ES2500365T3 - Alelos del gen mqo procedente de bacterias corineformes - Google Patents

Abstract

Mutantes aislados de bacterias corineformes, que contienen un gen, escogido entre el conjunto que se compone de los siguientes a) hasta c): a) un gen, que codifica un polipéptido con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo el polipéptido la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en cuyo caso está contenida L-fenilalanina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y eventualmente está contenida L-serina en la posición 201 de la SEQ ID NO: 2; b) un gen, que codifica un polipéptido con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo el polipéptido codificado una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en por lo menos un 98 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, estando contenida L-fenilalanina en la secuencia de aminoácidos en la posición, que corresponde a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; c) un gen, que codifica una proteína con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo la proteína codificada una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6, inclusive de uno a 5 intercambio(s) conservativo(s) de aminoácidos, estando contenida L-fenilalanina en la secuencia de aminoácidos en la posición, que corresponde a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; siendo aumentada en por lo menos un 0,5 % la segregación de aminoácidos de estos mutantes, en comparación con la de una cepa de partida no mutagenizada con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2.

Description

Alelos del gen mqo procedente de bacterias corineformes

5 Son objeto del invento unos mutantes y alelos del gen mqo procedente de bacterias corineformes, que codifican unas variantes de malato-quinona oxidorreductasa (EC: 1.1.99.16) y unos procedimientos para la producción de aminoácidos, en particular de L-lisina, triptófano y L-prolina, mediando utilización de unas bacterias, que contienen estos alelos.

10 Estado de la técnica

Los aminoácidos encuentran uso en la medicina humana, en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y en particular en la nutrición de animales.

15 Es conocido que ciertos aminoácidos pueden ser producidos por fermentación de unas cepas de bacterias corineformes, en particular de Corynebacterium glutamicum. A causa de la gran importancia de este hecho, se está trabajando constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de producción. Unos mejoramientos de los procedimientos pueden concernir a unas medidas técnicas de fermentación tales como por ejemplo la agitación y el abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos, tal como por ejemplo la concentración de

20 azúcares durante la fermentación, o al tratamiento para dar la forma del producto mediante por ejemplo una cromatografía con intercambio de iones, o a las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho.

Para el mejoramiento de las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se utilizan unos métodos de

25 mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen unas cepas, que son resistentes frente a unos antimetabolitos o que son auxótrofas para unos metabolitos importantes para regulación y que producen unos aminoácidos. Un antimetabolito conocido es el compuesto análogo a la lisina S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC).

Desde hace algunos años se emplean asimismo unos métodos de la técnica de ADN recombinante para el

30 mejoramiento de las cepas del género Corynebacterium que producen L-aminoácidos, mediante el recurso de que se amplifican unos genes individuales para la biosíntesis de aminoácidos, y se investiga la repercusión sobre la producción de aminoácidos. Una exposición recopilativa acerca los más diferentes aspectos de la genética, del metabolismo y de la biotecnología de Corynebacterium glutamicum se encuentra en la cita bibliográfica de Pühler ((coordinador de edición) en Journal of Biotechnology 104 (1-3), 1-338, 2003.

35 La secuencia de nucleótidos del gen que codifica la malato-quinona oxidorreductasa de Corynebacterium glutamicum fue determinada por Molenaar y colaboradores (European Journal of Biochemistry 254 : 395 -403 (1998) y está disponible en el Banco de Datos del National Center for Biotechnology Information (Centro nacional para información de biotecnología) (NCBI) de la National Library of Medicine (Biblioteca nacional de medicina)

40 (Bethesda, MD, EE.UU.) bajo el número de acceso (en inglés accession number) AJ224946.

Ella puede ser deducida asimismo de la solicitud de patente internacional WO 01/00844 como la secuencia n° 569 y como la secuencia n° 571, así como de la solicitud de patente europea EP-A-1108790 como la secuencia n° 3478, la secuencia n° 7065 y como la secuencia n° 7066.

45 En el documento de patente europea EP1038969 se describe un mejoramiento de la producción por fermentación de L-aminoácidos por bacterias corineformes mediante el reforzamiento del gen mqo.

En el documento WO02086137 se describe, por el contrario, el efecto favorecedor del debilitamiento del gen mqo

50 sobre la producción de L-aminoácidos por bacterias corineformes. Una mutación del gen mqo, descrita en la solicitud, designada como "alelo 672", lleva el nucleótido adenina en lugar del nucleótido guanina en la posición 672 de la secuencia de ADN del gen mqo, lo que conduce a la formación de un codón de interrupción en la posición 224 de la secuencia de aminoácidos de la malato-quinona oxidorreductasa de Corynebacterium glutamicum. Asimismo, se describe el "alelo 1230", que contiene, adicionalmente a la mutación en el alelo 672, todavía una transición de

55 citosina a timina en la posición 1230 de la secuencia de nucleótidos del gen mqo. Además de ello, en esta solicitud se describe la desconexión del gen mqo mediante una interrupción del gen por medio de una mutagénesis por integración, que conduce a un aumento de la producción de L-lisina por la correspondiente cepa.

La biosíntesis microbiana de L-aminoácidos en bacterias corineformes es un complejo sistema y está enredada en

60 múltiples capas con otras diversas rutas metabólicas en la célula. Por lo tanto, no se puede realizar ninguna predicción acerca de si una desconexión total o una disminución de la actividad catalítica de malato-quinona oxidorreductasa en diferentes etapas mejoran a la producción de L-aminoácidos. Por lo tanto, es deseable poner a disposición también unas variantes de malato-quinona oxidorreductasa, que se diferencien en el grado de su actividad.

Para conseguir una mejor claridad, la secuencia de nucleótidos del gen mqo (de tipo silvestre), que codifica la malato-quinona oxidorreductasa de Corynebacterium glutamicum, de acuerdo con los datos del banco de datos NCBI (acrónimo de National Center for Biotechnology Information = Centro nacional para información de biotecnología) se representa en la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de la malato-quinona oxidorreductasa, que se establece a partir de aquella, se representa en las SEQ ID NO: 2 y 4. En la SEQ ID NO: 3 se indican las secuencias de nucleótidos situadas corriente arriba (en inglés "upstream") y corriente abajo (en inglés "downstream”).

Misión del invento

Los autores del invento se han planteado la misión de poner a disposición nuevas medidas técnicas para la producción mejorada por fermentación de aminoácidos, en particular de L-lisina, L-triptófano y L-prolina.

Descripción del invento

Son objeto del invento unos mutantes producidos o respectivamente aislados de bacterias corineformes, que segregan de manera preferida aminoácidos, y que contienen un gen o respectivamente un alelo, que se escoge entre uno de los siguientes a) hasta c).

a) un gen, que codifica un polipéptido con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, caracterizado por que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en cuyo caso está contenida L-fenilalanina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

b) un gen, que codifica un polipéptido con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo el polipéptido codificado una secuencia de aminoácidos que es idéntica en por lo menos un 98 % o en por lo menos un 99 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, estando contenida L-fenilalanina en la secuencia de aminoácidos en la posición que corresponde a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

c) un gen, que codifica una proteína con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo la proteína codificada una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 inclusive de uno a cinco, de manera preferida a lo sumo dos, a lo sumo tres o a lo sumo cuatro, intercambio(s) conservativo(s) de aminoácidos, estando contenida L-fenilalanina en la secuencia de aminoácidos en la posición que corresponde a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

siendo aumentada la secreción de aminoácidos de estos mutantes en por lo menos un 0,5 %, en comparación con la de una cepa de partida no mutagenizada con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2,.

En el caso de las bacterias corineformes, se prefiere el género Corynebacterium. Se prefieren especialmente unas cepas que segregan aminoácidos, que se basan en las siguientes especies:

Corynebacterium efficiens tal como, por ejemplo, la cepa DSM44549,

Corynebacterium glutamicum tal como, por ejemplo, la cepa ATCC13032,

Corynebacterium thermoaminogenes tal como, por ejemplo, la cepa FERM BP-1539, y

Corynebacterium ammoniagenes tal como, por ejemplo, la cepa ATCC6871,

siendo muy especialmente preferida la especie Corynebacterium glutamicum.

Algunos representantes de la especie Corynebacterium glutamicum son conocidos en el estado de la técnica también por otras denominaciones de especies. A éstos pertenecen, por ejemplo:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium lilium DSM20137 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC14020

Unos conocidos representantes de cepas de bacterias corineformes que segregan aminoácidos, son por ejemplo:

las cepas que producen L-lisina

Corynebacterium glutamicum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) que se ha descrito en el documento EP 0 358 940 Corynebacterium glutamicum MH20 (= DSM5714) que se ha descrito en el documento EP 0 435 132 Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= FermBP-7382) que se ha descrito en el documento EP 1 108 790 Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP3304) que se ha descrito en el documento de patente de los EE.UU. US 5.250.423

o las cepas que producen L-triptófano

Corynebacterium glutamicum K76 (=FermBP-1847) que se ha descrito en el documento US 5.563.052 Corynebacterium glutamicum BPS13 (=FermBP-1777) que se ha descrito en el documento US 5.605.818 Corynebacterium glutamicum FermBP-3055 que se hadescrita en el documento US 5.235.940

Se encuentran datos acerca de la clasificación taxonómica de las cepas de este conjunto de bacterias, entre otros lugares, en las citas de Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983), Kämpfer y Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl y colaboradores (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991) y en el documento US-A-5.250.434.

Unas cepas con la denominación "ATCC" se pueden adquirir de la American Type Culture Collection (Colección americana de cultivos tipos) (Manassas, VA, EE.UU.). Unas cepas con la denominación "DSM" se pueden adquirir de la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares) (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Unas cepas con la denominación "FERM" se pueden adquirir del National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Instituto nacional de ciencia y tecnología industrial avanzada (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japón). Las mencionadas cepas de Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539, FERM BP-1540, FERM BP-1541 y FERM BP-1542) se describen en el documento US-A 5.250.434.

Por el concepto de aminoácidos proteinógenos se entienden los aminoácidos, que se presentan en proteínas naturales, es decir en proteínas de microorganismos, plantas, animales y seres humanos. A éstos pertenecen en particular unos L-aminoácidos, escogidos entre el conjunto formado por L-ácido aspártico, L-asparagina, L-treonina, L-serina, L-ácido glutámico, L-glutamina, glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptófano, L-prolina y L-arginina.

Los mutantes conformes al invento segregan de manera preferida los mencionados aminoácidos proteinógenos, en particular L-lisina. El concepto de aminoácidos abarca también las sales de los mismos, tales como, por ejemplo, el monohidrocloruro de lisina o el sulfato de lisina en el caso del aminoácido L-lisina.

En el caso de los aminoácidos aromáticos se habla de intercambios conservativos, cuando se intercambian unos/as por otros/as fenilalanina, triptófano y tirosina. En el caso de los aminoácidos hidrófobos se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian unas por otras leucina, isoleucina y valina. En el caso de los aminoácidos polares se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian una por otra glutamina y asparagina. En el caso de los aminoácidos de carácter básico se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian unas por otras arginina, lisina e histidina. En el caso de los aminoácidos de carácter ácido se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian uno por otro el ácido aspártico y el ácido glutámico. En el caso de los aminoácidos que contienen grupos hidroxilo se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian una por otra serina y treonina.

Durante el trabajo realizado en el presente invento, mediante una comparación de la secuencia de aminoácidos con el programa Clustal (Thompson y colaboradores, Nucleic Acids Research 22, 4637-4680 (1994)), se comprobó que las secuencias de aminoácidos de la malato-quinona oxidorreductasa de diferentes bacterias tales como, por ejemplo, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium diptheriae, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus cereus y Bacillus halodurans está contenido un motivo de secuencia que se compone de la sucesión Trp-Asn-Asn-Ala-Gly-Thr-Gly-His-Sal-Ala-Leu y también un motivo de secuencia que se compone de la sucesión Bra-Leu-Gly-Ali-Ser-Pro-Gly-Ala-Ser. La designación "Bra" representa a los aminoácidos Ile

o Leu, la designación "Sal" representa a los aminoácidos Ser o Ala y la designación "Ali" representa a los aminoácidos Ala o Gly.

De una manera correspondiente, se prefieren aquellos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo de mqo, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de malato-quinona oxidorreductasa, que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos escogida entre el conjunto que se compone de Trp-Asn-Asn-Ala-Gly-Thr-Gly-His-Sal-Ala-Leu y Bra-Leu-Gly-Ali-Ser-Pro-Gly-Ala-Ser y que contiene L-fenilalanina en la

posición 111 o respectivamente en una posición correspondiente o comparable de la secuencia de aminoácidos. Eventualmente, la secuencia de aminoácidos contiene además de esto un intercambio de aminoácidos de L-alanina por L-serina en la posición 201 de acuerdo con la SEQ ID NO: 2.

El motivo de secuencia de aminoácidos Trp-Asn-Asn-Ala-Gly-Thr-Gly-His-Sal-Ala-Leu está contenido, por ejemplo en la SEQ ID NO: 6, 8 o 10 desde la posición 59 hasta la 69. El motivo de secuencia de aminoácidos Bra-Leu-Gly-Ali-Ser-Pro-Gly-Ala-Ser está contenido, por ejemplo en la SEQ ID NO: 6, 8 o 10 desde la posición 433 hasta la 441.

Finalmente, son objeto del invento unos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo de mqo, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de malato-quinona oxidorreductasa, que abarca la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

Es conocido que la metionina situada en un extremo es eliminada en el caso de la síntesis de proteínas por medio de unas enzimas propias del anfitrión, las denominadas aminopeptidasas.

Por el concepto de "una posición correspondiente a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos" o de "una posición comparable a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos" se entiende el hecho de que mediante una inserción o supresión de un codón que codifica un aminoácido en la región terminal de N (referida a la posición 111 de la SEQ ID NO: 6) del polipéptido codificado, el dato sobre la posición y el dato sobre la longitud se aumentan formalmente en una unidad en el caso de una inserción o se disminuyen en una unidad en el caso de una supresión. Por ejemplo, mediante supresión del codón TCA, que codifica el aminoácido L-serina, en la posición 2 de la SEQ ID NO:5, la L-fenilalanina se desplaza desde la posición 111 hasta la posición 110. El dato sobre la longitud sería entonces: 499 aminoácidos. De igual manera, mediante una inserción o supresión de un codón que codifica un aminoácido en la región del terminal de C (referida a la posición 111) del polipéptido codificado, el dato sobre la longitud en el caso de una inserción se aumenta formalmente en una unidad, o en el caso de una supresión se disminuye en una unidad. Tales posiciones comparables se pueden identificar fácilmente mediante una comparación de las secuencias de aminoácidos en forma de una alineación (en inglés "alignment"), por ejemplo con ayuda del programa Clustal. La actividad enzimática no es afectada esencialmente por tales inserciones y supresiones. El concepto de "no es afectada esencialmente" significa que la actividad enzimática de las mencionadas variantes se modifica como máximo en un 10 %, como máximo en un 7,5 %, como máximo en un 5 %, como máximo en un 2,5 %

o como máximo en un 1 % de la actividad del polipéptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

Para la producción de los mutantes conformes al invento se pueden utilizar procedimientos clásicos de mutagénesis in vivo con unas poblaciones celulares de bacterias corineformes mediando utilización de sustancias mutágenas tales como, por ejemplo, la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) o de una luz ultravioleta. Unos métodos de mutagénesis se describen, por ejemplo, en la obra "Manual of Methods for General Bacteriology" (Manual de métodos de bacteriología general) (de Gerhard y colaboradores (coordinadores de edición), American Society for Microbiology, Washington, DC, EE.UU., 1981) o en la cita de Tosaka y colaboradores (Agricultural and Biological Chemistry 42 (4), 745-752 (1978), o en la cita de Konicek y colaboradores (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)). Unas mutagénesis típicas mediando utilización de MNNG comprenden unas concentraciones de 50 a 500 mg/l o también unas concentraciones más altas de hasta como máximo 1 g/l, y un período de tiempo de incubación de 1 a 30 minutos a un pH de 5,5 a 7,5. En estas condiciones, el número de las células capaces de vivir es reducido en una proporción de aproximadamente 50 % hasta 90 % o de aproximadamente 50 % hasta 99 % o de aproximadamente 50 % hasta 99,9 % o más.

