BRPI0717977B1 - Mutantes isolados de bactérias corineformes, polinucleotídeo isolado, micro-organismo recombinante, vetor, e processo para a produção de um L-aminoácido - Google Patents

Mutantes isolados de bactérias corineformes, polinucleotídeo isolado, micro-organismo recombinante, vetor, e processo para a produção de um L-aminoácido Download PDF

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Description

(54) Título: MUTANTES ISOLADOS DE BACTÉRIAS CORINEFORMES, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, MICRO-ORGANISMO RECOMBINANTE, VETOR, E PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM L-AMINOÁCIDO (51) Int.CI.: C12N 9/12; C12N 15/54; C12P 13/04; C12P 13/08; C12R 1/15; C12N 15/63; C12N 15/69; C12N 1/21; A23L 1/227 (30) Prioridade Unionista: 17/10/2006 DE 10 2006 048 882.2 (73) Titular(es): EVONIK DEGUSSA GMBH (72) Inventor(es): BRIGITTE BATHE; CAROLINE KREUTZER; GEORG THIERBACH
1/79
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para
MUTANTES ISOLADOS DE BACTÉRIAS CORINEFORMES, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, MICRO-ORGANISMO
RECOMBINANTE, VETOR, E PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM L-AMINOÁCIDO.
[001] O objeto da invenção são mutantes e alelos do gene rel de bactérias corineformes que codificam variantes da pirofosfatocinase GTP (EC no 2.7.6.5) e processos para a produção de aminoácidos, especialmente L-lisina, L-triptofano, L-prolina, L-valina, L-isoleucina e L-homosserina com o emprego de bactérias, que contêm esses alelos.
Estado da técnica [002] Aminoácidos encontram aplicação na medicina humana, na indústria farmacêutica, na indústria alimentícia e de modo muito particular, na nutrição animal.
[003] Sabe-se, que aminoácidos são produzidos através da fermentação de cepas de bactérias corineformes, especialmente Corynebacterium glutamicum. Devido ao grande interesse, trabalha-se continuamente no aperfeiçoamento dos processos de produção. Os aperfeiçoamentos dos processos podem referir-se às medidas técnicas de fermentação, tais como, por exemplo, mistura e abastecimento com oxigênio ou a composição dos meios nutrientes, tais como, por exemplo, a concentração de açúcar durante a fermentação ou o processamento para a forma do produto, por exemplo, através de cromatografia de troca de íons ou as propriedades de potência do próprio micro-organismo.
Petição 870170063878, de 30/08/2017, pág. 7/11
2/77 [004] Para melhorar as propriedades de potência desses microorganismos, são aplicados métodos da mutagênese, seleção e seleção de mutantes. Dessa maneira, obtêm-se cepas, que são resistentes contra antimetabólitos ou são autótrofos para metabólitos regulatoriamente importantes e que produzem aminoácidos. Um antimetabólito conhecido é o análogo da lisina S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC).
[005] Há alguns anos, também são utilizados métodos da técnica de DNA recombinante para o melhoramento da cepa de cepas de Corynebacterium produtoras de L-aminoácido, amplificando alguns genes da biossíntese do aminoácido e pesquisando o efeito sobre a produção do aminoácido.
[006] O cromossoma de Corynebacterium glutamicum foi completamente sequenciado há algum tempo (Kalinowski e colaboradores, Journal of Biotechnology 104, 5-25 (2003)). O cromossoma de Corynebacterium efficiens também já foi sequenciado (Nishio e colaboradores, Genome Res. 13 (7), 1572-1579 (2003)).
[007] Especificações correspondentes de sequências podem ser deduzidas dos bancos de dados públicos. Bancos de dados adequados são, por exemplo, o banco de dados do European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemanha ou Cambridge, Grã Bretanha), o banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EUA), o Swiss Institute of Bioinformatics (Swissport, Genebra, Suíça), a Protein Information Resource Database (PIR, Washington, DC, EUA) e o DNA Data Bank of Japan (DDBJ, 1111 Yata, Mishima, 411-8540, Japão).
[008] Descrições resumidas para a genética, para o metabolismo e para o significado técnico de Corynebacterium são encontradas nos estudos de Ikeda, de Pfefferle e colaboradores e de Mueller e Huebner no livro Microbial Production of L-Amino Acids (Advances in Biochemical Engineering 79, (2003), Springer Verlag, Berlin, Alemanha editor:
3/77
T. Scheper), na edição especial A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology do Journal of Biotechnology (volume 104 (13), 2003, editor: A. Pühler e T. Tauch) e no Handbook of Corynebacterium glutamicum (editor: L. Eggeling e M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, EUA, 2005).
[009] A sequência de nucleotídeo do gene rel que codifica a pirofosfatocinase GTP de Corynebacterium glutamicum está geralmente disponível, entre outros, no banco de dados o National Center for Biotechnology Information (NCBI) da National Library of Medicin (Bethesda, MD, EUA) sob o número de acesso AF038651. Além disso, ela pode ser deduzida do pedido de patente EP 1.108.790 como sequência no 1824.
[0010] Wehmeier e colaboradores (Microbiology 144, 1853-1862 (1998)) relata, entre outros, sobre pesquisas genéticas, microbiológicas e bioquímicas em um mutante de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, que porta uma deleção no gene rel.
[0011] Para a melhor clareza, a sequência de nucleotídeo do gene rel que codifica a pirofosfatocinase GTP do tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum (gene do tipo selvagem) de acordo com as especificações do banco de dados NCBI está representada na SEQ ID no: 1 e a sequência de aminoácidos da pirofosfatocinase GTP codificada dai resultante está representada na SEQ ID no 2 ou 4. Na SEQ ID no 3 indicam-se adicionalmente sequências de nucleotídeos posicionadas a montante (upstream) e a jusante (downstream). A sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID no 2 ou 4 contém glicina na posição 262. A sequência de aminoácidos do tipo selvagem pirofosfatocinase GTP publicada na EP 1.108.790 contém ácido L-glutâmico na posição 262. A sequência de nucleotídeo do gene rel do tipo selvagem de acordo com a EP 1.108.790 está representada na SEQ ID no: 21. A sequência de aminoácidos codificada está representada na SEQ ID no:
4/77
22.
Objetivo da Invenção [0012] Os inventores foram encarregados da tarefa de (haben sich zur Aufgabe gestellt) disponibilizar novas ações para a produção melhorada de aminoácidos, especialmente L-lisina, L-triptofano, Lprolina, L-valina, L-isoleucina e L-homosserina.
Descrição da Invenção [0013] O objeto da invenção são mutantes produzidos ou isolados de bactérias corineformes, que separam preferivelmente aminoácidos e os quais contêm um gene ou alelo, que codifica um polipeptídeo com atividade de pirofosfatocinase GTP, caracterizados pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos na qual, na posição 38 ou em uma posição correspondente ou comparável da sequência de aminoácidos, está contido um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L-prolina. Prefere-se trocar L-prolina por Lleucina.
[0014] Nas bactérias corineformes, prefere-se o gênero Corynebacterium. No gênero Corynebacterium preferem-se as seguintes espécies:
[0015] Corynebacterium efficiens (cepa do tipo DSM44549), [0016] Corynebacterium glutamicum (cepa do tipo ATCC13032), [0017] Corynebacterium thermoaminogenes (por exemplo, a cepa FERM BP-1539) e [0018] Corynebacterium ammoniagenes (cepa do tipo ATCC6871), [0019] sendo que a espécie Corynebacterium glutamicum é preferida de modo muito particularmente preferido.
[0020] Alguns representantes da espécie Corynebacterium glutamicum são conhecidos no estado da técnica também sob outras designações de espécie. Nesses incluem-se, por exemplo:
[0021] Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870,
5/77 [0022] Corynebacterium lilium DSM20137, [0023] Corynebacterium melassecola ATCC17965, [0024] Brevibacterium flavum ATCC14067, [0025] Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, [0026] Brevibacterium divaricatum ATCC14020 e [0027] Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354.
[0028] Do mesmo modo, o termo Micrococcus glutamicus é usado para Corynebacterium glutamicum.
[0029] As cepas de bactérias corineformes utilizadas para as medidas da invenção, já possuem preferivelmente a capacidade de enriquecer o aminoácido desejado na célula ou separá-lo no meio nutriente que o envolve e acumulá-lo. Para isso, utiliza-se a seguir também a expressão produzir. As cepas de bactérias corineformes possuem especialmente a capacidade, de enriquecer ou acumular > (pelo menos) 0,25 g/l, > 0,5 g/l, > 1,0 g/l, >1,5 g/l, > 2,0 g/l, > 4 g/l ou > 10 g/l do aminoácido desejado em < (no máximo), 120 horas, < 96 horas, < 48 horas, < 36 horas, < 24 horas ou < 12 horas na célula ou no meio nutriente. Nesse caso, pode tratar-se de cepas, que foram produzidas através de mutagênese e seleção, através de técnicas de DNA recombinantes ou através de uma combinação dos dois métodos.
[0030] Representantes conhecidos de cepas de bactérias corineformes produtoras ou separadoras de L-lisina são, por exemplo:
[0031] Corynebacterium glutamicum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) descrito na EP 0.358.940, [0032] Corynebacterium glutamicum MH20-22B (= DSM16835) descrito em Menkel e colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 55 (3), 684-688 (1989)), [0033] Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= Ferm BP-7382) descrito na EP 1.108.790, [0034] Corynebacterium glutamicum NRRL B-11474 descrito na
6/77
US 4.275.157 e [0035] Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP-3304) descrito na US 5.250.423.
[0036] Representantes conhecidos de cepas de bactérias corineformes produtoras ou separadoras de L-triptofano são, por exemplo: [0037] Corynebacterium glutamicum K76 (= Ferm BP-1847) descrito na US 5.563.052, [0038] Corynebacterium glutamicum BPS13 (= Ferm BP-1777) descrito na US 5.605.818 e [0039] Corynebacterium glutamicum Ferm BP-3055 descrito na US 5.235.940.
[0040] Representantes conhecidos de cepas de bactérias corineformes produtoras ou separadoras de L-prolina são, por exemplo: [0041] Brevibacterium lactofermentum NRRL B-11421 descrito na US 4.224.409, [0042] Brevibacterium flavum NRRL B-11422 descrito na US
4.224.409, [0043] Brevibacterium flavum FERM BP-2214 descrito na US
5.294.547, [0044] Corynebacterium glutamicum NRRL B-11423 descrito na US 4.224.409, [0045] Corynebacterium glutamicum ATCC 21157 descrito na US
4.444.885, [0046] Corynebacterium glutamicum ATCC 21158 descrito na US
4.444.885, [0047] Corynebacterium glutamicum ATCC 21159 descrito na US
4.444.885, [0048] Corynebacterium glutamicum ATCC 21355 descrito na US 4.444.885 e [0049] Microbacterium ammoniaphilum NRRL B-11424 descrito na
7/77
US 4.224.409.
[0050] Representantes conhecidos de cepas de bactérias corineformes produtoras ou separadoras de L-valina são, por exemplo:
[0051] Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763 descrito na US 5.188.948, [0052] Brevibacterium lactofermentum FERM BP-3007 descrito na US 5.521.074, [0053] Corynebacterium glutamicum FERM BP-3006 descrito na US 5.521.074 e [0054] Corynebacterium glutamicum FERM BP-1764 descrito na US 5.188.948.
[0055] Representantes conhecidos de cepas de bactérias corineformes produtoras ou separadoras de L-isoleucina são, por exemplo: [0056] Brevibacterium flavum FERM BP-760 descrito na US
4.656.135, [0057] Brevibacterium flavum FERM BP-2215 descrito na US
5.294.547 e [0058] Corynebacterium glutamicum FERM BP-758 descrito na US
4.656.135.
[0059] Representantes conhecidos de cepas de bactérias corineformes produtoras ou separadoras de L-homosserina são, por exemplo:
[0060] Micrococcus glutamicum ATCC 14296 descrito na US
3.189.526 e [0061] Micrococcus glutamicum ATCC 14297 descrito na US
3.189.526.
[0062] Especificações para a classificação taxonômica de cepas desse grupo de bactérias são encontradas, entre outros, em Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983)), Kinoshita (1985, Glutamic Acid Bacteria, página 115-142. Em: Demain and So8/77 lomon (ed), Biology of Industrial Microorganisms. The Benjamin/Cummins Publishing Co., Londres, Grã Bretanha), Kampfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl e colaboradores (International Journal of Systematic Bacteriology 41,255-260 (1991)) e na US-A-5.250.434.
[0063] Cepas com a designação ATCC dizem respeito à American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Cepas com a designação DSM podem ser referidas pela Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemanha). Cepas com a designação NRRL podem ser referidas pela Agricultural Research Service Patent Culture Collection (ARS, Peoria, Illinois, EUA). Cepas com a designação FERM podem ser referidas pelo National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japão).
[0064] Um gene é quimicamente um polinucleotídeo. Um outro termo deste é ácido nucleico. No estado da técnica, também são usadas outras designações, tais como GTP difosfocinase, guanosina 3',5'-polifosfato sintase ou stringent factor para o polipeptídeo codificado pelo gene rel com atividade de pirofosfatocinase GTP (vide, por exemplo, o banco de dados KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) do Kanehisa Laboratory, Bioinformatics Center, Institute for Chemical Research, Kyoto University, Japão).
[0065] De acordo com a nomenclatura da IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), este tem o número EC 2.7.6.5. [0066] Este catalisa a reação:
[0067] ATP + GTP AMP + guanosina-3'-difosfato-5'-trifosfato, sendo que ao invés de GTP, o GDP também é usado como substrato. [0068] Por aminoácidos proteinogênicos entendem-se geralmente os aminoácidos, que existem em proteínas naturais, isto é, em proteínas de micro-organismos, plantas, animais e no homem. Por aminoá9/77 cidos proteinogênicos no contexto com a presente invenção, contudo, entende-se o grupo dos L-aminoácidos, consistindo em ácido Lasparagínico, L-asparagina, L-treonina, L-serina, ácido L-glutâmico, Lglutamina, glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, Lisoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, Ltriptofano, L-prolina e L-arginina. Nos L-aminoácidos inclui-se igualmente a L-homosserina.
[0069] Os mutantes de acordo com a invenção,separam preferivelmente os aminoácidos proteinogênicos mencionados, especialmente L-lisina, L-triptofano, L-prolina, L-valina, L-isoleucina ou Lhomosserina. O termo aminoácidos compreende também seus sais, tais como, por exemplo, o monocloridrato de lisina ou sulfato de lisina no caso do aminoácido L-lisina.
[0070] Além disso, o objeto da invenção são mutantes de bactérias corineformes, que contêm um alelo rel, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID no: 2, sendo que na posição 38 está contido um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de Lprolina. A troca de L-prolina por L-leucina é preferida.
[0071] Além disso, o objeto da invenção são mutantes de bactérias corineformes, que contêm um alelo rel, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição correspondente à posição 38 da sequência de aminoácidos da SEQ ID no:2, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de Lprolina, preferivelmente, contudo, L-leucina, sendo que o gene compreende uma sequência de nucleotídeos, que é idêntica à sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo, que é obtenível através de uma reação em cadeia de polimerase (PCR) com o emprego de um par de iniciadores, cujas sequências de nucleotídeos compreendem em cada caso pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos, que são se10/77 lecionados da sequência de nucleotídeos entre a posição 1 e 750 da SEQ ID no: 3 ou da SEQ ID no: 7 e da sequência de nucleotídeos complementar entre a posição 3800 e 3031 da SEQ ID no: 3 ou SEQ ID no:
7. Um exemplo de um par de iniciadores adequado é mostrado na SEQ ID no: 19 e SEQ ID no: 20. Como material de partida (DNA modelo), prefere-se DNA cromossomal de bactérias corineformes, que foram especialmente tratadas com um mutagene. Particularmente, prefere-se o DNA cromossomal do gênero Corynebacterium e de modo particularmente preferido, o da espécie Corynebacterium glutamicum. [0072] Além disso, o objeto da invenção são mutantes de bactérias corineformes, que contêm um alelo rel, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que compreende uma sequência de aminoácidos com um comprimento correspondente a 760 L-aminoácidos, sendo que um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L-prolina, preferivelmente L-leucina, está contido na posição 38.
[0073] Além disso, o objeto da invenção são mutantes de bactérias corineformes, que contêm um alelo rel, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 19 a 57 da sequência de aminoácidos contém a sequência de aminoácidos correspondente à posição 19 a 57 da SEQ ID no: 6 ou 8. Preferivelmente, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado contém uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 9 a 107 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 9 a 207 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 9 a 407 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 9 a 607 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 9 a 707 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 2 a 707 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 9 a 757 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 2 a 757 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 2 a 758 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 2 a 759 SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição, sendo que eventualmente o ácido L-glutâmico está contido na posição 262. De modo
11/77 muito particularmente preferido, o comprimento do polipeptídeo codificado compreende 760 aminoácidos.
