ser Gln Leu Thr Ser Met Gly 180 185 190 Lys Ser Ala Asp His Val Met Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu Leu 195 200 205 Ala Gly Val Val Ser Tyr Met Ala Asp Met Ala Pro Arg Thr Ala Ile 210 215 220 Val Gly Ile Glu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Met Gln Ala Ala Leu His 225 230 235 240 Asn Gly Gly Pro Ile Thr Leu Glu Thr Val Asp Pro Phe Val Asp Gly 245 250 255 Ala Ala Val Lys Arg Val Gly Asp Leu Asn Tyr Thr Ile Val Glu Lys 260 265 270 Asn Gln Gly Arg Val His Met Met Ser Ala Thr Glu Gly Ala Val Cys 275 280 285 Thr Glu Met Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Ile Ile Ala Glu Pro 290 295 300 Ala Gly Ala Leu Ser Ile Ala Gly Leu Lys Glu Met Ser Phe Ala Pro 305 310 315 320 Gly Ser Val Val Val Cys Ile Ile Ser Gly Gly Asn Asn Asp Val Leu 325 330 335 Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Val His Arg Gly Leu Lys 340 345 350 His Tyr Phe Leu Val Asn Phe Pro Gln Lys Pro Gly Gln Leu Arg His 355 360 365 Phe Leu Glu Asp Ile Leu Gly Pro Asp Asp Asp Ile Thr Leu Phe Glu 370 375 380 Tyr Leu Lys Arg Asn Asn Arg Glu Thr Gly Thr Ala Leu Val Gly Ile 385 390 395 400 His Leu Ser Glu Ala Ser Gly Leu Asp Ser Leu Leu Glu Arg Met Glu 405 410 415 Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Arg Leu Glu Pro Gly Thr Pro Glu Tyr 420 425 430 Glu Tyr Leu Thr 435 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer rel_XL_A1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <220> <221> misc_structure <222> (3)..(8) <223> EcoRI-Restriktionsschnittstelle <400> 19 gcgaattcta tcggatggaa catgaccg 28 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer rel_XL_E1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <220> <221> misc_structure <222> (3)..(8) <223> EcoRI-Restriktionsschnittstelle <400> 20 gcgaattcat gcggatgcca acaagatc 28 <210> 21 <211> 2283 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(2280) <223> rel-Wildtyp-Gen gem癌 EP 1 108 790 <220> <221> misc_feature <222> (785)..(785) <223> Adenin <400> 21 atg agt ctg gag cgc aac aca caa aaa tct tcc atg ggt gtg cga agc 48 Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser 1 5 10 15 atg tca gcc agg ctt gcc cgc agc ctc aca gga aac cgc gtt cgc acc 96 Met Ser Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr 20 25 30 aac cct gtg ctg gat ccg ctg ctg agc atc cac cgg caa ttt cac cca 144 Asn Pro Val Leu Asp Pro Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro 35 40 45 cgc gcc gac gta caa gtg ttg gaa cgt gca tat gac acc gcg gaa cgt 192 Arg Ala Asp Val Gln Val Leu Glu Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Glu Arg 50 55 60 ctt cat gat ggt gtg att cga aaa tcg ggc gat ccg tat att acc cac 240 Leu His Asp Gly Val Ile Arg Lys Ser Gly Asp Pro Tyr Ile Thr His 65 70 75 80 ccg ttg gct gtc gcc acc atc gcc gcg gaa atc ggc atg gac acc acc 288 Pro Leu Ala Val Ala Thr Ile Ala Ala Glu Ile Gly Met Asp Thr Thr 85 90 95 acg ctc gtc gca gcc ttg ttg cat gac acg gtg gaa gac acc gac tac 336 Thr Leu Val Ala Ala Leu Leu His Asp Thr Val Glu Asp Thr Asp Tyr 100 105 110 tct ttg gac gat ctc acc cga gat ttc gga gaa gaa gtt gcc agg ctt 384 Ser Leu Asp Asp Leu Thr Arg Asp Phe Gly Glu Glu Val Ala Arg Leu 115 120 125 gtc gac