A partir de la población celular mutagenizada se sacan y multiplican mutantes o respectivamente células. En otra etapa, las células son disgregadas mediando toma de ayuda de un Ribolyser (de Hybaid, Heidelberg, Alemania) y la actividad intracelular de malato-quinona oxidorreductasa se determina, por ejemplo, según el método de Molenaar y colaboradores (European Journal of Biochemistry 254 : 395-403 (1998)). De esta manera se identifican unos mutantes, cuya actividad intracelular de malato-quinona oxidorreductasa ha disminuido en por lo menos un 30 %, de manera preferida en por lo menos un 35 % y de manera especialmente preferida en por lo menos un 40 % en comparación con la cepa de partida no mutagenizada. A continuación, se investiga su capacidad para segregar aminoácidos, de manera preferida L-lisina, L-triptófano o L-prolina, en un cultivo por tandas (en inglés "batch") mediando utilización de un medio nutritivo adecuado. Unos adecuados medios nutritivos y unas adecuadas condiciones de ensayo se describen, entre otros, en los documentos US 6.221.636, US 5.840.551, US 5.770.409, US 5.605.818, US 5.275.940 y US 4.224.409. En los casos de utilizaciones de unas instalaciones robóticas apropiadas, tales como las que se describen por ejemplo en la cita de Zimmermann y colaboradores (VDI Berichte n° 1.841, editorial VDI, Düsseldorf, Alemania 2004, 439-443) o en la de Zimmermann (Chemie Ingenieur Technik 77 (4), 426-428 (2005)), se pueden investigar numerosos mutantes en un breve período de tiempo. De esta manera se identifican unos mutantes que poseen una actividad disminuida de malato-quinona oxidorreductasa y que en comparación con la cepa parental o respectivamente con la cepa de partida no mutagenizada, segregan aminoácidos de manera multiplicada en el medio nutritivo o en el interior de las células. A éstos pertenecen, por ejemplo, unos mutantes cuya secreción de aminoácidos se ha aumentado por lo menos en un 0,5 %.

A continuación, a partir de los mutantes se pone a disposición o respectivamente se aísla un ADN, y con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa mediando utilización de unos pares de cebadores, que permiten la 5 5

amplificación del gen mqo o respectivamente del alelo de mqo conforme al invento, o de la mutación conforme al invento en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos, se sintetiza el correspondiente polinucleótido. De manera preferida, el ADN se aísla a partir de aquellos mutantes, que, en comparación con la cepa de partida, segregan aminoácidos en una forma aumentada.

A este fin, se pueden se pueden escoger unos pares de cebadores arbitrarios a partir de la secuencia de nucleótidos situada corriente arriba y corriente abajo de la mutación conforme al invento, y de la secuencia de nucleótidos que es complementaria con respecto a aquella. Un cebador de un par de cebadores comprende en este caso de manera preferida por lo menos 15, por lo menos 18, por lo menos 20, por lo menos 21 o por lo menos 24 nucleótidos consecutivos, escogidos entre la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1 y 679 de la SEQ ID NO: 3. El correspondiente segundo cebador de un par de cebadores comprende por lo menos 15, por lo menos 18, por lo menos 20, por lo menos 21 o por lo menos 24 nucleótidos consecutivos, escogidos a partir de la secuencia complementaria de nucleótidos entre las posiciones 2.002 y 953 de la SEQ ID NO:3. Si se desea la amplificación de la región codificadora, entonces el par de cebadores se escoge de manera preferida a partir de la secuencia de nucleótidos que se encuentra entre las posiciones 1 y 349 de la SEQ ID NO:3 y a partir de la secuencia complementaria de nucleótidos situada entre las posiciones 2.002 y 1.850 de la SEQ ID NO:3. Si se desea la amplificación de una parte de la región codificadora, tal como se representa a modo de ejemplo en las SEQ ID NO: 15, 17 y 19, entonces el par de cebadores se escoge de manera preferida a partir de la secuencia de nucleótidos que se encuentra entre las posiciones 351 y 679 de la SEQ ID NO:3, y a partir de la secuencia complementaria de nucleótidos que se encuentra entre las posiciones 1.848 y 953 de la SEQ ID NO: 3.

Unos adecuados pares de cebadores son, por ejemplo, el par de cebadores mqo-Start y mqo-Stop que se reproduce bajo la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, o el par de cebadores mqo-A1 y mqo-E1 que se reproduce bajo la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14.

Además de esto, el cebador puede ser provisto de unos sitios de reconocimiento para enzimas de restricción, de un grupo de biotina o de otros elementos accesorios, tales como los que se describen dentro del estado de la técnica. La longitud total del cebador es por lo general como máximo de 30, 40, 50 ó 60 nucleótidos.

Para la producción de polinucleótidos mediante amplificación de unas secuencias escogidas, tales como las del alelo de mqo conforme al invento, a partir de un ADN dispuesto previamente, por ejemplo cromosomal, mediante amplificación por medio de una PCR, se emplean por lo general unas polimerasas de ADN termoestables. Unos ejemplos de tales polimerasas de ADN son la polimerasa Taq procedente de Thermus aquaticus, que es comercializada, entre otras, por la entidad Qiagen (Hilden, Alemania), la polimerasa Vent procedente de Thermococcus litoralis, que es comercializada, entre otras, por la entidad New England Biolabs (Frankfurt, Alemania)

o la polimerasa Pfu procedente de Pyrococcus furiosus, que es comercializada, entre otras, por la entidad Stratagene (La Jolla, EE.UU.). Se prefieren unas polimerasas con una actividad de lectura de comprobación (en inglés "proof-reading"). El concepto de actividad de "lectura de comprobación" significa que estas polimerasas están en la situación de reconocer a unos nucleótidos que han sido introducidos erróneamente y de solventar los errores mediante una polimerización renovada (Lottspeich y Zorbas, Bioanalytik, editorial Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania (1998)). Unos ejemplos de polimerasas con una actividad de lectura de comprobación son la polimerasa Vent y la polimerasa Pfu.

Las condiciones en la tanda de reacción se ajustan según los datos del fabricante. Las polimerasas son proporcionadas por el fabricante por lo general en común con el tampón habitual, que tiene usualmente unas concentraciones de 10 -100 mM de Tris/HCl y de 6 -55 mM de KCl, a un pH de 7,5 -9,3. El cloruro de magnesio se añade en una concentración de 0,5 -10 mM, en el caso de que él no esté contenido en el tampón suministrado por el fabricante. A la tanda de reacción se le añaden además desoxinucleósido-trifosfatos en una concentración de 0,1 -16,6 mM. Los cebadores se disponen previamente en la tanda de reacción con una concentración final de 0,1 -3 µM y el ADN de molde, en el caso óptimo, con 102 hasta 105 copias. También se pueden emplear desde 106 hasta 107 copias. La correspondiente polimerasa se añade a la tanda de reacción en una cantidad de 2-5 unidades. Una típica tanda de reacción tiene un volumen de 20 -100 µl.

Como otras adiciones se pueden añadir a la reacción albúmina de suero bovino, Tween-20, gelatina, glicerol, formamida o DMSO (Dieffenbach y Dveksler, PCR Primer -A Laboratory Manual (Cebadores de PCR -Un manual de laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory Press, EE.UU. 1995).

Una típica evolución de una PCR se compone de tres diferentes escalones de temperatura, que se repiten consecutivamente. De antemano, la reacción se inicia con un aumento de la temperatura a 92°C -98°C durante 4 a 10 minutos, con el fin de desnaturalizar al ADN dispuesto previamente. Luego siguen, repitiéndose, en primer lugar una etapa para la desnaturalización del ADN dispuesto previamente durante 10 -60 segundos a aproximadamente 92 -98°C, luego una etapa para la unión de los cebadores con el ADN dispuesto previamente durante 10 -60 segundos a una determinada temperatura, dependiente de los cebadores (temperatura de reanillamiento = en inglés “annealing temperature”), que está situada, conforme a la experiencia, en 50°C hasta 60°C, y que se puede calcular individualmente para cada par de cebadores. Unas informaciones exactas acerca de esto las encontrará un experto en la especialidad en la cita de Rychlik y colaboradores (Nucleic Acids Research 18 (21): 6409-6412). A continuación

sigue una etapa de síntesis para la prolongación (extensión) del cebador dispuesto previamente en el valor óptimo de la actividad que se indica en cada caso para la polimerasa, que usualmente, según sea la polimerasa, está situado en el intervalo de 73°C a 67°C, de manera preferida de 72°C a 68°C. La duración de esta etapa de extensión depende de la productividad de la polimerasa y de la longitud del producto de la PCR que debe de ser amplificado. En una típica PCR, esta etapa dura 0,5 -8 minutos, de manera preferida 2 -4 minutos. Estas tres etapas se repiten de 30 hasta 35 veces, eventualmente hasta 50 veces. Una etapa final de extensión durante 4 -10 minutos finaliza la reacción. Los polinucleótidos producidos de esta manera son designados también como materiales amplificados; los conceptos de fragmento de ácido nucleico y de molécula de ácido nucleico son asimismo habituales.

Otras instrucciones e informaciones adicionales acerca de la PCR las encontrará un experto en la especialidad, por ejemplo, en el manual "PCR-Strategies" (Estrategias de PCR) (Innis, Felfand y Sninsky, Academic Press, Inc., 1995), en el manual de Diefenbach y Dveksler "PCR Primer -a laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995), en el manual de Gait "Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach" (Síntesis de oligonucleótidos: un enfoque práctico) (IRL Press, Oxford, Reino Unido 1984) y en la cita de Newton y Graham "PCR" (editorial Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994).

La secuencia de nucleótidos se determina a continuación, por ejemplo, según el procedimiento de rotura de la cadena de Sanger y colaboradores (Proceedings of the National Academies of Sciences, EE.UU., 74, 5463-5467 (1977)) con las modificaciones indicadas por Zimmermann y colaboradores (Nucleic Acids Research 18, páginas 1067 y siguientes (1990)), y se analiza el polipéptido que ha sido codificado por esta secuencia de nucleótidos en particular en lo que respecta a la secuencia de aminoácidos. Para esto, la secuencia de nucleótidos se introduce en un programa para la traducción de una secuencia de ADN en una secuencia de aminoácidos. Unos programas adecuados son, por ejemplo, el programa "Patentin", que es obtenible de las oficinas de patentes, por ejemplo de la Oficina de patentes de los EE.UU. (USPTO), o la herramienta de traducción "Translate Tool", que está disponible en el Servidor ExPASy Proteomics en el world wide web (internet) (Gasteiger y colaboradores, Nucleic Acids Research 31, 3784-3788 (2003).

De esta manera se identifican unos mutantes, cuyos alelos de mqo codifican unos polipéptidos con una actividad enzimática de malato-quinona oxidorreductasa que en la posición contienen cualquier aminoácido proteinógeno exceptuando la L-serina. Se prefiere el intercambio por L-fenilalanina o L-alanina. Eventualmente, la secuencia de aminoácidos contiene, además de ello, un intercambio de aminoácidos de L-alanina por otro aminoácido proteinógeno, de manera preferida L-serina, en la posición 201 o respectivamente en la posición correspondiente o comparable.

Unos mutantes conformes al invento de una bacteria corineforme son obtenibles, por lo tanto, mediante las siguientes etapas:

a) un tratamiento de una bacteria corineforme, que posee la capacidad de segregar aminoácidos, con un agente mutágeno,

b) un aislamiento y una multiplicación del mutante producido en a)

c) una determinación de la capacidad del mutante en un medio para segregar por lo menos un 0,5 % más del

aminoácido o para enriquecerlo en el interior de una célula en comparación con la bacteria corineforme

empleada en a),

d) una puesta a disposición de un ácido nucleico procedente del mutante obtenido en b),

e) una producción de una molécula de ácido nucleico mediando utilización de la reacción en cadena de la polimerasa, del ácido nucleico procedente de d), y de un par de cebadores que se compone de un primer cebador que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos escogidos a partir de la secuencia de nucleótidos que se encuentra entre las posiciones 1 y 394 de la SEQ ID NO: 3, y de un segundo cebador, que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos escogidos a partir de la secuencia complementaria de nucleótidos que se encuentra entre las posiciones 2.002 y 1.850 de la SEQ ID NO: 3.

f) una determinación de la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico obtenida en e), y una determinación de la secuencia de aminoácidos codificada.

g) eventualmente, una comparación de la secuencia de aminoácidos determinada en f) con la SEQ ID NO: 6, y

h) una identificación de un mutante, que contiene un polinucleótido, que codifica un polipéptido, que en la

posición 111 o en una posición comparable contiene L-fenilalanina, y eventualmente en la posición 201 o en

una posición comparable contiene L-serina.

Los mutantes producidos de este modo contienen típicamente una (1) copia del alelo de gnd descrito.

En la SEQ ID NO: 5 se reproducen a modo de ejemplo las regiones codificadoras de los alelos de mqo de unos mutantes conformes al invento. La región codificadora del gen de tipo silvestre se reproduce como la SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 1 contiene en la posición 332 la nucleobase citosina, en la posición 331 la nucleobase timina y en la posición 601 la nucleobase guanina. La SEQ ID NO: 1 contiene en las posiciones 331 hasta 333 el codón TCT que 5 codifica el aminoácido L-serina y en las posiciones 601 hasta 603 el codón GCT que codifica el aminoácido L-alanina. La SEQ ID NO: 5 contiene en la posición 332 la nucleobase timina. Mediante esta transición de citosina a timina resulta en las posiciones 331 hasta 333 el codón TTT que codifica el aminoácido L-fenilalanina. Por medio de una transversión de guanina a timina resulta en las posiciones 601 hasta 603 el codón TCT que codifica el aminoácido L-serina. Además de esto, la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID NO: 5 puede

10 contener otros intercambios de bases, que han resultado por medio del tratamiento de mutagénesis, pero que no se exteriorizan en una secuencia modificada de aminoácidos. Tales mutaciones son designadas en el mundo especializado también como mutaciones mudas o neutras. Estas mutaciones mudas pueden estar contenidas asimismo en la bacteria corineforme que se emplea para el tratamiento de mutagénesis.