[0074] Além disso, o objeto da invenção são mutantes de bactérias corineformes, que contêm um alelo rel, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 ou na posição correspondente da sequência de aminoácidos contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L-prolina, dando-se preferência à troca por L-leucina e cuja sequência de aminoácidos, além disso, é em pelo menos 90 %, preferivelmente em pelo menos 92 % e de modo muito particularmente preferido, pelo menos 94 % ou pelo menos 96 % e de modo muito particularmente preferido, em pelo menos 97 % ou pelo menos 98 % ou pelo menos 99 %, idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID no: 6 ou SEQ ID no: 8. Eventualmente, o ácido L-glutâmico está contido na posição 262 da SEQ ID no: 6 ou SEQ ID no: 8.
[0075] Além disso, o objeto da invenção são mutantes de bactérias corineformes, que contêm um alelo rel, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 ou na posição correspondente da sequência de aminoácidos, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L-prolina, dando-se preferência à troca por L-leucina e cuja sequência de nucleotídeos, além disso, é em pelo menos 90 %, preferivelmente em pelo menos 92 % ou pelo menos 94 % ou pelo menos 96 % e de modo muito particularmente preferido, em pelo menos 97 % ou pelo menos 98 % ou pelo menos 99 %, idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID no: 5. Eventualmente, a adenina está contida na posição 785.
[0076] Sabe-se, que trocas de aminoácidos conservativos modificam apenas insensivelmente a atividade enzimática. Em relação a isso, o alelo rel contido nos mutantes de acordo com a invenção, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase
12/77
GTP, pode conter adicionalmente à sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID no: 6 ou SEQ ID no: 8, uma (1) ou várias troca(s) de aminoácidos conservativo(s). Preferivelmente, o polipeptídeo contém duas (2), no máximo, três (3), no máximo quatro (4) ou no máximo cinco (5) trocas de aminoácidos conservativos. Eventualmente, o ácido Lglutâmico está contido na posição 262 da SEQ ID no: 6 ou SEQ ID no:
8.
[0077] No caso dos aminoácidos aromáticos fala-se de trocas conservativos, quando a fenilalanina, triptofano e tirosina são mutuamente trocados. No caso dos aminoácidos hidrófobos fala-se de trocas conservativas, quando a leucina, isoleucina e valina são mutuamente trocadas. No caso dos aminoácidos polares fala-se de trocas conservativas, quando a glutamina e a asparagina são mutuamente trocadas. No caso dos aminoácidos básicos fala-se de trocas conservativas, quando a arginina, lisina e histidina são mutuamente trocados. No caso dos aminoácidos ácidos fala-se de trocas conservativas, quando o ácido asparagínico e o ácido glutâmico são mutuamente trocados. No caso dos aminoácidos contendo grupos hidroxila fala-se de trocas conservativas, quando a serina e treonina são mutuamente trocadas.
[0078] Com o trabalho na presente invenção, verificou-se pela comparação da sequência de aminoácidos com o programa Clustal (Thompson e colaboradores, Nucleic Acids Research 22, 4637-4680 (1994)), que as sequências de aminoácidos da pirofosfatocinase GTP de várias bactérias, tais como, por exemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces avermitilis, Corynebacterium efficiens e Corynebacterium glutamicum contêm um motivo de sequência consistindo na sucessão Ser-Gly-Asp/Glu-Pro-Tyr-Ile-Thr/Ile-His-Pro-LeuAla-Val, um motivo de sequência consistindo na sucessão Ala-Ala/GlyLeu-Leu-His-Asp-Thr-Val-Glu-Asp-Thr e também um motivo de se13/77 quência consistindo na sucessão Thr-Pro-Val-Asp-Phe-Ala-Tyr-AlaVal-His-Thr-Glu-Val-Gly-His-Arg. As designações Asp/Glu, Thr/Ile e Ala/Gly significam, que Asp ou Glu ou Thr ou Ile ou Ala ou Gly estão contidos na posição correspondente.
[0079] Em relação a isso, preferem-se aqueles mutantes de bactérias corineformes, que contêm um alelo rel, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, o qual compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo Ser-Gly-Asp/Glu-Pro-Tyr-Ile-Thr/Ile-His-Pro-Leu-Ala-Val, AlaAla/Gly-Leu-Leu-His-Asp-Thr-Val-Glu-Asp-Thr e Thr-Pro-Val-Asp-PheAla-Tyr-Ala-Val-His-Thr-Glu-Val-Gly-His-Arg e na posição 38 ou na posição correspondente ou comparável da sequência de aminoácidos, contém um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção de Lprolina, preferivelmente L-leucina.
[0080] O motivo da sequência de aminoácidos Ser-Gly-Asp/GluPro-Tyr-Ile-Thr/Ile-His-Pro-Leu-Ala-Val está contido, por exemplo, na SEQ ID no: 2 ou 4 ou 6 ou 8 da posição 73 a 84. O motivo da sequência de aminoácidos Ala-Ala/Gly-Leu-Leu-His-Asp-Thr-Val-Glu-Asp-Thr está contido, por exemplo, na SEQ ID no: 2 ou 4 ou 6 ou 8 da posição 100 a 110. O motivo da sequência de aminoácidos Thr-Pro-Val-AspPhe-Ala-Tyr-Ala-Val-His-Thr-Glu-Val-Gly-His-Arg está contido, por exemplo, na SEQ ID no: 2 ou 4 ou 6 ou 8 da posição 437 a 452.
[0081] Finalmente, o objeto da invenção são mutantes de bactérias corineformes, que contêm um alelo rel, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID no: 6 ou SEQ ID no: 8, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262.
[0082] Sabe-se, que através de enzimas de ação própria, as chamadas aminopeptidases, a metionina em posição terminal pode ser
14/77 removida na síntese da proteína.
[0083] Pelo termo de uma posição correspondente à posição 38 da sequência de aminoácidos ou de uma posição comparável à posição 38 da sequência de aminoácidos, entende-se o fato, de que através de inserção ou deleção de um códon que codifica um aminoácido na região N-terminal (em relação à posição 38 da SEQ ID no: 6 ou 8) do polipeptídeo codificado, a especificação da posição e especificação do comprimento no caso de uma inserção é formalmente aumentada em uma unidade ou, no caso de uma deleção, reduzida em uma unidade. Por exemplo, através da deleção do códon GAG que codifica o aminoácido ácido L-glutâmico na posição 4 da SEQ ID no: 6 ou 8, a Lleucina retroceda da posição 38 para a posição 37. A especificação de comprimento seria, então: 759 aminoácidos. Da mesma maneira, através de inserção ou deleção de um códon que codifica um aminoácido na região C-terminal (em relação à posição 38) do polipeptídeo codificado, a especificação de comprimento no caso de uma inserção é formalmente aumentada em uma unidade ou, no caso de uma deleção, reduzida em uma unidade. Essas posições comparáveis podem ser facilmente identificadas através da comparação das sequências de aminoácidos na forma de um alinhamento, por exemplo, com auxílio de um programa Clustal ou do programa MAFFT.
[0084] Através dessas inserções e deleções, a atividade enzimática não é essencialmente afetada. Essencialmente não afetada significa, que a atividade enzimática das variantes mencionadas distinguese no máximo em 10 %, no máximo em 7,5 %, no máximo em 5 %, no máximo em 2,5 % ou no máximo em 1 % da atividade do polipeptídeo com a sequência de aminoácidos da SEQ ID no: 6 ou 8, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262.
[0085] Em conformidade com isso, o objeto da invenção são também alelos rel, que codificam variantes de polipeptídeos da SEQ ID no:
15/77 ou 8, que contêm uma ou mais inserção (ções) ou deleção (ções), sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262. Preferivelmente, o polipeptídeo contém no máximo 5, no máximo 4, no máximo 3 ou no máximo 2 inserções ou deleções de aminoácidos.
[0086] Os motivos de sequências Ser-Gly-Asp/Glu-Pro-Tyr-IleThr/Ile-His-Pro-Leu-Ala-Val, Ala-Ala/Gly-Leu-Leu-His-Asp-Thr-Val-GluAsp-Thr e Thr-Pro-Val-Asp-Phe-Ala-Tyr-Ala-Val-His-Thr-Glu-Val-GlyHis-Arg mencionados acima, não são preferivelmente rasgados por essas inserções/deleções.
[0087] Para produzir mutantes de acordo com a invenção, é possível utilizar processos clássicos de metagênese in-vivo com populações de células de bactérias corineformes com o emprego de substâncias mutagênicas, tais como, por exemplo, N-metil-N'-nitro-Nnitrosoguanidina (MNNG), etilmetanossulfonato (EMS), 5-bromouracila ou luz ultravioleta. Métodos de metagênese são descritos, por exemplo, no Manual of Methods for General Bacteriology (Gernard e colaboradores (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, EUA, 1981) ou por Tosaka e colaboradores (Agricultural and Biological Chemistry 42 (4), 745-752 (1978)) ou por Konicek e colaboradores (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)). Mutagêneses típicas com o emprego de MNNG compreendem concentrações de 50 a 500 mg/l ou também concentrações mais elevadas de a no máximo 1 g/l, um período de incubação de 1 a 30 minutos com um pH de 5,5 a 7,5. Nessas condições, o número das células capazes de viver é reduzido em uma fração de cerca de 50 % a 90 % ou cerca de 50 % a 99 % ou cerca de 50 % a 99,9 % ou mais.
[0088] Mutantes ou células são retiradas e multiplicadas da população celular submetida à mutagênese. Preferivelmente, em um outro estágio sua capacidade é pesquisada para, em uma cultura às batela16/77 das (batch) com o emprego de um meio nutriente adequado, separar aminoácidos, preferivelmente L-lisina, L-triptofano, L-prolina, L-valina, L-isoleucina ou L-homosserina. Meios nutrientes adequados e condições de teste são descritos, entre outros, na US 6.221.636, na US 5.840.551, na US 5.770.409, na US 5.605.818, na US 5.275.940 e na US 4.224.409. Com os empregos de instalações de robôs adequadas, tais como, por exemplo, descritas por Zimmermann e colaboradores (VDI Berichte no 1841, VDI-Verlag, Düsseldorf, Alemanha 2004, 439443) ou Zimmermann (Chemie Ingenenieur Technik 77 (4), 426-428 (2005)), é possível pesquisar inúmeros mutantes em pouco tempo. Em geral, são pesquisados no máximo 3.000, no máximo 10.000, no máximo 30.000 ou também no máximo 60.000 mutantes, eventualmente também mais. Dessa maneira, são identificados mutantes, que em comparação com a cepa mãe ou cepa de partida não submetida à mutagênese, separam crescentemente aminoácidos para o meio nutriente ou para o interior da célula. Nesses incluem-se, por exemplo, aqueles mutantes, cuja secreção de aminoácido está aumentada em pelo menos 0,5 %.
[0089] Em seguida, o DNA é preparado ou isolado a partir dos mutantes e com auxílio da reação em cadeia de polimerase com o emprego de pares de iniciadores, que permitem a amplificação do gene rel ou do alelo rel de acordo com a invenção ou da mutação de acordo com a invenção, na posição 38, o polinucleotídeo correspondente é sintetizado. O DNA é preferivelmente isolado daqueles mutantes, que separam aminoácidos de maneira aumentada.
[0090] Para isso, pares de iniciadores desejados podem ser selecionados da sequência de nucleotídeos posicionada a montante e a jusante da mutação de acordo com a invenção e da sequência de nucleotídeos complementar a essa. Nesse caso, um iniciador de um par de iniciadores compreende preferivelmente pelo menos 15, pelo me17/77 nos 18, pelo menos 20, pelo menos 21 ou pelo menos 24 nucleotídeos consecutivos selecionado da sequência de nucleotídeos entre a posição 1 e 861 da SEQ ID no: 3 ou SEQ ID no: 7. O segundo iniciador correspondente de um par de iniciadores compreende pelo menos 15, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 21 ou pelo menos 24 nucleotídeos consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeos complementar da posição 3800 e 865 da SEQ ID no: 3 ou SEQ ID no:
7. Caso se deseje a amplificação da região de codificação, então o par de iniciadores é preferivelmente selecionado da sequência de nucleotídeos entre a posição 1 e 750 da SEQ ID no: 3 ou SEQ ID no: 7 e da sequência de nucleotídeos complementar entre a posição 3800 e 3031 da SEQ ID no: 3 ou SEQ ID no: 7.
[0091] Caso se deseje a amplificação de uma parte da região de codificação, tal como representado, por exemplo, na SEQ ID no: 11 e 13, então o par de iniciadores é preferivelmente selecionado da sequência de nucleotídeos entre a posição 751 e 804 ou entre a posição 1 e 804 da SEQ ID no: 3 ou SEQ ID no: 7 e da sequência de nucleotídeos complementar entre a posição 3030 e 922 ou 3800 e 922 da SEQ ID no: 3 ou SEQ ID no: 7. Um par de iniciadores adequado é, por exemplo, o par de iniciadores rel_XL_A1 e rel_XL_E1 representado na SEQ ID no: 19 e SEQ ID no: 20. O iniciador pode ser munido, além disso, com pontos de reconhecimento para enzimas de restrição, com um grupo biotina ou outros acessórios, tais como são descritos no estado da técnica. O comprimento total do iniciador importa geralmente, no máximo, e 30, 40, 50 ou 60 nucleotídeos.
[0092] Para a produção de polinucleotídeos através da amplificação de sequências selecionadas, tal como do alelo rel de acordo com a invenção, a partir de DNA previamente introduzido, por exemplo, cromossomal (modelo de DNA) através da amplificação por meio de PCR, utilizam-se geralmente polimerases de DNA termoestáveis. E18/77 xemplos de tais polimerases de DNA são a polimerase TAQ de Thermus aquaticus, que é vendida, entre outros, pela Qiagen (Hilden, Alemanha), a polimerase Vent de Thermococcus litoralis, que é vendida, entre outros, pela New England Biolabs (Frankfurt, Alemanha) ou a polimerase Pfu de Pyrococcus furiosus, que é vendida, entre outros, pela Stratagene (La Jolla, EUA). É dada preferência, às polimerases com atividade proof-reading. Atividade proof-reading significa, que essas polimerases estão em condição, de reconhecer nucleotídeos incorporados de forma errada e corrigir o erro através de nova polimerização (Lottspeich und Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha (1998)). Exemplos de polimerases com atividade proof-reading são a polimerase Vent e a polimerase Pfu. [0093] As condições na preparação da reação são ajustadas de acordo com especificações do produtor. As polimerases são fornecidas pelo produtor, em geral, junto com o tampão usual, o qual normalmente apresenta concentrações de 10 - 100 mM de tris/HCl e 6 55 mM de KCl em pH 7,5 - 9,3. O cloreto de magnésio é acrescentado em uma concentração de 0,5 - 10 mM, caso não esteja contido no tampão fornecido pelo produtor. Além disso, acrescentam-se trifosfatos de desoxinucleosídeo à preparação da reação em uma concentração de 0,1 - 16,6 mM. Os iniciadores são previamente introduzidos na preparação da reação com uma concentração final de 0,1 - 3 pM e os DNA modelos no ótimo caso com 102 a 105 cópias. Também podem ser usadas 106 a 107 cópias. A polimerase correspondente é acrescentada à preparação da reação em uma quantidade de 2-5 unidades. Uma preparação de reação típica tem um volume de 20 - 100 pl.
[0094] Como outros aditivos, podem ser acrescentados à reação a albumina de soro bovino Tween-20, gelatina, glicerina, formamida ou DMSO (Dieffenbach e Dveksler, PCR Primer - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, EUA 1995).
19/77 [0095] Um decurso de PCR típico consiste em três diferentes estágios de temperatura, que se repetem sucessivamente. Em primeiro lugar, a reação é iniciada com um aumento de temperatura para 92oC - 98oC por 4 a 10 minutos, para desnaturar o DNA previamente introduzido. Depois, seguem-se repetidamente primeiro um estágio para a desnaturação do DNA previamente introduzido de 10 - 60 segundos a aproximadamente 92-98oC, depois um estágio para ligar o iniciador ao DNA previamente introduzido de 10 - 60 segundos a uma determinada temperatura, dependente dos iniciadores (temperatura annealing), que conforme a experiência, encontra-se em 50oC a 60oC e que pode ser individualmente calculada para cada par de iniciadores. O técnico encontra informações exatas para esse fim em Rychlik e colaboradores (Nucleic Acids Research 18 (21): 6409-6412. Em seguida, seguese um estágio de síntese para o prolongamento dos iniciadores previamente introduzidos (extensão), na melhor atividade respectivamente indicada para a polimerase, normalmente dependendo da polimerase, na faixa de 73oC a 67oC, preferivelmente 72oC a 68oC. A duração desse estágio de extensão depende da eficiência da polimerase e comprimento do produto de PCR a ser amplificado. Em um PCR típico, esse estágio dura 0,5 - 8 minutos, preferivelmente 2 - 4 minutos. Esses três estágios são repetidos 30 a 35 vezes, eventualmente a 50 vezes. Um estágio de extensão definitivo de 4 - 10 minutos conclui a reação. Os polinucleotídeos produzidos dessa maneira, também são designados como amplificados; o termo fragmento de ácido nucleico também é comum.
