ES2518995T3

ES2518995T3 - Alelos del gen prpD1 procedente de bacterias corineformes

Info

Publication number: ES2518995T3
Application number: ES07821449.1T
Authority: ES
Inventors: Brigitte Bathe; Caroline Kreutzer; Georg Thierbach
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2006-10-26
Filing date: 2007-10-17
Publication date: 2014-11-06
Anticipated expiration: 2027-10-17
Also published as: DK2078085T3; DE102006050489A1; KR20090078359A; BRPI0717983A2; EP2078085B1; BRPI0717983B1; KR101276978B1; US8080395B2; WO2008049769A1; US7893231B2; EP2078085A1; US20110171695A1; PL2078085T3; US20080274265A1

Abstract

Mutantes aislados de bacterias corineformes, que contienen un gen, que codifica un polipéptido con una actividad de 2-metilcitrato deshidratasa, caracterizados por que el polipéptido contiene L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o por que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272.

Description

Alelos del gen prpD1 procedente de bacterias corineformes

5 Son objeto del invento unos mutantes y alelos del gen prpD1 procedente de bacterias corineformes, que codifican unas variantes de la 2-metilcitrato deshidratasa (EC: 4.2.1.79) y unos procedimientos para la producción de L-lisina mediando utilización de unas bacterias que contienen estos alelos.

Estado de la técnica

10 Los aminoácidos encuentran uso en la medicina humana, en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y en particular en la nutrición de animales.

Es conocido que ciertos aminoácidos pueden ser producidos por fermentación de unas cepas de bacterias

15 corineformes, en particular de Corynebacterium glutamicum. A causa de la gran importancia de este hecho, se está trabajando constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de producción. Unos mejoramientos de los procedimientos pueden concernir a unas medidas técnicas de fermentación tales como por ejemplo la agitación y el abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos, tal como por ejemplo la concentración de azúcares durante la fermentación, o al tratamiento para dar la forma del producto mediante por ejemplo una

20 cromatografía con intercambio de iones, o a las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho.

Para el mejoramiento de las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se utilizan unos métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen unas cepas, que son resistentes frente

25 a unos antimetabolitos o que son auxótrofas para unos metabolitos importantes para regulación y que producen unos aminoácidos. Un antimetabolito conocido es el compuesto análogo a la lisina S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC).

Desde hace algunos años se emplean asimismo unos métodos de la técnica de ADN recombinante para el mejoramiento de las cepas del género Corynebacterium que producen L-aminoácidos, mediante el recurso de que

30 se amplifican unos genes individuales para la biosíntesis de aminoácidos, y se investiga la repercusión sobre la producción de aminoácidos.

El cromosoma de Corynebacterium glutamicum fue secuenciado completamente hace algún tiempo (Kalinowski y colaboradores, Journal of Biotechnology 104, 5-25 (2003)). El cromosoma de Corynebacterium efficiens asimismo ya

35 ha sido secuenciado (Nishio y colaboradores, Genome Res. 13 (7), 1572-1579 (2003)).

Unos correspondientes datos de secuencias se pueden tomar de los bancos de datos públicos. Unos apropiados bancos de datos son, por ejemplo, el Banco de Datos de los European Molecular Biologies Laboratories (Laboratorios europeos de biología molecular) (EMBL, Heidelberg, Alemania o respectivamente Cambridge, Reino

40 Unido), el Banco de Datos del National Center for Biotechnology Information (Centro nacional para información sobre biotecnología) (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.), el del Swiss Institute of Bioinformatics (Instituto suizo de bioinformática) (Swissprot, Ginebra, Suiza), de la Protein Information Resource Database (Base de datos de medios de información sobre proteínas) (PIR, Washington, DC, EE.UU.) y el DNA Data Bank of Japan (Banco de datos de ADN del Japón) (DDBJ, 1111 Yata, Mishima, 411-8540, Japón).

45 Unas exposiciones recopilativas acerca de la genética, del metabolismo y de la importancia técnica de Corynebacterium glutamicum se encuentran en los artículos de Ikeda, de Pfefferle y colaboradores y de Mueller y Huebner en la obra "Microbial Production of L-Amino Acids" (Producción microbiana de L-aminoácidos) (Advances in Biochemical Engineering 79, (2003), editorial Springer Verlag, Berlin, Alemania, compilador de edición: T. Scheper),

50 en la edición especial con el título "A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology" (Una nueva era en la biotecnología de Corynebacterium glutamicum) (Journal of Biotechnology tomo 104 (1-3), (2003), del Journal of Biotechnology (coordinadores de edición: A. Pühler y T. Tauch) y en la obra "Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Manual de Corynebacterium glutamicum) (coordinadores de edición: L. Eggeling y M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, EE.UU. 2005).

55 La secuencia de nucleótidos del gen prpD1 que codifica la 2-metilcitrato deshidratasa procedente de Corynebacterium glutamicum está disponible entre otros lugares en el Banco de Datos del National Center for Biotechnology Information (Centro nacional para información sobre biotecnología) (NCBI) de la National Library of Medicine (Biblioteca nacional de medicina) (Bethesda, MD, EE.UU.) bajo el número de acceso AF434798. Ella

60 puede ser deducida además de la solicitud de patente europea EP 1 108 790 como la secuencia n° 770.

Claes y colaboradores (Journal of Bacteriology 184(10), 2728-2739 (2002)) informan acerca de unas investigaciones genéticas, microbiológicas y bioquímicas en los genes prpD1, prpB1 y prpC1 de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.

Para conseguir una mejor claridad, la secuencia de nucleótidos del gen prpD1 (“gen de tipo silvestre”), que codifica la 2-metilcitrato deshidratasa procedente de Corynebacterium glutamicum, de acuerdo con los datos del banco de datos NCBI (acrónimo de National Center for Biotechnology Information = Centro nacional para información de biotecnología) está representada en la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de la 2-metilcitrato

5 deshidratasa codificada que se establece a partir de aquella está representada en las SEQ ID NO: 2 y 4. En la SEQ ID NO: 3 se indican adicionalmente las secuencias de nucleótidos que están situadas corriente arriba (en inglés "upstream") y corriente abajo (en inglés "downstream”).

Misión del invento

10 Los autores del invento se han planteado como misión la de poner a disposición nuevas medidas técnicas para la producción mejorada de aminoácidos, en particular de L-lisina, L-triptófano, L-valina, L-isoleucina y L-homoserina.

Descripción del invento

15 Un objeto del invento son unos mutantes producidos o respectivamente aislados de bacterias corineformes, que segregan de manera preferida unos aminoácidos, y que contienen un gen o respectivamente un alelo, que codifica un polipéptido con una actividad de 2-metilcitrato deshidratasa, caracterizado por que el polipéptido contiene L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de

20 la SEQ ID NO: 2 o por que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272.

En el caso de las bacterias corineformes, se prefiere el género Corynebacterium. En el caso del género Corynebacterium se prefieren las siguientes especies: 25 Corynebacterium efficiens (la cepa del tipo DSM44549),

Corynebacterium glutamicum (la cepa del tipo ATCC13032)

Corynebacterium thermoaminogenes (por ejemplo, la cepa FERM BP-1539), y

Corynebacterium ammoniagenes (la cepa del tipo ATCC6871),

30 siendo muy especialmente preferida la especie Corynebacterium glutamicum.

Algunos representantes de la especie Corynebacterium glutamicum son conocidos en el estado de la técnica también por otras denominaciones de especies. A éstos pertenecen, por ejemplo:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC127270,

Corynebacterium lilium DSM20137,

35 Corynebacterium melassecola ATCC17965

Brevibacterium flavum ATCC14067

Brevibacterium lactofermentum ATCC127269,

Brevibacterium divaricatum ATCC14020, y

Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354.

40 El concepto de "Micrococcus glutamicus" para Corynebacterium glutamicum era asimismo usual.

Las cepas de bacterias corineformes empleadas para las medidas técnicas del invento ya poseen de manera preferida la capacidad de enriquecer el aminoácido deseado en la célula y/o de segregarlo al medio nutritivo circundante y acumularlo allí. Para esto, en lo sucesivo se utiliza la expresión de "producir". En particular las cepas

45 de bacterias corineformes que se emplean poseen la capacidad de enriquecer o respectivamente de acumular ≥ (por lo menos) 0,25 g/l, ≥ 0,5 g/l, ≥ 1,0 g/l, ≥ 1,5 g/l, ≥ 2,0 g/l, ≥ 4 g/l o ≥ 10 g/l del aminoácido deseado en ≤ (como máximo) 120 horas, ≤ 96 horas, ≤ 48 horas, ≤ 36 horas, ≤ 24 horas o ≤ 12 horas en la célula o en el medio nutritivo. En este caso se puede tratar de unas cepas, que se habían producido mediante una mutagénesis y una selección, mediante unas técnicas de ADN recombinante o mediante una combinación de ambos métodos.

Unos conocidos representantes de cepas de bacterias corineformes que producen o respectivamente segregan L-lisina son por ejemplo:

Corynebacterium glutamicum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) que ha sido descrito en el documento EP 0 358 940,

Corynebacterium glutamicum MH20-22B (= DSM16835) que ha sido descrito en la cita de Menkel y colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 55 (3), 684-688 (1989)),

Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= Ferm BP-7382) que ha sido descrito en el documento EP 1 108 790,

Corynebacterium glutamicum NRRL B-11474 que ha sido descrito en el documento de patente de los EE.UU. US 4.275.157, y

Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP3304) que ha sido descrito en el documento US 5.250.423.

Unos conocidos representantes de cepas de bacterias corineformes que producen o respectivamente segregan L-triptófano son por ejemplo:

Corynebacterium glutamicum K76 (= Ferm BP-1847) que ha sido descrito en el documento US 5.563.052,

Corynebacterium glutamicum BPS13 (= Ferm BP-1777) que ha sido descrito en el documento US 5.605.818, y

Corynebacterium glutamicum Ferm BP-3055 que ha sido descrito en el documento US 5.235.940

Unos conocidos representantes de cepas de bacterias corineformes que producen o respectivamente segregan L-valina son por ejemplo:

Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763 que ha sido descrito en el documento US 5.188.948,

Brevibacterium lactofermentum FERM BP-3007 que ha sido descrito en el documento US 5.521.074,

Corynebacterium glutamicum FERM BP-3006 que ha sido descrito en el documento US 5.521.074, y

Corynebacterium glutamicum FERM BP-1764 que ha sido descrito en el documento US 5.188.948.

Unos conocidos representantes de cepas de bacterias corineformes que producen o respectivamente segregan L-isoleucina son por ejemplo:

Brevibacterium flavum FERM BP-760 que ha sido descrito en el documento US 4.656.135,

Brevibacterium flavum FERM BP-2215 que ha sido descrito en el documento US 5.294.547, y

Corynebacterium glutamicum FERM BP-758 que ha sido descrito en el documento US 4.656.135.

Unos conocidos representantes de cepas de bacterias corineformes que producen o respectivamente segregan L-homoserina son por ejemplo:

Micrococcus glutamicus ATCC 14296 que ha sido descrito en el documento US 3.189.526 y

Micrococcus glutamicus ATCC 14297 que ha sido descrito en el documento US 3.189.526. 4

Se encuentran datos acerca de la clasificación taxonómica de unas cepas de este conjunto de bacterias, entre otros lugares, en las citas de Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983), Kinoshita (1985, Glutamic Acid Bacteria, p. 115-142. En: Demain y Solomon (coordinadores de edición), Biology of Industrial Microorganisms (Biología de los microorganismos industriales). The Benjamin/Cummins Publishing Co., London, Reino Unido), Kämpfer y Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl y colaboradores (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991) y en el documento US-A-5.250.434.

Unas cepas con la denominación "ATCC" se pueden adquirir de la American Type Culture Collection (Colección americana de cultivos tipos) (Manassas, VA, EE.UU.). Unas cepas con la denominación "DSM" se pueden adquirir de la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares) (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Unas cepas con la denominación “NRRL” se pueden adquirir de la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (Colección de cultivos y patentes del sevicio de investigación agrícola) (ARS, Peoria, Illinois, EE.UU.). Unas cepas con la denominación "FERM" se pueden adquirir del National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Instituto nacional de ciencia y tecnología industrial avanzadas) (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japón).

Al polipéptido codificado por el gen prpD1 con una actividad de 2-metilcitrato deshidratasa (PrpD1) se le ha asignado correspondientemente a la nomenclatura de la IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry = Unión internacional de química pura y aplicada) el número EC 4.2.1.79.

Desde un punto de vista químico, un gen es un polinucleótido. Otro concepto para esto es el de un ácido nucleico.

Por el concepto de aminoácidos proteinógenos se entienden los aminoácidos, que se presentan en proteínas naturales, es decir en proteínas de microorganismos, plantas, animales y seres humanos. Dentro del contexto del presente invento por el concepto de "aminoácidos proteinógenos" se entiende el conjunto de los L-aminoácidos, que se compone de L-ácido aspártico, L-asparagina, L-treonina, L-serina, L-ácido glutámico, L-glutamina, glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptófano, L-prolina y L-arginina. A los L-aminoácidos pertenece asimismo la L-homoserina.

Los mutantes conformes al invento segregan de manera preferida los mencionados aminoácidos proteinógenos, en particular L-lisina, L-triptófano, L-valina, L-isoleucina o L-homoserina. El concepto de aminoácidos abarca también las sales de los mismos, tales como, por ejemplo, el monohidrocloruro de lisina o el sulfato de lisina en el caso del aminoácido L-lisina.

Un objeto del invento son por lo demás unos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo de prpD1, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272.

Un objeto del invento son por lo demás unos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo de prpD1, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, que contiene L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, comprendiendo el gen una secuencia de nucleótidos, que es idéntica a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido, que es obtenible mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediando utilización de un par de cebadores, cuyas secuencias de nucleótidos comprenden en cada caso por lo menos 15 nucleótidos consecutivos, que se escogen entre la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1 y 750 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7 y que se escogen entre la secuencia de nucleótidos complementaria situada entre las posiciones 2.245 y 3.000 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7. Un ejemplo de un tal adecuado par de cebadores se representa en las SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. Como material de partida (el ADN de molde) se prefiere un ADN cromosómico de bacterias corineformes, que en particular han sido tratadas con un mutágeno. Se prefiere especialmente el ADN cromosómico del género Corynebacterium y se prefiere muy especialmente el de la especie Corynebacterium glutamicum.

Un objeto del invento son por lo demás unos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo de prpD1, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que comprende una secuencia de aminoácidos con una longitud correspondiente a 498 L-aminoácidos, estando contenida L-lecitina en la posición 272.

Un objeto del invento son por lo demás unos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo de prpD1, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que en las posiciones 252 hasta 291 de la secuencia de aminoácidos contiene la secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 252 hasta 291 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8. De manera preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado contiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 202 hasta 341 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, o a las posiciones 152 hasta 391 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, o a las posiciones 102 hasta 441 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, o a las posiciones 52 hasta 491 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, o a las posiciones 2 hasta 495 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, o a las

posiciones 2 hasta 496 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, o a las posiciones 2 hasta 497 de la SEQ ID NO: 6

o respectivamente 8. De manera muy especialmente preferida, la longitud del polipéptido codificado comprende 498 aminoácidos.

Un objeto del invento son por lo demás unos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo de prpD1, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que contiene L-leucina en la posición 272 o respectivamente en la correspondiente posición de la secuencia de aminoácidos y cuya secuencia de aminoácidos es idéntica además de ello en por lo menos un 90 %, de manera preferida en por lo menos un 92 % o en por lo menos un 94 % o en por lo menos un 96 %, y de manera muy especialmente preferida en por lo menos un 97 % o en por lo menos un 98 % o en por lo menos un 99 % a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 6 o respectivamente SEQ ID NO: 8.