15 Las bacterias corineformes utilizadas para la mutagénesis ya poseen de manera preferida la capacidad de segregar el aminoácido deseado en el medio nutritivo, o respectivamente en el caldo de fermentación, que las rodea, o de enriquecerlo en el interior de las células.

Las bacterias corineformes productoras de L-lisina poseen típicamente una aspartato cinasa resistente a la

20 retroalimentación (en inglés "feed back") o respectivamente desensibilizada. Por el concepto de "aspartato cinasas resistentes frente a la retroalimentación" se entienden unas aspartato cinasas que, en comparación con la forma silvestre, tienen una sensibilidad más pequeña frente a la inhibición por unas mezclas de lisina y treonina o por unas mezclas de AEC (aminoetilcisteína) y treonina, o por lisina a solas o por AEC a solas. Los genes o respectivamente alelos que codifican estas aspartato cinasas desensibilizadas son designados también como alelos de lysCFBR.

25 Dentro del estado de la técnica (Tabla 1) se describen numerosos alelos de lysCFBR, que codifican unas variantes de la aspartato cinasa, que poseen intercambios de aminoácidos en comparación con la proteína de tipo silvestre. La región codificadora del gen lysC de tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum correspondiente al número de acceso AX756575 en el banco de datos NCBI se representa en la SEQ ID NO: 21 y la proteína codificada por este gen se representa en la SEQ ID NO: 22.

Tabla 1 Alelos de lysCFBR, que codifican aspartato cinasas resistentes frente a la retroalimentación

Designación del alelo

Otros datos Referencia Número de acceso

lysCFBR-E05108

documento JP 1993184366-A (secuencia 1) E05108

lysCFBR-E06825

lysC A279T documento JP 1994062866-A (secuencia 1) E06825

lysCFBR-E06826

lysC A279T documento JP 1994062866-A (secuencia 2) E06826

lysCFBR-E06827

documento JP 1994062866-A (secuencia 3) E06827

lysCFBR-E08177

documento JP 1994261766-A (secuencia 1) E08177

lysCFBR-E08178

lysC A279T documento JP 1994261766-A (secuencia 2) E08178

lysCFBR-E08179

lysC A279V documento JP 1994261766-A (secuencia 3) E08179

lysCFBR-E08180

lysC S301F documento JP 1994261766-A (secuencia 4) E08180

lysCFBR-E08181

lysC T308I documento JP 1994261766-A (secuencia 5) E08181

lysCFBR-E08182

documento JP 1994261766-A (secuencia 6) E08182

lysCFBR-E12770

documento JP 1997070291-A (secuencia 13) E12770

lysCFBR-E14514

documento JP 1997322774-A (secuencia 9) E14514

lysCFBR-E16352

documento JP 1998165180-A (secuencia 3) E16352

lysCFBR-E16745

documento JP 1998215883-A (secuencia 3) E16745

lysCFBR-E16746

documento JP 1998215883-A (secuencia 4) E16746

lysCFBR-I74588

documento US 5688671-A (secuencia 1) I74588

lysCFBR-I74589

lysC A279T documento US 5688671-A (secuencia 2) I74589

lysCFBR-I74590

documento US 5688671-A (secuencia 7) I74590

lysCFBR-I74591

lysC A279T documento US 5688671-A (secuencia 8) I74591

lysCFBR-I74592

documento US 5688671-A (secuencia 9) I74592

lysCFBR-I74593

lysC A279T documento US 5688671-A (secuencia 10) I74593

lysCFBR-I74594

documento US 5688671-A (secuencia 11) I74594

lysCFBR-I74595

lysC A279T documento US 5688671-A (secuencia 12) I74595

lysCFBR-I74596

documento US 5688671-A (secuencia 13) I74596

lysCFBR-I74597

lysC A279T documento US 5688671-A (secuencia 14) I74597

lysCFBR-X57226

lysC S301Y documento EP 0387527 Kalinowski y colaboradores, Molecular and General Genetics 224:317-324 (1990) X57226

lysCFBR-L16848

lysC G345D Folletie y Sinskey Base de datos de nucleótidos del NCBI (1990) L16848

lysCFBR-L27125

lysC R320G lysC G345D Jetten y colaboradores, Applied Microbiology Biotechnology 43:76-82 (1995) L27125

lysCFBR

lysC T311I documento WO0063388 (secuencia 17)

lysCFBR

lysC S301F documento US 3732144

lysCFBR

lysC S381F documento EP 0435132

lysCFBR

lysC S317A documento US 5688671 (secuencia 1)

lysCFBR

lysC T380I documento WO 01/49854

Las bacterias corineformes que segregan L-lisina poseen típicamente uno o varios de los intercambios de 5 aminoácidos que se exponen en lista en la Tabla 1.

Se prefieren los siguientes alelos de lysCFBR: lysC A279T (intercambio de alanina en la posición 279 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 por treonina), lysC A279V (intercambio de alanina en la posición 279 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 por valina), lysC S301F 10 (intercambio de serina en la posición 301 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 por fenilalanina), lysC T308I (intercambio de treonina en la posición 308 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 por isoleucina), lysC S301Y (intercambio de serina en la posición 308 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 por tirosina), lysC G345D (intercambio de glicina en la posición 345 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 por ácido 15 aspártico), lysC R320G (intercambio de arginina en la posición 320 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 por glicina), lysC T311I (intercambio de treonina en la posición 311 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 por isoleucina), lysC S381F (intercambio de serina en la posición 381 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 por fenilalanina), lysC S317A (intercambio de serina en la posición 317 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ

20 ID NO: 22 por alanina) y lysC T380I (intercambio de treonina en la posición 380 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 por isoleucina).

Se prefieren especialmente el alelo de lysCFBR lysC T311I (intercambio de treonina en la posición 311 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 por isoleucina), y un alelo de lysCFBR que contiene por

lo menos un intercambio, escogido entre el conjunto que se compone de A279T (intercambio de alanina en la posición 279 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 por treonina) y de S317A (intercambio de serina en la posición 317 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 por alanina).

El alelo de lysCFBR lysC T311I está contenido en la cepa DM1797 depositada en la DSMZ. El DM1797 es un mutante de Corynebacterium glutamicum ATCC13032.

Según el modo que se ha descrito más arriba, partiendo de la cepa DM1797, se aísla un mutante designado como DM1808, que contiene un alelo de mqo, que codifica un polipéptido, en el que está contenida L-fenilalanina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos del alelo de mqo del mutante DM1808 se representa como la SEQ ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado se representa como la SEQ ID NO: 6.

De igual manera se encontró un mutante, que contiene un alelo de mqo, que codifica un polipéptido en cuyo caso está contenida L-alanina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos y en cuyo caso está contenida L-serina en la posición 201 de la secuencia de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos del alelo de mqo de este mutante se representa como la SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado se representa como la SEQ ID NO: 10.

Además de esto, se pueden utilizar unas bacterias corineformes que segregan L-lisina, las cuales tienen una homoserina deshidrogenasa u homoserina cinasa debilitada o poseen otras propiedades distintas, tales como las que se conocen a partir del estado de la técnica.

Las bacterias corineformes productoras de L-triptófano poseen típicamente una antranilato sintasa resistente a la retroalimentación o respectivamente desensibilizada. Por el concepto de "antranilato sintasa resistente a la retroalimentación" se entienden unas antranilato sintasas que, en comparación con la forma silvestre, tienen una sensibilidad más pequeña frente a la inhibición (de 5 % a 10 %, de 10 % a 15 % o de 10 % a 20 %) por triptófano o 5-fluoro-triptófano (Matsui y colaboradores, Journal of Bacteriology 169 (11): 5330 -5332(1987)) o por compuestos análogos similares. Los genes o respectivamente alelos, que codifican estas antranilato sintasas desensibilizadas, son designados también como alelos de trpEFBR. Ejemplos de tales mutantes o respectivamente alelos se describen, por ejemplo, en los documentos US 6180373 y EP 0338474.

Los mutantes obtenidos muestran, en comparación con la cepa de partida o respectivamente con la cepa parental que se emplea, una segregación o respectivamente producción aumentada del aminoácido deseado en un proceso de fermentación.

Es un objeto del invento asimismo un polinucleótido aislado, que se escoge entre el conjunto formado por las siguientes etapas a) o b)

a) un polinucleótido, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de malato-quinona oxidorreductasa y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, el cual posee L-fenilalanina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y eventualmente L-serina en la posición 201 de la SEQ ID NO: 2,

b) un polinucleótido, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de malato-quinona oxidorreductasa, abarcando el polipéptido codificado una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 inclusive de uno a cinco, de manera preferida a lo sumo dos, a lo sumo tres o a lo sumo cuatro intercambio(s) conservativo(s) de aminoácidos, estando contenida L-fenilalanina en la secuencia de aminoácidos en la posición que corresponde a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

aumentando estos polinucleótidos en por lo menos un 0,5 % en peso la secreción de aminoácidos de unos correspondientes mutantes, en comparación con la cepa de partida no mutagenizada con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2.

El polinucleótido conforme al invento se puede aislar a partir de un mutante conforme al invento.

Por lo demás, para la mutagénesis del gen mqo se pueden emplear ciertos métodos in vitro. En el caso de la utilización de los métodos in vitro, unos polinucleótidos aislados, que contienen un gen mqo de una bacteria corineforme, de manera preferida el gen de tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum que se ha descrito en el estado de la técnica, son sometidos a un tratamiento mutágeno.

En el caso de los polinucleótidos aislados se puede tratar por ejemplo del ADN total aislado o respectivamente del ADN cromosomal aislado o también de unos materiales amplificados del gen mqo, que se habían producido con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Tales materiales amplificados son designados también

como productos de la PCR; los conceptos de "molécula de ácido nucleico" o "fragmento de ácido nucleico" son asimismo habituales. Unas instrucciones para realizar la amplificación de las secuencias de ADN con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa las encontrará un experto en la especialidad, entre otros lugares, en el manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (Síntesis de oligonucleótidos: un enfoque práctico) (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) y en la cita de Newton y Graham: PCR (editorial Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994). Asimismo es posible introducir el gen mqo que debe de ser mutagenizado, primeramente en un vector, por ejemplo en un bacteriófago o en un plásmido.

Unos métodos adecuados para realizar la mutagénesis in vitro son, entre otros, el tratamiento con hidroxilamina según Miller (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Un breve curso de genética bacteriana. Un manual de laboratorio y un manual para Escherichia coli y bacterias relacionadas con ella), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992), la utilización de oligonucleótidos mutágenos (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger (Tecnología genética para principiantes) editorial Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993 y R. M. Horton: PCR-mediated Recombination and Mutagenesis (Recombinación y mutagénesis mediadas por PCR), Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995) y el empleo de una reacción en cadena de la polimerasa mediando utilización de una polimerasa de ADN, que tiene una alta tasa de errores. Una tal polimerasa de ADN es, por ejemplo, la polimerasa de ADN Mutazyme (estuche para mutagénesis GeneMorph PCR, n° 600550) de la entidad Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.).

Otras instrucciones y recopilaciones acerca de la producción de mutaciones in vivo o in vitro se pueden tomar del estado de la técnica y de los libros de texto sobre genética y biología molecular que se conocen, tales como p.ej. el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik" (Genética molecular), 6a edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Alemania, 1995)), el de Winnacker ("Gene und Klone" (Genes y clones), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann ("Allgemeine Genetik" (Genética general), editorial Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Un polinucleótido aislado conforme al invento, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de malatoquinona oxidorreductasa, comprende de manera preferida una secuencia de aminoácidos con una longitud de 500 aminoácidos, estando contenida L-fenilalanina en la posición 111.

Un objeto del invento es por lo demás un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de malato-quinona oxidorreductasa, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

Un objeto del invento es por lo demás un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de malato-quinona oxidorreductasa, que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, inclusive una prolongación junto al extremo terminal de N o C en por lo menos un (1) aminoácido. Esta prolongación es de no más que 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 ó 2 aminoácidos o respectivamente restos de aminoácidos.

Un objeto del invento es por lo demás un polinucleótido, que contiene la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5.

Un objeto del invento es, además de esto, un polinucleótido aislado, que comprende una molécula de ácido nucleico

o un fragmento de ADN, que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 95 hasta 127 de la SEQ ID NO: 2, o que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 79 hasta 144 de la SEQ ID NO: 2, o que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 62 hasta 160 von SEQ ID NO: 2, o que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 45 hasta 177 de SEQ ID NO: 2, o que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 27 hasta 194 de la SEQ ID NO: 2, o que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 11 hasta 211 de la SEQ ID NO: 2, o que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente 2 hasta 250 de la SEQ ID NO: 2, o que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 2 hasta 375 de la SEQ ID NO: 2, o que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 2 hasta 495 de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-fenilalanina en la posición correspondiente a la posición 111 de la SEQ ID NO: 2, y estando contenida eventualmente L-serina en la posición correspondiente a la posición 201 de la SEQ ID NO: 2, para la utilización en la producción de bacterias corineformes, que tienen una secreción aumentada en por lo menos un 0,5 % en comparación con la cepa de partida no mutagenizada con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2.

Un ejemplo de un marco de lectura conforme al invento que comprende un polinucleótido, que codifica por lo menos la secuencia de aminoácidos desde las posiciones 95 hasta 127 correspondientes a la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-fenilalanina (Xaa representa la L-fenilalanina) en la posición correspondiente a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos, se expone seguidamente:

Asimismo él se representa como la SEQ ID NO: 15. La secuencia de aminoácidos codificada por este marco de lectura se representa como la SEQ ID NO: 16, representando Xaa L-fenilalanina.

Se prefieren unas moléculas de ácidos nucleicos, que codifican por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 95 hasta 127 de la SEQ ID NO: 6 o por lo menos correspondiente a las posiciones 79 hasta 144 de la SEQ ID NO: 6 o por lo menos correspondiente a las posiciones 62 hasta 160 de la SEQ ID NO: 6

o por lo menos correspondiente a las posiciones 45 hasta 177 de la SEQ ID NO: 6 o por lo menos correspondiente a las posiciones 27 hasta 194 de la SEQ ID NO: 6 o por lo menos correspondiente a las posiciones 11 hasta 211 de la SEQ ID NO: 6 o por lo menos correspondiente a las posiciones 2 hasta 250 de la SEQ ID NO: 6 o por lo menos correspondiente a las posiciones 2 hasta 375 de la SEQ ID NO: 6 o por lo menos correspondiente a las posiciones 2 hasta 495 de la SEQ ID NO: 6.

Un ejemplo de un marco de lectura conforme al invento que comprende un polinucleótido, que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 95 hasta 127 de la SEQ ID NO: 6, se expone a continuación:

Asimismo el marco de lectura se representa como la SEQ ID NO: 17. La SEQ ID NO: 18 muestra la secuencia de aminoácidos codificada por este marco de lectura.

Se prefieren muy especialmente unas moléculas de ácidos nucleicos, que comprenden por lo menos una secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 283 hasta 381 de la SEQ ID NO:5 o por lo menos una secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 235 hasta 432 de la SEQ ID NO:5 o por lo menos una secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 184 hasta 480 de la SEQ ID NO SEQ ID NO:5 o por lo menos una secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 133 hasta 531 de la SEQ ID NO:5 o por lo menos una secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 85 hasta 582 de la SEQ ID NO:5 o por lo menos una secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 28 hasta 630 de la SEQ ID NO:5 o por lo menos una secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 4 hasta 753 de la SEQ ID NO:5 o por lo menos una secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 4 hasta 1.125 de la SEQ ID NO:5 o por lo menos una secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 4 hasta 1.485 de la SEQ ID NO:5.