[0096] O técnico encontra outras introduções e informações para PCR, por exemplo, no manual PCR-Strategies (Innis, Felfand e Sninsky, Academic Press, Inc., 1995), no manual de Diefenbach e Dveksler PCR Primer - a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995), no manual de Gait Oligonukleotide synthesis: A
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Practical Approach (IRL Press, Oxford, Grã Bretanha, 1984) e em Newton e Graham PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1994).
[0097] Em seguida, a sequência de nucleotídeos é determinada, por exemplo, de acordo com o processo de ruptura de cadeia de Sanger e colaboradores (Proceedings of the National Academies of Sciences, EUA, 74, 5463-5467 (1977)) com as modificações mencionadas por Zimmermann e colaboradores (Nucleic Acids Research 18, página 1067 (1990)) e o polipeptídeo codificado por essa sequência de nucleotídeos é analisado, especialmente com respeito à sequência de aminoácidos. Para isso, a sequência de nucleotídeos é apresentada em um programa para a conversão da sequência de DNA para uma sequência de aminoácidos. Programas adequados são, por exemplo, o programa Patentin, que pode ser obtido no registro de patentes, por exemplo, no registro de patente norte americano (USPTO) ou o Translate Tool, que está disponível no ExPASy Proteomics Server no World Wide Web (Gasteiger e colaboradores, Nucleic Acids Research 31, 3784-3788 (2003).
[0098] Dessa maneira, são identificados mutantes, cujos alelos rel codificam polipeptídeos com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 da sequência de aminoácidos ou na posição correspondente ou comparável, contêm um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina. A troca preferida é por L-leucina. [0099] Eventualmente determina-se todo o cromossoma dos mutantes. Nesse caso, é possível utilizar o método descrito por Margulies e colaboradores (Nature, 437(7057): 376-380 (2005)) e Velicer e colaboradores (Proceedings of the National Academy of Sciences, EUA, 103(21), 8107-8112 (2006)), que é conhecido na técnica pela palavrachave pyro-sequencing e possibilita uma sequenciação rápida de genomas completos.
21/77 [00100] O objeto da invenção, em consequência disso, é um mutante de uma bactéria corineforme, caracterizado pelo fato de que este pode ser obtido através dos seguintes estágios:
[00101] a) tratamento de uma bactéria corineforme, que possui a capacidade de separar aminoácidos, com um agente mutagênico, [00102] b) isolamento e multiplicação do mutante produzido em a), [00103] c) determinação preferida da capacidade do mutante de separar em um meio pelo menos 0,5 % mais aminoácido ou de enriquecer no interior da célula do que a bactéria corineforme utilizada em
a), [00104] d) preparação de ácido nucleico do mutante obtido em b), [00105] e) produção de uma molécula de ácido nucleico (ou amplificado ou fragmento de ácido nucleico) com o uso da reação em cadeia de polimerase, do ácido nucleico de d) e de um par de iniciadores consistindo em um primeiro iniciador compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeos entre a posição 1 e 861, preferivelmente 1 a 750 da SEQ ID no: 3 ou SEQ ID no: 7 e de um segundo iniciador compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeos entre a posição 3800 e 865, preferivelmente 3800 e 3031 da SEQ ID no: 3 ou 7, [00106] f) determinação da sequência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico obtida em e) e determinação da sequência de aminoácidos codificada, [00107] g) eventualmente comparação da sequência de aminoácidos com SEQ ID no: 6 ou 8 determinada em f), sendo que o ácido Lglutâmico está eventualmente contido na posição 262 e [00108] h) identificação de um mutante, que contém um polinucleotídeo, que codifica um polipeptídeo, que na posição 38 ou na posição comparável, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exce22/77 ção de L-prolina, preferivelmente L-leucina.
[00109] Os mutantes produzidos dessa maneira, contêm tipicamente uma (1) cópia do alelo rel descrito.
[00110] Na SEQ ID no: 5 é apresentada, por exemplo, a região de codificação do alelo rel de um mutante de acordo com a invenção. A região de codificação do gene de tipo selvagem é representada como SEQ ID no: 1. A SEQ ID no: 1 contém na posição 112 a nucleobase citosina, na posição 113 a nucleobase citosina e na posição 114, a nucleobase guanina. A SEQ ID no: 1 contém, dessa maneira, da posição 112 a 114, o códon CCG que codifica o aminoácido L-prolina. A SEQ ID no: 5 contém na posição 113 a nucleobase timina. Através dessa transição de citosina para timina, o códon CTG que codifica o aminoácido L-leucina forma-se na posição 112 a 114.
[00111] Além disso, as sequências de nucleotídeos representadas na SEQ ID no: 5 ou 7 podem conter outras trocas de bases, que resultaram através do tratamento da mutagênese, contudo, não se exteriorizam em uma sequência de aminoácidos modificada. Na técnica, tais mutações são designadas também mutações silenciosas ou neutras. Essas mutações silenciosas já podem estar contidas também na bactéria corineforme utilizada para o tratamento da mutagênese.
[00112] As bactérias corineformes utilizadas para a mutagênese já possuem preferivelmente a capacidade, de separar o aminoácido desejado no meio nutriente/que o envolve ou caldo de fermentação ou enriquecer no interior da célula.
[00113] Bactérias corineformes produtoras de L-lisina possuem tipicamente uma aspartato cinase resistente ao feed back ou dessensibilizada. Por feed back de aspartato cinases resistentes entendem-se aspartato cinases (LysC), que em comparação com a forma selvagem, apresentam uma menor sensibilidade contra a inibição por misturas de lisina e treonina ou misturas de AEC (aminoetilcisteína) e treonina ou
23/77 lisina sozinha ou AEC sozinho. Os genes ou alelos que codificam essas aspartato cinases dessensibilizadas também são designados como alelos lysCFBR. No estado da técnica são descritos inúmeros alelos lysCFBR, que codificam variantes de aspartato cinases, que possuem trocas de aminoácido em comparação com a proteína de tipo selvagem. A região de codificação do gene lysC de tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum correspondente ao número de acesso AX756575 ou banco de dados NCBI está representada na SEQ ID no: 9 e o polipeptídeo codificado por esse gene, na SEQ ID no: 10.
[00114] As bactérias corineformes produtoras de L-lisina utilizadas para as medidas da invenção, dispõem preferivelmente de um alelo lysC, que codifica uma variante da aspartato cinase, que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID no: 10, sendo que essa compreende uma ou várias das trocas de aminoácidos selecionadas do grupo: [00115] LysC A279T (troca de L-alanina na posição 279 da proteína de aspartato cinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por Ltreonina; vide a US 5.688.671 e números de acesso E06825, E06826, E08178 e I74588 a I74597), [00116] LysC A279V (troca de L-alanina na posição 279 da proteína de aspartato cinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por Lvalina, vide JP 6-261766 e número de acesso E08179), [00117] LysC L279Q (troca de L-leucina na posição 297 da proteína de aspartato cinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por Lglutamina; vide a DE 102006026328), [00118] LysC S301F (troca de L-serina na posição 301 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por Lfenilalanina; vide a US 6.844.176 e número de acesso E08180), [00119] LysC S301Y (troca de L-serina na posição 301 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por Ltirosina, vide Kalinowski e colaboradores (Molecular and General Ge24/77 netics 224, 317-324 (1990)) e número de acesso X57226), [00120] LysC T308I (troca de L-treonina na posição 308 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por Lisoleucina; vide JP 6-261766 e número de acesso E08181) [00121] LysC T311I (troca de L-treonina na posição 311 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por Lisoleucina; vide WO 00/63388 e US 6.893.848), [00122] LysC S317A (troca de L-serina na posição 317 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por Lalanina; vide a US 5.688.671 e número de acesso I74589), [00123] LysC R320G (troca de L-arginina na posição 320 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por glicina; vide Jetten e colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) e número de acesso L27125), [00124] LysC G345D (troca de glicina na posição 345 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por ácido L-asparagínico; vide Jetten e colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) e número de acesso L16848), [00125] LysC T380I (troca de L-treonina na posição 380 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por Lisoleucina; vide a WO 01/49854 e número de acesso AX192358) e [00126] LysC S381F (troca de L-serina na posição 381 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por Lfenilalanina; vide a EP 0435132).
[00127] De modo particular, preferem-se o alelo lysCFBR lysC T311I (troca de treonina na posição 311 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por isoleucina) e um alelo lysCFBR contendo pelo menos uma troca selecionada do grupo A279T (troca de alanina na posição 279 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por treonina), S381F (troca de
25/77 serina na posição 381 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por fenilalanina) e S317A (troca de serina na posição 317 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por alanina).
[00128] O alelo lysCFBR lysC T311I (troca de treonina na posição 311 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID no: 10 por isoleucina é muito particularmente preferido.
[00129] A cepa DSM 16833 (WO 06/063660) possui um alelo lysCFBR, que codifica uma proteína de aspartato cinase, que contém a troca de aminoácido T311I.
[00130] A cepa NRRL B-11474 (US 4.275.157) possui um alelo lysCFBR, que codifica uma proteína de aspartato cinase, que contém as trocas de aminoácidos A279T e S381F.
[00131] De acordo com o modo e maneira descrito acima, partindo da cepa DSM 16833, foi isolado um mutante designado como DM1915, que na posição 38 da sequência de aminoácidos, contém um alelo rel, que codifica um polipeptídeo, no qual está contida L-leucina. A sequência de nucleotídeos da região de codificação do alelo rel do mutante DM1915 é representada como SEQ ID no: 5 e a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado, como SEQ ID no: 6 ou 8. [00132] Além disso, é possível utilizar bactérias corineformes separadoras de L-lisina, que possuem propriedades, tais como são conhecidas do estado da técnica.
[00133] Bactérias corineformes produtoras de L-triptofano possuem tipicamente uma antranilatossintase resistente ao feed back ou dessensibilizada. Por sintase de antranilato resistente ao feed back (TrpE) entendem-se sintases de antranilato, que em comparação com a forma selvagem, apresentam uma sensibilidade em pelo menos 5 a 10 %, ou pelo menos 10 % a 15 % ou pelo menos 10 % a 20 % menor contra a inibição por triptofano ou 5-fluortriptofano (Matsui e colabora26/77 dores, Journal of Bacteriology 169 (11) : 5330 - 5332 (1987)) ou análogos semelhantes. Os genes ou alelos que codificam as sintases de antranilato dessensibilizadas são designados também como alelos trpEFBR.
[00134] Exemplos desses mutantes ou alelos são descritos, por exemplo, na US 6180373 e EP 0338474.
[00135] Bactérias corineformes produtoras de L-prolina possuem, entre outros, uma γ-glutamilcinase (ProB), que na posição do aminoácido 149 ou posição comparável, apresenta um outro aminoácido proteinogênico como glicina, preferivelmente ácido L-asparagínico (WO 06066758).
[00136] Bactérias corineformes produtoras de L-valina possuem tipicamente uma sintase de acetolactato resistente ao feed back ou dessensibilizadas (Acetohydroxyacid Synthase; EC no 2.2.1.6).
[00137] Por sintase de acetolactato resistente ao feed back entende-se uma sintase de acetolactato que, em comparação com a forma selvagem, apresenta uma sensibilidade menor contra a inibição por um ou vários dos aminoácidos selecionados do grupo L-valina, Lisoleucina e L-leucina, preferivelmente L-valina.
[00138] A sintase de acetolactato (IlvB, IlvN) de Corynebacterium consiste em uma chamada subunidade grande codificada pelo gene ilvB e em uma chamada subunidade pequena codificada pelo gene ilvN (Keihauer e colaboradores, Journal of Bacteriology 175(17), 55955603 (1993)). Na WO 05/003357 e Elisakova e colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 71(1): 207-13 (2005) são relatadas variantes da subunidade IlvN, que conferem resistência à acetolactato sintase contra L-valina, L-isoleucina e L-leucina. Uma variante na posição 21 da sequência de aminoácidos contém ácido L-asparagínico ao invés de L-isoleucina (IlvN I21D) e na posição 22, L-fenilalanina ao invés de L-isoleucina (IlvN I22F). A segunda variante contém na posição
27/77 da sequência de aminoácidos, ácido L-asparagínico ao invés de glicina (IlvN G20D), na posição 21 da sequência de aminoácidos, ácido L-asparagínico ao invés de L-isoleucina (IlvN I21D) e na posição 22, L-fenilalanina ao invés de L-isoleucina (IlvN I22F).
[00139] Bactérias corineformes produtoras de L-isoleucina possuem tipicamente uma desidratase de treonina resistente ao feed back ou dessensibilizada (= desaminase de treonina).
[00140] Por desidratase de treonina resistente ao feed back entende-se uma desidratase de treonina (EC no 4.3.1.19), que em comparação com a forma selvagem, apresenta uma sensibilidade menor contra a inibição por L-isoleucina. Os genes ou alelos que codificam essa desidratase de treonina dessensibilizada também são designados como alelos ilvAFBR.
[00141] A região de codificação do gene ilvA de tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum correspondente ao número de acesso L01508 e NC_006958 do banco de dados NCBI, está representa na SEQ ID no: 17 e o polipeptídeo codificado por este gene, na SEQ ID no: 18.
[00142] As variantes de desidratase de treonina descritas na US 6.107.063 e por Morbach e colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 61 (12), 4315-4320 (1995)), contêm uma ou várias das trocas de aminoácidos selecionadas do grupo:
[00143] IlvA M199V (troca de L-metionina na posição 199 da proteína de desidratase de treonina codificada de acordo com a SEQ ID no: 18 por L-valina; vide a US 6.107.063), [00144] IlvA A257G (troca de L-alanina na posição 257 da proteína de desidratase de treonina codificada de acordo com a SEQ ID no: 18 por L-arginina; vide a US 6.107.063), [00145] IlvA H278R (troca de L-histidina da posição 278 da proteína de desidratase de treonina codificada de acordo com a SEQ ID no: 18
28/77 por L-arginina; vide a US 6.107.063), [00146] IlvA V323A (troca de L-valina na posição 323 da proteína de desidratase de treonina codificada de acordo com a SEQ ID no: 18 por L-alanina; vide Morbach e colaboradores), [00147] IlvA L351S (troca de L-leucina na posição 351 da proteína de desidratase de treonina codificada de acordo com a SEQ ID no: 18 por L-serina; vide a US 6.107.063) [00148] IlvA D378G (troca de ácido L-asparagínico na posição 378 da proteína de desidratase de treonina codificada de acordo com a SEQ ID no: 18 por glicina; vide Morbach e colaboradores).
[00149] Os mutantes obtidos mostram uma separação ou produção maior do aminoácido desejado em um processo de fermentação em comparação com a cepa de partida ou cepa mãe utilizada.
[00150] Do mesmo modo, o objeto da invenção é um polinucleotídeo isolado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 ou em uma posição correspondente ou comparável da sequência de aminoácidos, contém um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção de L-prolina, sendo preferida a troca por L-leucina.
[00151] O polinucleotídeo de acordo com a invenção, pode ser isolado de um mutante de acordo com a invenção.
[00152] Além disso, para a mutagênese do gene rel é possível utilizar métodos in-vitro. Quando são utilizados métodos in-vitro, os polinucleotídeos isolados, que contêm um gene rel de uma bactéria corineforme, preferivelmente o gene de tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum descrito no estado da técnica, são submetidos a um tratamento mutagênico.
[00153] No caso dos polinucleotídeos isolado, pode tratar-se, por exemplo, de um DNA total isolado ou de DNA cromossomal ou também de amplificados de um gene rel, que foram produzidos com auxí29/77 lio da reação em cadeia de polimerase (PCR). Tais amplificados também são designados como produtos PCR. Especificações para a amplificação de sequência de DNA com auxílio da reação em cadeia de polimerase são encontradas pelo técnico, entre outros, no manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Grã Bretanha, 1984) e em Newton e Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1994). Do mesmo modo, é possível, incorporar o gene rel a ser submetido à mutagênese, inicialmente em um vetor, por exemplo, em um bacteriófago ou em um plasmídeo.
[00154] Métodos adequados para a mutagênese in-vitro são, entre outros, o tratamento com hidroxilamina de acordo com Miller (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992), o emprego de oligonucleotídeos mutagênicos (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993 e R. M. Horton: PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis, Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995)) e o uso de uma reação em cadeia de polimerase com o emprego de uma polimerase de DNA, que apresenta uma alta taxa de erros. Uma tal polimerase de DNA é, por exemplo, a mutazima DNA polimerase (GeneMorph PCR Mutagenesis Kit, no 600550) da Stratagene (LaJolla, CA, EUA).