Un objeto del invento son por lo demás unos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo de prpD1, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que contiene L-leucina en la posición 272 o respectivamente en la correspondiente posición de la secuencia de aminoácidos, y cuya secuencia de nucleótidos es idéntica además en por lo menos un 90 %, de manera preferida en por lo menos un 92 %, o en por lo menos un 94 %, o en por lo menos un por lo menos un 96 %, y de manera muy especialmente preferida en por lo menos un 97 %, o en por lo menos un 98 %, o en por lo menos un 99 %, a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.

Es conocido que unos intercambios conservativos de aminoácidos modifican sólo de manera insignificante a la actividad enzimática. De modo correspondiente, el alelo prpD1 contenido en los mutantes conformes al invento, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, adicionalmente a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 6 o respectivamente en la SEQ ID NO: 8, puede contener uno (1) o varios intercambio(s) conservativo(s) de aminoácidos. De manera preferida, el polipéptido contiene a lo sumo dos (2), a lo sumo tres (3), a lo sumo cuatro (4), o a lo sumo cinco (5) intercambios conservativos de aminoácidos. Por tales intercambios conservativos de aminoácidos la actividad enzimática no es afectada esencialmente.

En el caso de los aminoácidos aromáticos se habla de intercambios conservativos, cuando se intercambian unos/as por otros/as fenilalanina, triptófano y tirosina. En el caso de los aminoácidos hidrófobos se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian unas por otras leucina, isoleucina y valina. En el caso de los aminoácidos polares se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian una por otra glutamina y asparagina. En el caso de los aminoácidos de carácter básico se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian unas por otras arginina, lisina e histidina. En el caso de los aminoácidos de carácter ácido se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian uno por otro el ácido aspártico y el ácido glutámico. En el caso de los aminoácidos que contienen grupos hidroxilo se habla de intercambios conservativos cuando se intercambian una por otra serina y treonina.

Durante el trabajo realizado en el presente invento, mediante una comparación de la secuencia de aminoácidos con el programa Clustal (Thompson y colaboradores, Nucleic Acids Research 22, 4637-4680 (1994)), se comprobó que las secuencias de aminoácidos de la 2-metilcitrato deshidratasa de diferentes bacterias tales como, por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Corynebacterium efficiens y Corynebacterium glutamicum está contenido un motivo de secuencia que se compone de la sucesión Arg-Glu-Leu-Asp-Phe-His-Asp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/Glu-Tyr-Ser-His-Pro, un motivo de secuencia que se compone de la sucesión Gly-Ile-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-Ile-Asp-His-Val-Ala-His-Leu-Gly-Pro, y también un motivo de secuencia que se compone de la sucesión Pro-Ala-Pro-Ile-Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-Ile-Ala-Trp-Leu-Leu. La designación "Asp/Glu" significa que en la posición correspondiente puede presentarse "Asp o Glu".

De una manera correspondiente, se prefieren aquellos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo de prpD1, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos escogida entre el conjunto que se compone de Arg-Glu-Leu-Asp-Phe-His-Asp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/Glu-Tyr-Ser-His-Pro, Gly-Ile-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-Ile-Asp-His-Val-Ala-His-Leu-Gly-Pro y Pro-Ala-Pro-Ile-Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-Ile-Ala-Trp-Leu-Leu, y que contiene uno de los aminoácidos proteinógenos en la posición 272 o respectivamente en la posición correspondiente o comparable de la secuencia de aminoácidos contiene uno de los aminoácidos proteinógenos estando exceptuada la L-prolina, de manera preferida L-leucina.

El motivo de secuencia de aminoácidos Arg-Glu-Leu-Asp-Phe-His-Asp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/Glu-Tyr-Ser-His-Pro está contenido, por ejemplo, en la SEQ ID NO: 2 o respectivamente 4 o 6 o respectivamente 8 desde la posición 102 hasta la 118. El motivo de secuencia de aminoácidos Gly-Ile-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-Ile-Asp-His-Val-Ala-His-Leu-Gly-Pro está contenido, por ejemplo, en la SEQ ID NO: 2 o respectivamente 4 o 6 o respectivamente 8 desde la posición 156 hasta la 172. El motivo de secuencia de aminoácidos Pro-Ala-Pro-Ile-Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-Ile-Ala-Trp-Leu-Leu está contenido, por ejemplo, en la SEQ ID NO: 2 o respectivamente 4 o 6 o respectivamente 8 desde la posición 240 hasta la 255.

Un objeto del invento son finalmente unos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo de prpD1, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente de la SEQ ID NO: 8.

Un objeto del invento son finalmente también unos mutantes de bacterias corineformes, que contienen un alelo de prpD1 correspondiente a la SEQ ID NO: 5 o respectivamente a la SEQ ID NO: 7.

Es conocido que, por medio de unas enzimas propias del anfitrión, las denominadas aminopeptidasas, la metionina situada en un extremo es eliminada al realizar la síntesis de proteínas.

Por el concepto de "una posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos" o de "una posición comparable a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos" se entiende el hecho de que mediante una inserción o supresión de un codón que codifica un aminoácido en la región terminal de N (referida a la posición 272 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8) del polipéptido codificado, el dato sobre la posición y el dato sobre la longitud se aumentan formalmente en una unidad en el caso de una inserción o se disminuyen formalmente en una unidad en el caso de una supresión. Por ejemplo, mediante una supresión del codón GAG que codifica el aminoácido L-ácido glutámico, en la posición 19 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8 la L-leucina se desplaza desde la posición 272 hasta la posición 271. El dato sobre la longitud sería entonces: 497 aminoácidos. De igual manera, mediante una inserción o supresión de un codón que codifica un aminoácido en la región del terminal de C (referida a la posición 272) del polipéptido codificado, el dato sobre la longitud en el caso de una inserción se aumenta formalmente en una unidad, o en el caso de una supresión se disminuye formalmente en una unidad. Tales posiciones comparables se pueden identificar fácilmente mediante una comparación de las secuencias de aminoácidos en forma de una alineación (en inglés "alignment"), por ejemplo con ayuda del programa Clustal o del programa MAFFT.

La actividad enzimática no es afectada esencialmente por tales inserciones y supresiones. El concepto de "no es afectada esencialmente" significa que la actividad enzimática de las mencionadas variantes se diferencia como máximo en un 10 %, como máximo en un 7,5 %, como máximo en un 5 %, como máximo en un 2,5 % o como máximo en un 1 % con respecto de la actividad del polipéptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8.

Un método para la determinación de la actividad enzimática de la 2-metilcitrato deshidratasa se describe en la cita de Horswill y Escalante-Semerena (Biochemistry 40(15), 4703-4713 (2001)).

Un objeto del invento son de modo correspondiente también unos alelos de prpD1, que codifican unas variantes de polipéptidos de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, que contienen una o varias inserción/ones o supresión/ones. De manera preferida, el polipéptido contiene como máximo 5, como máximo 4, como máximo 3 o como máximo 2 inserciones o supresiones de aminoácidos.

Los motivos de secuencias Arg-Glu-Leu-Asp-Phe-His-Asp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/Glu-Tyr-Ser-His-Pro, Gly-Ile-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-Ile-Asp-His-Val-Ala-His-Leu-Gly-Pro y Pro-Ala-Pro-Ile-Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-Ile-Ala-Trp-Leu-Leu no son desgarrados de manera preferida por tales inserciones/supresiones.

Para la producción de los mutantes conformes al invento se pueden utilizar procedimientos clásicos de mutagénesis in vivo con unas poblaciones celulares de bacterias corineformes mediando utilización de unas sustancias mutágenas tales como, por ejemplo, la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), el etilmetanosulfonato (EMS), el 5-bromouracilo, o de la luz ultravioleta. Unos métodos de mutagénesis se describen, por ejemplo, en la obra Manual of Methods for General Bacteriology (Manual de métodos de bacteriología general) (de Gerhard y colaboradores (coordinadores de edición)), American Society for Microbiology, Washington, DC, EE.UU., 1981) o en la cita de Tosaka y colaboradores (Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978), o en la cita de Konicek y colaboradores (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)). Unas mutagénesis típicas mediando utilización de la MNNG comprenden unas concentraciones de 50 a 500 mg/l o también unas concentraciones más altas de hasta como máximo 1 g/l, y un período de tiempo de incubación de 1 a 30 minutos a un pH de 5,5 a 7,5. En estas condiciones, el número de las células capaces de vivir es reducido en una proporción de aproximadamente 50 % hasta 90 % o de aproximadamente 50 % hasta 99 % o de aproximadamente 50 % hasta 99,9 % o más.

A partir de la población celular mutagenizada se sacan y multiplican mutantes o respectivamente células. De manera preferida, en otra etapa se investiga su capacidad para segregar unos aminoácidos, de manera preferida L-lisina, L-triptófano, L-valina, L-isoleucina o L-homoserina, en un cultivo por tandas (en inglés "batch") mediando utilización de un medio nutritivo adecuado. Unos/as adecuados/as medios nutritivos y condiciones de ensayo se describen, entre otros lugares, en los documentos US 6.221.636, US 5.840.551, US 5.770.409, US 5.605.818, US 5.275.940 y US 4.224.409. En los casos de las utilizaciones de unas instalaciones robóticas apropiadas, tales como las que se describen por ejemplo en las citas de Zimmermann y colaboradores (VDI Berichte n° 1.841, editorial VDI, Düsseldorf, Alemania 2004, 439-443) o de Zimmermann (Chemie Ingenieur Technik 77 (4), 426-428 (2005)), se pueden investigar numerosos mutantes en un breve período de tiempo. Por lo general se investigan como máximo 3.000, como máximo 10.000, como máximo 30.000 o también como máximo 60.000 mutantes y eventualmente incluso

más, De esta manera se identifican unos mutantes, que en comparación con la cepa parental o respectivamente con la cepa de partida no mutagenizada, segregan aminoácidos de manera multiplicada en el medio nutritivo o en el interior de las células. A éstos pertenecen, por ejemplo, aquellos mutantes, cuya secreción de aminoácidos se ha aumentado en por lo menos un 0,5 %.

A continuación, a partir de los mutantes se pone a disposición o respectivamente se aísla un ADN, y con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa, mediando utilización de unos pares de cebadores, que permiten la amplificación del gen prpD1 o respectivamente del alelo de prpD1 conforme al invento, o de la mutación conforme al invento en la posición 272, se sintetiza el correspondiente polinucleótido. De manera preferida, el ADN se aísla a partir de aquellos mutantes, que segregan aminoácidos en una forma aumentada.

A este fin, se pueden se pueden escoger unos pares de cebadores arbitrarios a partir de la secuencia de nucleótidos situada corriente arriba y corriente abajo de la mutación conforme al invento, y de la secuencia de nucleótidos que es complementaria con respecto a aquella. Un primer cebador de un par de cebadores comprende en este caso de manera preferida por lo menos 15, por lo menos 18, por lo menos 20, por lo menos 21 o por lo menos 24 nucleótidos consecutivos, escogidos entre la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1 y 1.563 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7. El correspondiente segundo cebador de un par de cebadores comprende por lo menos 15, por lo menos 18, por lo menos 20, por lo menos 21 o por lo menos 24 nucleótidos consecutivos, escogidos a partir de la secuencia de nucleótidos complementaria entre las posiciones 3.000 y 1.567 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7. Si se desea la amplificación de la región codificadora, entonces el par de cebadores se escoge a partir de la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1 y 750 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7 y a partir de la secuencia de nucleótidos complementaria entre las posiciones 3.000 y 2.245 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7. Un adecuado par de cebadores es por ejemplo el par de cebadores a base de prpD1_XL-A1 y prpD1-XL-E1 que es reproducido bajo las SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. Un producto de PCR producido mediando utilización de este par de cebadores está representado en la SEQ ID NO: 13.

Si se desea la amplificación de una parte de la región codificadora, tal como se representa, por ejemplo, en las SEQ ID NO: 17 y 19, entonces el par de cebadores se escoge de manera preferida a partir de la secuencia de nucleótidos que se encuentra situada entre las posiciones 751 y 1.563 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7, y a partir de la secuencia de nucleótidos complementaria que está situada entre las posiciones 2.244 y 1.567 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7.

El cebador puede ser provisto, además de esto, de unos sitios de reconocimiento para enzimas de restricción, de un grupo de biotina o de otros elementos accesorios, tales como los que se describen dentro del estado de la técnica. La longitud total del cebador es por lo general como máximo de 30, 40, 50 ó 60 nucleótidos.

Para la producción de polinucleótidos mediante amplificación de unas secuencias escogidas, tales como las del alelo de prpD1 conforme al invento, a partir de un ADN dispuesto previamente, por ejemplo cromosómico (= ADN de molde = en inglés "template DNA"), mediante la amplificación por medio de una PCR, se emplean por lo general unas polimerasas de ADN termoestables. Unos ejemplos de tales polimerasas de ADN son la polimerasa Taq procedente de Thermus aquaticus, que es comercializada, entre otras, por la entidad Qiagen (Hilden, Alemania), la polimerasa Vent procedente de Thermococcus litoralis, que es comercializada, entre otras, por la entidad New England Biolabs (Frankfurt, Alemania) o la polimerasa Pfu procedente de Pyrococcus furiosus, que es comercializada, entre otras, por la entidad Stratagene (La Jolla, EE.UU.). Se prefieren unas polimerasas con una actividad de lectura de comprobación (en inglés "proof-reading"). El concepto de actividad de "lectura de comprobación" significa que estas polimerasas están en la situación de reconocer a unos nucleótidos que han sido introducidos erróneamente y de solventar los errores mediante una polimerización renovada (Lottspeich y Zorbas, Bioanalytik, editorial Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania (1998)). Unos ejemplos de polimerasas con una actividad de lectura de comprobación son la polimerasa Vent y la polimerasa Pfu.

Las condiciones en la tanda de reacción se ajustan según los datos del fabricante. Las polimerasas son proporcionadas por el fabricante por lo general en común con el tampón habitual, que tiene usualmente unas concentraciones de 10 -100 mM de Tris/HCl y de 6 -55 mM de KCl, a un pH de 7,5 -9,3. El cloruro de magnesio se añade en una concentración de 0,5 -10 mM, en el caso de que él no esté contenido en el tampón suministrado por el fabricante. A la tanda de reacción se le añaden por lo demás unos desoxinucleósido-trifosfatos en una concentración de 0,1 -16,6 mM. Los cebadores se disponen previamente en la tanda de reacción con una concentración final de 0,1 -3 µM y el ADN de molde, en el caso óptimo, con 102 hasta 105 copias. También se pueden emplear desde 106 hasta 107 copias. La correspondiente polimerasa se añade a la tanda de reacción en una cantidad de 2-5 unidades. Una típica tanda de reacción tiene un volumen de 20 -100 µl.

Como otras adiciones se pueden añadir a la reacción albúmina de suero bovino, Tween-20, gelatina, glicerol, formamida o DMSO (Dieffenbach y Dveksler, PCR Primer -A Laboratory Manual (Cebadores de PCR -Un manual de laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory Press, EE.UU. 1995).