ggt gtc acc aag ctc gac aaa gtc gca cta ggt gct gcc gcg 432 Val Asp Gly Val Thr Lys Leu Asp Lys Val Ala Leu Gly Ala Ala Ala 130 135 140 gag gcc gaa acg att cgc aaa atg atc gtc gcc atg agc cag gac ccc 480 Glu Ala Glu Thr Ile Arg Lys Met Ile Val Ala Met Ser Gln Asp Pro 145 150 155 160 cgc gtg ctg gtg att aaa gtg gcc gac cgt ttg cac aat atg cgc acc 528 Arg Val Leu Val Ile Lys Val Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr 165 170 175 atg cgg ttc ctg ccg ccg gaa aag caa gct aaa aaa gca cgc caa acc 576 Met Arg Phe Leu Pro Pro Glu Lys Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr 180 185 190 ctt gaa gtg att gct cct ttg gca cac cgc ctg ggc atg gcc agc gtg 624 Leu Glu Val Ile Ala Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Met Ala Ser Val 195 200 205 aaa tgg gaa ttg gaa gat cta tcc ttt gcc att ttg tac ccc aag aag 672 Lys Trp Glu Leu Glu Asp Leu Ser Phe Ala Ile Leu Tyr Pro Lys Lys 210 215 220 tac gaa gag atc gtg cgt ctt gtt gcc gac cgc gcg ccc tct aga gac 720 Tyr Glu Glu Ile Val Arg Leu Val Ala Asp Arg Ala Pro Ser Arg Asp 225 230 235 240 cgg tac ctc aaa gaa att att gat caa gtc acc ggt ggc ttg cgc gaa 768 Arg Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gln Val Thr Gly Gly Leu Arg Glu 245 250 255 aac aac atc gcg gca gaa gtg ctt ggt cga cca aag cac tac tgg tct 816 Asn Asn Ile Ala Ala Glu Val Leu Gly Arg Pro Lys His Tyr Trp Ser 260 265 270 atc tat caa aag atg atc gtt cgc ggt cgt gat ttt gac gat att ttt 864 Ile Tyr Gln Lys Met Ile Val Arg Gly Arg Asp Phe Asp Asp Ile Phe 275 280 285 gat ctt gtt ggc atc cgc atc ctg gta gac aac gtg aac aac tgt tac 912 Asp Leu Val Gly Ile Arg Ile Leu Val Asp Asn Val Asn Asn Cys Tyr 290 295 300 gcc gcc atc ggt gtc gtg cac tcc ctg ttc aat gct ctg cct ggc cga 960 Ala Ala Ile Gly Val Val His Ser Leu Phe Asn Ala Leu Pro Gly Arg 305 310 315 320 ttc aaa gac tat att tca gcc ccg cgc ttc ggt gtc tac caa tcc ctg 1008 Phe Lys Asp Tyr Ile Ser Ala Pro Arg Phe Gly Val Tyr Gln Ser Leu 325 330 335 cac acc acc gtg atg gga cct ggc ggt aag cct ctg gaa gtt cag gca 1056 His Thr Thr Val Met Gly Pro Gly Gly Lys Pro Leu Glu Val Gln Ala 340 345 350 cgt acc cac gac atg cac tac aac gcc gaa ttc ggc att gca gcg cac 1104 Arg Thr His Asp Met His Tyr Asn Ala Glu Phe Gly Ile Ala Ala His 355 360 365 tgg cga tac aaa gaa acc aaa ggc agc cac agt ggc gag caa gcc gaa 1152 Trp Arg Tyr Lys Glu Thr Lys Gly Ser His Ser Gly Glu Gln Ala Glu 370 375 380 gtg gat caa atg gcg tgg atg cgc caa ctt ctg gac tgg caa aaa gaa 1200 Val Asp Gln Met Ala Trp Met Arg Gln Leu Leu Asp Trp Gln Lys Glu 385 390 395 400 gca gcc gac ccc aac gag ttc ctg gac agc ctg cgc tac gat ctg act 1248 Ala Ala Asp Pro Asn Glu Phe Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Asp Leu Thr 405 410 415 tcc aag cag atc ttc gtg ttc aca ccc aaa ggt gat gtg gtc aac ctg 1296 Ser Lys Gln Ile Phe Val Phe Thr Pro Lys Gly Asp Val Val Asn Leu 420 425 430 ccg gtg aac tcc acc ccg gtg gac ttc gcc tac gcg gtg cac acc gaa 1344 Pro Val Asn Ser Thr Pro Val Asp Phe Ala Tyr Ala Val His Thr Glu 435 440 445 gtg ggg cac cgc tgc atc ggc gcc aaa atc aac ggc aaa ctg gtc gct 1392 Val Gly His Arg Cys Ile Gly Ala Lys Ile Asn Gly Lys Leu Val Ala 450 455 460 ttg gaa