[00155] Outras especificações e sinopses para a produção de mutações in-vivo ou in-vitro podem ser deduzidas do estado da técnica e compêndios de genética e biologia molecular conhecidos, tais como, por exemplo, do compêndio de Knippers (Moleculare Genetik, 6a edição, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemanha, 1995), do de Winnacker (gene und Klone, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1990) ou do de Hagemann (Allgemeine Genetik, Gustav Fischer
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Verlag, Stuttgart, 1986).
[00156] O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID no: 2, sendo que na posição 38 da sequência de aminoácidos está contido um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de Lprolina. Prefere-se a troca por L-leucina. Ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262 da SEQ ID no: 2.
[00157] O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que compreende uma sequência de aminoácidos com um comprimento de 760 aminoácidos e em que na posição 38 está contido um dos L-aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L-prolina, preferivelmente L-leucina.
[00158] O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 19 a 57 da sequência de aminoácidos contém a sequência de aminoácidos correspondente à posição 19 a 57 da SEQ ID no: 6 ou 8. Preferivelmente, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado contém uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 9 a 107 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 9 a 207 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 9 a 407 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 9 a 607 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 9 a 707 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 2 a 707 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 9 a 757 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 2 a 757 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 2 a 758 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou posição 2 a 759 da SEQ ID no: 6 ou 8, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262. De modo muito particularmente preferido, o comprimento do polipeptídeo codificado compreende 760 aminoácidos. [00159] O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo iso31/77 lado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 da sequência de aminoácidos ou em uma posição correspondente ou comparável, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina, preferivelmente L-leucina e que compreende uma sequência de nucleotídeos, que é idêntica à sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo, que é obtenível através de uma reação em cadeia de polimerase (PCR) com o emprego de um par de iniciadores, cujas sequências de nucleotídeos compreendem em cada caso pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos, que são selecionados da sequência de nucleotídeos entre a posição 1 e 861, preferivelmente entre a posição 1 e 750, da SEQ ID no: 3 ou SEQ ID no: 7 e da sequência de nucleotídeos complementar entre a posição 3800 e 865, preferivelmente entre a posição 3800 e 3031, da SEQ ID no: 3 ou SEQ ID no: 7. Um exemplo de um tal par de iniciadores é representada na SEQ ID no: 19 e SEQ ID no:20. Como material de partida (template-DNA) prefere-se o DNA cromossomal de bactérias corineformes, que foram tratados especialmente com um agente mutagênico. Particularmente, prefere-se o DNA cromossomal do gênero Corynebacterium e de modo muito particularmente preferido, o da espécie Corynebacterium glutamicum.
[00160] O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que é hibridizado com uma sequência de nucleotídeos complementar à SEQ ID no: 5 sob condições limitadas e codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 da sequência de aminoácidos ou de uma posição correspondente ou comparável, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina, preferivelmente L-leucina.
[00161] Especificações para a hibridização de ácidos nucleicos ou polinucleotídeos são encontrados pelo técnico, entre outros, no manual The DIG System Users Guide for Filter Hybridization da Boehringer
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Mannheim GmbH (Mannheim, Alemanha, 1993) e em Liebl e colaboradores (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). A hibridização realiza-se em condições restritas, isto é, formam-se apenas híbridos, nos quais a sonda, isto é, um polinucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeos complementar à SEQ ID no: 5 e a sequência de células, isto é, os polinucleotídeos tratados com a sonda ou identificados, são idênticos em pelo menos 90 %. Sabe-se, que a limitação da hibridização inclusive o estágio de lavagem é influenciada ou determinada pela variação da composição do tampão, da temperatura e da concentração de sal. Em geral, a reação de hibridização é efetuada com restrição relativamente baixa em comparação com os estágios de lavagem (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Grã Bretanha, 1996).
[00162] Para a reação de hibridização, por exemplo, pode ser utilizado um tampão correspondente ao tampão 5x SSC a uma temperatura de cerca de 50oC - 68oC. Nesse caso, as sondas também podem hibridizar com polinucleotídeos, que apresentam menos do que 90 % de identidade para a sequência de nucleotídeos da sonda utilizada. Tais híbridos são menos estáveis e são removidos através de lavagem em condições restritas. Isso pode ser obtido, por exemplo, através da redução da concentração de sal para 2x SSC e eventualmente, em seguida, 0,5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha, 1995), sendo ajustada uma temperatura de cerca de 50oC - 68oC, cerca de 52oC - 68oC, cerca de 54oC - 68oC, cerca de 56oC - 68oC, cerca de 58oC - 68oC, cerca de 60oC - 68oC, cerca de 62oC - 68oC, cerca de 64oC - 68oC, cerca de 66oC - 68oC. Faixas de temperatura de cerca de 64oC - 68oC ou cerca de 66oC - 68oC são preferidas. Eventualmente, é possível reduzir a concentração de sal a uma concentração correspondente a 0,2x SSC ou 0,1x SSC. Eventualmente, o tampão SSC contém dode33/77 cilsulfato de sódio (SDS) em uma concentração de 0,1 %. Através de aumento escalonado da temperatura de hibridização em estágios de cerca de 1 - 2oC de 50oC para 68oC, podem ser isolados fragmentos de polinucleotídeos, que possuem pelo menos 90 % ou pelo menos 91 %, preferivelmente pelo menos 92 % ou pelo menos 93 % ou pelo menos 94 % ou pelo menos 95 % ou pelo menos 96 % e de modo muito particularmente preferido, pelo menos 97 % ou pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade para a sequência ou sequência complementar da sonda utilizada e codificam um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, o qual contém a troca de aminoácidos de acordo com a invenção. A sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo obtido dessa maneira é determinada com métodos conhecidos. Outras especificações para a hibridização são obteníveis no comércio na forma dos chamados kits (por exemplo, DIG Easy Hyb pela Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha, catálogo no 1603558). As sequência de nucleotídeos obtidas dessa maneira codificam polipeptídeos com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que são pelo menos 90 %, preferivelmente pelo menos 92 % ou pelo menos 94 % ou pelo menos 96 % e de modo muito particularmente preferido, pelo menos 97 % ou pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % idênticos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID no: 6 ou SEQ ID no: 8 e contêm a troca de aminoácidos de acordo com a invenção, sendo que o ácido L-glutamínico está eventualmente contido na posição 262.
[00163] O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 ou em uma posição correspondente ou comparável da sequência de aminoácidos, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina, sendo dada preferência à troca por L-leucina e que compreende uma sequência de
34/77 aminoácidos, que além disso, é em pelo menos 90 %, preferivelmente pelo menos 92 % ou pelo menos 94 % ou pelo menos 96 % e de modo muito particularmente preferido pelo menos 97 % ou pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID no: 6 ou SEQ ID no: 8, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262.
[00164] O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 ou em uma posição correspondente ou comparável da sequência de aminoácidos, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina, sendo dada preferência à troca por L-leucina e que compreende uma sequência de nucleotídeos que, além disso, é em pelo menos 90 %, preferivelmente pelo menos 92 % ou pelo menos 94 % ou pelo menos 96 % e de modo muito particularmente preferido pelo menos 97 % ou pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % idêntico à sequência de nucleotídeos da SEQ ID no: 5, sendo que a adenina está eventualmente contida na posição 785.
[00165] Além disso, são preferidos aqueles polinucleotídeos isolados, que codificam um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 da sequência de aminoácidos ou em uma posição correspondente ou comparável, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L-prolina, preferivelmente L-leucina e que contêm pelo menos um motivo de sequência ou uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo Ser-GlyAsp/Glu-Pro-Tyr-Ile-Thr/Ile-His-Pro-Leu-Ala-Val, Ala-Ala/Gly-Leu-LeuHis-Asp-Thr-Val-Glu-AspThr e Thr-Pro-Val-Asp-Phe-Ala-Tyr-Ala-ValHis-Thr-Glu-Val-Gly-His-Arg.
[00166] As designações Asp/Glu, Thr/Ile e Ala/Gly significam, que Asp ou Glu ou Thr ou Ile ou Ala ou Glyestão contidos na po35/77 sição correspondente.
[00167] O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID no: 6 ou 8, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262. Eventualmente, o polipeptídeo codificado contém um (1) ou várias troca(s) de aminoácidos conservativas. Preferivelmente, o polipeptídeo contém duas (2), no máximo três (3), no máximo quatro (4) ou no máximo cinco (5) trocas de aminoácidos conservativas.
[00168] O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID no: 6 ou 8 inclusive um (1) aminoácido. Esse prolongamento não importa em mais do que 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 ou 2 aminoácidos ou radicais de aminoácidos. Eventualmente o ácido L-glutâmico está contido na posição 262 da SEQ ID no: 6 ou 8.
[00169] O objeto da invenção são, finalmente, também alelos rel, que codificam variantes de polipeptídeo da SEQ ID no: 6 ou 8, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262, que contêm uma ou várias inserções ou deleções. Preferivelmente, esses contêm no máximo 5, no máximo 4, no máximo 3 ou no máximo 2 inserções ou deleções de aminoácidos. O motivo de sequência SerGly-Asp/Glu-Pro-Tyr-Ile-Thr/Ile-His-Pro-Leu-Ala-Val e/ou Ala-Ala/GlyLeu-Leu-His-Asp-Thr-Val-Glu-Asp-Thr e/ou Thr-Pro-Val-Asp-Phe-AlaThr-Ala-Val-His-Thr-Glu-Val-Gly-His-Arg preferivelmente não é/são rasgados por tais inserções/deleções.
[00170] O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que compreende a sequência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID no: 5 ou 7, sendo que a adenina está eventualmente contida
36/77 na posição 785 da SEQ ID no: 5 ou posição 1535 da SEQ ID no: 7. [00171] O objeto da invenção é, finalmente, um polinucleotídeo isolado contendo o alelo rel do mutante DM1915.
[00172] O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que compreende uma parte da região de codificação de um alelo rel de acordo com a invenção, sendo que o polinucleotídeo isolado compreende em cada caso a parte da região de codificação, que contém a troca de aminoácidos na posição 38 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado.
[00173] De modo especial, está compreendida uma molécula de ácido nucleico ou um fragmento de DNA, que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 19 a 57 da SEQ ID no: 2 ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 9 a 107 da SEQ ID no: 2 ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 9 a 207 da SEQ ID no: 2 ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 9 a 407 da SEQ ID no: 2 ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 9 a 607 da SEQ ID no: 2 ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 9 a 707 da SEQ ID no: 2 ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 2 a 707 da SEQ ID no: 2 ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 9 a 757 da SEQ ID no: 2 ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 2 a 757 da SEQ ID no: 2 ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 2 a 758 da SEQ ID no: 2 ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 2 a 759 da SEQ ID no: 2, sendo que na posição correspondente a 38 da SEQ ID no: 2, está contido um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção
37/77 de L-prolina, preferivelmente L-leucina. O ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262 da SEQ ID no: 2.
[00174] Um exemplo de um quadro de leitura de acordo com a invenção, que compreende um polinucleotídeo, que codifica pelo menos a sequência de aminoácidos da posição 19 a 57 correspondente à SEQ ID no: 2, sendo que na posição correspondente a 38 da sequência de aminoácidos, está contido um dos aminoácidos proteinogênicos (Xaa), com exceção de L-prolina, é mostrado a seguir:
gcc agg ctt gcc cgc agc ctc aca gga aac cgc gtt cgc acc aac cct gtg
Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr Asn Pro Val
20 25 30 35
ctg gat nnn ctg agc cac cgg caa ttt cac cca cgc gcc gac gta
Leu Asp Xaa Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro Arg Ala Asp Val
45 50 caa gtg ttg gaa cgt
Gln Val Leu Glu Arg [00175] Este está igualmente representadso como SEQ ID no: 11. A sequência de aminoácidos codificada por esse quadro de leitura está representada como SEQ ID no: 12. A posição 20 na SEQ ID no: 12 corresponde à posição 38 da SEQ ID no: 2, 4, 6 ou 8.
[00176] Preferivelmente, moléculas de ácido nucleico, que codificam pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 19 a 57 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 9 a 107 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 9 a 207 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 9 a 407 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 9 a 607 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 9 a 707 da SEQ ID no:6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 2 a 707 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 9 a 757 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à
38/77 posição 2 a 757 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 2 a 758 da SEQ ID no: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 2 a 759 da SEQ ID no: 6 ou 8, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262.
[00177] Um exemplo de um quadro de leitura de acordo com a invenção compreendendo um polinucleotídeo, que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 19 a 57 da SEQ ID no: 6 ou 8, é mostrado a seguir:
gcc agg ctt cgc agc ctc aca gga aac cgc gtt cgc acc aac cct gtg
Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr Asn Pro Val
20 25 30 35
ctg gat ctg ctg agc atc cac cgg caa ttt cac cca cgc gcc gac gta
Leu Asp Leu Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro Arg Ala Asp Val
40 45 50
caa gtg ttg gaa cgt
Gln Val Leu Glu Arg
[00178] O quadro de leitura também está representado como SEQ ID no: 13. A SEQ ID no: 14 mostra a sequência de aminoácidos codificada por este quadro de leitura. A posição 20 na SEQ ID no: 14 corresponde à posição 38 da SEQ ID no: 2, 4, 6 ou 8.
[00179] De modo muito particular, preferem-se moléculas de ácido nucleico, que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeos correspondente à posição 805 a 921 da SEQ ID no: 7 ou pelo menos uma sequência de nucleotídeos correspondente à posição 655 a 1071 da SEQ ID no: 7 ou pelo menos uma sequência de nucleotídeos correspondente à posição 355 a 1371 da SEQ ID no: 7 ou pelo menos uma sequência de nucleotídeos correspondente à posição 55 a 2671 da SEQ ID no: 7 ou pelo menos uma sequência de nucleotídeos correspondente à posição 1 a 2725 da SEQ ID no: 7, sendo que a adenina está eventualmente contida na posição 1535.
39/77 [00180] Os quadros de leitura de acordo com a invenção, tais como são mostrados, por exemplo, na SEQ ID no: 11 e 13 como sequência de nucleotídeos e na SEQ ID no: 12 e SEQ ID no: 14 na forma da sequência de aminoácidos codificada,podem conter, além disso, uma ou mais mutações, que levam a uma ou mais trocas de aminoácidos conservativas. Preferivelmente, as mutações levam a no máximo 4 %, a no máximo 2 % ou a no máximo 1 % de trocas de aminoácidos conservativas. Além disso, os quadros de leitura de acordo com a invenção,podem conter uma ou mais mutações silenciosas. Preferivelmente, os quadros de leitura de acordo com a invenção, contêm no máximo 4 % e de modo particularmente preferido, no máximo 2 % a no máximo 1 % de mutações silenciosas.
[00181] Os polinucleotídeos isolados, de acordo com a invenção, podem ser utilizados para produzir cepas recombinantes de microorganismos que, em comparação com a cepa de partida ou cepa mãe, da melhor maneira, distribuem aminoácidos ao meio que os circunda ou se acumulam no interior da célula.
[00182] Um método difundido para a incorporação de mutações no gene de bactérias corineformes é a troca de alelo, que também é conhecida pela designação gene replacement. Neste processo, um fragmento de DNA, que contém a mutação interessante, é transferido para a cepa desejada de uma bactéria corineforme e a mutação é incorporada no cromossoma da cepa desejada através de pelo menos duas ocorrências de recombinação ou ocorrências cross over ou a sequência de um gene presente na respectiva cepa é trocada pela sequência mutada.
[00183] Este método foi utilizado por Schwarzer e Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991) para incorporar um alelo lysA, o qual portou uma deleção e um alelo lysA, o qual portou uma inserção, no cromossoma de C. glutamicum ao invés do gene de tipo selvagem.
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Este método foi utilizado por Schafer e colaboradores (Gene 145, 6973 (1994), para incorporar uma deleção no Operon hom-thrB de C. glutamicum. Este método foi utilizado por Nakagawa e colaboradores (EP 1108790) e Ohnishi e colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 58 (2), 217-223 (2002), para incorporar diferentes mutações partindo dos alelos isolados, para o cromossoma de C. glutamicum. Dessa maneira, Nakagawa e colaboradores conseguiram incorporar uma mutação designada como Va159Ala, no gene da desidrogenase de homosserina (hom), uma mutação designada com Thr311Ile no gene da aspartato cinase (lysC ou ask), uma mutação designada com Pro458Ser no gene de piruvato-carboxilase (pyc) e uma mutação designada com Ala213Thr no gene da desidrogenase de glicose-6-fosfato (zwf) de cepas de C. glutamicum.
[00184] Para um processo de acordo com a invenção, pode ser utilizado um polinucleotídeo de acordo com a invenção, o qual compreende toda a região de codificação, tal como, por exemplo, mostrado na SEQ ID no 5, ou o qual compreende uma parte da região de codificação, tal como, por exemplo, a sequência de nucleotídeos, que codifica pelo menos a sequência de aminoácidos correspondente à posição 19 a 57 da SEQ ID no: 6 ou 8 e que são representadas como SEQ ID no 11 e 13. A parte da região de codificação correspondente à SEQ ID no 11 e 13 compreende um comprimento de > 117 nucleobases. Preferem-se aquelas partes da SEQ ID no: 7, que compreendem pelo menos a sequência entre a posição 1071 e 655 ou pelo menos entre a posição 1371 e 355 e em conformidade com isso, possuem um comprimento de > 407 ou > 1017 nucleobases.