Una típica evolución de una PCR se compone de tres diferentes escalones de temperatura, que se repiten consecutivamente. De antemano, la reacción es iniciada con un aumento de la temperatura a 92°C -98°C durante 4 8 15

a 10 minutos, con el fin de desnaturalizar al ADN dispuesto previamente. Luego siguen, repitiéndose, en primer lugar una etapa para la desnaturalización del ADN dispuesto previamente durante 10 -60 segundos a aproximadamente 92-98°C, luego una etapa para la unión de los cebadores con el ADN dispuesto previamente durante 10 -60 segundos a una determinada temperatura, que es dependiente de los cebadores (temperatura de reanillamiento = en inglés “annealing temperature”), que está situada, conforme a la experiencia, en 50°C hasta 60°C, y que se puede calcular individualmente para cada par de cebadores. Unas informaciones exactas acerca de esto las encontrará un experto en la especialidad en la cita de Rychlik y colaboradores (Nucleic Acids Research 18 (21): 6409-6412). A continuación sigue una etapa de síntesis para la prolongación (en inglés “extensión”) del cebador dispuesto previamente en el caso del valor óptimo de la actividad que se indica en cada caso para la polimerasa, que usualmente, según sea la polimerasa, está situado en el intervalo de 73°C a 67°C, de manera preferida en el de de 72°C a 68°C. La duración de esta etapa de prolongación depende de la productividad de la polimerasa y de la longitud del producto de la PCR que debe de ser amplificado. En una típica PCR, esta etapa dura 0,5 -8 minutos, de manera preferida 2 -4 minutos. Estas tres etapas se repiten de 30 hasta 35 veces, eventualmente hasta 50 veces. Una etapa final de prolongación durante 4 -10 minutos finaliza la reacción. Los polinucleótidos producidos de esta manera son designados también como materiales amplificados; el concepto de fragmento de ácido nucleico es asimismo habitual.

Un producto de PCR producido mediando utilización del par de cebadores prpD1_XL_A1 / prpD1_XL_E1 (véanse la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10) está representado en la SEQ ID NO: 13.

Otras instrucciones e informaciones acerca de la PCR las encontrará un experto en la especialidad, por ejemplo, en el manual "PCR-Strategies" (Estrategias de PCR) (Innis, Felfand y Sninsky, Academic Press, Inc., 1995), en el manual de Diefenbach y Dveksler "PCR Primer -a laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995), en el manual de Gait "Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach" (Síntesis de oligonucleótidos: un enfoque práctico) (IRL Press, Oxford, Reino Unido 1984) y en la cita de Newton y Graham "PCR" (editorial Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994).

La secuencia de nucleótidos se determina a continuación, por ejemplo, según el procedimiento de rotura de la cadena de Sanger y colaboradores (Proceedings of the National Academies of Sciences, EE.UU., 74, 5463-5467 (1977)) con las modificaciones indicadas por Zimmermann y colaboradores (Nucleic Acids Research 18, 1067 (1990)), y el polipéptido que ha sido codificado por esta secuencia de nucleótidos se analiza en particular en lo que respecta a la secuencia de aminoácidos. Para esto, la secuencia de nucleótidos se introduce en un programa para la traducción de una secuencia de ADN en una secuencia de aminoácidos. Unos programas adecuados son, por ejemplo, el programa "Patentin", que es obtenible en las oficinas de patentes, por ejemplo de la Oficina de patentes de los EE.UU. (USPTO), o la herramienta de traducción "Translate Tool", que está disponible en el Servidor de Proteomics ExPASy en el world wide web (internet) (Gasteiger y colaboradores, Nucleic Acids Research 31, 37843788 (2003).

De esta manera se identifican unos mutantes, cuyos alelos de prpD1 codifican unos polipéptidos con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que en la posición 272 de la secuencia de aminoácidos, o respectivamente en la posición correspondiente o comparable, contienen uno de los aminoácidos proteinógenos estando exceptuada la L-prolina. Se prefiere el intercambio por L-leucina.

Eventualmente, se determina el cromosoma global de los mutantes. En este caso, se puede emplear el método descrito por Margulies y colaboradores (Nature 437(7057): 376-2720 (2005)) y Velicer y colaboradores (Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 103(21), 8107-8112 (2006)), que es conocido en el mundo especializado bajo la palabra clave "pyrosequencing", y que hace posible una rápida secuenciación de genomas completos.

Un objeto del invento es de modo correspondiente un mutante de una bacteria corineforme, caracterizado por que ésta es obtenible mediante las siguientes etapas:

a) tratamiento de una bacteria corineforme, que posee la capacidad de segregar aminoácidos, con un agente mutágeno,

b) aislamiento y multiplicación del mutante producido en a)

c) de manera preferida, determinación de la capacidad del mutante en un medio para segregar por lo menos

un 0,5 % más del aminoácido, o para enriquecerlo en el interior de las células, en comparación con la

bacteria corineforme empleada en a),

d) puesta a disposición de un ácido nucleico procedente del mutante obtenido en b),

e) producción de una molécula de ácido nucleico (o respectivamente de un material amplificado o de un

fragmento de ácido nucleico) mediando utilización de la reacción en cadena de la polimerasa, del ácido

nucleico procedente de d), y de un par de cebadores que se compone de un primer cebador que

comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos escogidos a partir de la secuencia de nucleótidos que se encuentra situada entre las posiciones 1 y 1.563, de manera preferida 1 hasta 750 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7, y de un segundo cebador, que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos escogidos a partir de la secuencia de nucleótidos complementaria que se encuentra situada entre las

5 posiciones 3.000 y 1.567, de manera preferida 3.000 y 2.245, de la SEQ ID NO: 3 o 7,

f) determinación de la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico obtenida en e), y determinación de la secuencia de aminoácidos codificada.

10 g) eventualmente, comparación de la secuencia de aminoácidos determinada en f) con la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, y

h) identificación de un mutante, que contiene un polinucleótido, que codifica un polipéptido, que contiene L-leucina en la posición 272 o en una posición comparable. 15 Los mutantes producidos de este modo contienen típicamente una (1) copia del alelo de prpD1 descrito.

En la SEQ ID NO: 5 se reproduce a modo de ejemplo la región codificadora del alelo de prpD1 de un mutante conforme al invento. La región codificadora del gen de tipo silvestre se reproduce como la SEQ ID NO: 1. La SEQ ID

20 NO: 1 contiene en la posición 814 la nucleobase citosina, en la posición 815 la nucleobase citosina y en la posición 816 la nucleobase citosina. La SEQ ID NO: 1 contiene por consiguiente desde la posición 814 hasta la 816 el codón CCC que codifica el aminoácido L-prolina. La SEQ ID NO: 5 contiene en la posición 815 la nucleobase timina. Mediante esta transición de citosina a timina resulta en las posiciones 814 hasta 816 el codón CTC que codifica el aminoácido L-leucina.

25 Además de esto, las secuencias de nucleótidos representadas en la SEQ ID NO: 5 o respectivamente 7 pueden contener otros intercambios de bases, que han resultado por medio del tratamiento de mutagénesis, pero que no se exteriorizan en una secuencia de aminoácidos modificada. Tales mutaciones son designadas en el mundo especializado también como mutaciones mudas o neutras. Estas mutaciones mudas pueden estar contenidas ya

30 asimismo en la bacteria corineforme que se emplea para el tratamiento de mutagénesis.

Las bacterias corineformes utilizadas para la mutagénesis poseen de manera preferida ya la capacidad de segregar el aminoácido deseado en el medio nutritivo, o respectivamente en el caldo de fermentación, que las rodea, o de enriquecerlo en el interior de las células.

35 Las bacterias corineformes que producen L-lisina poseen típicamente una aspartato cinasa resistente a la retroalimentación (en inglés "feed back") o respectivamente desensibilizada. Por el concepto de "aspartato cinasas resistentes frente a la retroalimentación" se entienden unas aspartato cinasas (LysC) que, en comparación con la forma silvestre, tienen una sensibilidad más pequeña frente a la inhibición por unas mezclas de lisina y treonina o

40 por unas mezclas de AEC (aminoetilcisteína) y treonina, o por la lisina a solas o por la AEC a solas. Los genes o respectivamente alelos que codifican estas aspartato cinasas desensibilizadas son designados también como alelos de lysCFBR. Dentro del estado de la técnica se describen numerosos alelos de lysCFBR, que codifican unas variantes de la aspartato cinasa, los cuales poseen unos intercambios de aminoácidos en comparación con la proteína de tipo silvestre. La región codificadora del gen lysC de tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum correspondiente al

45 número de acceso AX756575 en el banco de datos NCBI está representada en la SEQ ID NO: 11 y el polipéptido codificado por este gen está representado en la SEQ ID NO: 12.

Las bacterias corineformes que producen la L-lisina, empleadas para las medidas técnicas del invento, disponen preferiblemente de un alelo de lysC, que codifica una variante de la aspartato cinasa, que posee la secuencia de

50 aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, conteniendo ésta uno o varios intercambios de aminoácidos, escogidos entre el conjunto que se compone de:

LysC A279T (intercambio de L-alanina en la posición 279 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por L-treonina; véanse el documento US 5.688.671 y los números de acceso

55 E06825, E06826, E08178 e I74588 hasta I74597),

LysC A279V (intercambio de L-alanina en la posición 279 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por L-valina; véanse el documento de solicitud de patente japonesa JP 6-261766 y el número de acceso E08179),

60 LysC L297Q (intercambio de L-leucina en la posición 297 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por L-glutamina; véase el documento de solicitud de patente alemana DE 102006026328),

LysC S301F (intercambio de L-serina en la posición 301 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por L-fenilalanina; véanse el documento US 6.844.176 y el número de acceso E08180),

LysC S301Y (intercambio de L-serina en la posición 301 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por L-tirosina, véanse la cita de Kalinowski y colaboradores (Molecular and General Genetics 224, 317-324 (1990)) y el número de acceso X57226),

LysC T308I (intercambio de L-treonina en la posición 308 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por L-isoleucina; véanse el documento JP 6-261766 y el número de acceso E08181),

LysC T311I (intercambio de L-treonina en la posición 311 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por L-isoleucina; véanse el documento de solicitud de patente internacional WO 00/632728 y el documento US 6.893.848),

LysC S317A (intercambio de L-serina en la posición 317 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por L-alanina; véanse el documento US 5.688.671 y el número de acceso I74589),

LysC R320G (intercambio de L-arginina en la posición 320 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por glicina; véanse la cita de Jetten y colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) y el número de acceso L27125),

LysC G345D (intercambio de glicina en la posición 345 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por L-ácido aspártico; véanse la cita de Jetten y colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) y el número de acceso L16848),

LysC T380I (intercambio de L-treonina en la posición 380 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por L-isoleucina, véanse el documento WO 01/49854 y el número de acceso AX192358), y

LysC S381F (intercambio de L-serina en la posición 381 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por L-fenilalanina; véase el documento EP 0435132).

Se prefieren especialmente el alelo de lysCFBR lysC T311I (intercambio de treonina en la posición 311 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por isoleucina) y un alelo de lysCFBR que contiene por lo menos un intercambio escogido entre el conjunto que se compone de A279T (intercambio de alanina en la posición 279 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por treonina), S381F (intercambio de serina en la posición 381 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por fenilalanina) y S317A (intercambio de serina en la posición 317 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por alanina)

Se prefieren muy especialmente el alelo de lysCFBR lysC T311I (intercambio de treonina en la posición 311 de la proteína aspartato cinasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 por isoleucina).

La cepa DSM 16833 (véase el documento WO 06/063660) posee, al igual que la cepa ATCC 21543 (véase el documento US 3.708.395), un alelo de lysCFBR, que codifica una proteína aspartato cinasa, que contiene un intercambio de aminoácidos T311I.

La cepa NRRL B-11474 (véase el documento US 4.275.157) posee un alelo de lysCFBR, que codifica una proteína aspartato cinasa, que contiene los intercambios de aminoácidos A279T y S381F.

Según el modo más arriba descrito, partiendo de la cepa ATCC 21543 se aisló un mutante designado como DM1916, que contiene un alelo de prpD1, el cual codifica un polipéptido, en el que está contenida L-leucina en la posición 272 de la secuencia de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos de la región codificadora del alelo de prpD1 del mutante DM1916 se representa como la SEQ ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado se representa como la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8.

Además de esto, se pueden utilizar unas bacterias corineformes que segregan L-lisina, las cuales poseen unas propiedades, tales como las que se conocen a partir del estado de la técnica.

Las bacterias corineformes que producen L-triptófano poseen típicamente una antranilato sintasa resistente a la retroalimentación o respectivamente desensibilizada. Por el concepto de "antranilato sintasa resistente a la retroalimentación" se entienden unas antranilato sintasas que, en comparación con la forma silvestre, tienen una sensibilidad más pequeña en por lo menos 5 a 10 %, o en por lo menos 10 % a 15 % o en por lo menos 10 % a

20 % frente a la inhibición por triptófano o 5-fluoro-triptófano (Matsui y colaboradores, Journal of Bacteriology 169 (11): 5330 -5332(1987)) o por unos compuestos análogos similares. Los genes o respectivamente alelos, que codifican estas antranilato sintasas desensibilizadas, son designados también como alelos de trpEFBR. Ejemplos de tales mutantes o respectivamente alelos se describen, por ejemplo, en los documentos US 6180373 y EP 0338474.

Unas bacterias corineformes que producen L-valina poseen típicamente una acetolactato sintasa (acetohidroxiácido sintasa) [n° de EC 2.2.1.6] resistente a la retroalimentación o respectivamente desensibilizada.

Por el concepto de "una acetolactato sintasa resistente a la retroalimentación" se entiende una acetolactato sintasa que, en comparación con la forma silvestre, tiene una sensibilidad más pequeña frente a la inhibición por uno o varios de los aminoácidos escogidos entre el conjunto formado por L-valina, L-isoleucina y L-leucina, de manera preferida por L-valina.

La acetolactato sintasa (IlvB, IlvN) de Corynebacterium glutamicum se compone de una denominada gran subunidad codificada por el gen ilvB y de una denominada pequeña subunidad codificada por el gen ilvN (Keilhauer y colaboradores, Journal of Bacteriology 175(17), 5595-5603 (1993). En el documento WO 05/003357 y en la cita de Elisakova y colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 71(1):207-13 (2005)) se informa sobre unas variantes de la subunidad de IlvN, que confieren a la acetolactato sintasa una resistencia frente a L-valina, L-isoleucina y L-leucina. Una variante contiene en la posición 21 de la secuencia de aminoácidos L-ácido aspártico en lugar de L-isoleucina (IlvN I21D) y en la posición 22 L-fenilalanina en lugar de L-isoleucina (IlvN I22F). La segunda variante contiene en la posición 20 de la secuencia de aminoácidos L-ácido aspártico en lugar de glicina (IlvN G20D), en la posición 21 de la secuencia de aminoácidos L-ácido aspártico en lugar de L-isoleucina (IIvN I21D) y en la posición 22 L-fenilalanina en lugar de L-isoleucina (IIvN I22F).

Unas bacterias corineformes que producen L-isoleucina poseen típicamente una treonina deshidratasa (= treonina desaminasa) resistente a la retroalimentación o respectivamente desensibilizada.

Por el concepto de "una treonina deshidratasa resistente a la retroalimentación" se entiende una treonina deshidratasa [n° de EC 4.3.1.19] que, en comparación con la forma silvestre, tiene una sensibilidad más pequeña frente a la inhibición por L-isoleucina. Los genes o respectivamente alelos que codifican esta treonina deshidratasa desensibilizada son designados también como alelos de ilvAFBR.

La región codificadora del gen ilvA de tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum correspondiente al n° de acceso L01508 del banco de datos NCBI está representada en la SEQ ID NO: 17 y el polipéptido codificado por este gen está representado en la SEQ ID NO: 18.