acg aaa ctc aaa tcc ggc gat cgt gtt gaa gtc ttt acc tcc 1440 Leu Glu Thr Lys Leu Lys Ser Gly Asp Arg Val Glu Val Phe Thr Ser 465 470 475 480 aag gac caa aac gct ggc cca agt agg gga tgg caa gaa ttt gtt gtc 1488 Lys Asp Gln Asn Ala Gly Pro Ser Arg Gly Trp Gln Glu Phe Val Val 485 490 495 tca cct cgt gca aag gcc aag att cgc cag tgg ttt gcc aag gaa cga 1536 Ser Pro Arg Ala Lys Ala Lys Ile Arg Gln Trp Phe Ala Lys Glu Arg 500 505 510 cgc gaa gaa tac cta gaa gcc gga cgc gat gcg ctg gca gca gtt att 1584 Arg Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Gly Arg Asp Ala Leu Ala Ala Val Ile 515 520 525 cag cgt ggc ggc ctg cca atg cac cgc ttg ttc acc gcg tcc tcc atg 1632 Gln Arg Gly Gly Leu Pro Met His Arg Leu Phe Thr Ala Ser Ser Met 530 535 540 aag acg gtg gca aca gag ctg cac tac cca gat gta gat gcg ctc tac 1680 Lys Thr Val Ala Thr Glu Leu His Tyr Pro Asp Val Asp Ala Leu Tyr 545 550 555 560 aca gcc atc ggc tcc ggt tct gta tct gcg caa cac gta gtc aac cgt 1728 Thr Ala Ile Gly Ser Gly Ser Val Ser Ala Gln His Val Val Asn Arg 565 570 575 ctc atg gct atc ttt ggt gac gaa gaa gat gcc gaa gac gca ttg gtt 1776 Leu Met Ala Ile Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala Glu Asp Ala Leu Val 580 585 590 gca cgc acc cca ttc agc gag ctg gtc aac tcc cgt gcc acc acg gaa 1824 Ala Arg Thr Pro Phe Ser Glu Leu Val Asn Ser Arg Ala Thr Thr Glu 595 600 605 agc agc acc ggc atc ctg gtc gaa ggc agc cca gat gtc atg gct aag 1872 Ser Ser Thr Gly Ile Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Val Met Ala Lys 610 615 620 ctc gct aaa tgc tgt atg cca gtg cca gga gat gaa atc ttt gga ttc 1920 Leu Ala Lys Cys Cys Met Pro Val Pro Gly Asp Glu Ile Phe Gly Phe 625 630 635 640 gtc acc cgt ggt ggc ggt gtc tcc gta cac cga aca gac tgc acg aat 1968 Val Thr Arg Gly Gly Gly Val Ser Val His Arg Thr Asp Cys Thr Asn 645 650 655 gtg gaa aag ctc aaa gaa gag cca gaa cgc att gtc tcc gtc tcc tgg 2016 Val Glu Lys Leu Lys Glu Glu Pro Glu Arg Ile Val Ser Val Ser Trp 660 665 670 gct tcg gaa ggt caa ggt tca gta ttc tct gcc aca ctg cag ctt gaa 2064 Ala Ser Glu Gly Gln Gly Ser Val Phe Ser Ala Thr Leu Gln Leu Glu 675 680 685 gca ctt gat cgc gca ggc ctg ctc ttt gag ctc acc cgc gta atc aac 2112 Ala Leu Asp Arg Ala Gly Leu Leu Phe Glu Leu Thr Arg Val Ile Asn 690 695 700 gaa caa aag gtc tcc gtt acc gca atg aac tcc cat tgc tca gaa gac 2160 Glu Gln Lys Val Ser Val Thr Ala Met Asn Ser His Cys Ser Glu Asp 705 710 715 720 cgc gta gcc acc gtg cgc ttc acc ttt gcg gtc tct gac acc aag cag 2208 Arg Val Ala Thr Val Arg Phe Thr Phe Ala Val Ser Asp Thr Lys Gln 725 730 735 ttg gga tcc ctg atg aca cag ctg cgc aat gcc gaa gga gtg ttt gat 2256 Leu Gly Ser Leu Met Thr Gln Leu Arg Asn Ala Glu Gly Val Phe Asp 740 745 750 gtc tac cga gtg acc tcg ggt ggc tag 2283 Val Tyr Arg Val Thr Ser Gly Gly 755 760 <210> 22 <211> 760 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 22 Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser 1 5 10 15 Met Ser Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr 20 25 30 Asn Pro Val Leu Asp Pro Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro 35 40 45 Arg Ala Asp Val Gln Val Leu Glu Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Glu