[00185] Na SEQ ID no: 15 é apresentado um exemplo de um polinucleotídeo de acordo com a invenção, que compreende uma parte da região de codificação.
[00186] O fragmento de DNA contendo a mutação interessante está
41/77 presente neste método, tipicamente em um vetor, especialmente em um plasmídeo, que preferivelmente não é ou é apenas limitadamente replicado pela cepa a ser provida com a mutação. Como hospedeiro auxiliar ou intermediário, no qual o vetor é replicável, utiliza-se geralmente uma bactéria do gênero Escherichia, preferivelmente da espécie Escherichia coli.
[00187] Exemplos de tais vetores de plasmídeos são os vetores pK*mob e pK*mobsacB descritos por Schafer e colaboradores (Gene 145, 69-73 (1994)), tais como, por exemplo, pK18mobsacB e os vetores descritos na WO 02/070685 e WO 03/014362. Esses são replicativos em Escherichia coli, mas não em bactérias corineformes. Vetores particularmente adequados são aqueles, que contêm um gene de ação dominante condicionalmente negativa, tal como, por exemplo, o gene sacB (gene de levansucrase), por exemplo, de Bacillus ou o gene galK (gene galactose cinase), por exemplo, de Escherichia coli. (Por um gene de ação dominante condicionalmente negativa entende-se um gene, que em determinadas condições é desvantajosamente tóxico, por exemplo, para o hospedeiro, mas em outras condições não tem ações negativas sobre o hospedeiro portador do gene). Esses possibilitam a seleção nas ocorrências de recombinação, nas quais o vetor é eliminado do cromossoma. Além disso, Nakamura e colaboradores (US-A-6.303.383) descreveram um plasmídeo sensível à temperatura para bactérias corineformes, que pode replicar meramente a temperaturas abaixo de 31oC.
[00188] Em seguida, o vetor é transferido para a bactéria corineforme através de conjugação, por exemplo, de acordo com o método de Schafer (Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)) ou transformação, por exemplo, de acordo com o método de Dunican e Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) ou de acordo com o método de Thierbach e colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology
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29, 356-362 (1988)). Eventualmente, a transferência do DNA também pode ser obtida através de bombardeamento de partículas.
[00189] Após recombinação homóloga por meio de uma primeira ocorrência cross-over que causa a integração e de uma segunda ocorrência cross-over adequada, que causa uma excisão no gene alvo ou na sequência alvo, consegue-se a incorporação da mutação e obtém-se uma bactéria recombinante.
[00190] Para a identificação e caracterização das cepas obtidas, é possível utilizar, entre outros, os métodos da hibridização Southern Blotting, da reação em cadeia de polimerase, da determinação de sequências, o método da Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) (Lay e colaboradores, Clinical Chemistry 43, 2262-2267 (1997)) ou métodos da enzimologia.
[00191] Em conformidade com isso, um outro objeto da invenção é um processo para a produção de uma bactéria corineforme, na qual [00192] a) um polinucleotídeo de acordo com a invenção,é transferido para uma bactéria corineforme, [00193] b) o gene pirofosfatocinase GTP presente no cromossoma da bactéria corineforme, que codifica uma sequência de aminoácidos com L-prolina na posição 38 ou em uma posição comparável da sequência de aminoácidos, é trocado pelo polinucleotídeo de a), que codifica uma sequência de aminoácidos, que na posição 38 ou em uma outra posição comparável da sequência de aminoácidos, possui um outro L-aminoácido proteinogênico, preferivelmente L-leucina e [00194] c) multiplicar a bactéria corineforme obtida de acordo com os estágios a) e b).
[00195] Dessa maneira, obtém-se uma bactéria corineforme recombinante, que ao invés do gene rel de tipo selvagem, contém (1) um alelo rel de acordo com a invenção.
[00196] Um outro processo de acordo com a invenção, para a pro43/77 dução de um micro-organismo, consiste em que [00197] a) um polinucleotídeo de acordo com a invenção, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, é transferido para um micro-organismo, [00198] b) o polinucleotídeo é replicado no micro-organismo e [00199] c) o micro-organismo obtido de acordo com o estágio a) e
b) é multiplicado.
[00200] Dessa maneira, obtém-se um micro-organismo recombinante, o qual contém pelo menos (1) uma cópia ou várias cópias de um polinucleotídeo de acordo com a invenção, que codifica uma pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 ou em uma posição comparável da sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L-prolina, sendo preferida a troca por L-leucina.
[00201] Outros objetos da invenção são, em conformidade com isso, hospedeiros ou células hospedeiras, preferivelmente microorganismos, de modo particularmente preferido, bactérias corineformes e bactérias do gênero Escherichia, que contêm os polinucleotídeos de acordo com a invenção. Do mesmo modo, o objeto da invenção são micro-organismos, que foram produzidos com o emprego dos polinucleotídeos isolados. Tais micro-organismos ou bactérias são designados também como micro-organismos recombinantes ou bactérias recombinantes. Da mesma maneira, os vetores, que contêm os polinucleotídeos de acordo com a invenção, são objeto da invenção. Finalmente, os hospedeiros, que contêm esses vetores, são também objeto da invenção.
[00202] Da mesma maneira, os polinucleotídeos isolados de acordo com a invenção, podem ser utilizados para a obtenção de uma superexpressão dos polipeptídeos codificados por estes.
[00203] Por superexpressão entende-se geralmente um aumento
44/77 da concentração intracelular ou atividade de um ácido ribonucleico, de uma proteína ou de uma enzima. No caso da presente invenção, alelos rel ou polinucleotídeos superexprimidos são os que codificam pirofosfatocinases GTP, que na posição 38 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado, contêm um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L-prolina, sendo preferida a troca por L-leucina. Sabe-se, que através de enzimas próprias do hospedeiro - as chamadas aminopeptidases - os aminoácidos N-terminais, especialmente a metionina N-terminal, podem ser dissociados do polipeptídeo formado. O aumento mencionado da concentração ou atividade de um produto gênico pode ser obtido, por exemplo, pelo fato, de se aumentar o número de cópias dos polinucleotídeos correspondentes em pelo menos uma cópia.
[00204] Um método amplamente divulgado para aumentar o número de cópias, consiste em incorporar o gene ou alelo correspondente em um vetor, preferivelmente um plasmídeo, que é replicado por uma bactéria corineforme. Vetores de plasmídeos adequados são, por exemplo, pZ1 (Menkel e colaboradores, Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) ou os vetores pSELF descritos por Tauch e colaboradores (Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)). O artigo da sinopse sobre o tema plasmídeos em Corynebacterium glutamicum está em Tauch e colaboradores (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)).
[00205] Um outro método difundido para a obtenção de uma superexpressão é o processo da amplificação gênica cromossomal. Neste método, pelo menos uma cópia adicional do gene ou alelo interessante é introduzido no cromossoma de uma bactéria corineforme.
[00206] Em uma forma de concretização, tal como descrita, por exemplo, por Reinscheid e colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) para o hom-thrB-operon, um plasmí45/77 deo não replicativo em C. glutamicum, o qual contém o gene interessante, é transferido para uma bactéria corineforme. Após recombinação homóloga de uma ocorrência cross-over, a cepa resultante contém pelo menos duas cópias do respectivo gene ou alelo.
[00207] Em uma outra forma de concretização, que é descrita na WO 03/040373 e US-2003-0219881-A1, uma ou várias cópia(s) do gene interessante é(são) introduzida(s) por meio de pelo menos duas ocorrências de recombinação em um local desejado do cromossoma de C. glutamicum. Dessa maneira, por exemplo, uma cópia do alelo lysC, que codifica uma L-lisina de aspartato cinase insensível, é incorporada no gene gluB de C. glutamicum.
[00208] Em uma outra forma de concretização, que é descrita na WO 03/014330 e US 2004-0043458-A1, pelo menos uma outra cópia, preferivelmente em disposição tandem em relação ao gene ou alelo já presente, do gene interessante, é incorporada por meio de pelo menos duas ocorrências de recombinação, no local natural. Dessa maneira, por exemplo, obtém-se uma duplicação tandem de um alelo lysCFBR no local do gene lysC natural.
[00209] Um outro método para a obtenção de uma superexpressão, consiste em ligar o gene ou alelo correspondente de maneira funcional (operably linked) com um promotor ou um cassete de expressão. Promotores adequados para o Corynebacterium glutamicum são descritos, por exemplo, no artigo da sinopse de Patek e colaboradores (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 311-323 (2003). Da mesma maneira, é possível utilizar as variantes do promotor dapA descritas por Vasicova e colaboradores (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)), por exemplo, do promotor A25. Além disso, é possível utilizar o promotor gap de Corynebacterium glutamicum (EP 06007373). Finalmente, é possível utilizar os promotores T3, T7, SP6, M13, lac, tac e trc suficientemente conhecidos, descritos por Amann e colaborado46/77 res (Gene 69(2), 301-315 (1988)) e Amann e Brosius (Gene 40 (2-3) 183-190 (1985)). Um tal promotor pode ser introduzido, por exemplo, a montante do alelo rel, tipicamente no intervalo de aproximadamente 1 - 500 nucleotídeos do códon de partida, de uma bactéria corineforme recombinante, a qual codifica uma proteína, que ao invés do aminoácido L-prolina naturalmente presente na posição 38, contém um outro aminoácido proteinogênico. Naturalmente, um tal promotor também pode ser introduzido a montante da região de codificação do alelo rel de um mutante de acordo com a invenção. Além disso, é possível, ligar um polinucleotídeos isolado de acordo com a invenção, que codifica uma variante da pirofosfatocinase GTP de acordo com a invenção, com um promotor e incorporar a unidade de expressão obtida no plasmídeo a ser replicado extracromossomalmente ou no cromossoma de uma bactéria corineforme.
[00210] Além disso, a região do promotor e regulação ou o ponto de ligação do ribossomo, que se encontra a montante do gene de estrutura, pode ser mutada. Através de medidas para o prolongamento da durabilidade do mRNA, a expressão também melhora. Além disso, impedindo a degradação da proteina enzimática, a atividade enzimática também é reforçada. Alternativamente, além disso, obtém-se uma superexpressão do respectivo gene ou alelo através da modificação da composição do meio e condução da cultura.
[00211] Através das medidas da superexpressão, a atividade ou concentração da proteína correspondente aumenta geralmente em pelo menos 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % ou 500 %, no máximo, em a 1000 % ou 2000 %, em relação à atividade ou concentração da proteína no micro-organismo de partida ou cepa mãe. Por um micro-organismo de partida ou cepa mãe entendese um micro-organismo, no qual as medidas da invenção são efetuadas.
47/77 [00212] A concentração da proteína pode ser determinada por meio da separação do gel da proteína mono e bidimensional e subsequente identificação óptica da concentração de proteína com respectivo software de avaliação no gel. Um método usual para a preparação dos géis de proteína nas bactérias corineformes e para a identificação da proteína, é o procedimento descrito por Hermann e colaboradores (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)). Do mesmo modo, a concentração de proteína pode ser determinada através da hibridização de WesternBlot com um anticorpo específico para a proteína a ser detectada (Sambrook e colaboradores, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989) e subsequente avaliação óptica com software correspondente para determinar a concentração (Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 38: 2630-2647 (1999)).
[00213] Em conformidade com isso, o objeto da invenção são processos para a superexpressão das pirofosfatocinases GTP de acordo com a invenção. Um processo para a superexpressão de acordo com a invenção,consiste entre outros, no fato, de que o número de cópias de um polinucleotídeo de acordo com a invenção, que codifica uma variante da pirofosfatocinase GTP, na qual, na posição 38 ou na posição correspondente da sequência de aminoácidos codificada, está contido um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de Lprolina, aumenta em pelo menos uma (1) ou mais cópias. Um outro processo de acordo com a invenção, consiste em ligar um promotor funcionalmente com o polinucleotídeo.
[00214] O objeto da invenção são, além disso, micro-organismos, que apresentam uma maior concentração ou atividade das variantes da pirofosfatocinase GTP de acordo com a invenção no interior de suas células.
48/77 [00215] Adicionalmente, para a melhor produção de L-aminoácidos, pode ser vantajoso superexprimir vários genes nos mutantes de acordo com a invenção ou cepas recombinantes. Em geral, prefere-se utilizar genes endógenos.
[00216] Por genes endógenos ou sequência de nucleotídeos endógenos entendem-se os genes ou sequências de nucleotídeos ou alelos presentes na população de uma espécie.
[00217] Dessa maneira, para a preparação de L-lisina um ou vários dos genes, selecionados do grupo [00218] · um gene dapA que codifica uma sintase de dihidrodipicolinato (DapA, EC no 4.2.1.52), tal como, por exemplo, o gene dapA do tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum descrito na EP 0.197.335, [00219] · um gene lysA que codifica uma diaminopimelato descarboxilase (LysA, EC no 4.1.1.20), tal como, por exemplo, o gene lysA de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 descrito na US 6.090.597, [00220] · um gene zwf que codifica uma glicose-6-fosfato desidrogenase (Zwf, EC no 1.1.1.49), tal como, por exemplo, o gene zwf do tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum descrito na JP-A09224661 e EP-A-1108790, [00221] · os alelos zwf de Corynebacterium glutamicum descritos na US-2003-0175911-A1, que codificam uma proteína com atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase, na qual, por exemplo, a L-alanina é substituída por L-treonina na posição 243 da sequência de aminoácidos ou na qual o ácido L-asparagínico é substituído por L-serina na posição 245, [00222] · um gene pyc que codifica uma piruvato-carboxilase (Pyc,
EC no 6.4.1.1), tal como, por exemplo, o gene pyc do tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum descrito na DE-A-198 31 609 e EP 1108790,
49/77 [00223] · o alelo pyc de Corynebacterium glutamicum descrito na
EP 1.108.790, que codifica uma proteína com atividade de piruvatocarboxilase, na qual a L-prolina é substituída por L-serina na posição 458 da sequência de aminoácidos, [00224] · os alelos pyc de Corynebacterium glutamicum descritos na WO 02/31158 e especialmente EP 1325135B1, que codificam proteínas com atividade de piruvato-carboxilase, que portam uma ou várias das trocas de aminoácidos selecionadas do grupo L-valina na posição 1 substituída por L-metionina, ácido L-glutâmico na posição 153 substituída por ácido L-asparagínico, L-alanina na posição 182 substituída por L-serina, L-alanina na posição 206 substituída por L-serina, L-histidina na posição 227 substituída por L-arginina, L-alanina na posição 455 substituída por glicina e ácido L-asparagínico na posição 1120 substituída por ácido L-glutâmico, [00225] · um gene lysC que codifica uma aspartato cinase (LysC,
EC no 2.7.2.4), tal como, por exemplo, o gene lysC do tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum descrito como SEQ ID no: 281 na EPA-1108790 (vide também o número de acesso AX120085 e 120365) e aquele descrito como SEQ ID no: 25 na WO 01/00843 (vide o número de acesso AX063743), [00226] · um alelo lysCFBR que codifica uma variante de aspartato cinase resistente ao feed-back, especialmente correspondente à tabela 1, [00227] · um gene lysE que codifica uma proteína lisina-export (LysE), tal como, por exemplo, o gene lysE do tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum descrito na DE-A-195 48 222, [00228] · o gene aat que codifica uma aspartato-aminotransferase (Aat, EC no 2.6.1.1) (o gene aat de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 é descrito, por exemplo, por Kalinowski e colaboradores (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 5-25 (2003); vide também o núme50/77 ro de acesso NC_006958). Este é designado ali como gene aspB. Na US 6.004.773, o gene que codifica uma aspartato aminotransferase é designado como aspC. Marienhagen e colaboradores (Journal of Bacteriology 187 (22), 7693-7646 (2005) designam o gene aat como gene aspT)), [00229] · o gene zwa1 do tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum que codifica a proteína Zwa1 (US 6.632.644), pode ser superexprimido.
[00230] Além disso, para a produção de L-lisina pode ser vantajoso, além do emprego dos alelos do gene rel de acordo com a invenção, eventualmente com simultânea superexpressão de pelo menos um dos genes selecionados do grupo de genes mencionados acima, enfraquecer ou desligar um ou vários dos genes endógenos, selecionados do grupo [00231] · um gene pgi que codifica a glicose-6-fosfato-isomerase (Pgi, EC no 5.3.1.9), tal como, por exemplo, o gene pgi de Corynebacterium glutamicum descrito na US 6.586.214 e US 6.465.238, [00232] · um gene jom que codifica a homosserina-desidrogenase (Hom, EC no 1.1.1.3), tal como, por exemplo, o gene hom de Corynebacterium glutamicum descrito na EP-A-0131171, [00233] · um gene thrB que codifica uma homosserina-cinase (ThrB, EC no 2.7.1.39), tal como, por exemplo, o gene thrB de Corynebacterium glutamicum descrito por Peoples e colaboradores (Molecular Microbiology 2 (1988) : 63 - 72)) e [00234] · um gene pfkB que codifica uma fosfofruktocinase (PfkB,
EC no 2.7.1.56), tal como, por exemplo, o gene pfkB de Corynebacterium glutamicum descrito na WO 01/00844 (sequência no 57), [00235] · um gene mdh que codifica a malato-desidrogenase (Mdh,
EC no 1.1.1.37), tal como, por exemplo, descrito na WO 02/02778, [00236] · um gene mqo que codifica a oxidorredutase de malato51/77 quinona (Mqo, EC no 1.1.99.16), tal como, por exemplo, descrito na US 7.094.106 e PCT/EP2005/057216.