Las variantes de la treonina deshidratasa descritas en el documento US 6.107.063 y en la cita de Morbach y colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 61 (12), 4315-4320 (1995)) contienen uno o varios de los intercambios de aminoácidos que se escogen entre el conjunto formado por:

IlvA M199V (intercambio de L-metionina en la posición 199 de la proteína treonina deshidratasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 18 por L-valina; véase el documento US 6.107.063),

IlvA A257G (intercambio de L-alanina en la posición 257 de la proteína treonina deshidratasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 18 por L-arginina; véase el documento US 6.107.063),

IlvA H278R (intercambio de L-histidina en la posición 278 de la proteína treonina deshidratasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 18 por L-arginina; véase el documento US 6.107.063),

IlvA V323A (intercambio de L-valina en la posición 323 de la proteína treonina deshidratasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 18 por L-alanina; véase la cita de Morbach y colaboradores),

IlvA L351S (intercambio de L-leucina en la posición 351 de la proteína treonina deshidratasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 18 por L-serina; véase el documento US 6.107.063),

IlvA D378G (intercambio de L-ácido aspártico en la posición 378 de la proteína treonina deshidratasa codificada de acuerdo con la SEQ ID NO: 18 por glicina; véase la cita de Morbach y colaboradores).

Los mutantes obtenidos muestran una segregación o respectivamente producción del aminoácido deseado en un proceso de fermentación que ha aumentado en comparación con la cepa de partida o respectivamente con la cepa parental que se emplea.

Es un objeto del invento asimismo un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que contiene L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272.

El polinucleótido conforme al invento se puede aislar a partir de un mutante conforme al invento.

Por lo demás, para la mutagénesis del gen prpD1 se pueden emplear unos métodos in vitro. En el caso de la utilización de unos métodos in vitro, unos polinucleótidos aislados, que contienen un gen prpD1 de una bacteria corineforme, de manera preferida el gen de tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum que ha sido descrito en el estado de la técnica, son sometidos a un tratamiento mutágeno.

En el caso de los polinucleótidos aislados se puede tratar por ejemplo del ADN total aislado o respectivamente del ADN cromosómico aislado o también de unos materiales amplificados del gen prpD1, que se habían producido con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Tales materiales amplificados son designados también como unos productos de la PCR. Unas instrucciones para realizar la amplificación de unas secuencias de ADN con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa las encontrará un experto en la especialidad, entre otros lugares, en el manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (Síntesis de oligonucleótidos: un enfoque práctico) (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) y en la cita de Newton y Graham: PCR (editorial Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994). Asimismo es posible introducir el gen prpD1 que debe de ser mutagenizado, primeramente en un vector, por ejemplo en un bacteriófago o en un plásmido.

Unos métodos adecuados para realizar la mutagénesis in vitro son, entre otros, el tratamiento con hidroxilamina según Miller (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Un breve curso de genética bacteriana. Un manual de laboratorio y un manual para Escherichia coli y bacterias relacionadas con ella), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992), la utilización de oligonucleótidos mutágenos (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger (Tecnología genética para principiantes) editorial Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993 y R. M. Horton: PCR-mediated Recombination and Mutagenesis (Recombinación y mutagénesis mediadas por PCR), Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995) y el empleo de una reacción en cadena de la polimerasa mediando utilización de una polimerasa de ADN, que tiene una alta tasa de errores. Una tal polimerasa de ADN es, por ejemplo, la polimerasa de ADN Mutazyme (estuche para mutagénesis GeneMorph PCR, n° 600550) de la entidad Stratagene (LaJolla, CA, EE.UU.).

Otras instrucciones y recopilaciones acerca de la producción de mutaciones in vivo o in vitro se pueden tomar del estado de la técnica y de los libros de texto sobre genética y biología molecular que se conocen, tales como p.ej. el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik" (Genética molecular), 6a edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Alemania, 1995)), el de Winnacker ("Gene und Klone" (Genes y clones), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann ("Allgemeine Genetik" (Genética general), editorial Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Un objeto del invento es por lo demás un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272 de la secuencia de aminoácidos.

Un objeto del invento es por lo demás un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que comprende una secuencia de aminoácidos con una longitud de 498 aminoácidos, y conteniendo el polipéptido L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o comprendiendo el polipéptido la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en la que está contenida L-leucina en la posición 272.

Un objeto del invento es por lo demás un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que en las posiciones 252 hasta 291 de la secuencia de aminoácidos contiene la secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 252 hasta 291 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8. De manera preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado contiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 202 hasta 341 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8

: o a las posiciones 152 hasta 391 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8 o a las posiciones 102 hasta 441 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8 o a las posiciones 52 hasta 491 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8 o a las posiciones 2 hasta 495 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8 o a las posiciones 2 hasta 496 de la SEQ ID NO: 6

: o respectivamente 8 o a las posiciones 2 hasta 497 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8. De manera muy especialmente preferida, la longitud del polipéptido codificado comprende 498 aminoácidos.

Un objeto del invento es por lo demás un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que contiene L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272, y que comprende una secuencia de nucleótidos, que es idéntica a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido, que es obtenible mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediando utilización del par de cebadores, cuyas secuencias de nucleótidos comprenden en cada caso por lo menos 15 nucleótidos consecutivos, que se escogen entre la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1 y 750 de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 7, y entre la secuencia de nucleótidos complementaria entre las posiciones 3.000 y 2.245 de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 7. Un ejemplo de un tal par de cebadores está

representado en la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10. Como material de partida (= el ADN de molde) se prefiere el ADN cromosómico de unas bacterias corineformes, que han sido tratadas en particular con un mutágeno. Se prefiere especialmente el ADN cromosómico del genero Corynebacterium y de manera muy especialmente preferida el de la especie Corynebacterium glutamicum.

Un objeto del invento es por lo demás un polinucleótido aislado que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO: 5, y que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que contiene L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272.

Unas instrucciones para la hibridación de ácidos nucleicos o respectivamente de polinucleótidos las encontrará un experto en la especialidad, entre otros lugares, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" [La guía de los usuarios del sistema DIG para la hibridación en filtros de la entidad Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania 1993) y en la cita de Liebl y colaboradores (International Journal of Systematic Bacteriology

41: 255-260 (1991)). La hibridación tiene lugar en condiciones rigurosas, es decir que solamente se forman unos híbridos, en los que la sonda, es decir un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO: 5, y la secuencia diana, es decir los polinucleótidos tratados o respectivamente identificados con la sonda, son idénticos en por lo menos un 90 %. Es conocido que la rigurosidad de la hibridación, inclusive de las etapas de lavado, es influida o respectivamente determinada por una variación de la composición del tampón, de la temperatura y de la concentración de sales. La reacción de hibridación se lleva a cabo por lo general con una rigurosidad relativamente baja en comparación con la de las etapas de lavado (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Reino Unido, 1996).

Para la reacción de hibridación se puede emplear por ejemplo un tampón correspondiente a un tampón 5x SSC a una temperatura de aproximadamente 50°C -68°C. En este caso, las sondas se pueden hibridar también con unos polinucleótidos, que tienen menos que un 90 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la sonda empleada. Tales híbridos son menos estables y son eliminados mediante un lavado en condiciones rigurosas. Esto se puede realizar por ejemplo mediante una disminución de la concentración de sales a 2x SSC y eventualmente a continuación a 0,5x SSC (The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, de la entidad Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania 1995), ajustándose una temperatura de aproximadamente 50°C -68°C, de aproximadamente 52°C -68°C, de aproximadamente 54°C -68°C, de aproximadamente 56°C -68°C, de aproximadamente 58°C 68°C, de aproximadamente 60°C -68°C, de aproximadamente 62°C -68°C, de aproximadamente 64°C -68°C o de aproximadamente 66°C -68°C. Se prefieren unos intervalos de temperaturas de aproximadamente 64°C -68°C o de aproximadamente 66°C -68°C. Es posible eventualmente disminuir la concentración de sales hasta una concentración correspondiente a 0,2x SSC

: o 0,1x SSC. Eventualmente, el tampón SSC contiene dodecilsulfato de sodio (SDS) en una concentración de 0,1 %. Mediante un aumento escalonado de la temperatura de hibridación en unos escalones de aproximadamente 1 -2°C desde 50°C hasta 68°C se pueden aislar unos fragmentos de polinucleótidos, que poseen por lo menos un 90 % o por lo menos un 91 %, de manera preferida por lo menos un 92 % o por lo menos un 93 % o por lo menos un 94 % o por lo menos un 95 % o por lo menos un 96 %, y de manera muy especialmente preferida por lo menos un 97 % o por lo menos un 98 % o por lo menos un 99 % de identidad con la secuencia o respectivamente con la secuencia complementaria de la sonda empleada, y que codifican un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que contiene el intercambio de aminoácidos conforme al invento. La secuencia de nucleótidos del polinucleótido obtenido de esta manera se determina con unos métodos conocidos. Otras instrucciones para la hibridación son obtenibles en el mercado en la forma de unos denominados estuches (p.ej. DIG Easy Hyb de la entidad Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, n° de catálogo 1603558). Las secuencias de nucleótidos obtenidas de esta manera codifican unos polipéptidos con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que son idénticos en por lo menos un 90 %, de manera preferida en por lo menos un 92 % o en por lo menos un 94 % o en por lo menos un 96 %, y de manera muy especialmente preferida en por lo menos un 97 % o en por lo menos un 98 % o en por lo menos un 99 % a ´la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente de la SEQ ID NO: 8, y que contiene el intercambio de aminoácidos conforme al invento.

Un objeto del invento es por lo demás un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que contiene L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2

: o que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272, y que comprende una secuencia de aminoácidos, que además de ello es idéntica en por lo menos un 90 %, de manera preferida en por lo menos un 92 % o en por lo menos un 94 % o en por lo menos un 96 %, y de manera muy especialmente preferida en por lo menos un 97 % o en por lo menos un 98 % o en por lo menos un 99 % a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente de la SEQ ID NO: 8.

: o que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272, y que comprende una secuencia de nucleótidos, que además de ello es idéntica en por lo menos un 90 %, de manera preferida en por lo menos un 92 % o en por lo menos un 94 % o en por lo menos un 96 %, y de manera muy especialmente preferida en por lo menos un 97 % o en por lo menos un 98 % o en por lo menos un 99 % a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.

Además de esto, se prefieren aquellos polinucleótidos aislados, que codifican un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que contiene L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2

: o que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272, y que por lo menos contiene un motivo de secuencia o respectivamente una secuencia de aminoácidos escogida entre el conjunto formado por Arg-Glu-Leu-Asp-Phe-His-Asp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/Glu-Tyr-Ser-His-Pro, Gly-Ile-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-Ile-Asp-His-Val-Ala-His-Leu-Gly-Pro y Pro-Ala-Pro-Ile-Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-Ile-Ala-Trp-Leu-Leu.

Las designaciones "Asp/Glu" significan que en la correspondiente posición puede presentarse "Asp o Glu".

Un objeto del invento es por lo demás un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8. Eventualmente, el polipéptido codificado contiene uno (1) o varios intercambio(s) conservativo(s) de aminoácido(s). De manera preferida, el polipéptido contiene a lo sumo dos (2), a lo sumo tres (3), a lo sumo cuatro (4) o a lo sumo cinco (5) intercambios conservativos de aminoácidos.

Un objeto del invento es por lo demás un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, inclusive una prolongación junto al extremo terminal de N o de C en por lo menos un (1) aminoácido. Esta prolongación es de no más que 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 ó 2 aminoácidos o respectivamente radicales de aminoácidos.

Un objeto del invento son finalmente también unos alelos de prpD1, que codifican unas variantes de polipéptidos de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, que contienen una o varias inserciones o supresiones. De manera preferida, éstas contienen como máximo 5, como máximo 4, como máximo 3 o como máximo 2 inserciones o supresiones de aminoácidos. El/los motivo(s) de secuencia Arg-Glu-Leu-Asp-Phe-His-Asp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/Glu-Tyr-Ser-His-Pro y/o Gly-Ile-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-Ile-Asp-His-Val-Ala-His-Leu-Gly-Pro y/o Pro-Ala-Pro-IIe-Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-Ile-Ala-Trp-Leu-Leu no es/son desgarrado(s) por tales inserciones/supresiones.

Un objeto del invento es por lo demás un polinucleótido aislado, que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 o 7.

Un objeto del invento es finalmente un polinucleótido aislado que contiene el alelo de prpD1 del mutante DM1916.

Un objeto del invento es además de ello un polinucleótido aislado, que comprende una parte de la región codificadora de un alelo de prpD1 conforme al invento, comprendiendo el polinucleótido aislado en cualquier caso la parte de la región codificadora que contiene el intercambio de aminoácidos en la posición 272 de la secuencia del polipéptido codificado.

En particular, está comprendida/o una molécula de ácido nucleico o respectivamente un fragmento de ADN, que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 252 hasta 291 de la SEQ ID NO: 2, o que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 202 hasta 341 de la SEQ ID NO: 2, o que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 152 hasta 391 de la SEQ ID NO: 2, o que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 102 hasta 441 de la SEQ ID NO: 2, o que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 52 hasta 491 de la SEQ ID NO: 2, o que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 2 hasta 495 de la SEQ ID NO: 2, o que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 2 hasta 496 de la SEQ ID NO: 2, o que codifica por lo menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 2 hasta 497 de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la SEQ ID NO: 2.

Un ejemplo de un marco de lectura que comprende un polinucleótido, que codifica por lo menos la secuencia de aminoácidos de la posición 252 hasta la 291 correspondiente a la SEQ ID NO: 2, estando contenido en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos uno de los aminoácidos proteinógenos (Xaa) estando exceptuada L-prolina, se expone seguidamente:

Él se representa asimismo como la SEQ ID NO: 17. La secuencia de aminoácidos codificada por este marco de lectura se representa como la SEQ ID NO: 18. La posición 21 en la SEQ ID NO: 18 corresponde a la posición 272 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 o respectivamente 8.

Se prefieren unas moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una secuencia de aminoácidos correspondiente por lo menos a las posiciones 252 hasta 291 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, o correspondiente por lo menos a las posiciones 202 hasta 341 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, o correspondiente por lo menos a las posiciones 152 hasta 391 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, o correspondiente por lo menos a las posiciones 102 hasta 441 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, o correspondiente por lo menos a las posiciones 52 hasta 491 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, o correspondiente por lo menos a las posiciones 2 hasta 495 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, o correspondiente por lo menos a las posiciones 2 hasta 496 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, o correspondiente por lo menos a las posiciones 2 hasta 497 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8.

Un ejemplo de un marco de lectura conforme al invento que comprende un polinucleótido, que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente por lo menos a las posiciones 252 hasta 291 de la SEQ ID NO: 6 o

El marco de lectura se representa asimismo como la SEQ ID NO: 19. La SEQ ID NO: 20 muestra la secuencia de aminoácidos codificada por este marco de lectura. La posición 21 en la SEQ ID NO: 20 corresponde a la posición 272 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 o respectivamente 8.

Se prefieren muy especialmente unas moléculas de ácidos nucleicos, que codifican 1.504 hasta 1.623 de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia de nucleótidos correspondiente por lo menos a las posiciones 1.354 hasta 1.773 de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia de nucleótidos correspondiente por lo menos a las posiciones 1.204 hasta 1.923 de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia de nucleótidos correspondiente por lo menos a las posiciones 1.054 hasta 2.073 de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia de nucleótidos correspondiente por lo menos a las posiciones 904 hasta 2.223 de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia de nucleótidos correspondiente por lo menos a las posiciones 754 hasta 2.235 de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia de nucleótidos correspondiente por lo menos a las posiciones 754 hasta 2.238 de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia de nucleótidos correspondiente por lo menos a las posiciones 754 hasta 2.241 de la SEQ ID NO: 7.