Los polinucleótidos aislados conformes al invento se pueden utilizar para producir unas cepas recombinantes de microorganismos que, en comparación con la cepa de partida, o respectivamente con la cepa parental, entregan de manera mejorada aminoácidos al medio que los rodea o los acumulan en el interior de las células.

Un método propagado para la incorporación de mutaciones en genes de bacterias corineformes es el del intercambio de alelos, que se conoce también bajo la designación "reemplazo de genes" (en inglés "gene replacement"). En el caso de este procedimiento, un fragmento de ADN, que contiene la mutación que interesa, es transferido a la cepa deseada de una bacteria corineforme y la mutación es incorporada mediante por lo menos dos sucesos de recombinación o respectivamente sucesos de cruzamiento (en inglés "cross over") en el cromosoma de la cepa deseada, o respectivamente la secuencia de un gen, que está presente en la respectiva cepa, se intercambia por la secuencia mutada.

Este método fue utilizado por Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991) para incorporar un alelo de lysA, que llevaba una supresión y para incorporar un alelo de lysA, que llevaba una inserción, en el cromosoma de C. glutamicum en lugar del gen de tipo silvestre. Este método fue empleado por Schäfer y colaboradores (Gene 145, 69-73 (1994)) para incorporar una supresión en el operón hom-thrB de C. glutamicum. Este método fue empleado por Nakagawa y colaboradores (documento EP 1108790) para incorporar diferentes mutaciones, partiendo de los alelos aislados, en el cromosoma de C. glutamicum. De esta manera, Nakagawa y colaboradores consiguieron

incorporar una mutación designada como Val59Ala en el gen de la homoserina deshidrogenasa (hom), una mutación designada como Thr311Ile en el gen de la aspartato cinasa (lysC o respectivamente ask), una mutación designada como Pro458Ser en el gen de la piruvato carboxilasa (pyc) y una mutación designada como Ala213Thr en el gen de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (zwf) de cepas de C. glutamicum.

Para un procedimiento conforme al invento se puede utilizar un polinucleótido conforme al invento, que comprende toda la región codificadora, tal como se expone por ejemplo en la SEQ ID NO:5, o que comprende una parte de la región codificadora, tal como, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos, que codifica por lo menos la secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 95 hasta 127 de la SEQ ID NO: 6, y que se representan como las SEQ ID NO: 15 y 17. La parte de la región codificadora correspondiente a las SEQ ID NO: 15 y 17 tiene una longitud de 99 nucleobases. Se prefieren aquellas partes de la región codificadora cuya longitud es de ≥ 195 nucleobases, tales como, por ejemplo, unas moléculas de ácidos nucleicos, que codifican por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 79 hasta 144 de la SEQ ID NO: 6. Se prefieren muy especialmente aquellas partes de la región codificadora, cuya longitud es de ≥ 295 nucleobases, tales como por ejemplo unas moléculas de ácidos nucleicos, que codifican por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 62 hasta 160 de la SEQ ID NO: 6.

El fragmento de ADN, que contiene la mutación que interesa, se presenta, en el caso de este método, típicamente dentro de un vector, en particular un plásmido, que preferiblemente no es replicado, o lo es sólo de un modo restringido, por la cepa que debe de ser provista de la mutación. Como anfitrión auxiliar o intermedio, en el que es replicable el vector, se utiliza por lo general una bacteria del género Escherichia, de manera preferida de la especie Escherichia coli.

Unos ejemplos de tales vectores de plásmidos son los vectores pK*mob y pK*mobsacB, tales como, por ejemplo el pk18mobsacB, que han sido descritos por Schäfer y colaboradores (Gene 145, 69-73 (1994)) y los vectores que han sido descritos en los documentos de solicitudes de patentes internacionales WO 02/070685 y WO 03/014362. Éstos son replicativos en Escherichia coli, pero no en bacterias corineformes. Se adecuan especialmente unos vectores, que contienen un gen que actúa de un modo dominante negativo condicional, tal como, por ejemplo, el gen sacB (gen de la levano sucrasa) de, por ejemplo, Bacillus, o el gen galK (gen de la galactosa cinasa) de, por ejemplo, Escherichia coli. (Por el concepto de "un gen, que actúa de un modo dominante negativo condicional" se entiende un gen, que en determinadas condiciones es desventajoso, por ejemplo tóxico, para el anfitrión, pero que en otras condiciones no tiene repercusiones negativas sobre el anfitrión que lleva el gen). Éstos hacen posible la selección en cuanto a unos sucesos de recombinación, en cuyos casos el vector es eliminado desde el cromosoma. Por lo demás, por Nakamura y colaboradores (documento US-A-6.303.383) se describió un plásmido sensible frente a la temperatura para bacterias corineformes, que solamente se puede replicar a unas temperaturas situadas por debajo de 31°C.

El vector es transferido a continuación a la bacteria corineforme mediante conjugación, por ejemplo según el método de Schäfer (Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)) o mediante transformación, por ejemplo según el método de Dunican y Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989) o según el método de Thierbach y colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)). Eventualmente, la transferencia del ADN se puede alcanzar también mediante un bombardeo con partículas.

Después de una recombinación homóloga por medio de un primer suceso de cruzamiento que da lugar a una integración, y de un segundo adecuado suceso de cruzamiento que da lugar a una escisión, en el gen diana o respectivamente en la secuencia diana, se consigue la introducción de la mutación y se obtiene una bacteria recombinante.

Para realizar la identificación y la caracterización de las cepas obtenidas, se pueden emplear, entre otros, los métodos de la hibridación por transferencia de borrón Southern, la reacción en cadena de la polimerasa, la determinación de las secuencias, el método de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia ("Fluorescence Resonance Energy Transfer", FRET) (Lay y colaboradores Clinical Chemistry 43, 2262-2267 (1997) o métodos de la enzimología.

Otro objeto de la descripción es, de modo correspondiente, un procedimiento para la producción de una bacteria corineforme, en el que

(a)

se transfiere un polinucleótido conforme al invento a una bacteria corineforme,

(b)

el gen de malato-quinona oxidorreductasa que está presente en el cromosoma de la bacteria corineforme, que codifica una secuencia de aminoácidos con L-serina en la posición 111 o en una posición comparable de la secuencia de aminoácidos, se intercambia por el polinucleótido procedente de a), que codifica una secuencia de aminoácidos, que posee en la posición 111 o en una posición comparable de la secuencia de aminoácidos otro L-aminoácido, de manera preferida L-fenilalanina o L-alanina, y eventualmente en la posición 201 cualquier aminoácido proteinógeno exceptuando la L-alanina, de manera preferida el aminoácido L-serina, y

13 5

(c) se multiplica y reproduce la bacteria corineforme obtenida de acuerdo con las etapas a) y b).

De esta manera se obtiene una bacteria corineforme recombinante que, en lugar del gen mqo de tipo silvestre, contiene un alelo de mqo conforme al invento.

Otros objetos del invento son, de modo correspondiente, unos anfitriones o respectivamente unas células anfitrionas, de manera preferida unos microorganismos, de manera especialmente preferida unas bacterias corineformes y unas bacterias del género Escherichia, que contienen los polinucleótidos conformes al invento. De igual manera, son objeto del invento unos microorganismos, que se habían producido mediando utilización de los polinucleótidos aislados. Tales microorganismos o bacterias se designan también como microorganismos recombinantes o bacterias recombinantes. De igual manera, son objeto del invento unos vectores que contienen los polinucleótidos conformes al invento. Finalmente, son asimismo objeto del invento unos anfitriones que contienen estos vectores.

Los polinucleótidos aislados conformes al invento se pueden utilizar asimismo para la consecución de una sobreexpresión de las/los proteínas/polipéptidos codificadas/os por ellos.

Por el concepto de "sobreexpresión" se entiende por lo general un aumento de la concentración, o de la actividad, intracelular de un ácido ribonucleico, de una proteína o de una enzima. En el caso del presente invento, se sobreexpresan unos alelos de mqo o respectivamente unos polinucleótidos, que codifican unas malato-quinona oxidorreductasas, que en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado contienen cualquier aminoácido proteinógeno exceptuando la L-serina, siendo preferido el intercambio por L-fenilalanina o por L-alanina. Eventualmente, la proteína codificada contiene además de ello un intercambio de L-alanina por otro aminoácido proteinógeno, de manera preferida L-serina, en la posición 201 de la secuencia de aminoácidos.

Es conocido que mediante unas enzimas propias del anfitrión -las denominadas aminopeptidasas -se pueden separar desde el polipéptido formado unos aminoácidos terminales de N, en particular la metionina terminal de N.

El mencionado aumento de la concentración o de la actividad de un producto génico se puede conseguir por ejemplo mediante el recurso de que se aumenta en por lo menos una copia el número de copias de los correspondientes polinucleótidos.

Un método ampliamente propagado para el aumento del número de copias consiste en que el correspondiente gen o alelo se incorpora en un vector, de manera preferida un plásmido, que es replicado por una bacteria corineforme. Unos vectores de plásmidos adecuados son por ejemplo el pZ1 (Menkel y colaboradores, Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) o los vectores pSELF que han sido descritos por Tauch y colaboradores (Journal of Biotechnoloy 99, 79-91 (2002). Un artículo recopilativo sobre el tema de los plásmidos en Corynebacterium glutamicum se encuentra en la cita de Tauch y colaboradores (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)).

Otro método propagado para la consecución de una sobreexpresión es el procedimiento de la amplificación cromosomal de genes. En el caso de este método, por lo menos una copia adicional del gen o alelo que interesa se introduce en el cromosoma de una bacteria corineforme.

En una forma de realización, tal como se ha descrito por ejemplo en la cita de Reinscheid y colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132) para el operón hom-thrB, un plásmido, que no es replicativo en C. glutamicum, el cual contiene el gen que interesa, se transfiere a una bacteria corineforme. Después de una recombinación homóloga, mediante un suceso de cruzamiento, la cepa resultante contiene por lo menos dos copias del correspondiente gen o respectivamente alelo.

En otra forma de realización, que se describe en los documentos WO 03/040373 y de solicitud de patente de los EE.UU. US-2003-0219881-A1, una o varias copia(s) del gen que interesa se introduce(n) mediante por lo menos dos sucesos de recombinación en un sitio deseado del cromosoma de C. glutamicum. De esta manera se incorporó, por ejemplo, una copia de un alelo de lysC, que codifica una aspartato cinasa insensible a la L-lisina, en el gen gluB de

C. glutamicum.

En otra forma de realización, que se describe en los documentos WO 03/014330 y US-2004-0043458-A1, mediante por lo menos dos sucesos de recombinación se incorpora en el sitio natural por lo menos otra copia más del gen que interesa, de manera preferida en una disposición en tándem con respecto al gen o alelo que ya está presente. De esta manera se consiguió por ejemplo una duplicación en tándem de un alelo de lysCFBR junto al sitio natural del gen lysC.

Otro método para la consecución de una sobreexpresión consiste en unir el correspondiente gen o respectivamente alelo de un modo funcional (en inglés "operably linked" = enlazado operativamente) con un promotor o respectivamente una casete de expresión. Unos promotores adecuados para Corynebacterium glutamicum se describen, por ejemplo, en el artículo recopilativo de Patek y colaboradores (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311323 (2003). Por lo demás, se pueden utilizar los promotores T3, T7, SP6, M13, lac, tac y trc, suficientemente

conocidos, y que han sido descritos en las citas de Amann y colaboradores (Gene 69(2), 301-315 (1988)) y de Amann y Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)). Un tal promotor puede ser introducido, por ejemplo, corriente arriba del alelo de mqo conforme al invento, típicamente a una distancia de aproximadamente 1 -500 nucleótidos desde el codón de iniciación, de una bacteria corineforme recombinante, que en lugar del aminoácido L-serina, que está presente de modo natural en la posición 111, contiene otro aminoácido proteinógeno. Un tal promotor se puede introducir naturalmente asimismo corriente arriba del alelo de mqo de un mutante conforme al invento. Por lo demás, es posible unir con un promotor a un polinucleótido que ha sido aislado conforme al invento, que codifica una variante conforme al invento de la malato-quinona oxidorreductasa, e incorporar la unidad de expresión obtenida en un plásmido que se replica extracromosomalmente, o en el cromosoma de una bacteria corineforme.

Además de esto, se pueden mutar las regiones de promotor y de regulación, o el sitio de fijación a ribosomas, que se encuentra corriente arriba del gen estructural. Por medio de unas medidas técnicas para la prolongación de la duración de vida del ARNm (ARN mensajero) se mejora asimismo la expresión. Por lo demás, mediante una evitación de la degradación de la proteína enzimática se puede reforzar asimismo la actividad enzimática. Alternativamente, se puede conseguir por lo demás una sobreexpresión del correspondiente gen o alelo mediante una modificación de la composición de los medios y de la realización del cultivo.

Mediante las medidas técnicas de sobreexpresión se aumenta la actividad o concentración de la correspondiente proteína por lo general en por lo menos un 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 %, como máximo hasta en un 1.000 % o 2.000 %, referido a la actividad o a la concentración de la proteína en el microorganismo de partida o respectivamente en la cepa parental. Por el concepto de "un microorganismo de partida" o de "una cepa parental" se entiende un microorganismo, en el que se llevan a cabo las medidas técnicas del invento.

Un método para la determinación de la actividad enzimática de la malato-quinona oxidorreductasa se describe en la cita de Molenaar y colaboradores (Journal of Bacteriology 182(24), 6884-6891 (2000)).

La concentración de la proteína se puede determinar en el gel por medio de una separación de proteínas en un gel uni-o bidimensional (de 1 y 2 dimensiones) y de una subsiguiente identificación óptica de la concentración de proteínas con un correspondiente software de evaluación. Un método habitual para la preparación de los geles para proteínas en el caso de bacterias corineformes y para la identificación de las proteínas lo constituye el modo de proceder descrito por Hermann y colaboradores (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001). La concentración de las proteínas se puede determinar asimismo mediante una hibridación por transferencia de borrón Western con un anticuerpo específico para la proteína que de ha de detectar (Sambrook y colaboradores, Molecular cloning: a laboratory manual. 2a edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) y una subsiguiente evaluación óptica con un correspondiente software para la determinación de la concentración (Lohaus y Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999)).

De modo correspondiente, son objeto del invento unos procedimientos para la sobreexpresión de las malato-quinona oxidorreductasas conformes al invento. Un procedimiento conforme al invento para la sobreexpresión consiste, entre otras cosas, en que se aumenta el número de copias de un polinucleótido conforme al invento, que codifica una variante de la malato-quinona oxidorreductasa, en la que está contenida L-fenilalanina en la posición 111 o en la correspondiente posición de la secuencia de aminoácidos codificada, en por lo menos una (1) o varias copia(s). Otro procedimiento conforme al invento consiste en que se une un promotor funcionalmente con el polinucleótido.