[00237] O termo enfraquecimento neste contexto, descreve a redução ou desligamento da atividade intracelular de uma ou várias enzimas (proteínas) em um micro-organismo, que são codificadas pelo DNA correspondente, utilizando, por exemplo, um promotor fraco ou utilizando um gene ou alelo, que codifica uma enzima correspondente com uma baixa atividade ou inativando o gene ou enzima (proteína) correspondente e combinando eventualmente essas medidas.
[00238] Através das medidas do enfraquecimento, a atividade ou concentração da proteína correspondente é geralmente reduzida para 0 a 75 %, 0 a 50 %, 0 a 25 %, 0 a 10 % ou 0 a 5 % da atividade ou concentração da proteína de tipo selvagem ou a atividade ou concentração da proteína no micro-organismo de partida.
[00239] Como mutações para a produção de um enfraquecimento, tomam-se em consideração as transições, transversões, inserções e deleções de pelo menos um (1) par de bases ou nucleotídeo. Em função do efeito da troca de aminoácidos provocada pela mutação sobre a atividade enzimática, fala-se de mutações de sentido incorreto (missense mutations) ou mutações sem sentido (nonsense mutations). A mutação de sentido incorreto leva a uma troca de um aminoácido dado em uma proteína por um outro, sendo que se trata especialmente de uma troca de aminoácido não conservativa. Por esse meio, a capacidade operacional ou atividade da proteína é prejudicada e reduzida para um valor de 0 a 75 %, 0 a 50 %, 0 a 25 %, 0 a 10 % ou 0 a 5 %. A mutação de sentido incorreto leva a um códon de terminação na região de codificação do gene e, com isso, a uma interrupção prematura da translação. Inserções ou deleções de pelo menos um par de bases em um gene levam a mutações do quadro de leitura (frame shift mutations), que levam a que aminoácidos falsos sejam incorporados ou a
52/77 translação seja prematuramente interrompida. Caso se forme um códon de terminação na região de codificação como consequência da mutação, então este leva também a uma interrupção prematura da translação. As medidas mencionadas são preferivelmente efetuadas na parte 5'-terminal da região de codificação, o qual codifica o Nterminal do polipeptídeo. Designando o comprimento total de um polinucleotídeo (medido como número dos L-aminoácidos quimicamente ligados) com 100 %, então - no âmbito da presente invenção - a parte da sequência de aminoácidos que, calculada a partir do aminoácido de partida L-formil-metionina, contém 80 % dos L-aminoácidos seguintes, pertence ao N-terminal do polipeptídeo.
[00240] Outras especificações para a produção de tais mutações pertencem ao estado da técnica e podem ser deduzidas de compêndios conhecidos da genética e biologia molecular, tais como, por exemplo, do compêndio de Knippers (Molekulare Genetik, 6a edição, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemanha, 1995), do de Winnacker (Gene und Klone, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1990) ou do de Hagemann (Allgemeine Genetik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986). Outras medidas são descritas no estado da técnica.
[00241] Um método para a redução visada da expressão gênica consiste em pôr o gene a ser enfraquecido sob o controle de um promotor induzível através da adição de quantidades dosadas de IPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranosídeo), tal como, por exemplo, do promotor trc ou do promotor tac. Vetores adequados para esse fim são, por exemplo, o vetor de expressão de Escherichia coli pXK99E (WO 0226787; apresentado de acordo com o contrato de Budapest em 31 de julho de 2001 em DH5alfa/pXK99E como DSM14440 na Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemanha)) ou pVWEx2 (Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des
53/77
Forschungszentrums Jülich, Jül-3397, ISSN 0994-2952, Jülich, Alemanha (1997)), que possibilitam uma expressão dependente de IPTG do gene clonado no Corynebacterium glutamicum.
[00242] Este método foi utilizado, por exemplo, na patente WO 0226787 para e expressão regulada do gene deaD através da integração do vetor pXK99EdeaD no genoma de Corynebacterium glutamicum e de Simic e colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327 (2002)) para a expressão regulada do gene glyA através da integração do vetor pK18mobglyA' em Corynebacterium glutamicum.
[00243] Um outro método para a redução específica da expressão gênica é a técnica antissenso, em que oligodesoxinucleotídeos curtos ou vetores são levados para as células alvo para a síntese de RNA antissenso mais longo. O RNA antissenso pode ligar-se ali a fragmentos complementares de mRNAs específicos e reduzir sua estabilidade ou bloquear a capacidade de translação. O técnico encontra um exemplo disso em Srivastava e colaboradores (Applied Environmental Microbiology 2000 outubro; 66 (10) : 4366 - 4371).
[00244] As bactérias corineformes isoladas obtidas através das medidas da invenção,mostram uma alta separação ou produção do aminoácido desejado em um processo de fermentação em comparação com a cepa de partida ou cepa mãe utilizada.
[00245] Por bactérias isoladas entendem-se os mutantes isolados ou produzidos de acordo com a invenção e bactérias recombinantes, especialmente bactérias corineformes, que contêm um alelo rel, que codifica uma pirofosfatocinase GTP, que contém a troca de aminoácidos descrita na posição 38 da sequência de aminoácidos.
[00246] A capacidade das bactérias isoladas ou do processo de fermentação com o emprego das mesmas com respeito a um ou vários dos parâmetros selecionados do grupo da concentração do produto
54/77 (produto por volume), do rendimento do produto (produto formado por fonte de carbono gasta) e da formação do produto (produto formado por volume e tempo) ou também de outros parâmetros do processo e combinações dos mesmos, é reduzida em pelo menos 0,5 %, pelo menos 1 %, pelo menos 1,5 % ou pelo menos 2 % em relação à cepa de partida ou cepa mãe ou o processo de fermentação com o emprego das mesmas.
[00247] As bactérias corineformes isoladas de acordo com a invenção, podem ser cultivadas continuamente - tal como, por exemplo, descrito na PCT/EP2004/008882 - ou descontinuamente no processo em bateladas (cultivo em bateladas ou no fed batch (processo de adição) ou processo repeated fed batch (processo de bateladas de adição repetidas) com a finalidade de produzir L-aminoácidos. No compêndio de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no compêndio de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) está disponível um resumo de natureza geral sobre métodos de cultivo conhecidos.
[00248] O meio de cultura ou meio de fermentação a ser utilizado deve satisfazer, de maneira adequada, às reivindicações das respectivas cepas. Descrições de meios de cultura de diversos microorganismos estão contidas no manual Manual of Methods for General Bacteriology da American Society for Bacteriology (Washington D.C., EUA, 1981). Os termos meio de cultura, meio de fermentação e meio nutriente ou meio podem ser mutuamente trocados.
[00249] Como fonte de carbono podem ser utilizados açúcar e carboidratos, tais como, por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, soluções contendo sacarose da produção de beterrabas ou cana-de-açúcar, amido, hidrolisado de amido e celulose, óleos e gorduras, tais como, por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol,
55/77 óleo de amendoim e gordura de coco, ácidos graxos, tais como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linólico, álcoois, tais como, por exemplo, glicerina, metanol e etanol e ácidos orgânicos, tal como, por exemplo, ácido acético. Essas substâncias podem ser utilizadas individualmente ou como mistura.
[00250] Como fonte de nitrogênio podem ser utilizados compostos orgânicos contendo nitrogênio, tais como peptonas, extratos de levedura, extrato de carne, extrato de malte, água de fonte de milho, farinha de soja e uréia ou compostos inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. As fontes de nitrogênio podem ser utilizadas individualmente ou como mistura.
[00251] Como fonte de fósforo, podem ser utilizados ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato dipotássico ou os sais contendo sódio correspondentes.
[00252] Além disso, o meio de cultura deve conter sais, por exemplo, na forma de cloretos ou sulfatos de metais, tais como, por exemplo, sódio, potássio, magnésio, cálcio e ferro, tal como, por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para o crescimento. Finalmente, adicionalmente às substâncias mencionadas acima, podem ser utilizadas substâncias de crescimento essenciais, tais como aminoácidos, por exemplo, homosserina e vitaminas, por exemplo, tiamina, biotina ou ácido pantotênico. Além disso, préestágios adequados do respectivo aminoácido podem ser acrescentados ao meio de cultura.
[00253] As substâncias usadas mencionadas podem ser acrescentadas à cultura na forma de uma preparação única ou (zugefüttert) de maneira adequada durante o cultivo.
[00254] Para o controle do pH da cultura são utilizados compostos básicos, tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amoníaco
56/77 ou água amoniacal ou compostos ácidos, tal como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, de maneira adequada. Em geral, o pH é ajustado para um valor de 6,0 a 9,0, preferivelmente 6,5 a 8. Para o controle do desenvolvimento de espuma podem ser utilizados antiespumantes, tal como, por exemplo, éster poliglicólico de ácido graxo. Para a manutenção da estabilidade dos plasmídeos, podem ser acrescentadas substâncias de ação seletiva adequadas ao meio, tais como, por exemplo, antibióticos. Para manter as condições aeróbicas, oxigênio ou misturas gasosas contendo oxigênio, tal como, por exemplo, ar, são introduzidos na cultura. O emprego de líquidos, que são enriquecidos com peróxido de hidrogênio, também é possível. Eventualmente, a fermentação é efetuada com superpressão, por exemplo, com uma pressão de 0,03 a 0,2 MPa. A temperatura da cultura encontra-se normalmente a 20oC a 45oC e preferivelmente a 25oC a 40oC. Nos processos às bateladas, o cultivo é prosseguido por tanto tempo, a se formar um máximo do aminoácido desejado. Este alvo é normalmente obtido dentro de 10 horas a 160 horas. Nos processos contínuos, são possíveis tempos de cultivo mais longos.
[00255] Meios de fermentação adequados são descritos, entre outros, na US 6.221.636, na US 5.840.551, na US 5.770.409, na US 5.605.818, na US 5.275.940, na US 4.275.157 e na US 4.224.409. [00256] Métodos para a determinação de L-aminoácidos são conhecidos do estado da técnica. A análise pode ser efetuada, por exemplo, tal como descrito por Spackman e colaboradores (Analytical Chemistry, 30 (1958), 1190) através de cromatografia de troca de ânions com subsequente derivatização da ninidrina ou ela pode ser efetuada por meio de HPLC de fase reversa, tal como descrito por Lindroth e colaboradores (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174). [00257] O objeto da invenção é, em conformidade com isso, um processo para a produção de um L-aminoácido, no qual
57/77 [00258] a) uma bactéria corineforme isolada fermenta em um meio adequado, sendo que a bactéria contém um gene que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, sendo que nas sequências de aminoácidos do polipeptídeo a L-prolina é substituída na posição 38 ou na posição correspondente por um outro aminoácido proteinogênico, preferivelmente L-leucina e [00259] b) o L-aminoácido acumula no caldo de fermentação ou nas células da bactéria corineforme isolada.
[00260] A isso segue-se, em geral, a coleta (collecting) do Laminoácido acumulado no meio nutriente ou no caldo de fermentação e/ou nas células das bactérias, para obter um produto sólido ou líquido.
[00261] Por um caldo de fermentação entende-se um meio de fermentação, no qual um micro-organismo foi cultivado por um determinado tempo e a uma determinada temperatura. O meio de fermentação ou o meio usado durante a fermentação contém/contêm todas as substâncias ou componentes, que assegura um crescimento do microorganismo e uma formação do aminoácido desejado.
[00262] No fim da fermentação, o caldo de fermentação formado contém, em conformidade com isso, a) a biomassa (massa celular) do micro-organismo formada em consequência do crescimento das células do micro-organismo, b) o aminoácido desejado, formado no decorrer da fermentação, c) os subprodutos orgânicos formados no decorrer da fermentação e d) os componentes não gastos pela fermentação do/dos meio de fermentação/meios de fermentação usados ou das substâncias de aplicação, tais como, por exemplo, vitaminas, tais como biotina, aminoácidos, como homosserina ou sais, tal como sulfato de magnésio.
[00263] Nos subprodutos orgânicos incluem-se substâncias, que são produzidas pelos micro-organismos usados na fermentação, even58/77 tualmente além dos respectivos L-aminoácidos desejados e eventualmente separados. Nestes incluem-se L-aminoácidos, que perfazem menos do que 30 %, 20 % ou 10 % em comparação com o aminoácido desejado. Nestes incluem-se, além disso, ácidos orgânicos, que portam um a três grupos carboxila, tais como, por exemplo, ácido acético, ácido lático, ácido cítrico, ácido málico ou ácido fumárico. Finalmente, incluem-se também açúcares, tal como, por exemplo, trealose.
[00264] Caldos de fermentação típicos adequados para fins industriais têm tipicamente um teor de aminoácido de 30 g/kg a 200 g/kg ou 40 g/kg a 175 g/kg ou 50 g/kg a 150 g/kg. O teor de biomassa (como biomassa seca) importa geralmente em 20 a 50 g/kg.
[00265] No caso do aminoácido L-lisina, são conhecidas essencialmente quatro diferentes formas de produção no estado da técnica. [00266] Produtos contendo um grupo L-lisina compreendem soluções alcalinas, aquosas, concentradas de L-lisina purificada (EP-B0534865). Um outro grupo, tal como, por exemplo, descrito na US 6.340.486 e US 6.465.025, compreende concentrados aquosos, ácidos, contendo biomassa de caldos de fermentação contendo L-lisina. O grupo mais conhecido de produtos sólidos compreende formas pulverizadas ou cristalinas de L-lisina purificada ou pura, que está tipicamente presente na forma de um sal, tal como, por exemplo, monocloridrato de L-lisina. Um outro grupo de formas de produto sólidas é descrito, por exemplo, na EP-B-0533039. A forma de produto ali descrita contém, além da lisina, a maior parte das substâncias de aplicação usadas durante a produção fermentativa e não gasta e eventualmente a biomassa do micro-organismo usado com uma proporção de >0 % 100 %.
[00267] No caso dos aminoácidos L-valina, L-isoleucina, L-prolina, L-triptofano e L-homosserina, conhecem-se no estado da técnica essencialmente formas de produto, que contêm os respectivos aminoáci59/77 dos em forma purificada ou pura (> 95 % em peso ou > 98 % em peso).
[00268] Em relação às várias formas de produto, conhecem-se os mais diferentes processos, nos quais o L-aminoácido é colhido, isolado ou purificado do caldo de fermentação, para produzir o produto contendo L-aminoácido ou o L-aminoácido purificado.
[00269] Para produzir L-aminoácidos puros, sólidos, utilizam-se essencialmente métodos da cromatografia de troca de íons, eventualmente com o emprego de carvão ativo e métodos de cristalização. No caso da lisina, obtém-se, dessa maneira, a base correspondente ou um sal correspondente, tal como, por exemplo, o monocloridrato (LysHCl) ou o sulfato de lisina (Lys2-H2SO4).
[00270] No caso da lisina, a EP-B-0534865 descreve um processo para a produção de soluções de caldos de fermentação contendo Llisina básica, aquosa. No processo ali descrito, a biomassa é separada do caldo de fermentação e rejeitada. Por meio de uma base, tal como, por exemplo, hidróxido de sódio, potássio ou amônio, é ajustado um pH entre 9 a 11. Os componentes minerais (sais inorgânicos) são separados através de cristalização do caldo após a concentração e resfriamento e utilizados como adubo ou rejeitados.
[00271] Nos processos para a produção de lisina com o emprego das bactérias de acordo com a invenção, são utilizados também aqueles processos, nos quais são obtidos produtos, que contêm componentes do caldo de fermentação. Esses são especialmente empregados como aditivos de rações animais.
[00272] Dependendo das exigências, a biomassa pode ser total ou parcialmente removida do caldo de fermentação através de métodos de separação, tais como, por exemplo, da centrifugação, da filtração, da decantação ou de uma combinação das mesmas ou ser totalmente deixada nesta. Eventualmente, a biomassa ou o caldo de fermentação
60/77 contendo a biomassa é inativada durante um estágio de processo adequado, por exemplo, através de tratamento térmico (aquecimento) ou através da adição de ácido.