Arg 50 55 60 Leu His Asp Gly Val Ile Arg Lys Ser Gly Asp Pro Tyr Ile Thr His 65 70 75 80 Pro Leu Ala Val Ala Thr Ile Ala Ala Glu Ile Gly Met Asp Thr Thr 85 90 95 Thr Leu Val Ala Ala Leu Leu His Asp Thr Val Glu Asp Thr Asp Tyr 100 105 110 Ser Leu Asp Asp Leu Thr Arg Asp Phe Gly Glu Glu Val Ala Arg Leu 115 120 125 Val Asp Gly Val Thr Lys Leu Asp Lys Val Ala Leu Gly Ala Ala Ala 130 135 140 Glu Ala Glu Thr Ile Arg Lys Met Ile Val Ala Met Ser Gln Asp Pro 145 150 155 160 Arg Val Leu Val Ile Lys Val Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr 165 170 175 Met Arg Phe Leu Pro Pro Glu Lys Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr 180 185 190 Leu Glu Val Ile Ala Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Met Ala Ser Val 195 200 205 Lys Trp Glu Leu Glu Asp Leu Ser Phe Ala Ile Leu Tyr Pro Lys Lys 210 215 220 Tyr Glu Glu Ile Val Arg Leu Val Ala Asp Arg Ala Pro Ser Arg Asp 225 230 235 240 Arg Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gln Val Thr Gly Gly Leu Arg Glu 245 250 255 Asn Asn Ile Ala Ala Glu Val Leu Gly Arg Pro Lys His Tyr Trp Ser 260 265 270 Ile Tyr Gln Lys Met Ile Val Arg Gly Arg Asp Phe Asp Asp Ile Phe 275 280 285 Asp Leu Val Gly Ile Arg Ile Leu Val Asp Asn Val Asn Asn Cys Tyr 290 295 300 Ala Ala Ile Gly Val Val His Ser Leu Phe Asn Ala Leu Pro Gly Arg 305 310 315 320 Phe Lys Asp Tyr Ile Ser Ala Pro Arg Phe Gly Val Tyr Gln Ser Leu 325 330 335 His Thr Thr Val Met Gly Pro Gly Gly Lys Pro Leu Glu Val Gln Ala 340 345 350 Arg Thr His Asp Met His Tyr Asn Ala Glu Phe Gly Ile Ala Ala His 355 360 365 Trp Arg Tyr Lys Glu Thr Lys Gly Ser His Ser Gly Glu Gln Ala Glu 370 375 380 Val Asp Gln Met Ala Trp Met Arg Gln Leu Leu Asp Trp Gln Lys Glu 385 390 395 400 Ala Ala Asp Pro Asn Glu Phe Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Asp Leu Thr 405 410 415 Ser Lys Gln Ile Phe Val Phe Thr Pro Lys Gly Asp Val Val Asn Leu 420 425 430 Pro Val Asn Ser Thr Pro Val Asp Phe Ala Tyr Ala Val His Thr Glu 435 440 445 Val Gly His Arg Cys Ile Gly Ala Lys Ile Asn Gly Lys Leu Val Ala 450 455 460 Leu Glu Thr Lys Leu Lys Ser Gly Asp Arg Val Glu Val Phe Thr Ser 465 470 475 480 Lys Asp Gln Asn Ala Gly Pro Ser Arg Gly Trp Gln Glu Phe Val Val 485 490 495 Ser Pro Arg Ala Lys Ala Lys Ile Arg Gln Trp Phe Ala Lys Glu Arg 500 505 510 Arg Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Gly Arg Asp Ala Leu Ala Ala Val Ile 515 520 525 Gln Arg Gly Gly Leu Pro Met His Arg Leu Phe Thr Ala Ser Ser Met 530 535 540 Lys Thr Val Ala Thr Glu Leu His Tyr Pro Asp Val Asp Ala Leu Tyr 545 550 555 560 Thr Ala Ile Gly Ser Gly Ser Val Ser Ala Gln His Val Val Asn Arg 565 570 575 Leu Met Ala Ile Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala Glu Asp Ala Leu Val 580 585 590 Ala Arg Thr Pro Phe Ser Glu Leu Val Asn Ser Arg Ala Thr Thr Glu 595 600 605 Ser Ser Thr Gly Ile Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Val Met Ala Lys 610 615 620 Leu Ala Lys Cys Cys Met Pro Val Pro Gly Asp Glu Ile Phe Gly Phe 625 630 635 640 Val Thr Arg Gly Gly Gly Val Ser Val His Arg Thr Asp Cys Thr Asn 645 650 655 Val Glu Lys Leu Lys Glu Glu Pro Glu Arg Ile Val Ser Val Ser Trp 660 665 670 Ala Ser Glu Gly Gln Gly Ser Val Phe Ser Ala Thr Leu Gln Leu Glu 675 680 685 Ala Leu Asp Arg Ala Gly Leu Leu Phe Glu Leu Thr Arg Val Ile Asn 690 695 700 Glu Gln Lys Val Ser Val Thr Ala Met Asn Ser His Cys Ser Glu Asp 705 710 715 720 Arg Val Ala Thr Val Arg Phe Thr Phe Ala Val Ser Asp Thr Lys Gln 725 730 735 Leu Gly Ser Leu Met Thr Gln Leu Arg Asn Ala Glu Gly Val Phe Asp 740 745 750 Val Tyr Arg Val Thr Ser Gly Gly 755 760