Son objeto del invento por lo demás unos microorganismos, que tienen en el interior de sus células una concentración, o una actividad, aumentada de las variantes conformes al invento de la malato-quinona oxidorreductasa.

Adicionalmente, para realizar la producción mejorada de L-aminoácidos puede ser ventajoso sobreexpresar en los mutantes, o en las cepas recombinantes, conformes al invento una o varias enzimas de la respectiva ruta de biosíntesis, de la glicolisis, de las reacciones anapleróticas, del ciclo del ácido cítrico, del ciclo del fosfato de pentosa, de la exportación de aminoácidos, y eventualmente unas proteínas reguladoras. La utilización de unos genes endógenos es preferida por lo general.

Por el concepto de "genes endógenos" o de "secuencias endógenas de nucleótidos" se entienden los genes o respectivamente las secuencias de nucleótidos o alelos, que están presentes en la población de una especie.

Así, para la producción de L-lisina se puede(n) sobreexpresar uno o varios de los genes, escogidos entre el conjunto que se compone de

• un gen dapA, que codifica la dihidrodipicolinato sintasa, tal como por ejemplo el gen dpaA del tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito en el documento EP 0 197 335,

• un gen zwf, que codifica una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, tal como por ejemplo el gen zwf del tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito en el documento de solicitud de patente japonesa JP-A-09224661 y en el de solicitud de patente europea EP-A-1108790,

5 • los alelos de zwf de Corynebacterium glutamicum, que se han descrito en el documento US-2003-0175911-A1, que codifican una proteína, en la que, por ejemplo, la L-alanina ha sido reemplazada por L-treonina en la posición 243 de la secuencia de aminoácidos, o en la que el L-acido aspártico ha sido reemplazado por L-serina en la posición 245,

•

un gen pyc, que codifica una piruvato carboxilasa, tal como, por ejemplo, el gen pyc de tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito en el documento de solicitud de patente alemana DE-A-198 31609 y en el documento EP 1108790,

•

el alelo de pyc de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito en el documento EP 1 108 790, que

15 codifica una proteína, en la que la L-prolina ha sido reemplazada por L-serina en la posición 458 de la secuencia de aminoácidos,

• los alelos de pyc de Corynebacterium glutamicum, que se han descrito en el documento WO 02/31158, que codifican unas proteínas, que llevan de acuerdo con la reivindicación 1 uno o varios de los intercambios de aminoácidos escogidos entre el conjunto que se compone de L-acido glutámico reemplazado por L-acido aspártico en la posición 153, de L-alanina reemplazada por L-serina en la posición 182, de L-alanina reemplazada por L-serina en la posición 206, de L-histidina reemplazada por L-arginina en la posición 227, de L-alanina reemplazada por glicina en la posición 452 y de L-acido aspártico reemplazado por L-acido glutámico en la posición 1.120 (la Figura 2A del documento WO 02/31158 indica dos diferentes posiciones

25 de iniciación para la piruvato carboxilasa, que se diferencian por una longitud correspondiente a 17 aminoácidos. De modo correspondiente, la posición 153 de acuerdo con la reivindicación 1 del documento WO 02/31158 corresponde a la posición 170 de la Fig. 2A del documento 02/31158, la posición 182 de acuerdo con la reivindicación 1 corresponde a la posición 199 de la Fig. 2A, la posición 206 de acuerdo con la reivindicación 1 corresponde a la posición 223 de la Fig. 2A, la posición 227 de acuerdo con la reivindicación 1 corresponde a la posición 244 de la Fig. 2A, la posición 452 de acuerdo con la reivindicación 1 corresponde a la posición 469 de la Fig. 2A, la posición 1.120 de acuerdo con la reivindicación 1 corresponde a la posición 1.137 de la Fig. 2B. En la Figura 2A del documento WO 02/31158 se indica además un intercambio de aminoácidos de A (alanina) por G (glicina) en la posición

472. La posición 472 de la proteína con la secuencia MTA en el extremo terminal de N corresponde a la

35 posición 455 de la proteína con la secuencia MST en el extremo terminal de N de acuerdo con la Fig. 2A. En la Fig. 2B del documento WO 02/31158 se indica además un intercambio de aminoácidos de D (ácido aspártico) por E (ácido glutámico) en la posición 1.133 de la proteína con la MTA situada en el extremo terminal de N),

• un gen lysC que codifica una aspartato cinasa, tal como por ejemplo el gen lysC del tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito como la SEQ ID NO: 281 en el documento EP-A-1108790 (véanse también los números de acceso AX120085 y 120365) y que se ha descrito como la SEQ ID NO: 25 en el documento WO 01/00843 (véase el número de acceso AX063743),

45 • un alelo de lysCFBR que codifica una variante de la aspartato cinasa resistente a la retroalimentación, en particular de manera correspondiente a la Tabla 1,

•

un gen lysE que codifica una proteína exportadora de lisina, tal como por ejemplo el gen lysE del tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito en el documento DE-A-195 48 222,

•

el gen zwa1 del tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína Zwa1 (documento US 6.632.644).

Por lo demás, para la producción de L-lisina puede ser ventajoso, junto a la utilización de los alelos del gen mqo 55 conformes al invento, debilitar o desconectar simultáneamente uno o varios de los genes endógenos, que se escogen entre el conjunto que se compone de

•

un gen pgi que codifica la glucosa-6-fosfato isomerasa, tal como, por ejemplo, el gen pgi de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito en los documentos US 6.586.214 y US 6.465.238,

•

un gen hom que codifica la homoserina deshidrogenasa, tal como, por ejemplo, el gen hom de Corynebacterium glutamicum, que se ha descrito en el documento EP-A-0131171,

• un gen thrB que codifica la homoserina cinasa, tal como, por ejemplo, el gen thrB de Corynebacterium 65 glutamicum, que ha sido descrito por Peoples y colaboradores (Molecular Microbiology 2 (1988): 63 -72)) y

• un gen pfk que codifica la fosfofructocinasa, tal como, por ejemplo, el gen pfkB de Corynebacterium glutamicum que se ha descrito en el documento WO 01/00844 (secuencia n° 57).

Las medidas técnicas de debilitamiento que se exponen se pueden combinar eventualmente con las adicionales medidas técnicas de sobreexpresión (sobreexpresión del gen dapA, del gen zwf, etc.) que se exponen.

El concepto de "debilitamiento" describe en este contexto la disminución o desconexión de la actividad intracelular de una o varias enzima(s) (proteína(s)) en un microorganismo, que es (son) codificada(s) por el correspondiente ADN, mediante el recurso de que, por ejemplo, se utiliza un promotor débil o se utiliza un gen o respectivamente alelo, que codifica una correspondiente enzima con una baja actividad o respectivamente se desactiva al correspondiente gen o a la correspondiente enzima (proteína), y eventualmente se combinan estas medidas técnicas.

Mediante las medidas técnicas del debilitamiento se reduce la actividad o concentración de la correspondiente proteína por lo general a0 hasta 75 %, a0 hasta 50 %, a0 hasta 25 %, a0 hasta 10 % o a0 hasta 5 % de la actividad o concentración de la proteína de tipo silvestre, o respectivamente de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.

Como mutaciones para la producción de un debilitamiento entran en consideración transiciones, transversiones, inserciones y supresiones de por lo menos un (1) par de bases o respectivamente nucleótido. En dependencia del efecto del intercambio de aminoácidos, que es provocado por la mutación, sobre la actividad enzimática, se habla de mutaciones en un sentido erróneo (en inglés "missense mutations") o de mutaciones sin sentido (en inglés "nonsense mutations"). La mutación en un sentido erróneo conduce a un intercambio de un aminoácido dado en una proteína por otro distinto, tratándose en particular de un intercambio no conservativo de aminoácidos. De esta manera, la capacidad de funcionar o respectivamente la actividad de la proteína se perjudica y se reduce a un valor de 0 a 75 %, de 0 a 50 %, de 0 a 25 %, de 0 a 10 % o de 0 a 5 %. La mutación sin sentido conduce a un codón de interrupción en la región codificadora del gen y, por consiguiente, a una interrupción prematura de la traducción. Las inserciones o supresiones de por lo menos un par de bases en un gen conducen a unas mutaciones por desplazamiento del marco de lectura (en inglés "frame shift mutations"), que conducen a que sean incorporados unos aminoácidos erróneos, o a que la traducción se interrumpa prematuramente. Si como consecuencia de la mutación resulta un codón de interrupción en la región codificadora, entonces esto conduce asimismo a una interrupción prematura de la traducción. Unas supresiones de por lo menos (1) o varios codones conducen típicamente asimismo a una pérdida total de la actividad enzimática.

Unas instrucciones para la producción de tales mutaciones pertenecen al estado de la técnica y se pueden deducir de los libros de texto conocidos acerca de genética y biología molecular tales como p.ej. el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik" (Genética molecular), 6a edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Alemania, 1995), del de Winnacker ("Gene und Klone" (Genes y clones), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o del de Hagemann ("Allgemeine Genetik" (Genética general), editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1986). Otras medidas técnicas adicionales se describen en el estado de la técnica.

Las bacterias corineformes aisladas, que se han obtenido por medio de las medidas técnicas del invento, muestran una segregación o producción, aumentada en comparación con la cepa de partida empleada o respectivamente con la cepa parental, del aminoácido deseado en un proceso de fermentación.

Por el concepto de "bacterias aisladas" se han de entender los mutantes y las bacterias recombinantes aislados/as o respectivamente producidos/as conformes al invento, que contienen un alelo de mqo, que codifica una malatoquinona oxidorreductasa, que contiene el intercambio de aminoácidos que se ha descrito en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos y eventualmente un intercambio de aminoácidos de L-alanina por otro aminoácido proteinógeno, de manera preferida L-serina, en la posición 201.

El rendimiento de las bacterias aisladas o respectivamente del proceso de fermentación mediando utilización de las mismas en lo que respecta a uno o varios de los parámetros que se escogen entre el conjunto que se compone de la concentración del producto (producto por volumen), del rendimiento del producto (producto formado por fuente de carbono consumida) y la formación del producto (producto formado por volumen y tiempo) o también de otros parámetros del proceso y combinaciones de éstos, es mejorado en por lo menos un 0,5 %, en por lo menos un 1 %, en por lo menos un 1,5 % o en por lo menos un 2 %, referido a la cepa de partida o respectivamente a la cepa parental o respectivamente al proceso de fermentación mediando utilización de las mismas.

Las bacterias corineformes aisladas, conformes al invento, se pueden cultivar continuamente -tal como se ha que se ha descrito por ejemplo en el documento PCT/EP2004/008882 -o discontinuamente en el procedimiento batch (cultivación por tandas) o en el procedimiento fed batch (procedimiento de afluencia) o en el procedimiento fed batch repeated (procedimiento de afluencia repetida) con el fin de efectuar la producción de L-aminoácidos. Una recopilación de tipo general acerca de métodos de cultivación conocidos se describe en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Técnica de bioprocesos 1. Introducción en la técnica de los bioprocesos] (editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und

periphere Einrichtungen [Biorreactores y disposiciones periféricas] (editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo o respectivamente el medio de fermentación que se ha de utilizar, debe de satisfacer de una manera apropiada las exigencias de las respectivas cepas. Unas descripciones de medios de cultivo de diferentes microorganismos están contenidas en el manual “Manual of Methods for General Bacteriology” [Manual de métodos para la bacteriología general] de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., EE.UU., 1981). Los conceptos de medio de cultivo y de medio de fermentación o respectivamente de un medio se pueden intercambiar recíprocamente.

Como fuente de carbono se pueden utilizar unos azúcares y unos hidratos de carbono, tales como p.ej. glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, unas soluciones que contienen sacarosa procedentes de la producción de remolacha azucarera o de caña de azúcar, unos almidones, unos materiales hidrolizados de almidones y unas celulosas, unos aceites y unas grasas, tales como por ejemplo aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, unos ácidos grasos, tales como por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, unos alcoholes, tales como por ejemplo glicerol, metanol y etanol, y unos ácidos orgánicos, tales como por ejemplo ácido acético. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o como una mezcla.

Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar unos compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, tales como peptonas, un extracto de levadura, un extracto de carne, un extracto de malta, agua de maceración de maíz, harina de soja y urea, o unos compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar individualmente o como una mezcla.

Como fuente de fósforo se pueden utilizar ácido fosfórico, dihidrógeno-fosfato de potasio o hidrógeno-fosfato de dipotasio o bien las correspondientes sales que contienen sodio.

El medio de cultivo debe de contener por lo demás unas sales, por ejemplo en forma de cloruros o sulfatos, de unos metales, tales como por ejemplo sodio, potasio, magnesio, calcio y hierro, tales como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, de manera adicional a las sustancias arriba mencionadas se pueden emplear unas sustancias de crecimiento esenciales, tales como aminoácidos, por ejemplo homoserina, y unas vitaminas, por ejemplo tiamina, biotina o ácido pantoténico. Al medio de cultivo se le pueden añadir además de ello unos adecuados compuestos precursores de los respectivos aminoácidos.

Las mencionadas sustancias empleadas de partida se pueden añadir al cultivo en forma de una tanda única o se pueden alimentar de una manera apropiada durante la cultivación.

Para realizar el control del pH del cultivo se emplean de un modo apropiado unos compuestos de carácter básico, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o respectivamente agua amoniacal, o unos compuestos de carácter ácido, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. El pH se ajusta en general a un valor de 6,0 hasta 9,0, de manera preferida de 6,5 hasta 8. Para la represión del desarrollo de espuma se pueden emplear unos agentes antiespumantes, tales como por ejemplo ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Para la conservación de la estabilidad de los plásmidos, se pueden añadir al medio unas apropiadas sustancias que actúan de un modo selectivo, tales como por ejemplo unos antibióticos. Con el fin de mantener unas condiciones aerobias, se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno, tales como por ejemplo aire. La utilización de unos líquidos, que están enriquecidos con peróxido de hidrógeno, es asimismo posible. Eventualmente, la fermentación se realiza a sobrepresión, por ejemplo a una presión de 0,03 a 0,2 MPa. La temperatura del cultivo está situada normalmente en 20ºC hasta 45ºC y de manera preferida en 25ºC hasta 40 °C. En el caso de los procedimientos de cultivación por tandas, se continúa realizando la cultivación hasta que se haya formado una cantidad máxima del deseado aminoácido. Este objetivo se alcanza normalmente en el transcurso de 10 horas hasta 160 horas. En el caso de los procedimientos continuos son posibles unos más largos períodos de tiempo de cultivación.

Unos adecuados medios de fermentación se han descrito, entre otros lugares, en los documentos US 6.221.636, US 5.840.551, US 5.770.409, US 5.605.818, US 5.275.940 y US 4.224.409.