[00273] Os componentes químicos da biomassa são, entre outros, o invólucro celular, por exemplo, o peptidoglicano e o arabinogalactano, a proteína ou polipeptídeo, por exemplo, o polipeptídeo pirofosfatocinase GTP, lipídeos e fosfolipídeos e ácidos nucleicos (DNA e RNA), por exemplo, polinucleotídeos contendo a mutação de acordo com a invenção. Como consequência das medidas de inativação e/ou dos outros estágios do processo (por exemplo, acidificação, secagem por atomização, granulação e outros), os ácidos nucleicos estão tipicamente presentes como fragmentos com um comprimento, entre outros, de > 40 - 60 bp, > 60 - 80 bp, > 80 - 100 bp, > 100 - 200 bp, > 200 300 bp, > 300 - 400 bp, > 400 - 500 bp, > 500 - 750 bp, > 750 - 1000 bp, > 1000 - 1250 bp, > 1250 - 1500 bp, > 1500 - 1750 bp, > 1750 2000 bp, > 2000 - 2500 bp, > 2500 - 3000 bp, > 3000 - 4000 bp, > 4000 - 5000 bp.
[00274] Em um modo operacional, a biomassa é totalmente ou quase totalmente removida, de maneira que não remanesce nenhum (0 %) ou no máximo, 30 %, no máximo 20 %, no máximo 10 %, no máximo 5 %, no máximo 1 % ou no máximo 0,1 % de biomassa no produto produzido. Em um outro modo operacional, a biomassa não é removida ou somente em proporções insignificantes, de maneira que todos os (100 %) ou mais do que 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % ou 99,9 % de biomassa remanescem no produto produzido. Em um processo de acordo com a invenção, consequentemente, a biomassa é removida em proporções de > 0 % a < 100 %.
[00275] Finalmente, o caldo de fermentação obtido após a fermentação pode ser ajustado para um pH ácido antes ou após a remoção total ou parcial da biomassa com um ácido inorgânico, tal como, por
61/77 exemplo, ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico ou ácido orgânico, tal como, por exemplo, ácido propiônico (GB 1.439.728 ou EP 1.331.220). Do mesmo modo, é possível, acidificar o caldo de fermentação com a biomassa totalmente contida (US 6.340.486 ou US 6.465.025). Finalmente, o caldo pode ser estabilizado também através da adição de bissulfito de sódio (NaHSO3, GB 1.439.728) ou com um outro sal, por exemplo, sal de amônio, de metal alcalino ou de metal alcalinoterroso ou ácido sulfuroso.
[00276] Sólidos orgânicos ou inorgânicos eventualmente contidos no caldo de fermentação são parcial ou totalmente removidos da separação da biomassa. Os subprodutos orgânicos dissolvidos no caldo de fermentação e os componentes dissolvidos não gastos do meio de fermentação (substâncias de aplicação) permanecem pelo menos parcialmente (> 0 %), preferivelmente em pelo menos 25 %, de modo particularmente preferido, em pelo menos 50 % e de modo particularmente preferido, em pelo menos 75 % no produto. Eventualmente, esses também permanecem totalmente (100 %) ou quase totalmente, isto é, em > 95 % ou > 98 % no produto. Neste sentido, o termo base de caldo de fermentação significa, que um produto contém pelo menos uma parte dos componentes do caldo de fermentação.
[00277] Em seguida, retira-se a água do caldo com métodos conhecidos, tais como, por exemplo, com auxílio de um evaporador rotativo, evaporador de camada fina, evaporador de película em queda, através de osmose inversa ou através de nanofiltração. Em seguida, esse caldo de fermentação concentrado pode ser processado por métodos de liofilização, de secagem por atomização, de granulação por atomização ou por outros processos, tais como, por exemplo, são descritos na camada fluidizante circulante de acordo com a PCT/EP2004/006655, para formar produtos escoáveis, especialmente para formar um produto finamente dividido ou preferivelmente granulado de grãos grossos.
62/77
Eventualmente, isola-se um produto desejado do granulado obtido através de peneiração ou separação do pó.
[00278] Do mesmo modo, é possível secar diretamente o caldo de fermentação, isto é, sem prévia concentração, através de secagem por atomização ou granulação por atomização.
[00279] Por escoável entendem-se pós, que escorrem de forma desimpedida de uma série de recipientes de descarga de vidro com aberturas de descarga de diferente tamanho, pelo menos, de um recipiente com a abertura de 5 mm (milímetros) (Klein: Seifen, Ole, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).
[00280] Com finamente dividido entende-se um pó com proporção preponderante (> 50 %) com um tamanho de grão de 20 a 200 pm de diâmetro.
[00281] Com grãos grossos entende-se um produto com uma proporção preponderante (> 50 %) de um tamanho de grão de 200 a 200 pm de diâmetro.
[00282] A determinação do tamanho do grão pode ser efetuada com métodos da espectroscopia de difração a laser. Os métodos correspondentes são descritos no compêndio para a Teilchengrõpenmessung in der Laborpraxis de R. H. Müller e R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) ou no compêndio Introduction to Particle Technology de M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998).
[00283] O pó escoável, finamente dividido pode ser novamente convertido para um produto de grãos grossos, bem escoável, armazenável e amplamente livre de pó através de processos de compactação ou granulação adequados.
[00284] O termo livre de pó significa, que o produto contém meramente pequenas proporções (< 5 %) de tamanhos de grãos inferiores a 100 pm de diâmetro.
63/77 [00285] Armazenável no sentido desta invenção,significa um produto, que pode ser armazenado por pelo menos um (1) ano ou mais, preferivelmente por pelo menos 1,5 anos ou mais, de modo particularmente preferido, por dois (2) anos ou mais em meio seco e refrigerado sem a ocorrência de uma perda essencial (< 5 %) do respectivo aminoácido.
[00286] Um outro objeto da invenção é, em conformidade com isso, um processo para a produção de um produto contendo L-aminoácido, preferivelmente L-lisina ou L-triptofano, preferivelmente um aditivo de ração animal, de caldos de fermentação, caracterizado pelos estágios [00287] a) cultivo e fermentação de uma bactéria corineforme que separa L-aminoácido, a qual contém pelo menos um alelo rel, que codifica um polipeptídeo com atividade de pirofosfatocinase GTP, que compreende uma sequência de aminoácidos, na qual na posição 38 ou posição comparável, está contido um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção de L-prolina, preferivelmente L-leucina, em um meio de fermentação, [00288] b) remoção da biomassa formada durante a fermentação em uma quantidade de 0 a 100 % em peso e [00289] c) secagem do caldo de fermentação obtido de acordo com
a) e/ou b), para obter o produto na forma de pó ou granulado desejada, sendo que eventualmente antes do estágio b) ou c) é acrescentado um ácido selecionado do grupo do ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou ácido clorídrico. Preferivelmente em seguida ao estágio a) ou b), remove-se a água do caldo de fermentação contendo L-aminoácido (concentração).
[00290] Um outro objeto da invenção é um processo para a produção de um produto contendo sulfato de lisina, que é descrito em suas características na DE 102006016158 e no qual o caldo de fermentação
64/77 obtido com o emprego dos micro-organismos de acordo com a invenção, a partir do qual a biomassa foi eventualmente total ou parcialmente separada, é transformado, em que se efetua um processo, que compreende pelo menos os seguintes estágios:
[00291] a) diminuir o pH para 4,0 a 5,2, especialmente 4,9 a 5,1 através da adição de ácido sulfúrico e ajustar uma proporção molar de sulfato/L-lisina de 0,85 a 1,2, preferivelmente 0,9 a 1,0, de modo particularmente preferido, > 0,9 a < 0,95, no caldo, eventualmente através da adição de um outro ou vários composto(s) contendo sulfato e [00292] b) concentrar a mistura obtida dessa maneira através de desidratação e eventualmente granular, sendo que eventualmente antes do estágio a) é/são efetuada(s) uma ou as duas das seguintes medidas:
[00293] c) medição da proporção molar do sulfato/L-lisina para determinar a quantidade necessária de composto(s) contendo sulfato, [00294] d) adição de um composto contendo sulfato selecionado do grupo do sulfato de amônio, hidrogenossulfato de amônio e ácido sulfúrico em proporções correspondentes.
[00295] Eventualmente, além disso, antes do estágio b) acrescentase um sal do ácido sulfuroso, preferivelmente hidrogenossulfato de metal alcalino, de modo particularmente preferido, hidrogenossulfato de sódio, em uma concentração de 0,01 a 0,5 % em peso, preferivelmente 0,1 a 0,3 % em peso, de modo particularmente preferido, de 0,1 a 0,2 % em peso, em relação ao caldo de fermentação.
[00296] Como compostos preferidos contendo sulfato no sentido dos estágios do processo mencionados acima, são especialmente mencionados o sulfato de amônio e/ou hidrogenossulfato de amônio ou misturas correspondente de amoníaco e ácido sulfúrico e o próprio ácido sulfúrico.
[00297] A proporção molar de sulfato/L-lisina V é calculada de a65/77 cordo com a fórmula: V = 2 x [SO4 2-] / L-lisina]. Essa fórmula considera o fato, de que o ânion SO4 2- é bivalente. Uma proporção V = 1 significa, que há uma Lys2 (SO4) estequiometricamente composta, enquanto em uma proporção de V = 0,9 é encontrado uma falta de 10 % de sulfato e em uma proporção de V = 1,1, um excesso de 10 % de sulfato. [00298] A vantagem da granulação ou compactação é o uso de substâncias auxiliares orgânicas ou inorgânicas usuais, ou veículos, tais como amido, gelatina, derivados de celulose ou substâncias similares, tais como são normalmente utilizados no processamento de alimentos ou forragem como adesivos, agentes de gelificação ou espessantes, ou de outras substâncias, tais como, por exemplo, ácidos silícicos, silicatos (EP 0743016A) ou estearatos.
[00299] Além disso, é vantajoso prover a superfície dos granulados obtidos com óleo, tal como está descrito na WO 04/054381. Como óleos podem ser utilizados óleos minerais, óleos vegetais ou misturas de óleos vegetais. Exemplos de tais óleos são óleo de soja, óleo de oliva, misturas de óleo de soja/lecitina. Da mesma maneira, também são adequados óleos de silicone, polietilenoglicóis ou hidroxietilcelulose. Através do tratamento das superfícies com os óleos mencionados, obtém-se uma alta estabilidade à abrasão do produto e uma redução da proporção de poeira. O teor de óleo no produto importa em 0,02 a 2,0 % em peso, preferivelmente 0,02 a 1,0 % em peso e de modo muito particularmente preferido, 0,2 a 1,0 % em peso, em relação à quantidade total do aditivo de forragem.
[00300] É dada preferência aos produtos com uma proporção de > 97 % em peso, de um tamanho de grão de 100 a 1800 pm ou com uma proporção de > 95 % em peso, de um tamanho de grão de 300 a 1800 pm de diâmetro. A proporção de poeira, isto é, partículas com um tamanho de grão < 100 pm encontra-se preferivelmente em > 0 a 1 % em peso, de modo particularmente preferido, em no máximo 0,5 % em
66/77 peso.
[00301] Mas alternativamente, o produto também pode ser absorvido em um veículo orgânico ou inorgânico conhecido e usual no processamento de forragens, tal como, por exemplo, ácidos silícicos, silicatos, cereais triturados, farelos, farinhas, amidos, açúcares ou outros e/ou misturado com espessantes ou adesivos usuais e estabilizado. Exemplos de aplicação e processos para este fim são descritos na literatura (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, página 817). [00302] Finalmente, o produto também através de processos de revestimento (coating) com formadores de película, tais como, por exemplo, carbonatos de metais, ácidos silícicos, silicatos, alginatos, estearatos, amidos, borrachas e éteres de celulose, tal como descrito na DE-C-4100920, pode ser levado a um estado, no qual este é estável contra a digestão através dos estômagos de animais, especialmente estômago de ruminantes.
[00303] Para ajustar uma concentração de aminoácido desejada no produto, conforme a exigência, o aminoácido correspondente pode ser acrescentado durante o processo na forma de um concentrado ou eventualmente de uma substância amplamente pura ou seu sal, em forma líquida ou sólida. Esses podem ser acrescentados individualmente ou como misturas ao caldo de fermentação obtido ou concentrado ou também durante o processo de secagem ou granulação. [00304] Um outro objeto da invenção é um processo para a produção de um produto sólido contendo lisina, tal como é descrito em suas características na US 20050220933 e que compreende o processamento do caldo de fermentação obtido com o emprego dos microorganismos de acordo com a invenção, nos seguintes estágios:
[00305] a) filtração do caldo de fermentação, preferivelmente com um filtro de membrana, de maneira que se obtém uma lama contendo biomassa e um filtrado,
67/77 [00306] b) concentração do filtrado, preferivelmente de modo tal, que se obtém um teor sólido de 48 a 52 % em peso, [00307] c) granulação do concentrado obtido no estágio b), preferivelmente a uma temperatura de 50oC a 62oC e [00308] d) revestimento do granulado obtido em c) com um ou vários dos agentes de revestimento (coating agent (s)).
[00309] Para o revestimento no estágio d), utilizam-se preferivelmente agentes de revestimento, que são selecionados do grupo, consistindo [00310] d1) na biomassa obtida no estágio a), [00311] d2) em um composto contendo L-lisina, preferivelmente selecionado do grupo do cloridrato de L-lisina ou sulfato de L-lisina, [00312] d3) em uma substância essencialmente livre de L-lisina com teor de L-lisina < 1 % em peso, preferivelmente < 0,5 % em peso, preferivelmente selecionada do grupo amido, carragenano, ágar, ácidos silícicos, silicatos, cereais triturados, farelos e farinhas e [00313] d4) em uma substância hidrorrepelente, preferivelmente selecionada do grupo dos óleos, polietilenoglicóis e parafinas líquidas. [00314] No caso da lisina, a proporção dos íons na produção de produtos contendo lisina é preferivelmente ajustada de modo tal, que a proporção de íons equivalente de acordo com a seguinte fórmula
2x[SO4 2-]+ [Cl-]-[NH4+]-[Na']-[K+]-2x[Mg2+]-2x[Ca2+]/[L-Lys] perfaz 0,68 a 0,95, preferivelmente 0,68 a 0,90, tal como descrito por Kushiki e colaboradores na US 20030152633 (nos [ ] são indicadas as concentrações molares).
[00315] No caso da lisina, o produto sólido à base de caldo de fermentação produzido dessa maneira, tem um teor de lisina (como base de lisina) de 10 % em peso a 70 % em peso ou 20 % em peso a 70 % em peso, preferivelmente 30 % em peso a 70 % em peso e de modo muito particularmente preferido, de 40 a 70 % em peso, em relação à
68/77 massa seca do produto. Do mesmo modo, são possíveis teores máximos de base de lisina de 71 % em peso, 72 % em peso, 73 % em peso.
[00316] No caso de um aminoácido eletricamente neutro, tal como do L-triptofano, o produto sólido à base de caldo de fermentação produzido dessa maneira, tem um teor de aminoácido de pelo menos 5 % em peso, 10 % em peso, 20 % em peso, 30 % em peso e no máximo, 50 % em peso, 60 % em peso, 70 % em peso, 80 % em peso, 90 % em peso ou a 95 % em peso.
[00317] O teor de água do produto sólido perfaz a 5 % em peso, preferivelmente a 4 % em peso e de modo particularmente preferido, menos do que 3 % em peso.
[00318] Portanto, o objeto da invenção é também um aditivo de forragem contendo L-lisina à base de caldo de fermentação, o qual apresenta as seguintes características:
[00319] a) um teor de lisina (como base) de, pelo menos, 10 % em peso, a o máximo de 73 % em peso, [00320] b) um teor de água de, no máximo, 5 % em peso e [00321] c) um teor de biomassa correspondendo a pelo menos 0,1 % da biomassa contida no caldo de fermentação, sendo que a biomassa eventualmente inativada é formada a partir de bactérias corineformes de acordo com a invenção.
[00322] Portanto, o objeto da invenção é também um aditivo de forragem contendo L-triptofano à base de caldo de fermentação, o qual apresenta as seguintes características:
[00323] a) um teor de triptofano de, pelo menos, 5 % em peso a o máximo de 95 % em peso, [00324] b) um teor de água de, no máximo, 5 % em peso e [00325] c) um teor de biomassa correspondendo a pelo menos 0,1 % da biomassa contida no caldo de fermentação, sendo que a bio69/77 massa eventualmente inativada é formada a partir de bactérias corineformes de acordo com a invenção.
[00326] A cepa MH20-22B foi depositada em 28 de outubro de 2004 na Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) como DSM 16835.
[00327] O mutante Corynebacterium glutamicum DM1915 de acordo com a invenção, que contém L-leucina na posição 38 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo rel, foi depositado em 15 de maio de 2006 na Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) como DSM 18257.
[00328] A presente invenção é detalhadamente ilustrada abaixo, com base em exemplos de concretização.