Claims (63)

  1. GTP-피로포스페이트 키나제 활성을 가지고, 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하고, 상기 코딩된 폴리펩티드가 위치 38에서 L-류신을 포함하는 것인 코리네형(coryneform) 박테리아의 단리된 돌연변이체.
  2. 제1항에 있어서, 코리네형 박테리아가 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) 및 코리네박테리움 아미노게네스(Corynebacterium aminogenes)로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아인 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  3. 제2항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰인 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, L-아미노산-분비 박테리아인 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  5. 제4항에 있어서, L-리신, L-발린, L-이소류신, L-트립토판 또는 L-호모세린 을 분비하는 박테리아인 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 L-류신이 위치 38에 존재하는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하며 L-글루탐산이 위치 262에 존재할 수 있는 것인 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 760개의 L-아미노산에 상응하는 길이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 아미노산 서열의 위치 19로부터 57에 서열 6의 위치 19 내지 57에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열 6의 아미노산 서열을 포함하며 L-글루탐산이 위치 262에 존재할 수 있는 것인 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자가 서열 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 아데닌이 위치 785에 존재할 수 있는 것인 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  11. 제1항에 있어서, 코딩된 단백질이
    a) 서열 6에 따른 아미노산 서열,
    b) 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열 6에 따른 아미노산 서열, 및
    c) 1개 내지 5개의 아미노산의 삽입 또는 결실을 포함하는 서열 6에 따른 아미노산 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며 L-글루탐산이 위치 262에 존재할 수 있는 것인 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  12. 제6항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열이 위치 38에 L-류신을 포함하는 것인 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  13. 제12항에 있어서, 유전자가 서열 5 또는 서열 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 서열 5의 위치 785의 구아닌 또는 서열 7의 위치 1535의 구아닌이 아데닌에 의해 대체될 수 있는 것인 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  14. a) 아미노산을 분비할 수 있는 코리네형 박테리아를 돌연변이유발제로 처리하는 단계,
    b) 상기 a)에서 생성된 돌연변이체를 단리 및 증식시키는 단계,
    c) 상기 b)에서 얻어진 돌연변이체의 핵산을 제공하는 단계,
    d) 서열 3 또는 서열 7의 위치 1 내지 861 사이의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열 3 또는 서열 7의 위치 3800 내지 865 사이의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 상기 c)로부터의 핵산의 폴리머라제 연쇄 반응을 이용해서 핵산 분자를 제조하는 단계,
    e) 상기 d)에서 얻어진 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 및 코딩된 아미노산 서열을 결정하는 단계,
    f) 상기 e)에서 결정된 아미노산 서열을 서열 6과 비교하고, 여기서 L-글루탐산이 위치 262에 존재할 수 있는 것인 단계, 및
    g) 위치 38에서 L-류신을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돌연변이체를 확인하는 단계
    를 특징으로 하는, 코리네형 박테리아의 돌연변이체를 수득하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 단계 b)에 이어서 단계 a)에서 사용된 코리네형 박테리아보다 0.5％ 이상 더 많은 L-아미노산을 배지내로 분비하거나 또는 세포의 내부에 축적할 수 있는 돌연변이체를 선택하는 단계가 수행되는 것인 코리네형 박테리아의 돌연변이체를 수득하는 방법.