Los marcos de lectura conformes al invento, tal como se muestran a modo de ejemplo en las SEQ ID NO: 17 y 19 como una secuencia de nucleótidos y en la SEQ ID NO: 18 y en la SEQ ID NO: 20 en forma de la secuencia de aminoácidos codificada, pueden contener además de esto una o varias mutaciones, que conducen a uno o varios intercambio(s) conservativo(s) de aminoácido(s). De manera preferida, las mutaciones conducen a como máximo un 4 %, a como máximo un 2 % o a como máximo un 1 % de intercambios conservativos de aminoácidos. Por lo demás, los marcos de lectura conformes al invento contienen una o varias mutaciones mudas. De manera preferida, los marcos de lectura conformes al invento contienen a lo sumo un 4 % y de manera especialmente preferida desde a lo sumo un 2 % hasta a lo sumo un 1 % de mutaciones mudas.

Los polinucleótidos aislados conformes al invento se pueden utilizar para producir unas cepas recombinantes de microorganismos que, en comparación con la cepa de partida, o respectivamente con la cepa parental, entregan de manera mejorada aminoácidos al medio que los rodea o los acumulan en el interior de las células.

Un método propagado para la incorporación de mutaciones en genes de bacterias corineformes es el del intercambio de alelos, que se conoce también bajo la denominación de "reemplazo de genes" (en inglés "gene replacement"). En el caso de este procedimiento, un fragmento de ADN, que contiene la mutación que interesa, es transferido a la deseada cepa de una bacteria corineforme y la mutación es incorporada mediante por lo menos dos sucesos de recombinación o respectivamente sucesos de cruzamiento (en inglés "cross over") en el cromosoma de la deseada cepa, o respectivamente la secuencia de un gen que está presente en la respectiva cepa, es intercambiada por la secuencia mutada.

Este método fue utilizado por Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) para incorporar un alelo de lysA, que llevaba una supresión y para incorporar un alelo de lysA, que llevaba una inserción, en el cromosoma de C. glutamicum en lugar del gen de tipo silvestre. Este método fue empleado por Schäfer y colaboradores (Gene 145, 69-73 (1994)) para incorporar una supresión en el operón hom-thrB de C. glutamicum. Este método fue empleado por Nakagawa y colaboradores (documento EP 1108790) y Ohnishi y colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 217-223 (2022) para incorporar diferentes mutaciones, partiendo de los alelos aislados, en el cromosoma de C. glutamicum. De esta manera, Nakagawa y colaboradores consiguieron incorporar una mutación designada como Val59Ala en el gen de la homoserina deshidrogenasa (hom), una mutación designada como Thr311Ile en el gen de la aspartato cinasa (lysC o respectivamente ask), una mutación designada como Pro458Ser en el gen de la piruvato carboxilasa (pyc) y una mutación designada como Ala213Thr en el gen de la glucosa-6fosfato deshidrogenasa (zwf) de cepas de C. glutamicum.

Para un procedimiento conforme al invento se puede utilizar un polinucleótido conforme al invento, que comprende toda la región codificadora, tal como se muestra por ejemplo en la SEQ ID NO: 5, o que comprende una parte de la región codificadora, tal como, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos, que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente por lo menos a las posiciones 252 hasta 291 de la SEQ ID NO: 6 o respectivamente 8, y que se representa como las SEQ ID NO: 17 y 19. La parte de la región codificadora correspondiente a las SEQ ID NO: 17 y 19 comprende una longitud de ≥ 120 nucleobases. Se prefieren aquellas partes de la SEQ ID NO: 7, que comprenden por lo menos la secuencia situada entre las posiciones 1.354 y 1.773, o por lo menos entre las posiciones 1.204 y 1.923, o por lo menos entre las posiciones 1.054 y 2.073, y que poseen de modo correspondiente una longitud de ≥ 420, ≥ 720 o ≥ 1.020 nucleobases.

El fragmento de ADN, que contiene la mutación que interesa, se presenta, en el caso de este método, típicamente dentro de un vector, en particular un plásmido, que preferiblemente no es replicado, o lo es solamente de un modo restringido, por la cepa que debe de ser provista de la mutación. Como anfitrión auxiliar o intermedio, en el que es replicable el vector, se utiliza por lo general una bacteria del género Escherichia, de manera preferida de la especie Escherichia coli.

Unos ejemplos de tales vectores de plásmidos son los vectores pK*mob y pK*mobsacB, tales como, por ejemplo el pk18mobsacB, que han sido descritos por Schäfer y colaboradores (Gene 145, 69-73 (1994)) y los vectores que han sido descritos en los documentos de solicitudes de patentes internacionales WO 02/070685 y WO 03/014362. Éstos son replicativos en Escherichia coli, pero no en bacterias corineformes. Se adecuan especialmente unos vectores, que contienen un gen que actúa de un modo dominante negativo condicional, tal como, por ejemplo, el gen sacB (gen de la levano sucrasa) de, por ejemplo, Bacillus, o el gen galK (gen de la galactosa cinasa) de, por ejemplo, Escherichia coli. (Por el concepto de "un gen, que actúa de un modo dominante negativo condicional" se entiende un gen, que en determinadas condiciones es desventajoso, por ejemplo tóxico, para el anfitrión, pero que en otras condiciones no tiene repercusiones negativas sobre el anfitrión que lleva el gen). Éstos hacen posible la selección en cuanto a unos sucesos de recombinación, en cuyos casos el vector es eliminado desde el cromosoma. Por lo demás, por Nakamura y colaboradores (documento US-A-6.303.2723) se describió un plásmido sensible frente a la temperatura para unas bacterias corineformes, que solamente se puede replicar a unas temperaturas situadas por debajo de 31°C.

El vector es transferido a continuación a la bacteria corineforme mediante una conjugación, por ejemplo según el método de Schäfer (Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)) o mediante una transformación, por ejemplo según el método de Dunican y Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989) o según el método de Thierbach y colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)). Eventualmente, la transferencia del ADN se puede conseguir también mediante un bombardeo con partículas.

Después de una recombinación homóloga por medio de un primer suceso de cruzamiento que da lugar a una integración, y de un adecuado segundo suceso de cruzamiento que da lugar a una escisión, en el gen diana o respectivamente en la secuencia diana, se consigue la introducción de la mutación y se obtiene una bacteria recombinante.

Para realizar la identificación y la caracterización de las cepas obtenidas, se pueden emplear, entre otros, los métodos de la hibridación por transferencia de borrón Southern, de la reacción en cadena de la polimerasa, de la determinación de las secuencias, el método de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia

("Fluorescence Resonance Energy Transfer", FRET) (Lay y colaboradores Clinical Chemistry 43, 2262-2267 (1997) o los métodos de la enzimología.

La descripción divulga, de un modo correspondiente, un procedimiento para la producción de una bacteria corineforme, en el que

(a): un polinucleótido conforme al invento se transfiere a una bacteria corineforme,

(b): el gen de la 2-metilcitrato deshidratasa que está presente en el cromosoma de la bacteria corineforme, que codifica una secuencia de aminoácidos con L-prolina en la posición 272 o en una posición comparable de la secuencia de aminoácidos, se intercambia por el polinucleótido procedente de a), que codifica una secuencia de aminoácidos, que posee en la posición 272 o en una posición comparable de la secuencia de aminoácidos otro L-aminoácido proteinógeno, de manera preferida L-leucina, y

(c): se multiplica y reproduce la bacteria corineforme obtenida de acuerdo con las etapas a) y b).

De esta manera se obtiene una bacteria corineforme recombinante que, en lugar del gen prpD1 de tipo silvestre, contiene un (1) alelo de prpD1 conforme al invento.

Un procedimiento para la producción de un microorganismo consiste en que

a) un polinucleótido conforme al invento, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2metilcitrato deshidratasa, se transfiere a un microorganismo,

b) el polinucleótido se replica en el microorganismo, y

c) se multiplica y reproduce el microorganismo obtenido según las etapas a) y b).

De esta manera se obtiene un microorganismo recombinante, que contiene por lo menos una (1) copia o varias copias de un polinucleótido conforme al invento.

Otros objetos del invento son, de modo correspondiente, unos anfitriones o respectivamente unas células anfitrionas, de manera preferida unos microorganismos, de manera especialmente preferida unas bacterias corineformes y unas bacterias del género Escherichia, que contienen los polinucleótidos conformes al invento. Un objeto del invento son igualmente unos microorganismos, que habían sido producidos mediando utilización de los polinucleótidos aislados. Tales microorganismos o bacterias se designan también como microorganismos recombinantes o como bacterias recombinantes. De igual manera, son un objeto del invento unos vectores, que contienen los polinucleótidos conformes al invento. Finalmente, son objeto del invento asimismo unos anfitriones, que contienen estos vectores.

Adicionalmente, para realizar la producción mejorada de L-aminoácidos, en particular de L-lisina, L-triptófano, L-valina, L-isoleucina y L-homoserina, puede ser ventajoso sobreexpresar en los mutantes o en las cepas recombinantes conformes al invento diversos genes. La utilización de unos genes endógenos es preferida por lo general.

Por el concepto de "genes endógenos" o de "secuencias de nucleótidos endógenas" se entienden los genes o respectivamente las secuencias de nucleótidos o los alelos, que están presentes en la población de una especie.

Así, para la producción de L-lisina se puede(n) sobreexpresar uno o varios de los genes, que se escogen entre el conjunto que se compone de

•: un gen dapA, que codifica una dihidrodipicolinato sintasa (DapA, nº de EC 4.2.1.52), tal como por ejemplo el gen dpaA del tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum, que ha sido descrito en el documento EP 0 197 335,

•: un gen lysA, que codifica una diaminopimelato descarboxilasa (LysA, nº de EC 4.1.1.20), tal como por ejemplo el gen lysA de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, que ha sido descrito en el documento US 6.090.597,

•: un gen zwf, que codifica una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (Zwf, nº de EC 1.1.1.49), tal como por ejemplo el gen zwf del tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum, que ha sido descrito en el documento JP-A-09224661 y en el documento EP-A-1108790,

•: los alelos de zwf de Corynebacterium glutamicum, que han sido descritos en el documento de solicitud de patente de los EE.UU US-2003-0175911-A1, que codifican una proteína con una actividad de glucosa-6fosfato deshidrogenasa, en la que, por ejemplo, la L-alanina ha sido reemplazada por L-treonina en la

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posición 243 de la secuencia de aminoácidos, o en la que el L-acido aspártico ha sido reemplazado por Lserina en la posición 245,

•: un gen pyc, que codifica una piruvato carboxilasa (Pyc, nº de EC 6.4.1.1), tal como, por ejemplo, el gen pyc del tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum, que ha sido descrito en el documento DE-A-198 31609 y en el documento EP 1108790,

•: el alelo de pyc de Corynebacterium glutamicum, que ha sido descrito en el documento EP 1 108 790, que codifica una proteína con una actividad de piruvato carboxilasa, en la que la L-prolina ha sido reemplazada por L-serina en la posición 458 de la secuencia de aminoácidos,

•: los alelos de pyc de Corynebacterium glutamicum, que han sido descritos en el documento WO 02/31158 y en particular en el documento EP1325135B1, que codifican unas proteínas con una actividad de piruvato carboxilasa, que llevan uno o varios de los intercambios de aminoácidos que se escogen entre el conjunto que se compone de L-valina reemplazada por L-metionina en la posición 1, de L-acido glutámico reemplazado por L-acido aspártico en la posición 153, de L-alanina reemplazada por L-serina en la posición 182, de L-alanina reemplazada por L-serina en la posición 206, de L-histidina reemplazada por L-arginina en la posición 227, de L-alanina reemplazada por glicina en la posición 455 y de L-acido aspártico reemplazado por L-acido glutámico en la posición 1.120

•: un gen lysC que codifica una aspartato cinasa (LysC, nº de EC 2.7.2.4), tal como por ejemplo el gen lysC del tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum, que ha sido descrito como la SEQ ID NO: 281 en el documento EP-A-1108790 (véanse también los números de acceso AX120085 y 120365) y que ha sido descrito como la SEQ ID NO: 25 en el documento WO 01/00843 (véase el número de acceso AX063743),

•: un alelo de lysCFBR que codifica una variante de la aspartato cinasa que es resistente a la retroalimentación, en particular de manera correspondiente a la Tabla 1,

•: un gen (lysE) que codifica una proteína exportadora de lisina, tal como por ejemplo el gen lysE del tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum, como se ha descrito en el documento DE-A-195 48 222,

•: el gen aat (el gen aat de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ha sido descrito por ejemplo en la cita de Kalinowski y colaboradores (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 5-25 (2003); véase también el número de acceso NC_006958), que codifica una aspartato aminotransferasa (Aat, nº de EC 2.6.1.1). Allí, él es designado como gen aspB. En el documento US 6.004.773, un gen que codifica una aspartato aminotransferasa es designado como aspC. Marienhagen y colaboradores (Journal of Bacteriology 187 (22), 7693-7646 (2005) designan al gen aat como el gen aspT)), y

•: el gen zwa1 del tipo silvestre de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína Zwa1 (documento US 6.632.644).

Por el concepto de "sobreexpresión" se entiende por lo general un aumento de la concentración o de la actividad intracelular de un ácido ribonucleico, de una proteína o de una enzima. En el caso del presente invento, se sobreexpresan unos alelos de prpD1 o respectivamente unos polinucleótidos, que codifican unas 2-metilcitrato deshidratasas, que en la posición 272 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado contienen cualquier aminoácido proteinógeno estando exceptuada la L-prolina, siendo preferido el intercambio por L-leucina. Es conocido que mediante unas enzimas propias del anfitrión -las denominadas aminopeptidasas -se pueden separar desde el polipéptido formado unos aminoácidos terminales de N, en particular la metionina terminal de N. El mencionado aumento de la concentración o de la actividad de un producto génico se puede conseguir por ejemplo mediante el recurso de que se aumenta en por lo menos una copia el número de copias de los correspondientes polinucleótidos.

Un método ampliamente propagado para el aumento del número de copias consiste en que el correspondiente gen o alelo se incorpora en un vector, de manera preferida un plásmido, que es replicado por una bacteria corineforme. Unos vectores de plásmidos adecuados son por ejemplo el pZ1 (Menkel y colaboradores, Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) o los vectores pSELF que han sido descritos por Tauch y colaboradores (Journal of Biotechnoloy 99, 79-91 (2002). Un artículo recopilativo sobre el tema de los plásmidos en Corynebacterium glutamicum se encuentra en la cita de Tauch y colaboradores (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)).

Otro método propagado para la consecución de una sobreexpresión es el procedimiento de la amplificación cromosómica de genes. En el caso de este método, por lo menos una copia adicional del gen o alelo que interesa se introduce en el cromosoma de una bacteria corineforme.

En una forma de realización, tal como se ha descrito por ejemplo en la cita de Reinscheid y colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132) (1994) para el operón hom-thrB, un plásmido, que no es replicativo en

C. glutamicum, el cual contiene el gen que interesa, se transfiere a una bacteria corineforme. Después de una recombinación homóloga, mediante un suceso de cruzamiento, la cepa resultante contiene por lo menos dos copias del correspondiente gen o respectivamente alelo.