Exemplo 1
Mutagênese da cepa DM1797 produtora de L-lisina [00329] A cepa Corynebacterium glutamicum DM 1797 foi utilizada como cepa de partida para a mutagênese com N-metil-N'-nitro-Nnitrosoguanidina (MNNG). A cepa DM1797 é um mutante de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 resistente a aminoetilcisteína e depositada sob a designação DSM16833 na Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemanha). [00330] A cepa DM1797 foi cultivada em 10 ml de LB-Bouillon (Merck, Darmstadt, Alemanha), que estavam contidos em um balão Erlenmeyer de 100 ml, por 24 horas a 33oC e 200 rotações por minuto, em um agitador de rotação do tipo Certomat BS-1 (B. Braun Biotech International, Melsungen, Alemanha). Em seguida, a cultura foi centrifugada, o sedimento re-suspenso em 10 ml de uma solução de NaCl a 0,9 %, a suspensão obtida foi novamente centrifugada e o sedimento obtido retomado em 10 ml de solução de NaCl a 0,9 %. 5 ml dessa suspensão de células foram tratados com 400 pg/ml de MNNG por 15 minutos a 30oC e 200 rotações por minuto em um agitador (vide aci70/77 ma). Em seguida, a preparação de mutagênese foi centrifugada e o sedimento retomado em 10 ml de tiossulfato de Na a 2 % foi retomado em 0,9 % de tampão de NaCl (pH = 6,0). A seguir, a suspensão de células na proporção de 1:1000, 1:10000 e 1:100000 foi diluída com de solução de NaCl a 0,9 % e alíquotas foram plaqueadas em ágar cérebro-coração (Merck, Darmstadt, Alemanha). Dessa maneira, foram isolados aproximadamente 4500 mutantes.
Exemplo 2
Teste de capacidade dos mutantes da cepa DM1797 [00331] Os mutantes obtidos no exemplo 1 foram cultivados em um meio nutriente adequado para a produção de lisina e o teor de lisina foi determinado no sobrenadante da cultura.
[00332] Para isso, inicialmente os clones foram multiplicados por meio de plaqueamento em ágar de cérebro-coração (Merck, Darmstadt, Alemanha) a 33oC por 24 horas. Partindo dessas culturas em placas de ágar, uma pré-cultura cada foi inoculada (10 ml de meio no balão Erlenmeyer de 100 ml). Como meio para a pré-cultura foi utilizado o meio MM. A pré-cultura foi incubada a 33oC e 240 rotações por minuto por 24 horas em um agitador. Desta pré-cultura foi inoculada uma cultura principal, de maneira que o OD inicial (660 nm) da cultura principal perfez 0,1 OD. Para a cultura principal, utilizou-se igualmente o meio MM.
Meio MM
CSL 5 g/l
MOPS 20 g/l glicose (autoclavada separadamente) 50 g/l
Sais:
(NH4)2SO4) KH2PO4 MgSO4 * 7 H2O g/l
0,1 g/l
1,0 g/l
71/77
CaCl2 * 2 H2O 10 mg/l
FeSO4 * 7 H2O 10 mg/l
MnSO4 * H2O 5,0 mg/l biotina (filtrada estéril) 0,3 mg/l tiamina * HCl (filtrada estéril) 0,2 mg/l
CaCO3 25 g/l [00333] CSL (Corn Steep Liquor), MOPS (ácido morfolinopropanossulfônico) e a solução salina foram ajustados para pH 7 com água amoniacal e autoclavados. Em seguida, acrescentaram-se as soluções de substrato e vitamina estéreis, bem como o CaCO3 autoclavado seco.
[00334] O cultivo foi efetuado em volumes de 10 ml, que estavam contidos em um balão Erlenmeyer de 100 ml com defletores. A temperatura perfez 33oC, o número de rotações, 250 rotações por minuto e a umidade atmosférica, 80 %.
[00335] Após 24 horas, a densidade óptica (OD) com um comprimento de onda de medição de 660 nm, foi determinada com o Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munique, Alemanha). A quantidade de lisina formada foi determinada com um analisador de aminoácido da Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemanha) por meio de cromatografia de troca de íons e derivatização de pós-coluna com detecção de ninidrina. Um mutante, que se distinguiu por uma alta formação de lisina, foi designado como DM1915.
Tabela 1
cepa OD (660) lisina-HCl
DM1797 9,3 2,2
DM1915 9,2 2,4
Exemplo 3
Sequenciamento do alelo rel do mutante DM1915 [00336] DNA cromossomal foi isolado a partir do clone DM1915 com o método de Eikmanns e colaboradores (Microbiology 140: 1817
72/77
- 1828 (1994)). Um fragmento de DNA, o qual porta o gene rel ou alelo, foi amplificado com auxílio da reação em cadeia de polimerase. Com base na sequência do gene rel conhecida para C. glutamicum (sequência no 1824 da EP 1108790), os seguintes oligonucleotídeos iniciador foram selecionados para PCR:
rel_XL_A1 (SEQ ID no: 19);
5' gcgaattcta tcggatggaa catgaccg 3' rel_XL_A2 (SEQ ID no: 20):
5' gcgaattcat gcggatgcca acaagatc 3' [00337] Os iniciadores apresentados foram sintetizados pela MWG Biotech (Ebersberg, Alemanha) e a reação PCR foi efetuada de acordo com o método PCR padrão de Innis e colaboradores (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press). Os iniciadores possibilitam a amplificação de um fragmento de DNA com comprimento de aproximadamente 1,53 kb, o qual porta o gene rel ou alelo. Além disso, os iniciadores contêm a sequência para um ponto de interseção da endonuclease de restrição EcoRI, que na sucessão de nucleotídeos representados acima está marcada por meio de sublinhados.
[00338] O fragmento de DNA amplificado com comprimento de aproximadamente 1,53 kb, que porta o alelo rel da cepa DM 1915, foi identificado através de eletroforese em um gel de agarose a 0,8 %, isolado do gel e purificado com métodos usuais (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden).
[00339] A sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA amplificado ou do produto PCR foi determinada pela Agowa (Berlin, Alemanha) através de sequenciação. A sequência do produto PCR está representada na SEQ ID no: 15. A sequência da região de codificação está adicionalmente representada na SEQ ID no: 5. A sequência de aminoácidos da respectiva proteína pirofosfatocinase GTP resultante
73/77 com auxílio do programa Patentin, está representa na SEQ ID no: 6. [00340] Na posição 113 da sequência de nucleotídeos da região de codificação do alelo rel da cepa DM1915, encontra-se a base timina (SEQ ID no:5). Na posição correspondente do gene de tipo selvagem encontra-se a base citosina (SEQ ID no: 1).
[00341] Na posição 38 da sequência de aminoácidos da proteína pirofosfatocinase GTP da cepa DM1915 encontra-se o aminoácido leucina (SEQ ID no: 6). O aminoácido prolina (SEQ ID no: 2) encontrase na posição correspondente da proteína de tipo selvagem.
[00342] O alelo rel, que contém a base timina na posição 113 da região de codificação e em conformidade com isso, codifica uma proteína pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 da sequência de aminoácidos contém o aminoácido leucina, é designado, a seguir, como alelo rel_P38L. Na designação rel_P38L, P representa L-prolina, L representa L-leucina e 38 indica a posição da troca de aminoácidos (vide SEQ ID no: 2 e 6).
[00343] O mutante Corynebacterium glutamicum DM1915, que contém L-leucina na posição 38 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo rel, foi depositado em 15 de maio de 2006 na Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) como DSM 18257.
Exemplo 4
Troca do gene de tipo selvagem rel da cepa DM1797 pelo alelo rel P38L
4.1 Construção do vetor de troca pK18mobsacB rel P38L [00344] O fragmento de DNA com comprimento de cerca de 1,53 kb produzido por meio de PCR, descrito no exemplo 3, que porta o alelo rel_P38L, foi incorporado no cromossoma da cepa de C. glutamicum DM1797 descrita no exemplo 1, por meio de mutagênese de troca com auxílio do sistema sacB descrito por Schafer e colaboradores (Gene,
74/77
14, 69-73 (1994)). Esse sistema possibilita a produção ou a seleção de trocas de alelos, que se realiza através de recombinação homóloga. [00345] Para isso, o fragmento rel_P38L com tamanho de cerca de 1,53 kb, foi dissociado com a endonuclease de restrição EcoRI, identificado através de eletroforese em um gel de agarose a 0,8 % e em seguida, isolado do gel e purificado com os métodos usuais (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden).
[00346] O vetor de clonagem pK18mobsac mobilizável foi digerido com a enzima de restrição EcoRI e as extremidades foram desfosforiladas com fosfatase alcalina (fosfatase alcalina, Boehringer Mannheim, Alemanha). O vetor preparado dessa maneira foi misturado com o fragmento rel_P38L com cerca de 1,53 kb e a preparação tratada com T4-DNA-ligase (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemanha).
[00347] Em seguida, a cepa de E. coli S17-1 (Simon e colaboradores, Bio/Technology 1: 784-791, 1993) foi transformada com preparação de ligação (Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989). A seleção das células portadoras de plasmídeo foi efetuada através do plaqueamento da preparação de transformação sobre ágar LB (Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor, Nova York, 1989), que foi suplementado com 25 mg/l de kanamicina.
[00348] O plasmídeo-DNA foi isolado de um transformante com auxílio do kit QIAprep Spin Miniprep da Qiagen e através da dissociação de restrição foi examinado com a enzima PstI e subsequente eletroforese de gel de agarose. O plasmídeo é mencionado pK18mobsacB_rel_P38L e está representado na figura 1.
4.2 Troca de alelos [00349] O vetor pK18mobsacB_rel_P38L mencionado no exemplo
4.1, foi transferido através de conjugação, de acordo com um protocolo
75/77 de Schafer e colaboradores (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)), para a cepa C. glutamicum DM1797. O vetor não pode replicar independentemente no DM1797 e só permanece na célula, se ele estiver presente de forma integrada no cromossoma, como consequência de uma ocorrência de recombinação. A seleção de transconjugados, isto é, de clones com pK18mobsacB_rel_P38L integrado foi efetuada através de plaqueamento da preparação de conjugação sobre ágar LB (Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor, Nova York, 1989), que foi suplementado com 15 mg/l de kanamicina e 50 mg/l de ácido nalidixínico. Transconjugados resistentes à kanamicina foram riscados em placas de ágar LB com 25 mg/l de kanamicina e incubados a 33oC por 24 horas. Para a seleção de mutantes, nos quais, como consequência de uma segunda ocorrência de recombinação, realizou-se a excisão do plasmídeo, os clones foram cultivados não seletivamente em meio líquido LB por 30 horas, em seguida, riscados sobre ágar LB com 10 % de sucrose e incubados por 16 horas.
[00350] O plasmídeo pK18mobsacB_rel_P38L contém, do mesmo modo como o plasmídeo de partida pK18mobsacB, além do gene resistente à kanamicina, uma cópia do gene sacB que codifica a levansucrase de Bacillus subtilis. A expressão induzível através da sucrose leva à formação da levan-sucrase, que catalisa a síntese do produto levan tóxico para C. glutamicum. No ágar LB com sucrose crescem, portanto, somente aqueles clones, nos quais o pK18mobsacB_rel_P38L integrado excisiu como consequência de uma segunda ocorrência de recombinação. Dependendo da condição da segunda ocorrência de recombinação em relação ao local da mutação, a troca de alelos ou a incorporação da mutação é realizada na excisão ou uma cópia original permanece no cromossoma do hospedeiro.
76/77 [00351] Cerca de 40 a 50 colônias foram testadas para o fenótipo crescimento na presença de sucrose e não crescimento na presença de kanamicina. Em quatro colônias, que apresentaram o fenótipo crescimento na presença de sucrose e não crescimento na presença de kanamicina, uma região do gene rel que sobretensiona a mutação P38L, partindo do iniciador de sequenciamento rel-2 (corresponde à sequência de nucleotídeos posição 695-714 da sequência de SEQ ID no: 3 posicionada a montante do CDS do gene rel), foi sequenciada pela Agowa (Berlin, Alemanha), para comprovar, que a mutação do alelo rel_P38L está presente no cromossoma. Para isso, o iniciador rel-2 utilizado foi sintetizado pela Agowa:
rel-2:
5' ccg tca ttg tgg tca gag at 3' [00352] Dessa maneira, foi identificado um clone, que contém a base timina na posição 113 da região de codificação do gene rel e assim, possui o alelo rel_P38L. Este clone foi designado como cepa DM1797rel_P38L.
Exemplo 6
Comparação da capacidade da cepa DM1797rel P38L com a cepa de partida DM1797 [00353] O teste de capacidade da cepa de C. glutamicum DM1797rel_P38L obtida no exemplo 5 foi efetuado tal como descrito no exemplo 2. O resultado do ensaio está representado na tabela 2. Tabela 2 cepa OD (660 nm) lisina-HCl g/l
DM1797 9,3 2,2
DM1797rel_P38L 9,2 2,5
Rápida descrição da figura:
Figura 1: Carta do plasmídeo pK18mobsacB rel P38L.
[00354] As abreviações e designações utilizadas têm o seguinte significado. No caso da especificação dos números dos pares de ba77/77 ses trata-se de valores aproximados, que são obtidos no âmbito da capacidade de reprodução de medições.
[00355] Kan: gene resistente à kanamicina [00356] EcoRI: ponto de interseção da enzima de restrição EcoRI [00357] PstI: ponto de interseção da enzima de restrição PstI [00358] rel: alelo rel_P38L [00359] sacB: gene sacB [00360] RP4-mob: região mob com a origem de replicação para a transferência (oriT) [00361] oriV: origem de replicação V
1/4

Claims (19)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Mutante isolado de bactéria corineforme, caracterizado pelo fato de que compreende um gene que codifica um polipeptídeo com atividade pirofosfatocinase GTP compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5, ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
  2. 2. Mutante de bactéria corineforme, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria corineforme é bactéria selecionada dentre o grupo que consiste em Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes e Corynebacterium aminogenes.
  3. 3. Mutante de bactéria corineforme, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é uma bactéria secretora de L-aminoácido, preferencialmente uma bactéria secretoras de L-lisina, L-valina, L-isoleucina, L-triptofano ou L-homoserina.
  4. 4. Mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o gene compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7.
  5. 5. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5, ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
  6. 6. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a sua sequência de nucleotídeos compreende SEQ ID NO: 5.
  7. 7. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo isolado como definido na reivindicação 5 ou 6.
  8. 8. Microrganismo recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende polinucleotídeo isolado como definido na reivindicação
    Petição 870170063878, de 30/08/2017, pág. 8/11
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    5 ou 6 ou o vetor como definido na reivindicação 7.
  9. 9. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é uma bactéria corineforne ou uma bactéria do gênero Escherichia.
  10. 10. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que é do gênero Corynebacterium.
  11. 11. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é da espécie Corynebacterium glutamicum.
  12. 12. Processo para a produção de um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que compreende (a) fermentar uma bactéria corinefone isolada em um meio adequado, em que a referida bactéria contém pelo menos uma cópia de um gene que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, em que o gene compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5, ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e (b) concentrar o L-aminoácido no caldo de fermentação ou nas células da referida bactéria.
  13. 13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a bactéria corineforme isolada é um mutante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou uma bactéria corineforme recombinante que contém um polinucleotídeo isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, ou que foi produzido com o emprego deste último.
  14. 14. Processo, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é isolado ou acumulado e preferencialmente purificado.
    Petição 870170063878, de 30/08/2017, pág. 9/11
    3/4
  15. 15. Processo, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é isolado ou acumulado em conjunto com componentes do caldo de fermentação e/ou da biomassa (> 0 a 100%).
  16. 16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende (a) remover uma quantidade de 0 a 100% da biomassa produzida a partir do caldo de fermentação obtido na etapa (b) da reivindicação 12, e (b) produzir a partir do caldo obtido na etapa (a) um produto essencialmente seco e conformado através de um método selecionado dentre o grupo que consiste em granulação, compactação, secagem por atomização e extrusão.
  17. 17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que, no caso do aminoácido L-lisina, é adicionado ao caldo de fermentação um ácido selecionado dentre o conjunto constituído por ácido sulfúrico, ácido clorídrico e ácido fosfórico antes ou depois da etapa (a).
  18. 18. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que, no caso do aminoácido L-lisina, a água é removida do caldo obtido antes ou após a etapa (a) e/ou o produto moldado obtido na ou durante a etapa (b) é borrifado com um óleo.
  19. 19. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que, no caso do aminoácido L-lisina, são realizadas as seguintes etapas (a) filtração do caldo de fermentação, preferencialmente com um filtro de membrana, de maneira que seja obtida uma lama contendo biomassa e um filtrado, (b) concentração do referido filtrado, preferencialmente de forma tal, que seja obtido um teor sólido de 48 a 52% em peso,
    Petição 870170063878, de 30/08/2017, pág. 10/11
    4/4 (c) granulação do concentrado obtido na etapa (b), preferencialmente a uma temperatura de 50°C a 62° C, e
    d) revestimento do granulado obtido em (c) com um ou mais dos agentes de revestimento.
    Petição 870170063878, de 30/08/2017, pág. 11/11
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