Unos métodos para la determinación de L-aminoácidos se conocen a partir del estado de la técnica. El análisis se puede efectuar, por ejemplo, tal como se ha descrito en la cita de Spackman y colaboradores (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1.190) mediante una cromatografía de gases con intercambio de aniones con una subsiguiente derivatización con ninhidrina, o él se puede efectuar mediante una HPLC (cromatografía de fase líquida de alto rendimiento) de fase inversa (en inglés "reversed phase HPLC), tal como se ha descrito en la cita de Lindroth y colaboradores (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

Un objeto del invento es, de modo correspondiente, también un procedimiento para la producción de un L-aminoácido, en cuyo caso

a) se fermenta una bacteria corinefrome aislada en un medio adecuado, conteniendo la bacteria un gen conforme al invento, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de malato-quinona oxidorreductasa, siendo reemplazada, en las secuencias de aminoácidos del polipéptido, la L-serina por L-fenilalanina en la posición 111 o en la posición correspondiente, y siendo reemplazada eventualmente la L-alanina por otro aminoácido proteinógeno, de manera preferida L-serina en la posición 201 o en la posición correspondiente, y

b) el L-aminoácido se enriquece en el caldo de fermentación o en las células de la bacteria corinefrome aislada.

El caldo de fermentación producido de esta manera se transforma a continuación en un producto sólido o líquido.

Por el concepto de "un caldo de fermentación" se entiende un medio de fermentación, en el que se había cultivado un microorganismo durante un determinado período de tiempo y a una temperatura determinada. El medio de fermentación o respectivamente los medios empleados durante la fermentación contiene(n) todas las sustancias o respectivamente todos los componentes, que aseguran una multiplicación o reproducción del microorganismo y una formación del aminoácido deseado.

Al finalizar la fermentación, el caldo de fermentación resultante contiene de modo correspondiente: a) la biomasa del microorganismo que ha resultado como consecuencia de la multiplicación o reproducción de las células del microorganismo, b) el aminoácido deseado que se ha formado en el transcurso de la fermentación, c) los productos secundarios orgánicos que se han formado en el transcurso de la fermentación y d) los componentes no consumidos por la fermentación del medio de fermentación o de los medios de fermentación que se emplea(n) o respectivamente de las sustancias empleadas de partida, tales como, por ejemplo, unas vitaminas tales como biotina, unos aminoácidos tales como homoserina o unas sales tales como sulfato de magnesio.

A los productos secundarios orgánicos pertenecen unas sustancias, que son producidas por los microorganismos empleados al realizar la fermentación eventualmente junto con el respectivo L-aminoácido deseado y que son segregadas eventualmente. Entre éstos se cuentan unos L-aminoácidos, que en comparación con el aminoácido deseado constituyen menos que un 30 %, 20 % o 10 %. A éstos pertenecen además unos ácidos orgánicos, que llevan de uno a tres grupos carboxilo, tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido málico

o ácido fumárico. Finalmente, pertenecen a éstos también unos azúcares tales como, por ejemplo, trehalosa.

Unos típicos caldos de fermentación que son adecuados para finalidades industriales, tienen un contenido de aminoácidos de 40 g/kg a 180 g/kg o de 50 g/kg a 150 g/kg. El contenido de biomasa (en forma de biomasa secada) es por lo general de 20 a 50 g/kg.

En el caso del aminoácido L-lisina, dentro del estado de la técnica se conocen esencialmente cuatro diferentes formas de productos.

Un conjunto de productos que contienen L-lisina comprende unas soluciones acuosas concentradas, de carácter alcalino, de L-lisina purificada (documento de patente europea EP-B-0534865). Otro conjunto, tal como el que se ha descrito por ejemplo en los documentos US 6.340.486 y US 6.465.025, comprende unos concentrados acuosos, de carácter ácido, que contienen una biomasa, de caldos de fermentación que contienen L-lisina. El conjunto más conocido de productos sólidos comprende unas formas pulverulentas o cristalinas de L-lisina purificada o respectivamente pura, que se presenta típicamente en forma de una sal tal como, por ejemplo, el monohidrocloruro de L-lisina. Otro conjunto de formas de productos sólidos se describe, por ejemplo, en el documento EP-B-0533039. La forma de producto allí descrita contiene, junto a L-lisina, la mayor parte de las sustancias de partida empleadas, que se han utilizado durante la producción por fermentación y que no se han consumido, y eventualmente la biomasa del microorganismo empleado con una proporción de > 0 % -100 %.

Correspondientemente a las diferentes formas de productos, se conocen los más diversos procedimientos, en los cuales el L-aminoácido se recoge a partir del caldo de fermentación, se aísla o purifica, con el fin de producir el producto que contiene el L-aminoácido, o el L-aminoácido purificado.

Para la producción de L-aminoácidos puros, sólidos, se usan en lo esencial los métodos de la cromatografía con intercambio de iones eventualmente mediando utilización de carbón activo, y los métodos de la cristalización. En el caso de la lisina se obtiene de esta manera la correspondiente base o una correspondiente sal, tal como, por ejemplo, el monohidrocloruro de lisina (Lys-HCl) o el sulfato de lisina (Lys2-H2SO4).

En el caso de la lisina, en el documento EP-B-0534865 se describe un procedimiento para la producción de soluciones acuosas, de carácter básico, que contienen L-lisina, a partir de caldos de fermentación. En el caso de los procedimientos allí descritos, la biomasa procedente del caldo de fermentación se separa y desecha. Mediante una base tal como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio o amonio, se ajusta un valor del pH comprendido entre 9 y

11. Los componentes minerales (unas sales inorgánicas) se separan, después de haber concentrado y enfriado,

mediante cristalización a partir del caldo, y o bien se utilizan como fertilizantes o se desechan. 19

En el caso de los procedimientos para la producción de lisina mediando utilización de las bacterias conformes al invento, se prefieren aquellos procedimientos, en los que se obtienen unos productos que contienen unos componentes del caldo de fermentación. Éstos se utilizan en particular como aditivos para piensos de animales.

Según sea el requisito, la biomasa se puede eliminar total o parcialmente a partir del caldo de fermentación, mediante unos métodos de separación tales como p.ej. los de la centrifugación, de la filtración, de la decantación o una combinación de éstos, o se puede dejar completamente dentro de éste. Eventualmente, la biomasa, o respectivamente el caldo de fermentación que contiene la biomasa, se desactiva durante una adecuada etapa de procedimiento, por ejemplo mediante un tratamiento térmico (calentamiento) o mediante la adición de un ácido.

Los componentes químicos de la biomasa son, entre otros, la envoltura de las células, por ejemplo el peptidoglicano y el arabinogalactano, la proteína o respectivamente el polipéptido, por ejemplo el polipéptido de malato-quinona oxidorreductasa, unos lípidos y fosfolípidos y unos ácidos nucleicos (ADN y ARN), por ejemplo unos polinucleótidos que contienen la mutación conforme al invento. Como consecuencia de las medidas técnicas de la desactivación y/o de las otras etapas del procedimiento (por ejemplo, las de acidificación, desecación por atomización, granulación, etc.) los ácidos nucleicos se presentan típicamente en forma de fragmentos con una longitud de, entre otras, ≥40 -60 pb (acrónimo de "pares de bases"), >60 -80 pb, >80 -100 pb, >100 -200 pb, >200 -300 pb, >300 -400 pb, >400 -500 pb, >500 -750 pb, >750 -1.000 pb, >1.000 -1.250 pb, >1.250 -1.500 pb, >1.500 -1.750 pb, >1.750

2.000 pb, >2.000 -2.500 pb, >2.500 -3.000 pb, >3.000 -4.000 pb y >4.000 -5.000 pb.

En un modo de proceder, la biomasa se elimina totalmente o casi totalmente, de tal manera que en el producto producido no permanece nada (0 %) o permanece a lo sumo un 30 %, a lo sumo un 20 %, a lo sumo un 10 %, a lo sumo un 5 %, a lo sumo un 1 % o a lo sumo un 0,1 % de la biomasa. En otro modo de proceder, la biomasa no se elimina o se elimina solamente en pequeñas proporciones, de tal manera que permanece en el producto producido la totalidad (el 100 %) o más de un 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 99,9 % de la biomasa. En un procedimiento conforme al invento, se elimina de modo correspondiente la biomasa en unas proporciones de ≥ 0 % hasta ≤ 100 %.

Finalmente, el caldo de fermentación que se ha obtenido después de la fermentación, se puede ajustar a un valor ácido del pH, antes o después de la eliminación total o parcial de la biomasa, con un ácido inorgánico tal como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico, o con un ácido orgánico, tal como, por ejemplo, ácido propiónico (documento de patente británica GB 1.439.728 o documento EP 1 331 220). De igual manera es posible acidificar el caldo de fermentación con la biomasa contenida completamente. Finalmente, el caldo se puede estabilizar también mediante una adición de bisulfito de sodio (NaHSO3, documento GB 1.439.728) o de otra sal, tal como, por ejemplo, una sal de amonio, de un metal alcalino o de un metal alcalino-térreo del ácido sulfuroso.

Al realizar la separación de la biomasa, se eliminan parcial o totalmente los materiales sólidos orgánicos o inorgánicos contenidos eventualmente en el caldo de fermentación. Los productos secundarios orgánicos, que están disueltos en el caldo de fermentación, y los componentes disueltos, que no se han consumido, del medio de fermentación (es decir, las sustancias de partida empleadas) permanecen en el producto por lo menos parcialmente (> 0 %), de manera preferida por lo menos en un 25 %, de manera especialmente preferida por lo menos en un 50 % y de manera muy especialmente preferida por lo menos en un 75 %. Eventualmente, éstos permanecen en el producto también totalmente (en el 100 %) o casi totalmente, es decir en > 95 % o en > 98 %. En este sentido, el concepto de "base del caldo de fermentación" significa que un producto contiene por lo menos una parte de los componentes del caldo de fermentación.

A continuación, al caldo se le substrae agua con métodos conocidos, tales como p.ej. con ayuda de un evaporador rotatorio, un evaporador de capa fina, un evaporador de película descendente, mediante una ósmosis inversa o mediante una nanofiltración, o respectivamente el caldo es espesado o concentrado. Este caldo de fermentación aumentado de concentración se puede elaborar seguidamente mediante unos métodos de liofilización, desecación por atomización, granulación por atomización o mediante procedimientos de otros tipos, tal como, por ejemplo, en la capa turbulenta circulante, tal como se ha descrito en el documento PCT/EP2004/006655, para dar unos productos capaces de corrimiento, en particular para dar un polvo finamente dividido o de manera preferida un granulado de granos gruesos. Eventualmente, el producto deseado se puede aislar a partir del granulado obtenido mediante tamizado o separación del polvo fino.

Asimismo, es posible secar el caldo de fermentación directamente, es decir, sin ninguna concentración previa, mediante desecación por atomización o granulación por atomización.

Por el concepto de "capaz de corrimiento" se entienden unos polvos que salen sin obstáculos desde una serie de recipientes de salida de vidrio, que tienen unos orificios de salida de diferentes tamaños, y por lo menos desde elrecipiente con el orificio de 5 mm (milímetros) (Klein: Seifen, Öle, Fette, Wachse (Jabones, aceites, grasas, ceras), 94, 12 (1968)).

Por el concepto de "finamente dividido" se entiende un polvo con una proporción predominante (> 50 %) de un tamaño de granos con unos diámetros de 20 a 200 µm.

Por el concepto de "de granos gruesos" se entiende un producto con una proporción predominante (> 50 %) de un tamaño de granos con unos diámetros de 200 a 2.000 µm.

La determinación de los tamaños de los granos se puede llevar a cabo con unos métodos de espectrometría por difracción de rayos láser. Los correspondientes métodos se describen en el libro de texto "Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis" [Medición del tamaño de partículas en la práctica de laboratorio] de R. H. Müller y R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) o en el libro de texto "Introduction to Particle Technology" [Introducción a la tecnología de partículas] de M. Rhodes, editorial Wiley & Sons (1998)).

El polvo capaz de corrimiento, finamente dividido, puede ser transformado, a su vez, mediante unos apropiados procedimientos de compactación o de granulación, en un producto de granos gruesos, bien capaz de corrimiento, almacenable y ampliamente exento de polvo.

El concepto de "exento de polvo" significa, que el producto contiene solamente unas pequeñas proporciones (< 5 %) de unos tamaños de granos con unos diámetros por debajo de 100 µm.

El concepto de "almacenable", dentro del sentido de este invento, significa que un producto se puede almacenar durante por lo menos un (1) año o más tiempo, de manera preferida por lo menos durante 1,5 años o más tiempo, de manera especialmente preferida durante dos (2) años o más tiempo, en un entorno seco y frío, sin que aparezca una pérdida esencial (< 5 %) del respectivo aminoácido.

Otro objeto del invento es, de modo correspondiente, un procedimiento para la producción de un producto que contiene un L-aminoácido, de manera preferida la L-lisina o el L-triptófano, de manera preferida un aditivo para piensos de animales, a partir de unos caldos de fermentación, que está caracterizado por las etapas de

a) cultivación y fermentación de una bacteria corineforme que segrega un L-aminoácido conforme al invento, que contiene por lo menos un alelo de mqo, que codifica un polipéptido con una actividad de malatoquinona oxidorreductasa, que comprende una secuencia de aminoácidos, en la que está contenida L-fenilalanina en la posición 111 o en la posición comparable, y estando contenida eventualmente L-serina en la posición 201 o en la posición comparable, en un medio de fermentación,

b) eliminación de la biomasa que se ha formado durante la fermentación, en una proporción de 0 a 100 % en peso, y

c) desecación del caldo de fermentación que se ha obtenido de acuerdo con a) y/o b), con el fin de obtener el producto en la deseada forma de polvo o granulado,

añadiéndose eventualmente antes de la etapa b) o c) un ácido escogido entre el conjunto que se compone de ácido sulfúrico, ácido fosfórico o ácido clorhídrico.

De manera preferida, a continuación de la etapa a) o b) se elimina agua a partir del caldo de fermentación que contiene el L-aminoácido (proceso de aumento de concentración).

Al realizar la granulación o compactación, es ventajoso el empleo de unas usuales sustancias auxiliares orgánicas o inorgánicas, o respectivamente de unos vehículos tales como almidones, gelatinas, derivados de celulosas o sustancias similares, tales como las que encuentran utilización usualmente en la elaboración de alimentos o de piensos como agentes aglutinantes, gelificantes o espesantes, o de otras sustancias tales como por ejemplo ácidos silícicos, silicatos (documento EP0743016A) y estearatos.

Además, es ventajoso proveer de aceites a la superficie de los granulados obtenidos, tal como se ha descrito en el documento WO 04/054381. Como aceites se pueden utilizar aceites minerales, aceites vegetales o unas mezclas de aceites vegetales. Unos ejemplos de tales aceites son aceite de soja, aceite de oliva, y unas mezclas de aceite de soja y de lecitina. De igual manera, también se adecuan unos aceites de siliconas, unos poli(etilenglicoles) o una hidroxietil-celulosa. Mediante el tratamiento de las superficies con los aceites mencionados se consiguen una resistencia aumentada a la abrasión del producto y una disminución de la proporción de polvo fino. El contenido de aceite en el producto es de 0,02 a 2,0 % en peso, de manera preferida de 0,02 a 1,0 % en peso, y de manera muy especialmente preferida de 0,2 a 1,0 % en peso, referido a la cantidad total del aditivo para piensos.

Se prefieren unos productos con una proporción de ≥ 97 % en peso de un tamaño de granos con unos diámetros de 100 a 1.800 µm o con una proporción de ≥ 95 % en peso de un tamaño de granos con unos diámetros de 300 a

1.800 µm. La proporción de polvo fino, es decir de partículas con un tamaño de granos < 100 µm, se sitúa de manera preferida en > 0 a 1 % en peso, -de manera especialmente preferida en como máximo 0,5 % en peso.