En otra forma de realización, que se describe en los documentos WO 03/040373 y solicitud de patente de los EE.UU US-2003-0219881-A1, una o varias copia(s) del gen que interesa se introduce(n) mediante por lo menos dos sucesos de recombinación en un sitio deseado del cromosoma de C. glutamicum. De esta manera se incorporó, por ejemplo, una copia de un alelo de lysC, que codifica una aspartato cinasa insensible a la L-lisina, en el gen gluB de

C. glutamicum.

En otra forma de realización, que se describe en los documentos WO 03/014330 y US-2004-0043458-A1, mediante por lo menos dos sucesos de recombinación se incorpora en el sitio natural por lo menos otra copia más del gen que interesa, de manera preferida en una disposición en tándem con respecto al gen o alelo que ya está presente. De esta manera se consiguió por ejemplo una duplicación en tándem de un alelo de lysCFBR junto al sitio natural del gen lysC.

Finalmente, es posible aumentar el número de copias con ayuda de transposones y de elementos IS (véanse los documentos US 5.804.414 y US 5.591.577).

Otro método para la consecución de una sobreexpresión consiste en unir el correspondiente gen o respectivamente alelo de un modo funcional (en inglés "operably linked" = enlazado operativamente) con un promotor o respectivamente una casete de expresión. Unos promotores adecuados para Corynebacterium glutamicum se describen, por ejemplo, en el artículo recopilativo de Patek y colaboradores (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311323 (2003). De igual manera se pueden emplear las variantes del promotor de dapA que han sido descritas por Vasicova y colaboradores (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)), por ejemplo, el promotor A25. Por lo demás se puede utilizar el promotor gap de Corynebacterium glutamicum (véase el documento EP 06007373). Finalmente, se pueden utilizar los promotores T3, T7, SP6, M13, lac, tac y trc, suficientemente conocidos, y que han sido descritos en las citas de Amann y colaboradores (Gene 69(2), 301-315 (1988)) y de Aman y Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)).

Además de esto, se pueden mutar las regiones de promotor y de regulación, o el sitio de fijación a ribosomas, que se encuentra corriente arriba del gen estructural. Por medio de unas medidas técnicas para la prolongación de la duración de vida del ARNm (ARN mensajero) se mejora asimismo la expresión. Por lo demás, mediante una evitación de la degradación de la proteína enzimática se puede reforzar asimismo la actividad enzimática. Alternativamente, se puede conseguir por lo demás una sobreexpresión del correspondiente gen o alelo mediante una modificación de la composición de los medios y de la realización del cultivo.

Mediante las medidas técnicas de la sobreexpresión se aumenta la actividad o concentración de la correspondiente proteína por lo general en por lo menos un 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 %, como máximo hasta en un 1.000 % o 2.000 %, referido a la actividad o a la concentración de la proteína en el microorganismo de partida o respectivamente en la cepa parental. Por el concepto de "un microorganismo de partida" o de "una cepa parental" se entiende un microorganismo, en el que se llevan a cabo las medidas técnicas del invento.

La concentración de la proteína se puede determinar en el gel por medio de una separación de proteínas en un gel uni-o bidimensional (de 1 y 2 dimensiones) y de una subsiguiente identificación óptica de la concentración de proteínas con un correspondiente software de evaluación. Un método habitual para la preparación previa de los geles para proteínas en el caso de bacterias corineformes y para la identificación de las proteínas lo constituye el modo de proceder descrito por Herrmann y colaboradores (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001). La concentración de las proteínas se puede determinar asimismo mediante una hibridación por transferencia de borrón Western con un anticuerpo específico para la proteína que se ha de detectar (Sambrook y colaboradores, Molecular cloning: a laboratory manual. 2a edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) y una subsiguiente evaluación óptica con un correspondiente software para la determinación de la concentración (Lohaus y Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 272: 2630-2647 (1999)).

Por lo demás, para la producción de L-lisina puede ser ventajoso, junto a la utilización de los alelos del gen prpD1 conformes al invento, eventualmente con una sobreexpresión simultánea de por lo menos uno de los genes escogidos entre el conjunto precedentemente mencionado, debilitar o desconectar simultáneamente uno o varios de los genes endógenos, que se escogen entre el conjunto que se compone de

•: un gen pgi que codifica la glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi, nº de EC 5.3.1.9), tal como, por ejemplo, el gen pgi de Corynebacterium glutamicum, que ha sido descrito en los documentos US 6.586.214 y US 6.465.238,

•: un gen hom que codifica la homoserina deshidrogenasa (Hom, nº de EC 1.1.1.3), tal como, por ejemplo, el

gen hom de Corynebacterium glutamicum, que ha sido descrito en el documento EP-A-0131171, 20

•: un gen thrB que codifica la homoserina cinasa (ThrB, nº de EC 2.7.1.39), tal como, por ejemplo, el gen thrB de Corynebacterium glutamicum, que ha sido descrito por Peoples y colaboradores (Molecular Microbiology 2 (1988): 63 -72)) y

•: un gen pfkB que codifica la fosfofructo cinasa (PfkB, nº de EC 2.7.1.56), tal como, por ejemplo, el gen pfkB de Corynebacterium glutamicum, que ha sido descrito en el documento WO 01/00844 (secuencia n° 57).

•: un gen mdh que codifica la malato deshidrogenasa (Mdh, nº de EC 1.1.1.37), tal como se ha descrito a modo de ejemplo en el documento WO 02/02778,

•: un gen mqo que codifica la malato-quinona oxidorreductasa (Mqo, nº de EC 1.1.99.16), tal como se ha descrito en los documentos US 7.094.106 y PCT/EP2005/057216.

El concepto de "debilitamiento" describe en este contexto la disminución o desconexión de la actividad intracelular de una o varias enzima(s) (proteína(s)) en un microorganismo, que es (son) codificada(s) por el correspondiente ADN, mediante el recurso de que, por ejemplo, se utiliza un promotor débil o se utiliza un gen o respectivamente alelo, que codifica una correspondiente enzima con una baja actividad o respectivamente se desactiva al correspondiente gen o a la correspondiente enzima (proteína), y eventualmente se combinan estas medidas técnicas.

Mediante las medidas técnicas del debilitamiento se reduce la actividad o concentración de la correspondiente proteína por lo general a0 hasta 75 %, a 0 hasta 50 %, a 0 hasta 25 %, a 0 hasta 10 % o a 0 hasta 5 % de la actividad o concentración de la proteína de tipo silvestre, o respectivamente de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.

Como mutaciones para la producción de un debilitamiento entran en consideración transiciones, transversiones, inserciones y supresiones de por lo menos un (1) par de bases o respectivamente nucleótido. En dependencia del efecto del intercambio de aminoácidos, que es provocado por la mutación, sobre la actividad enzimática, se habla de mutaciones en un sentido erróneo (en inglés "missense mutations") o de mutaciones sin sentido (en inglés "nonsense mutations"). La mutación en un sentido erróneo conduce a un intercambio de un aminoácido dado en una proteína por otro distinto, tratándose en particular de un intercambio no conservativo de aminoácidos. De esta manera, la capacidad de funcionar o respectivamente la actividad de la proteína se perjudica y se reduce a un valor de 0 a 75 %, de 0 a 50 %, de 0 a 25 %, de 0 a 10 % o de 0 a 5 %. La mutación sin sentido conduce a un codón de interrupción en la región codificadora del gen y, por consiguiente, a una interrupción prematura de la traducción. Las inserciones o supresiones de por lo menos un par de bases en un gen conducen a unas mutaciones por desplazamiento del marco (en inglés "frame shift mutations"), que conducen a que sean incorporados unos aminoácidos erróneos, o a que la traducción se interrumpa prematuramente. Si como consecuencia de la mutación resulta un codón de interrupción en la región codificadora, entonces esto conduce asimismo a una interrupción prematura de la traducción. Las medidas técnicas mencionadas se llevan a cabo de manera preferida en la parte del extremo terminal en 5' de la región codificadora, que codifica el extremo terminal de N del polipéptido. Si se designa a la longitud total de un polipéptido (medida como el número de los L-aminoácidos unidos químicamente) como de 100 %, entonces -dentro del marco del presente invento -al extremo terminal de N del polipéptido pertenece la parte de la secuencia de aminoácidos, que, calculada a partir del aminoácido iniciador L-formil-metionina, contiene un 80 % de los siguientes L-aminoácidos.

Otras instrucciones para la producción de tales mutaciones pertenecen al estado de la técnica y se pueden deducir de los conocidos libros de texto acerca de genética y biología molecular tales como p.ej. el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik" (Genética molecular), 6a edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Alemania, 1995), el de Winnacker ("Gene und Klone" (Genes y clones), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann ("Allgemeine Genetik" (Genética general), editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1986). Otras medidas técnicas se describen en el estado de la técnica.

Un método para la disminución deliberada de la expresión génica consiste en poner al gen que debe de ser debilitado bajo el control de un promotor inducible mediante la adición de unas cantidades dosificadas de IPTG (isopropil-β-tiogalactopiranósido), tal como, por ejemplo, el promotor de trc o el promotor de tac. Para esto se adecuan unos vectores tales como, por ejemplo, el vector de expresión de Escherichia coli pXK99E (documento WO0226787; depositado de acuerdo con el Convenio de Budapest el 31 de julio del 2001 en DH5alpha/pXK99E como DSM14440 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares) (DSMZ, Braunschweig, Alemania)) o pVWEx2 (Wendisch, tesis doctoral Berichte des Forschungszentrums Jülich (Informes del Centro de Investigación Jülich), Jül-3397, ISSN 0994-2952, Jülich, Alemania (1997)), que hacen posible una expresión dependiente de IPTG del gen clonado en Corynebacterium glutamicum.

Este método se empleó, por ejemplo, en el documento de patente WO0226787 para la expresión regulada del gen deaD mediante integración del vector pXK99EdeaD en el genoma de Corynebacterium glutamicum y por Simic y

colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327 (2002)) para la expresión regulada del gen glyA mediante integración del vector pK18mobglyA' en Corynebacterium glutamicum.

Otro método para la disminución específica de la expresión génica es la técnica antisentido, introduciéndose en las células diana unos oligodesoxinucleótidos o vectores cortos para la síntesis de un ARN antisentido más largo. El ARN antisentido se puede fijar allí a unos segmentos complementarios de unos ARNm específicos y disminuir su estabilidad o bloquear su traducibilidad. Un ejemplo de esto lo encontrará un experto en la especialidad en la cita de Srivastava y colaboradores (Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10): 4366 -4371).

Las bacterias corineformes aisladas, que se han obtenido por medio de las medidas técnicas del invento, muestran una segregación o respectivamente producción, aumentada en comparación con la cepa de partida o respectivamente con la cepa parental que se emplea, del aminoácido deseado en un proceso de fermentación.

Por el concepto de "bacterias aisladas" se han de entender los mutantes y las bacterias recombinantes aislados/as o respectivamente producidos/as, conformes al invento, que contienen un alelo de prpD1, que codifica una 2-metilcitrato deshidratasa, que contiene el intercambio de aminoácidos que ha sido descrito en la posición 272 de la secuencia de aminoácidos.

El rendimiento de las bacterias aisladas o respectivamente del proceso de fermentación mediando utilización de las mismas en lo que respecta a uno o varios de los parámetros que se escogen entre el conjunto que se compone de la concentración del producto (producto por volumen), del rendimiento del producto (producto formado por fuente de carbono consumida) y la formación del producto (producto formado por volumen y tiempo) o también de otros parámetros del proceso y unas combinaciones de éstos, es mejorado en por lo menos un 0,5 %, en por lo menos un 1 %, en por lo menos un 1,5 % o en por lo menos un 2 %, referido a la cepa de partida o respectivamente a la cepa parental o respectivamente al proceso de fermentación mediando utilización de las mismas.

Las bacterias corineformes aisladas, conformes al invento, se pueden cultivar continuamente -tal como se ha que ha sido descrito por ejemplo en el documento PCT/EP2004/008882 -o discontinuamente en el procedimiento batch (cultivación por tandas) o en el procedimiento fed batch (procedimiento de afluencia) o en el procedimiento fed batch repeated (procedimiento de afluencia repetida) con el fin de efectuar la producción de L-aminoácidos. Una recopilación de tipo general acerca de los métodos de cultivación conocidos se describe en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Técnica de bioprocesos 1. Introducción en la técnica de los bioprocesos] (editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Biorreactores y disposiciones periféricas] (editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo o respectivamente el medio de fermentación que se ha de utilizar, debe de satisfacer de una manera apropiada las exigencias de las respectivas cepas. Unas descripciones de medios de cultivo de diferentes microorganismos están contenidas en el manual “Manual of Methods for General Bacteriology” [Manual de métodos para la bacteriología general] de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., EE.UU., 1981). Los conceptos de un medio de cultivo, de un medio de fermentación de un medio nutritivo o respectivamente de un medio se pueden intercambiar recíprocamente.

Como fuente de carbono se pueden utilizar unos azúcares y unos hidratos de carbono, tales como p.ej. glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, unas soluciones que contienen sacarosa procedentes de la producción de remolacha azucarera o de caña de azúcar, unos almidones, unos materiales hidrolizados de almidones y unas celulosas, unos aceites y unas grasas, tales como por ejemplo aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y grasa de coco, unos ácidos grasos, tales como por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, unos alcoholes, tales como por ejemplo glicerol, metanol y etanol, y unos ácidos orgánicos, tales como por ejemplo ácido acético. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o como una mezcla.

Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar unos compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, tales como peptonas, un extracto de levadura, un extracto de carne, un extracto de malta, agua de maceración de maíz, harina de soja y urea, o unos compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar individualmente o como una mezcla.

Como fuente de fósforo se pueden utilizar ácido fosfórico, dihidrógeno-fosfato de potasio o hidrógeno-fosfato de dipotasio o bien las correspondientes sales que contienen sodio.

El medio de cultivo debe de contener por lo demás unas sales, por ejemplo en forma de cloruros o sulfatos, de unos metales, tales como por ejemplo sodio, potasio, magnesio, calcio y hierro, tales como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente, de manera adicional a las sustancias más arriba mencionadas se pueden emplear unas sustancias de crecimiento esenciales, tales como aminoácidos, por ejemplo homoserina, y unas vitaminas, por ejemplo tiamina, biotina o ácido pantoténico. Al medio

de cultivo se le pueden añadir además de ello unos adecuados compuestos precursores de los respectivos aminoácidos.

Las mencionadas sustancias empleadas de partida se pueden añadir al cultivo en forma de una tanda única o se pueden alimentar de una manera apropiada durante la cultivación.

Para realizar el control del pH del cultivo, se emplean de un modo apropiado unos compuestos de carácter básico, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o respectivamente agua amoniacal, o unos compuestos de carácter ácido, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. El pH se ajusta en general a un valor de 6,0 hasta 9,0, de manera preferida de 6,5 hasta 8. Para la represión del desarrollo de espuma se pueden emplear unos agentes antiespumantes, tales como por ejemplo unos ésteres poliglicólicos de ácidos grasos. Para la conservación de la estabilidad de unos plásmidos, se pueden añadir al medio unas apropiadas sustancias que actúan de un modo selectivo, tales como por ejemplo unos antibióticos. Con el fin de mantener unas condiciones aerobias, se introducen en el cultivo oxígeno o unas mezclas gaseosas que contienen oxígeno, tales como por ejemplo aire. La utilización de unos líquidos, que están enriquecidos con peróxido de hidrógeno, es asimismo posible. Eventualmente, la fermentación se realiza a sobrepresión, por ejemplo a una sobrepresión de 0,03 a 0,2 MPa. La temperatura del cultivo está situada normalmente en 20ºC hasta 45ºC y de manera preferida en 25ºC hasta 40 °C. En el caso de los procedimientos de cultivación por tandas, se continúa realizando la cultivación durante tanto tiempo hasta que se haya formado una cantidad máxima del deseado aminoácido. Este objetivo se alcanza normalmente en el transcurso de 10 horas hasta 160 horas. En el caso de unos procedimientos continuos son posibles unos más largos períodos de tiempo de cultivación.