  16. 서열 2의 아미노산 서열의 위치 38에서 L-류신을 포함하며 GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  17. 제16항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 추가로 위치 262에 존재하는 L-글루탐산을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  18. 제16항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 760개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  19. 제16항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 아데닌이 위치 785에 존재할 수 있는 서열 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  20. 제16항에 있어서, 코딩된 단백질이
    a) 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열 6에 따른 아미노산 서열, 및
    b) 1개 내지 5개의 아미노산의 삽입 또는 결실을 포함하는 서열 6에 따른 아미노산 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택되며 L-글루탐산이 위치 262에 존재할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  21. 서열 2의 위치 19 내지 57에 상응하는 아미노산 서열을 가지며 L-류신이 서열 2의 위치 38에 상응하는 위치에 존재하는 리딩 프레임(reading frame)을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  22. 제21항에 있어서, 아미노산 서열이 위치 38 이외의 위치에 보존적 아미노산이 치환되는 1개 내지 5개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  23. 제21항에 있어서, 서열 7의 위치 805 내지 921에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  24. a) 제16항, 제17항, 및 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 코리네형 박테리아로 전달하고,
    b) 상기 코리네형 박테리아의 염색체에 존재하며 위치 38에서 L-프롤린을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 GTP-피로포스페이트 키나제 유전자를, 위치 38에서 L-류신을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 a)의 폴리뉴클레오티드로 대체하고,
    c) 단계 a) 및 b)에 의해 얻어진 코리네형 박테리아를 증식시키는 것을 포함하는 재조합 코리네형 박테리아의 제조 방법.
  25. a) 제16항 또는 제17항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 코리네형 박테리아로 전달하고,
    b) 상기 코리네형 박테리아의 염색체에 존재하며 위치 38에서 L-프롤린을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 GTP-피로포스페이트 키나제 유전자를, 위치 38에서 L-류신을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 a)의 폴리뉴클레오티드로 대체하고,
    c) 단계 a) 및 b)에 의해 얻어진 코리네형 박테리아를 증식시키는 것을 포함하는 재조합 코리네형 박테리아의 제조 방법.
  26. a) 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 코리네형 박테리아로 전달하고,
    b) 상기 코리네형 박테리아의 염색체에 존재하며 위치 38에서 L-프롤린을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 GTP-피로포스페이트 키나제 유전자를, 위치 38에서 L-류신을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 a)의 폴리뉴클레오티드로 대체하고,
    c) 단계 a) 및 b)에 의해 얻어진 코리네형 박테리아를 증식시키는 것을 포함하는 재조합 코리네형 박테리아의 제조 방법.
  27. a) 제16항 또는 제17항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 미생물로 전달하고,
    b) 상기 단리된 폴리뉴클레오티드를 상기 미생물에서 복제하고,
    c) 단계 a) 및 b)에서 얻어진 미생물을 증식시키는 것을 포함하는 재조합 미생물의 제조 방법.
  28. 제16항, 제17항 및 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물.
  29. 제28항에 있어서, 코리네형 박테리아 또는 에세리키아(Escherichia) 속의 박테리아인 재조합 미생물.
  30. 제29항에 있어서, 코리네형 박테리아가 코리네박테리움 속의 박테리아인 재조합 미생물.
  31. 제30항에 있어서, 코리네박테리움 속의 박테리아가 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 박테리아인 재조합 미생물.
  32. 제16항, 제17항 및 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  33. 제32항에 따른 벡터를 포함하는 재조합 미생물.