Alternativamente, el producto se puede extender sin embargo también sobre un material de vehículo orgánico o inorgánico, conocido en la elaboración de piensos, tal como, por ejemplo, ácidos silícicos, silicatos, materiales

molidos, salvados, harinas, almidones, azúcares u otros, y/o se puede mezclar y estabilizar con unos usuales agentes espesantes o aglutinantes. Unos correspondientes ejemplos de usos y procedimientos para ello se describen en la bibliografía (Die Mühle + Mischfuttertechnik (El molino + la técnica de piensos mixtos) 132 (1995) 49, página 817).

5 Finalmente, el producto se puede llevar a un estado, en el que él sea estable frente a la digestión por estómagos de animales, en particular por el estómago de rumiantes, también mediante unos procedimientos de revestimiento (en inglés "coating") con unos agentes formadores de películas, tales como por ejemplo carbonatos metálicos, ácidos silícicos, silicatos, alginatos, estearatos, almidones, gomas y éteres de celulosa, tal como se ha descrito en el

10 documento de patente alemana DE-C-4100920.

Para el ajuste de una deseada concentración de aminoácidos en el producto, según sea el requisito, el respectivo aminoácido se puede añadir durante el proceso en forma de un concentrado o eventualmente de una sustancia ampliamente pura o respectivamente de una de sus sales en una forma líquida o sólida. Éstos/as se pueden añadir

15 individualmente o como unas mezclas al caldo de fermentación que se ha obtenido o que ha sido aumentado de concentración, o también durante el proceso de desecación o granulación.

En el caso de la lisina, al realizar la producción de unos productos que contienen lisina, la relación de los iones se ajusta de manera preferida de tal modo que se establezca la relación de los iones, de un modo correspondiente a la 20 siguiente fórmula,

de 0,68 a 0,95, de manera preferida de 0,68 a 0,90, tal como ha sido descrito por Kushiki y colaboradores en el 25 documento US 20030152633.

En el caso de la lisina, el producto sólido constituido sobre la base del caldo de fermentación, producido de esta manera, tiene un contenido de lisina (como la base de lisina) de 10 % en peso a 70 % en peso o de 20 % en peso a 70 % en peso, de manera preferida de 30 % en peso a 70 % en peso y de manera muy especialmente preferida de

30 40 % en peso a 70 % en peso, referido a la masa seca del producto. Asimismo, son posibles unos contenidos máximos de la base de lisina de 71 % en peso, 72 % en peso o 73 % en peso.

En el caso de un aminoácido eléctricamente neutro, tal como el L-triptófano, el producto sólido constituido sobre la base del caldo de fermentación, producido de esta manera, tiene un contenido del aminoácido de por lo menos 5 % 35 en peso, 10 % en peso, 20 % en peso, 30 % en peso, y como máximo de 50 % en peso, 60 % en peso, 70 % en peso, 80 % en peso, 90 % en peso o hasta de 95 % en peso.

El contenido de agua del producto sólido es hasta de 5 % en peso, de manera preferida hasta de 4 % en peso, y de manera especialmente preferida de menos que 3 % en peso.

40 Por lo tanto, un objeto del invento es también un aditivo para piensos, que contiene L-lisina, constituido sobre la base de un caldo de fermentación, que tiene las siguientes características

a) un contenido de lisina (como la base) de desde por lo menos 10 % en peso hasta como máximo 45 73 % en peso,

b) un contenido de agua de a lo sumo 5 % en peso, y

c) un contenido de biomasa correspondiente a por lo menos un 0,1 % de la biomasa contenida en el 50 caldo de fermentación, siendo formada la biomasa eventualmente desactivada a partir de bacterias corineformes conformes al invento.

Por lo demás, es un objeto del invento un aditivo para piensos, que contiene L-triptófano, constituido sobre la base de un caldo de fermentación, que tiene las siguientes características 55 a) un contenido de triptófano de desde por lo menos 5 % en peso hasta como máximo 95 % en peso,

b) un contenido de agua de a lo sumo 5 % en peso, y

60 c) un contenido de biomasa correspondiente a por lo menos un 0,1 % de la biomasa contenida en el caldo de fermentación, siendo formada la biomasa eventualmente desactivada a partir de bacterias corineformes conformes al invento.

Un mutante de Corynebacterium glutamicum con la denominación DM1797, que contiene el intercambio de aminoácidos lysC T311I en la aspartato cinasa, fue depositado el 28 de octubre de 2004 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania) como DSM 16833.

El mutante de Corynebacterium glutamicum DM1808 conforme al invento, que contiene L-fenilalanina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido Mqo, se depositó el 24 de noviembre de 2004 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania) como DSM 16937.

Ejemplos

Ejemplo 1

Mutagénesis de la cepa DM1797 que produce L-lisina

La cepa DM1797 de Corynebacterium glutamicum se empleó como cepa de partida para la mutagénesis con Nmetil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG). La cepa DM1797 es un mutante de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 resistente a la aminoetilcisteína y se ha depositado bajo la denominación DSM16833 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania).

La cepa DM1797 se cultivó en 10 ml del caldo LB-Bouillon (de Merck, Darmstadt, Alemania), que estaban contenidos en un matraz Erlenmeyer con una capacidad de 100 ml, durante 24 horas, a 33°C y 200 rpm (revoluciones por minuto), en un aparato sacudidor rotatorio del tipo Certomat BS-1 (de B. Braun Biotech International, Melsungen, Alemania). A continuación, el cultivo se separó por centrifugación, el sedimento se volvió a suspender en 10 ml de una solución al 0,9 % de NaCl, la suspensión obtenida se separó de nuevo por centrifugación y el sedimento obtenido se recogió en 10 ml de una solución al 0,9 % de NaCl. 5 ml de esta suspensión de células se trataron con 400 µg/ml de MNNG durante 15 minutos a 30°C y 200 rpm en un aparato sacudidor (véase más arriba). A continuación, la tanda de mutagénesis se separó por centrifugación y el sedimento se recogió en 10 ml de tiosulfato de Na al 2 % en un tampón de NaCl al 0,9 % (pH = 6,0). La suspensión de células se diluyó a continuación en las relaciones de 1:1.000, 1:10.000 y 1:100.000 con una solución al 0,9 % de NaCl, y unos partes alícuotas se sembraron en placas sobre un agar de corazón y cerebro (de Merck, Darmstadt, Alemania). De esta manera se aislaron aproximadamente 2.500 mutantes.

Ejemplo 2

Ensayo de rendimiento de los mutantes de la cepa DM1797

Los mutantes obtenidos en el Ejemplo 1 se cultivaron en un medio nutritivo adecuado para la producción de lisina y se determinó el contenido de lisina en el material sobrenadante del cultivo.

Para esto, los clones se multiplicaron primeramente sobre placas de un agar de corazón y cerebro (de Merck, Darmstadt, Alemania) durante 24 horas a 33°C. Partiendo de estos cultivos en placas de agar, se inoculó en cada caso un cultivo previo (10 ml del medio en un matraz Erlenmeyer con una capacidad de 100 ml). Como medio para el cultivo previo se utilizó el medio MM. El cultivo previo se incubó durante 24 horas a 33°C y 240 rpm en un aparato sacudidor. A partir de este cultivo previo se inoculó un cultivo principal, de tal manera que la DO (densidad óptica) inicial (a 660 nm) del cultivo principal fue de 0,1 DO. Para el cultivo principal se utilizó asimismo el medio MM.

Medio MM CSL 5 g/l MOPS 20 g/l glucosa (autoclavada por separado) 50 g/l Sales: (NH4)2SO4) 25 g/l KH2PO4 0,1 g/l MgSO4 * 7 H2O 1,0 g/l CaCl2 * 2 H2O 10 mg/l FeSO4 * 7 H2O 10 mg/l MnSO4 * H2O 5,0 mg/l biotina (filtrada en condiciones estériles) 0,3 mg/l tiamina * HCl (filtrada en condiciones estériles) 0,2 mg/l CaCO3 25 g/l

El CSL (acrónimo de Corn Steep Liquor = líquido de maceración de maíz), el MOPS (ácido morfolinopropanosulfónico) y la solución salina se ajustaron a un pH de 7 con agua amoniacal y se autoclavaron. A continuación se añadieron las soluciones estériles de substrato y de vitaminas así como el CaCO3 autoclavado seco.

La cultivación se efectuó en unos volúmenes de 10 ml, que estaban contenidos en matraces Erlenmeyer, con una capacidad de 100 ml, provistos de obstáculos. La temperatura fue de 33°C, el número de revoluciones fue de 250 rpm y la humedad del aire fue de 80 %.

Después de 48 horas se determinó la densidad óptica (DO) en el caso de una longitud de onda de medición de 660 nm con el Biomek 1000 (de Beckmann Instruments GmbH, München). La cantidad de lisina formada se determinó con un analizador de aminoácidos BioTronik de la entidad Eppendorf (Hamburg, Alemania) mediante una cromatografía con intercambio de iones y una derivatización posterior en la columna con detección por ninhidrina. Un mutante, que se distinguía por una formación aumentada de lisina, se designó como DM1808.

Tabla 1

Cepa

DO (660) Lisina-HCl (g/l)

DM1797

12,1 4,9

DM1808

12,0 5,3

Ejemplo 3 Secuenciación del gen mqo del mutante DM1808 A partir del clon DM1808, con el método de Eikmanns y colaboradores (Microbiology 140: 1817 -1828 (1994)) se

aisló un ADN cromosomal. Con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa se amplificó un fragmento de ADN,

Los cebadores expuestos fueron sintetizados por la entidad MWG Biotech (Ebersberg, Alemania). Ellos hacen posible la amplificación de un fragmento de ADN con una longitud de aproximadamente 2 kb (kilobases), que lleva el gen mqo. El cebador mqo-A1 se fija a la región que corresponde a las posiciones 22 hasta 41 de la cadena complementaria con respecto a la SEQ ID NO: 3. El cebador mqo-E1 se fija a la región que corresponde a las posiciones 2.002 hasta 1.983 de la cadena de acuerdo con la SEQ ID NO: 3.

La reacción de PCR se llevó a cabo con la polimerasa de ADN Phusion High Fidelity (de New England Biolabs, Francfort, Alemania). La tanda de reacción se formuló según los datos del fabricante y contenía, en el caso de un volumen total de 50 µl, 10 µl del tampón 5 x Phusion HF suministrado conjuntamente, desoxinucleósido-trifosfatos en una concentración de en cada caso 200 µM, unos cebadores en una concentración de 0,5 µM, aproximadamente 50 ng de ADN de molde y 2 unidades de la polimerasa Phusion. Mediante una adición de H2O se ajustó el volumen a 50 µl.

La tanda de PCR se sometió en primer lugar a una desnaturalización introductoria a 98°C durante 30 segundos. Después de esto, repitiéndose 35x (veces), siguieron una etapa de desnaturalización a 98°C durante 20 segundos, una etapa para la fijación del cebador al ADN dispuesto previamente a 60°C durante 20 segundos y la etapa de extensión para la prolongación del cebador a 72°C durante 60 segundos. Después de la etapa final de extensión durante 5 minutos a 72°C, la tanda de PCR se sometió a una electroforesis en gel de agarosa (agarosa al 0,8 %). Un fragmento de ADN con una longitud de aproximadamente 2 kb se identificó, se aisló a partir del gel y se purificó mediando utilización del estuche QIAquick Gel Extraction Kit de la entidad Qiagen (Hilden, Alemania).

La secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN amplificado o respectivamente del producto de la PCR fue determinada por la entidad Agowa (Berlín, Alemania). La secuencia obtenida de la región codificadora del alelo de mqo se representa en la SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoácidos, que se establece con ayuda del programa Patentin, se representa en la SEQ ID NO: 6.

La secuencia de nucleótidos de la región codificadora del alelo de mqo del mutante DM1808 contiene en la posición 332 la nucleobase timina (véase la SEQ ID NO: 5). El gen del tipo silvestre (véase la SEQ ID NO: 1) contiene en esta posición la nucleobase citosina. Esta transición de citosina a timina conduce a un intercambio de aminoácidos de serina por fenilalanina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos resultante. Esta mutación se designa a continuación como mqoS111F.

Ejemplo 4

Construcción del vector de intercambio pk18mobsacB_mqoS111F

Con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa se amplificó una parte de la región codificadora, es decir un denominado fragmento interno o respectivamente una denominada región interna, del alelo de mqo, que contiene la mutación mqoS111F. Como molde se utilizó el ADN cromosomal obtenido en el Ejemplo 3. Se escogieron los siguientes oligonucleótidos como cebadores para la PCR:

Ellos fueron sintetizados por la entidad MWG Biotech (Ebersberg, Alemania) y hacen posible la amplificación de un segmento de ADN de la región codificadora con una longitud de aproximadamente 1,05 kb. Los nucleótidos 11 hasta 30 del cebador mqo-int1-bam se fijan a la región correspondiente a las posiciones 362 hasta 381 de la cadena complementaria con respecto a la SEQ ID NO: 3. Las posiciones 362 y 381 de la SEQ ID NO:3 corresponden a las posiciones 13 y 32 en la SEQ ID NO: 1. Los nucleótidos 11 hasta 30 del cebador mqo-int2-bam se fijan a la región correspondiente a las posiciones 1.385 hasta 1.366 de la cadena de acuerdo con la SEQ ID NO: 3. Las posiciones

1.385 y 1.366 de la SEQ ID NO:3 corresponden a las posiciones 1.036 y 1.017 de la SEQ ID NO: 1. Además de ello, los cebadores contienen las secuencias para los sitios de corte por la endonucleasa de restricción BamHI, que se han marcado mediante subrayado en la secuencia de nucleótidos arriba representada.

La reacción de PCR se llevó a cabo con la polimerasa de ADN Phusion High-Fidelity (de New England Biolabs, Francfort, Alemania). La tanda de reacción tenía la composición más arriba descrita. La PCR se llevó a cabo tal como se ha descrito más arriba, con una excepción: la etapa de extensión a 72°C en la repetición de 35 veces se llevó a cabo en cada caso sólo durante 30 segundos.

El material amplificado con una longitud de aproximadamente 1,05 kb se trató con la endonucleasa de restricción BamHI y se identificó mediante una electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 %. A continuación, él se aisló a partir del gel y se purificó con el estuche QIAquick Gel Extraction Kit de la entidad Qiagen.

El fragmento de ADN purificado de esta manera contiene la mutación mqoS111F descrita y posee unos extremos compatibles con BamHI (fragmento mqoS111F o respectivamente "mqo" en la Figura 1). A continuación, él fue incorporado en el vector pK18mobsacB movilizable, descrito por Schäfer y colaboradores (Gene 145, 69-73 (1994), con el fin de hacer posible un intercambio de alelos o respectivamente de mutaciones. Para esto, el pK18mobsacB fue digerido con la enzima de restricción BamHI y los extremos fueron desfosforilados con una fosfatasa alcalina (Alkaline Phosphatase, de Boehringer Mannheim, Alemania). El vector preparado previamente de esta manera se mezcló con el fragmento mqoS111F y la tanda se trató con el estuche Ready-To-Go T4 DNA Ligase Kit (de Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemania).