Unos adecuados medios de fermentación han sido descritos, entre otros lugares, en los documentos US 6.221.636, US 5.840.551, US 5.770.409, US 5.605.818, US 5.275.940, US 4.275.157 y US 4.224.409.

Unos métodos para la determinación de L-aminoácidos se conocen a partir del estado de la técnica. El análisis se puede efectuar, por ejemplo, tal como se ha descrito en la cita de Spackman y colaboradores (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) mediante una cromatografía de gases con intercambio de aniones con una subsiguiente derivatización con ninhidrina, o él se puede efectuar mediante una HPLC (cromatografía de fase líquida de alto rendimiento) de fase inversa (en inglés "reversed phase HPLC), tal como se ha descrito en la cita de Lindroth y colaboradores (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

Un objeto del invento es, de modo correspondiente, también un procedimiento para la producción de L-lisina, en cuyo caso

a) se fermenta una bacteria corineforme aislada en un medio adecuado, conteniendo la bacteria un gen que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, conteniendo el polipéptido L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2

o comprendiendo el polipéptido la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en la que en la posición 272 está contenida L-leucina

b) el L-aminoácido se acumula en el caldo de fermentación o en las células de la bacteria corineforme aislada.

A esto le sigue por regla general la recolección (en inglés "collecting") del L-aminoácido enriquecido en el medio nutritivo o respectivamente en el caldo de fermentación y/o en las células de las bacterias, con el fin de acceder a un producto sólido o líquido.

Por el concepto de "un caldo de fermentación" se entiende un medio de fermentación, en el que se había cultivado un microorganismo durante un determinado período de tiempo y a una temperatura determinada. El medio de fermentación o respectivamente los medios empleados durante la fermentación contiene(n) todas las sustancias o respectivamente todos los componentes, que aseguran una multiplicación o reproducción del microorganismo y una formación del aminoácido deseado.

Al final de la fermentación, el caldo de fermentación resultante contiene de modo correspondiente: a) la biomasa (masa celular) del microorganismo que ha resultado como consecuencia de la multiplicación o reproducción de las células del microorganismo, b) el aminoácido deseado, que se ha formado en el transcurso de la fermentación, c) los productos secundarios orgánicos que se han formado en el transcurso de la fermentación y d) los componentes, no consumidos por la fermentación, del medio de fermentación o de los medios de fermentación que se emplea(n) o respectivamente de las sustancias empleadas de partida, tales como, por ejemplo, unas vitaminas tales como biotina, unos aminoácidos tales como homoserina o unas sales tales como sulfato de magnesio.

A los productos secundarios orgánicos pertenecen unas sustancias, que son producidas por los microorganismos empleados al realizar la fermentación, eventualmente junto con el respectivo L-aminoácido deseado y que son segregadas eventualmente. Entre éstos se cuentan unos L-aminoácidos, que en comparación con el aminoácido deseado constituyen menos que un 30 %, 20 % o 10 %. A éstos pertenecen además unos ácidos orgánicos, que

llevan de uno a tres grupos carboxilo, tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido málico

o ácido fumárico. Finalmente, pertenecen a éstos también unos azúcares tales como, por ejemplo, trehalosa.

Unos típicos caldos de fermentación que son adecuados para finalidades industriales, tienen típicamente un contenido de aminoácidos de 30 g/kg a 200 g/kg o de 40 g/kg a 180 g/kg o de 50 g/kg a 150 g/kg. El contenido de biomasa (en forma de biomasa secada) es por lo general de 20 a 50 g/kg.

En el caso del aminoácido L-lisina, dentro del estado de la técnica se conocen esencialmente cuatro diferentes formas de productos.

Un conjunto de productos que contienen L-lisina comprende unas soluciones acuosas concentradas, de carácter alcalino, de L-lisina purificada (documento de patente europea EP-B-0534865). Otro conjunto, tal como el que ha sido descrito por ejemplo en los documentos US 6.340.486 y US 6.465.025, comprende unos concentrados acuosos, de carácter ácido, que contienen una biomasa, de unos caldos de fermentación que contienen L-lisina. El conjunto más conocido de productos sólidos comprende unas formas pulverulentas o cristalinas de L-lisina purificada o respectivamente pura, que se presenta típicamente en forma de una sal tal como, por ejemplo, el monohidrocloruro de L-lisina. Otro conjunto de formas de productos sólidos se describe, por ejemplo, en el documento EP-B-0533039. La forma de producto allí descrita contiene, junto a L-lisina, la mayor parte de las sustancias de partida empleadas, que se han utilizado durante la producción por fermentación y que no se han consumido, y eventualmente la biomasa del microorganismo empleado con una proporción de > 0 % -100 %.

En el caso de los aminoácidos L-valina, L-isoleucina, L-prolina, L-triptófano y L-homoserina, dentro del estado de la técnica se conocen esencialmente unas formas de productos, que contienen los respectivos aminoácidos en una forma purificada o pura (≥ 95 % en peso o ≥ 98 % en peso).

Correspondientemente a las diferentes formas de productos, se conocen los más diversos procedimientos, en los cuales el L-aminoácido se recoge a partir del caldo de fermentación, se aísla o purifica, con el fin de producir el producto que contiene el L-aminoácido, o el L-aminoácido purificado.

Para la producción de L-aminoácidos puros, sólidos, se usan en lo esencial los métodos de la cromatografía con intercambio de iones eventualmente mediando utilización de carbón activo, y los métodos de la cristalización. En el caso de la lisina se obtiene de esta manera la correspondiente base o una correspondiente sal, tal como, por ejemplo, el monohidrocloruro de lisina (Lys-HCl) o el sulfato de lisina (Lys2-H2SO4).

En el caso de la lisina, en el documento EP-B-0534865 se describe un procedimiento para la producción de soluciones acuosas, de carácter básico, que contienen L-lisina, a partir de unos caldos de fermentación. En el caso de los procedimientos allí descritos, la biomasa procedente del caldo de fermentación se separa y desecha. Mediante una base tal como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio o amonio, se ajusta un valor del pH comprendido entre 9 y 11. Los componentes minerales (unas sales inorgánicas) se separan, después de haber concentrado y enfriado, mediante una cristalización a partir del caldo, y o bien se utilizan como fertilizantes o se desechan.

En el caso de los procedimientos para la producción de lisina mediando utilización de las bacterias conformes al invento, se prefieren también aquellos procedimientos, en los que se obtienen unos productos que contienen unos componentes del caldo de fermentación. Éstos se utilizan en particular como aditivos para piensos de animales.

Según sea el requisito, la biomasa se puede eliminar total o parcialmente a partir del caldo de fermentación, mediante unos métodos de separación tales como p.ej. los de la centrifugación, de la filtración, de la decantación o una combinación de éstos, o se puede dejar completamente dentro de éste. Eventualmente, la biomasa, o respectivamente el caldo de fermentación que contiene la biomasa, se desactiva durante una adecuada etapa de procedimiento, por ejemplo mediante un tratamiento térmico (calentamiento) o mediante la adición de un ácido.

Los componentes químicos de la biomasa son, entre otros, la envoltura de las células, por ejemplo el peptidoglicano y el arabinogalactano, la proteína o respectivamente el polipéptido, por ejemplo el polipéptido de 2-metilcitrato deshidratasa, unos lípidos y fosfolípidos y unos ácidos nucleicos (ADN y ARN), por ejemplo unos polinucleótidos que contienen la mutación conforme al invento. Como consecuencia de las medidas técnicas de la desactivación y/o de las otras etapas del procedimiento (por ejemplo, las de acidificación, desecación por atomización, granulación, etc.) los ácidos nucleicos se presentan típicamente en forma de fragmentos con una longitud de, entre otras, ≥40 -60 pb (acrónimo de "pares de bases"), >60 -80 pb, >80 -100 pb, >100 -200 pb, >200 -300 pb, >300 -400 pb, >400 -500 pb, >500 -750 pb, >750 -1.000 pb, >1.000 -1.250 pb, >1.250 -1.500 pb, >1.500 -1.750 pb, >1.750 -2.000 pb, >2.000 -2.500 pb, >2.500 -3.000 pb, >3.000 -4.000 pb y >4.000 -5.000 pb.

En un modo de proceder, la biomasa se elimina totalmente o casi totalmente, de tal manera que en el producto producido no permanece nada (0 %) o permanece a lo sumo un 30 %, a lo sumo un 20 %, a lo sumo un 10 %, a lo sumo un 5 %, a lo sumo un 1 % o a lo sumo un 0,1 % de la biomasa. En otro modo de proceder, la biomasa no se elimina o se elimina solamente en insignificantes proporciones, de tal manera que permanece en el producto

producido la totalidad (el 100 %) o más de un 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 99,9 % de la biomasa. En un procedimiento conforme al invento, se elimina de modo correspondiente la biomasa en unas proporciones de desde ≥ 0 % hasta ≤ 100 %.

Finalmente, el caldo de fermentación que se ha obtenido después de la fermentación, se puede ajustar a un valor ácido del pH, antes o después de la eliminación total o parcial de la biomasa, con un ácido inorgánico tal como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico, o con un ácido orgánico, tal como, por ejemplo, ácido propiónico (documento de patente británica GB 1.439.728 o documento EP 1 331 220). De igual manera es posible acidificar el caldo de fermentación con la biomasa contenida completamente (documento US 6.340.486 o US 6.465.025). Finalmente, el caldo se puede estabilizar también mediante una adición de bisulfito de sodio (NaHSO3, documento GB 1.439.728) o de otra sal, tal como, por ejemplo, una sal de amonio, de un metal alcalino o de un metal alcalino-térreo del ácido sulfuroso.

Al realizar la separación de la biomasa, se eliminan parcial o totalmente los materiales sólidos orgánicos o inorgánicos que están contenidos eventualmente en el caldo de fermentación. Los productos secundarios orgánicos, que están disueltos en el caldo de fermentación, y los componentes disueltos, que no se han consumido, del medio de fermentación (es decir, las sustancias de partida empleadas) permanecen en el producto por lo menos parcialmente (> 0 %), de manera preferida en por lo menos un 25 %, de manera especialmente preferida en por lo menos un 50 % y de manera muy especialmente preferida en por lo menos un 75 %. Eventualmente, éstos permanecen en el producto también totalmente (en el 100 %) o casi totalmente, es decir en > 95 % o en > 98 %. En este sentido, el concepto de "base del caldo de fermentación" significa que un producto contiene por lo menos una parte de los componentes del caldo de fermentación.

A continuación, al caldo se le substrae agua con unos métodos conocidos, tal como p.ej. con ayuda de un evaporador rotatorio, un evaporador de capa fina, un evaporador de película descendente, mediante una ósmosis inversa o mediante una nanofiltración, o respectivamente el caldo es espesado o concentrado. Este caldo de fermentación aumentado de concentración se puede elaborar seguidamente mediante unos métodos de liofilización, de desecación por atomización, de granulación por atomización o mediante unos procedimientos de otros tipos, tal como, por ejemplo, en la capa turbulenta circulante que ha sido descrito en el documento PCT/EP2004/006655, para dar unos productos capaces de corrimiento, en particular para dar un polvo finamente dividido o de manera preferida un granulado de granos gruesos. Eventualmente, el producto deseado se aísla a partir del granulado obtenido mediante un tamizado o una separación del polvo fino.

Asimismo, es posible secar el caldo de fermentación directamente, es decir, sin ningún precedente aumento de la concentración, mediante una desecación por atomización o una granulación por atomización.

Por el concepto de "capaz de corrimiento" se entienden unos polvos que salen sin obstáculos desde una serie de recipientes de salida de vidrio, que tienen unos orificios de salida de diferentes tamaños, y por lo menos desde elrecipiente con el orificio de 5 mm (milímetros) (Klein: Seifen, Öle, Fette, Wachse (Jabones, aceites, grasas, ceras), 94, 12 (1968)).

Por el concepto de "finamente dividido" se entiende un polvo con una proporción predominante (> 50 %) de un tamaño de granos con unos diámetros de 20 a 200 µm.

Por el concepto de "de granos gruesos" se entiende un producto con una proporción predominante (> 50 %) de un tamaño de granos con unos diámetros de 200 a 2.000 µm.

La determinación de los tamaños de los granos se puede llevar a cabo con unos métodos de espectrometría por difracción de rayos láser. Los correspondientes métodos se describen en el libro de texto "Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis" [Medición de los tamaños de partículas en la práctica de laboratorio] de R. H. Müller y R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) o en el libro de texto "Introduction to Particle Technology" [Introducción a la tecnología de las partículas] de M. Rhodes, editorial Wiley & Sons (1998)).

El polvo capaz de corrimiento, finamente dividido, puede ser transformado, a su vez, mediante unos apropiados procedimientos de compactación o de granulación, en un producto de granos gruesos, bien capaz de corrimiento, almacenable y ampliamente exento de polvo.

El concepto de "exento de polvo" significa, que el producto contiene solamente unas pequeñas proporciones (< 5 %) de unos tamaños de granos con unos diámetros situados por debajo de 100 µm.

El concepto de "almacenable", dentro del sentido de este invento, significa que un producto se puede almacenar durante por lo menos un (1) año o más tiempo, de manera preferida por lo menos durante 1,5 años o más tiempo, de manera especialmente preferida durante dos (2) años o más tiempo, en un entorno seco y frío, sin que aparezca una pérdida esencial (< 5 %) del respectivo aminoácido.

Otro objeto del invento es, de modo correspondiente, un procedimiento para la producción de un producto que contiene L-lisina, de manera preferida un aditivo para piensos de animales, a partir de unos caldos de fermentación, que está caracterizado por las etapas de

a) cultivación y fermentación de una bacteria corineforme que segrega un L-aminoácido, que contiene por lo menos un alelo de prpD1, que codifica un polipéptido con una actividad de 2-metilcitrato deshidratasa, que conteniendo el polipéptido L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o comprendiendo el polipéptido la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en la que en la posición 272 está contenida L-leucina

b) eliminación de la biomasa que se ha formado durante la fermentación, en una proporción de 0 a 100 % en peso, y

c) desecación del caldo de fermentación que se ha obtenido de acuerdo con a) y/o b), con el fin de obtener el producto en la deseada forma de polvo o granulado,

añadiéndose eventualmente antes de la etapa b) o c) un ácido escogido entre el conjunto que se compone de ácido sulfúrico, ácido fosfórico o ácido clorhídrico. De manera preferida, a continuación de la etapa a) o b) se elimina agua a partir del caldo de fermentación que contiene un L-aminoácido (proceso de aumento de concentración).

La descripción divulga también un procedimiento para la producción de un producto que contiene sulfato de lisina, que ha sido descrito en sus rasgos fundamentales en el documento DE 102006016158, y en cuyo caso el caldo de fermentación que se ha obtenido mediando utilización de los microorganismos conformes al invento, a partir del cual se había separado la biomasa eventualmente de un modo total o parcial, se transforma, mediante el recurso de que se lleva a cabo un procedimiento que comprende por lo menos las siguientes etapas:

a) se disminuye el valor del pH, mediante una adición de ácido sulfúrico, a 4,0 hasta 5,2, en particular a 4,9 hasta 5,1, y se ajusta de una relación molar de sulfato/L-lisina de 0,85 a 1,2, de manera preferida de 0,9 a 1,0, de manera especialmente preferida de > 0,9 a < 0,95, en el caldo de cultivo, eventualmente mediante la adición de uno o varios compuesto(s) que contienen sulfato y

b) se aumenta la concentración de la mezcla así obtenida mediante substracción de agua, y eventualmente se granula,

llevándose a cabo eventualmente antes de la etapa a) una o ambas de las siguientes medidas técnicas:

c) medición de la relación molar de sulfato/L-lisina para la determinación de la cantidad requerida de un(os) compuesto(s) que contiene(n) sulfato

d) adición de un compuesto que contiene sulfato escogido entre el conjunto que se compone de sulfato de amonio, hidrógenosulfato de amonio y ácido sulfúrico en unas correspondientes relaciones.