  34. 제33항에 있어서, 코리네형 박테리아 또는 에세리키아 속의 박테리아인 재조합 미생물.
  35. 제34항에 있어서, 코리네형 박테리아가 코리네박테리움 속의 박테리아인 재조합 미생물.
  36. 제35항에 있어서, 코리네박테리움 속의 박테리아가 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 박테리아인 재조합 미생물.
  37. 미생물에서 제16항 또는 제17항의 폴리뉴클레오티드의 카피수를 한 (1) 카피 이상 증가시키는 것을 포함하는, 미생물에서 GTP-피로포스페이트 키나제를 과발현시키는 방법.
  38. 프로모터 또는 발현 카세트를, GTP-피로포스페이트 키나제 활성을 가지며 서열 2의 아미노산 서열의 위치 38에서 L-류신을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 것을 포함하는, 미생물에서 GTP-피로포스페이트 키나제를 과발현시키는 방법.
  39. a) GTP-피로포스페이트 키나제 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 1 카피 이상 보유하며, 상기 폴리펩티드의 서열 2의 아미노산 서열내 위치 38에서의 L-류신에 의해 대체된 것인, 단리된 코리네형 박테리아를 배지 중에서 발효시키고,
    b) 발효 브로쓰 또는 상기 박테리아의 세포내에 L-아미노산을 농축시키는 것을 포함하는 L-아미노산의 제조 방법.
  40. 제39항에 있어서, 단리된 코리네형 박테리아가 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 단리된 코리네형 박테리아가, 제16항, 제17항 및 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 보유하거나 또는 이를 사용해서 제조된 재조합 코리네형 박테리아인 방법.
  42. 제39항에 있어서, L-아미노산이 단리 또는 수집되는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, L-아미노산이 정제되는 것인 방법.
  44. 제39항에 있어서, L-아미노산이 발효 브로쓰, 0 내지 100％의 바이오매스, 또는 발효 브로쓰 및 0 내지 100％의 바이오매스의 성분들과 함께 단리 또는 수집되는 것인 방법.
  45. 제39항에 있어서,
    a') 제39항의 단계 b)에서 얻어진 발효 브로쓰로부터 생성된 바이오매스를 0 내지 100％의 양으로 제거하고,
    b') 건조된 성형 생성물을, 단계 a')에서 얻어진 브로쓰로부터 과립화, 압착, 분무 건조 및 압출로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 제조하는 것을 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 황산, 염산 및 인산으로 이루어진 군으로부터 선택된 산이 단계 a')의 이전 또는 이후에 발효 브로쓰에 첨가되는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 물이 단계 a')의 이전 또는 이후에 얻어진 브로쓰로부터 제거되는 것인 방법.
  48. 제45항에 있어서, 단계 b')에서 또는 단계 b') 동안 얻어진 성형 생성물이 오일과 함께 분무되는 것인 방법.
  49. 제39항에 있어서,
    a) 발효 브로쓰를 여과함으로써 바이오매스-함유 슬러지 및 여과물을 얻는 단계,
    b) 상기 여과물을 농축시키는 단계,
    c) 단계 b)에서 얻어진 농축물을 과립화하는 단계, 및
    d) 단계 c)에서 얻어진 과립을 하나 이상의 코팅제로 코팅하는 단계가 수행되는 것인 방법.
  50. a) 10 중량％ 이상 73 중량％ 이하의, 베이스인 리신 함량,
    b) 5 중량％ 이하의 함수량, 및
    c) 발효 브로쓰에 존재하는 바이오매스의 0.1％ 이상에 상응하는 바이오매스 함량의 특징을 가지며, 불활성화될 수 있는 바이오매스는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 박테리아에 의해 형성되는 것인, 발효 브로쓰 기재의 L-리신-함유 사료 첨가제.
  51. a) 5 중량％ 이상의 트립토판 함량,
    b) 5 중량％ 이하의 함수량, 및
    c) 발효 브로쓰에 존재하는 바이오매스의 0.1％ 이상에 상응하는 바이오매스 함량의 특징을 가지며, 불활성화될 수 있는 바이오매스는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 박테리아에 의해 형성되는 것인, 발효 브로쓰 기재의 L-트립토판-함유 사료 첨가제.
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