A continuación, la cepa de E. coli S17-1 (Simon y colaboradores, Bio/Technologie 1: 784-791, 1993) se transformó con la tanda de ligación (Hanahan, In. DNA cloning. A practical approach, tomo 1, IRL-Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). La selección en cuanto a células portadoras del plásmido se efectuó por siembra en placas de la tanda de transformación sobre un agar LB (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), que había sido suplementado con 25 mg/l de kanamicina.

El ADN de plásmido fue aislado a partir de un transformante con ayuda del estuche QIAprep Spin Miniprep Kit de la entidad Qiagen y fue comprobado mediante una disociación por restricción, en cada caso una vez con la enzima BamHI y una vez con la enzima EcoRI, y mediante una subsiguiente electroforesis en gel de agarosa. El plásmido fue denominado pK18mobsacB_mqoS111F y se ha representado en la Figura 1.

Ejemplo 5

Incorporación de la mutación mqoS111F en la cepa DM1797

El vector pK18mobsacB_mqoS111F descrito en el Ejemplo 4 fue transferido por conjugación a la cepa DM1797 de

C. glutamicum de acuerdo con el protocolo de Schäfer y colaboradores (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990). El vector no se puede replicar de manera autónoma en DM1797 y permanece conservado en la célula solamente cuando él se presenta integrado en el cromosoma como consecuencia de un suceso de recombinación. La selección de transconjugantes, es decir de clones con el pK18mobsacB_mqoS111F integrado, se efectuó

mediante siembra en placas de la tanda de conjugación sobre un agar LB, que había sido suplementado con 25 mg/l de kanamicina y 50 mg/l de ácido nalidíxico. Los transconjugantes resistentes frente a kanamicina fueron extendidos como un frote a continuación sobre placas de agar LB suplementadas con kanamicina (25 mg/l), y se incubaron durante 24 horas a 33°C. Para realizar la selección de unos mutantes, en los que, como consecuencia de un

5 segundo suceso de recombinación, había tenido lugar la escisión del plásmido, los clones fueron cultivados durante 30 horas de un modo no selectivo en un medio LB líquido, a continuación fueron extendidos como un frote sobre un agar LB, que había sido suplementado con sacarosa al 10 %, y fueron incubados durante 24 horas a 33°C.

El plásmido pK18mobsacB_mqoS111F, al igual que el plásmido de partida pK18mobsacB, junto al gen de

10 resistencia a kanamicina, contiene una copia del gen sacB que codifica la levano sucrasa procedente de Bacillus subtilis. La expresión del gen sacB, inducible por sacarosa, conduce a la formación de la levano sucrasa, que cataliza la síntesis del producto levano, que es tóxico para C. glutamicum. Sobre un agar LB suplementado con sucrosa (= sacarosa) crecen por lo tanto sólo aquellos clones, en los que el pK18mobsacB_mqoS111F integrado se ha escindido como consecuencia de un segundo suceso de recombinación. En dependencia de la localización del

15 segundo suceso de recombinación en lo que respecta al sitio de la mutación tiene lugar una escisión del intercambio de alelos o respectivamente de la incorporación de la mutación, o la copia original permanece en el cromosoma del anfitrión.

A continuación se buscó un clon, en el que se había efectuado el intercambio deseado, es decir la incorporación de

20 la mutación mqoS111F. Para esto, a partir de 10 clones con el fenotipo "crecimiento en presencia de sacarosa" y "ausencia de crecimiento en presencia de kanamicina", se determinó la secuencia del gen mqo. De esta manera se identificó un clon, que lleva la mutación mqoS111F. Esta cepa fue designada como C. glutamicum DM1797_ mqoS111F.

25 Ejemplo 6

Comparación del rendimiento de la cepa DM1797_mqoS111F con la cepa de partida DM1797.

El ensayo de rendimiento se llevó a cabo tal como se ha descrito en el Ejemplo 2. La cepa DM1797_ mqoS111F

30 mostró, en comparación con la cepa DM1797, una segregación manifiestamente aumentada de lisina, similar a la de la DM1808 (véase la Tabla 1).

Breve descripción de la Figura:

35 Figura 1: Mapa del plásmido pK18mobsacB_mqoS111F

Las abreviaturas utilizadas y las denominaciones tienen los siguientes significados. En el caso de la indicación de los números de pares de bases se trata de unos valores aproximados, que se obtuvieron dentro del marco de la

40 reproducibilidad de las mediciones.

Kan: gen de resistencia a kanamicina

BamHI: sitio de corte de la enzima de restricción EcoRI

45 EcoRI: sitio de corte de la enzima de restricción EcoRI

´mqo´: fragmento de ADN clonado que contiene un segmento interno del alelo de mqoS111F

50 sacB: gen sacB

RP4-mob: región mob con el origen de la replicación para la transferencia (oriT)

oriV: origen de la replicación V 55

LISTA DE SECUENCIAS:

<110> Degussa AG 5 <120> Alelos del gen mqo procedente de bacterias corineformes

<130> 040041 BT

<160> 26 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1503 15 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDSS 20 <222> (1)..(1500)

<223> gen mqo de tipo silvestre

<400> 1

<210> 2

<211> 500

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 2

<210> 3

<211> 2002

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (350)..(1849) 10 <223> gen mqo de tipo silvestre

<400> 3

<210> 4

<211> 500

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 4

<210> 5

<211> 1503

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222>

(1)..(1500) 10 <223> alelo de mqo

<220>

<221> mutación

<222>

(332)..(332) 15 <223> transición: intercambio de citosina por timina

<400> 5

<210> 6

<211> 500

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 6

<210> 7

<211> 1503

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222>

(1)..(1542) 10 <223> alelo de mqo

<220>

<221> mutación

<222>

(331)..(331) 15 <223> transversión: intercambio de timina por guanina

<400> 7

<210> 8

<211> 500

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 8

<210> 9

<211> 1503

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222>

(1)..(1500) 10 <223> alelo de mqo

<220>

<221> mutación

<222>

(331)..(331) 15 <223> transversión: intercambio de timina por guanina

<220>

<221> mutación

<222>

(601).. (601) 20 <223> transversión: intercambio de guanina por timina

<400> 9

<210> 10

<211> 500

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 10

5

<210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador mqo-start

10

<400> 11 cagagaactc gcggagataa 20

<210> 12

<211> 20

<212> ADN

5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador mqo-stop

10 <400> 12 aacctcaaca gacatgtgcg 20

<210> 13

<211> 20 15 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador mqo-A1 20

<400> 13 ggtgaaactt ccgcgatact 20

<210> 14 25 <211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220> 30 <223> cebador mqo-E1

<400> 14 gtgtcgccta aatcacactg 20

35 <210> 15

<211> 99

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

40 <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (99)

<223> marco de lectura

45 <220>

<221> mutación

<222> (49)..(51)

<223> las posiciones 49 hasta 51 corresponden a las posiciones 331 hasta 333 de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5,

SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9, 50

<220>

<221> característica variada

<222> (49)..(51)

<223> n es a, c, g ó t 55

<400> 15

<210> 16

<211> 33

<212> PRT 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> característica variada

<222> (17)..(17)

10 <223> El "xaa" en la posición 17 representa Lys, Asn, Arg, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys o Phe.

<400> 16

15 <210> 17

<211> 99

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

20 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(99)

<223> marco de lectura

<220> 25 <221> mutación

<222> (49)..(51)

<223> las posiciones 49 hasta 51 corresponden a las posiciones 331 hasta 333 de la SEQ ID NO:5

<400> 17

<210> 18

<211> 33

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 18

<210> 19

<211> 99 5 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>

CDS 10 <222> (1)..(99)

<223> marco de lectura

<220>

<221>

mutación 15 <222> (49)..(51)

<223> las posiciones 49 hasta 51 corresponden a las posiciones 331 hasta 333 de la SEQ ID NO: 7 o de la SEQ ID NO: 9

<400> 19

<210> 20

<211> 33

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 20

<210> 21

<211> 1263 30 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS 35 <222> (1)..(1263)

<223> gen lysC del tipo silvestre

<400> 21

<210> 22

<211> 421

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 22

<210> 23

<211> 1503

<212> ADN

5

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1500)

10

<223> alelo de mqo

<220>

<221> mutación

<222> (1168)..(1170)

15

<220>

<221> característica variada

<222> (1168)..(1170)

<223> n es a, c, g ó t

20

<400> 23

<210> 24

<211> 500

<212> PRT 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> característica variada

<222> (390)..(390)

10 <223> El "xaa" en la posición 390 representa Lys, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys o Phe.

<400> 24

<210> 25

<211> 1503

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222>

(1)..(1500) 10 <223> alelo de mqo

<220>

<221> mutación

<222>

(1168)..(1170) 15

<400> 25

<210> 26

<211> 500

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 26

5

<210> 27 <211> 30 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador mqo-int1-bam

10

<400> 27 ctagggatcc ccgaagaacg caccgaggat 30

15

<210> 28 <211> 30 <212> ADN <213> secuencia artificial

20

<220> <223> cebador mqo-int2-bam <400> 28 ctagggatcc ggcggatgga cttgaacagg 30

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES

   1. Mutantes aislados de bacterias corineformes, que contienen un gen, escogido entre el conjunto que se compone de los siguientes a) hasta c):

   a) un gen, que codifica un polipéptido con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo el polipéptido la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en cuyo caso está contenida L-fenilalanina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y eventualmente está contenida L-serina en la posición 201 de la SEQ ID NO: 2;

   b) un gen, que codifica un polipéptido con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo el polipéptido codificado una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en por lo menos un 98 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, estando contenida L-fenilalanina en la secuencia de aminoácidos en la posición, que corresponde a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

   c) un gen, que codifica una proteína con una actividad de malato-quinona oxidorreductasa, comprendiendo la proteína codificada una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6, inclusive de uno a 5 intercambio(s) conservativo(s) de aminoácidos, estando contenida L-fenilalanina en la secuencia de aminoácidos en la posición, que corresponde a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

   siendo aumentada en por lo menos un 0,5 % la segregación de aminoácidos de estos mutantes, en comparación con la de una cepa de partida no mutagenizada con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2.

2. 2.

   Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizados por que en el caso de las bacterias corineformes se trata de una bacteria escogida entre el conjunto que se compone de Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes y Corynebacterium aminogenes.

3. 3.

   Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizados por que se trata de Corynebacterium glutamicum.

4. 4.

   Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizados por que se trata de unas bacterias que segregan L-lisina o L-triptófano o L-prolina,

5. 5.

   Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizados por que el gen comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.

6. 6.

   Un polinucleótido aislado escogido entre uno de los siguientes a) o b)

   a) un polinucleótido, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de malato-quinona oxidorreductasa y con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, que contiene L-fenilalanina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y eventualmente posee L-serina en la posición 201 de la SEQ ID NO: 2.

   b) un polinucleótido, comprendiendo la proteína codificada una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 inclusive de uno a 5 intercambio(s) conservativo(s) de aminoácidos, estando contenida L-fenilalanina en la secuencia de aminoácidos, en la posición, que corresponde a la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

   aumentando estos polinucleótidos en por lo menos un 0,5 % la secreción de aminoácidos de los correspondientes mutantes, en comparación con la de una cepa de partida no mutagenizada, con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2,.

7. 7.

   Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que el polipéptido codificado con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 tiene una longitud de 500 aminoácidos, y está contenida L-fenilalanina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

8. 8.

   Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por que el polipéptido codificado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

9. 9.

   Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5.

10. 10.

    Un polinucleótido aislado, que comprende una molécula de ácido nucleico, que codifica por lo menos un marco de lectura con una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 95 hasta 127 de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-fenilalanina en la posición correspondiente a la posición 111 de la SEQ ID NO: 2, para la utilización para la producción de unas bacterias corineformes, que tienen una segregación de aminoácidos

    aumentada en por lo menos un 0,5 % en comparación con la de la cepa de partida no mutagenizada, de acuerdo con la SEQ ID NO: 2,.

11. 11.

    Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado por que comprende por lo menos la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 283 hasta 381 de la SEQ ID NO: 5.

12. 12.

    Procedimiento para la producción de una bacteria corineforme recombinante, caracterizado por que

    (a)

    un polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 6 hasta 9 o de acuerdo con las reivindicaciones 10 hasta 11 se transfiere a una bacteria corineforme,

    (b)

    el gen de malato-quinona oxidorreductasa presente en el cromosoma de la bacteria corineforme, que codifica una secuencia de aminoácidos con L-serina en la posición 111 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, se intercambia por el polinucleótido procedente de a), que codifica una secuencia de aminoácidos, que contiene Lfenilalanina en la posición 111 de la SEQ ID NO: 2 y eventualmente L-serina en la posición 201 de la SEQ ID NO: 2, y

    (c)

    se multiplica y reproduce la bacteria corineforme obtenida de acuerdo con las etapas a) y b).

13. 13.

    Un vector, que contiene el polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 6 hasta 90 o 10 hasta 11.

14. 14.

    Un microorganismo recombinante, que contiene el vector de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que se trata de una bacteria corineforme.

15. 15.

    Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado por que en el caso de la bacteria corineforme se trata del género Corynebacterium.

16. 16.

    Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado por que en el caso de la bacteria del género Corynebacterium se trata de la especie Corynebacterium glutamicum.

17. 17.

    Procedimiento para la producción de un L-aminoácido caracterizado por que, a) se fermenta una bacteria corinefrome aislada en un medio adecuado, conteniendo la bacteria un gen que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de malato-quinona oxidorreductasa, siendo reemplazada, en las secuencias de aminoácidos del polipéptido, la L-serina por L-fenilalanina en la posición 111 o en la correspondiente posición, y tratándose en el caso del gen de un polinucleótido de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 hasta 11, y b) el L-aminoácido se enriquece en el caldo de fermentación o en las células de la bacteria.

18. 18.

    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado por que en el caso de la bacteria corineforme aislada se trata de un mutante de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 6.

19. 19.

    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado por que se aísla o recoge el L-aminoácido.

20. 20.

    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado por que se purifica el L-aminoácido.

21. 21.

    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado por que el L-aminoácido se aísla o se recoge en común con unos componentes procedentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa (> 0 hasta 100 %).

22. 22.

    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado por que a) a partir del caldo de fermentación obtenido a partir de la etapa b) de la reivindicación 17 se elimina la biomasa formada en una proporción de 0 a 100 %, y b) a partir del caldo obtenido en la etapa a) se produce un producto que está esencialmente seco y conformado, mediante un método escogido entre el conjunto que se compone de una granulación, una compactación, una desecación por atomización y una extrusión.

23. 23.

    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado por que al caldo de fermentación, antes o después de la etapa a), se le añade un ácido escogido entre el conjunto que se compone de ácido sulfúrico, ácido clorhídrico y ácido fosfórico.

24. 24.

    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado por que a partir del caldo obtenido antes o después de la etapa a), se elimina agua.

25. 25.

    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado por que el producto conformado obtenido en o durante la etapa b) es rociado con un aceite.

    Figura 1: Mapa del plásmido pK18mobsacB_mqoS111F