Eventualmente, antes de la etapa b) se sigue añadiendo una sal del ácido sulfuroso, de manera preferida un hidrógenosulfito de metal alcalino, de manera especialmente preferida el hidrógenosulfito de sodio en una concentración de 0,01 a 0,5 % en peso, de manera preferida de 0,1 a 0,3 % en peso, de manera especialmente preferida de 0,1 a 0,2 % en peso, referida al caldo de fermentación.

Como unos preferidos compuestos que contienen sulfato, dentro del sentido de las etapas de procedimiento arriba mencionadas se han de mencionar en particular el sulfato de amonio y/o el hidrógenosulfato de amonio o unas correspondientes mezclas de amoníaco y ácido sulfúrico y el ácido sulfúrico por sí sólo.

La relación molar V de sulfato/L-lisina se calcula según la fórmula: V = 2 x [SO42-] / [L-lisina]. Esta fórmula toma en cuenta el hecho de que el anión de SO42-es bivalente. Una relación de V = 1 significa, que se presenta un Lys2(SO4) compuesto estequiométricamente, mientras que en el caso de una relación de V = 0,9 se encuentra un déficit de sulfato de 10 % y en el caso de una relación de V = 1,1 se encuentra un exceso de sulfato de 10 %

Al realizar la granulación o compactación, es ventajoso el empleo de unas usuales sustancias auxiliares orgánicas o inorgánicas, o respectivamente de unos vehículos o soportes tales como almidones, gelatinas, derivados de celulosas o unas sustancias similares, tales como las que encuentran utilización usualmente en la elaboración de alimentos o de piensos como agentes aglutinantes, gelificantes o espesantes, o de otras sustancias tales como por ejemplo ácidos silícicos, silicatos (documento EP0743016A) y estearatos.

Por lo demás, es ventajoso proveer de aceites a la superficie de los granulados obtenidos, tal como se ha descrito en el documento WO 04/054381. Como aceites se pueden utilizar aceites minerales, aceites vegetales o unas mezclas de aceites vegetales. Unos ejemplos de tales aceites son aceite de soja, aceite de oliva, y unas mezclas de aceite de soja y de lecitina. De igual manera, también se adecuan unos aceites de siliconas, unos poli(etilenglicoles)

o una hidroxietil-celulosa. Mediante el tratamiento de las superficies con los aceites mencionados se consiguen una aumentada resistencia a la abrasión del producto y una disminución de la proporción de polvo fino. El contenido de aceite en el producto es de 0,02 a 2,0 % en peso, de manera preferida de 0,02 a 1,0 % en peso, y de manera muy especialmente preferida de 0,2 a 1,0 % en peso, referido a la cantidad total del aditivo para piensos.

Se prefieren unos productos con una proporción de ≥ 97 % en peso de un tamaño de granos con unos diámetros de 100 a 1.800 µm o con una proporción de ≥ 95 % en peso de un tamaño de granos con unos diámetros de 300 a

1.800 µm. La proporción de polvo fino, es decir de partículas con un tamaño de granos < 100 µm, se sitúa de manera preferida en > 0 a 1 % en peso, -de manera especialmente preferida en como máximo 0,5 % en peso.

Alternativamente, el producto se puede extender sin embargo también sobre un material de soporte o vehículo orgánico o inorgánico, conocido y usual en la elaboración de piensos, tal como, por ejemplo, ácidos silícicos, silicatos, materiales molidos, salvados, harinas, almidones, azúcares u otros, y/o se puede mezclar y estabilizar con unos usuales agentes espesantes o aglutinantes. Unos correspondientes ejemplos de usos y unos procedimientos para esto se describen en la bibliografía (Die Mühle + Mischfuttertechnik (El molino + la técnica de piensos mixtos) 132 (1995) 49, página 817).

Finalmente, el producto se puede llevar a un estado, en el que él sea estable frente a la digestión por unos estómagos de animales, en particular por el estómago de rumiantes, también mediante unos procedimientos de revestimiento (en inglés "coating") con unos agentes formadores de películas, tales como por ejemplo carbonatos metálicos, ácidos silícicos, silicatos, alginatos, estearatos, almidones, gomas y éteres de celulosa, tal como se ha descrito en el documento de patente alemana DE-C-4100920.

Para el ajuste de una deseada concentración de aminoácidos en el producto, según sea el requisito, el respectivo aminoácido se puede añadir durante el proceso en forma de un concentrado o eventualmente de una sustancia ampliamente pura o respectivamente de una de sus sales en una forma líquida o sólida. Éstos/as se pueden añadir individualmente o como unas mezclas al caldo de fermentación que se ha obtenido o que ha sido aumentado de concentración, o también durante el proceso de desecación o granulación.

Otro objeto del invento es un procedimiento para la producción de un producto sólido que contiene lisina, tal como se ha descrito en sus rasgos fundamentales en el documento US 20050220933, y que comprende la elaboración del caldo de fermentación obtenido mediando utilización de los microorganismos conformes al invento, en las siguientes etapas:

a) filtración del caldo de fermentación, de manera preferida con un filtro de membrana, de tal manera que se obtenga un lodo que contiene una biomasa y un material filtrado,

b) aumento de la concentración del material filtrado, preferiblemente de tal manera que se obtenga un contenido de materiales sólidos de 48 a 52 % en peso,

c) granulación del material concentrado obtenido en la etapa b), de manera preferida a una temperatura de 50°C a 62°C, y

d) revestimiento del granulado obtenido en la etapa c) con uno o varios de los agentes de revestimiento (en inglés "coating agent(s)).

Para el revestimiento en la etapa d) se utilizan de manera preferida unos agentes de revestimiento, que se escogen entre el conjunto que se compone de

d1) la biomasa obtenida en la etapa a),

d2) un compuesto que contiene L-lisina, de manera preferida escogido entre el conjunto que se compone de hidrocloruro de L-lisina o sulfato de L-lisina,

d3) una sustancia exenta esencialmente de L-lisina con un contenido de L-lisina < 1 % en peso, de manera

preferida < 0,5 % en peso, de manera preferida escogida entre el conjunto que se compone de almidones,

carragenano, un agar, ácidos silícicos, silicatos, materiales molidos, salvados y harinas, y

d4) una sustancia repelente del agua, que se escoge de manera preferida entre el conjunto que se compone de aceites, poli(etilenglicoles) y parafinas líquidas.

En el caso de la lisina, al realizar la producción de unos productos que contienenlisina, la relación de los iones se ajusta preferentemente de tal manera, que se establezca la equivalente relación de iones de un modo correspondiente a la siguiente fórmula

2 x [SO42-] + [Cl-] -[NH4+] -[Na+] -[K+] -2x [Mg2+] -2x [Ca2+] / [L-Lys] 27

como de 0,68 a 0,95, de manera preferida de 0,68 a 0,90, tal como ha sido descrito por Kushiki y colaboradores en el documento US 20030152633 (En los "[ ]" se indican las concentraciones molares).

En el caso de la lisina, el producto sólido constituido sobre la base del caldo de fermentación, que ha sido producido de esta manera, tiene un contenido de lisina (en forma de la base de lisina) de 10 % en peso a 70 % en peso o de 20 % en peso a 70 % en peso, de manera preferida de 30 % en peso a 70 % en peso y de manera muy especialmente preferida de 40 % en peso a 70 % en peso, referido a la masa seca del producto. Asimismo, son posibles unos contenidos máximos de la base de lisina de 71 % en peso, 72 % en peso o 73 % en peso.

En el caso de un aminoácido eléctricamente neutro, tal como el L-triptófano, el producto sólido constituido sobre la base del caldo de fermentación, que ha sido producido de esta manera, tiene un contenido del aminoácido de por lo menos 5 % en peso, 10 % en peso, 20 % en peso, 30 % en peso, y como máximo de 50 % en peso, 60 % en peso, 70 % en peso, 80 % en peso, 90 % en peso o hasta de 95 % en peso.

El contenido de agua del producto sólido es hasta de 5 % en peso, de manera preferida hasta de 4 % en peso, y de manera especialmente preferida de menos que 3 % en peso.

La descripción divulga también un aditivo para piensos que contiene L-lisina, constituido sobre la base de un caldo de fermentación, que tiene las siguientes características

a) un contenido de lisina (como la base) de desde por lo menos 10 % en peso hasta como máximo 73 % en peso,

b) un contenido de agua de a lo sumo 5 % en peso, y

c) un contenido de biomasa correspondiente a por lo menos un 0,1 % de la biomasa contenida en el

caldo de fermentación, siendo formada la biomasa eventualmente desactivada a partir de bacterias

corineformes conformes al invento.

La descripción divulga también un aditivo para piensos, que contiene L-triptófano, constituido sobre la base de un caldo de fermentación, que tiene las siguientes características

a) un contenido de triptófano de desde por lo menos 5 % en peso hasta como máximo 95 % en peso,

b) un contenido de agua de a lo sumo 5 % en peso, y

caldo de fermentación, siendo formada la biomasa eventualmente desactivada a partir de

bacterias corineformes conformes al invento.

La cepa MH20-22B se depositó el 28 de octubre de 2004 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania) como DSM 16835.

El mutante conforme al invento Corynebacterium glutamicum DM1916, que contiene L-leucina en la posición 272 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido prpD1, se depositó el 15 de mayo de 2006 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania) como DSM 18258.

El invento se describe seguidamente de una manera más detallada con ayuda de los siguientes Ejemplos de realización.

Ejemplo 1

Mutagénesis de la cepa DM416 que produce L-lisina

La cepa DM416 de Corynebacterium glutamicum se empleó como cepa de partida para la mutagénesis con N-metilN'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG). La cepa DM416 es un mutante de Corynebacterium glutamicum que requiere homoserina y leucina, y se ha depositado bajo la denominación ATCC21543 en la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.).

La cepa DM416 se cultivó en 10 ml del caldo LB-Bouillon (de Merck, Darmstadt, Alemania), que estaban contenidos en un matraz Erlenmeyer con una capacidad de 100 ml, durante 24 horas, a 33°C y 200 rpm (revoluciones por minuto), en un aparato sacudidor rotatorio del tipo Certomat BS-1 (de B. Braun Biotech International, Melsungen, Alemania). A continuación, el cultivo se separó por centrifugación, el sedimento se volvió a suspender en 10 ml de una solución al 0,9 % de NaCl, la suspensión obtenida se separó de nuevo por centrifugación y el sedimento obtenido se recogió en 10 ml de una solución al 0,9 % de NaCl. 5 ml de esta suspensión de células se trataron con

400 µg/ml de MNNG durante 15 minutos a 30°C y 200 rpm en un aparato sacudidor (véase más arriba). A continuación, la tanda de mutagénesis se separó por centrifugación y el sedimento se recogió en 10 ml de tiosulfato de Na al 2 % en un tampón de NaCl al 0,9 % (pH = 6,0). La suspensión de células se diluyó a continuación en las relaciones de 1:1.000, 1:10.000 y 1:100.000 con una solución al 0,9 % de NaCl, y unas partes alícuotas se sembraron en placas sobre un agar de corazón y cerebro (de Merck, Darmstadt, Alemania). De esta manera se aislaron aproximadamente 4.000 mutantes.

Ejemplo 2

Ensayo de rendimiento de los mutantes de la cepa DM416

Los mutantes obtenidos en el Ejemplo 1 se cultivaron en un medio nutritivo adecuado para la producción de lisina y se determinó el contenido de lisina en el material sobrenadante del cultivo.

Para esto, los clones se multiplicaron primeramente sobre unas placas de agar de corazón y cerebro (de Merck, Darmstadt, Alemania) durante 24 horas a 33°C. Partiendo de estos cultivos en placas de agar, se inoculó en cada caso un cultivo previo (10 ml del medio en un matraz Erlenmeyer con una capacidad de 100 ml). Como medio para el cultivo previo se utilizó el medio MM. El cultivo previo se incubó durante 24 horas a 33°C y 240 rpm en un aparato sacudidor. A partir de este cultivo previo se inoculó un cultivo principal, de tal manera que la DO (densidad óptica) inicial (a 660 nm) del cultivo principal fue de 0,1 DO. Para el cultivo principal se utilizó asimismo el medio MM.

Medio MM CSL 5 g/l MOPS 20 g/l Glucosa (autoclavada por separado) 50 g/l Sales: (NH4)2SO4) 25 g/l KH2PO4 0,1 g/l MgSO4 * 7 H2O 1,0 g/l CaCl2 * 2 H2O 10 mg/l FeSO4 * 7 H2O 10 mg/l MnSO4 * H2O 5,0 mg/l Biotina (filtrada en condiciones estériles) 0,3 mg/l Tiamina * HCl (filtrada en condiciones estériles) 0,2 mg/l L-leucina (filtrada en condiciones estériles) 0,2 g/l L-homoserina (filtrada en condiciones estériles) 0,2 g/l CaCO3 25 g/l

El CSL (acrónimo de Corn Steep Liquor = líquido de maceración de maíz), el MOPS (ácido morfolinopropanosulfónico) y la solución salina se ajustaron a un pH de 7 con agua amoniacal y se autoclavaron. A continuación se añadieron las soluciones estériles del substrato y de las vitaminas así como el CaCO3 autoclavado en seco.

La cultivación se efectuó en unos volúmenes de 10 ml, que estaban contenidos en unos matraces Erlenmeyer, con una capacidad de 100 ml, provistos de obstáculos. La temperatura fue de 33°C, el número de revoluciones fue de 250 rpm y la humedad del aire fue de 80 %.

Después de 24 horas se determinó la densidad óptica (DO) en el caso de una longitud de onda de medición de 660 nm con el Biomek 1000 (de Beckmann Instruments GmbH, München). La cantidad de lisina formada se determinó con un analizador de aminoácidos BioTronik de la entidad Eppendorf (Hamburg, Alemania) mediante una cromatografía con intercambio de iones y una derivatización posterior en la columna con detección por ninhidrina. Un mutante, que se distinguía por una formación aumentada de lisina, se designó como DM1916.

Tabla 1

Cepa: DO (660) Lisina-HCl (g/l)

DM416: 6,3 1,43

DM1916: 6,3 1,61

Ejemplo 3

Secuenciación del gen prpD1 del mutante DM1916

A partir del clon DM1916, con el método de Eikmanns y colaboradores (Microbiology 140: 1817 -1828 (1994)) se aisló un ADN cromosómico. Con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa se amplificó un fragmento de ADN, que lleva el gen prpD1 o respectivamente un alelo del mismo. A partir de la secuencia conocida para C. 29 5

glutamicum del gen prpD1 (la secuencia n° 770 del documento EP1108790) se escogieron los siguientes oligonucleótidos como cebadores:

Los cebadores representados fueron sintetizados por la entidad MWG Biotech (Ebersberg, Alemania) y la reacción PCR se llevó a cabo según el método clásico de PCR de Innis y colaboradores (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press). Los cebadores hacen posible la amplificación de un fragmento de ADN que tiene una longitud de aproximadamente 1,63 kb (kilobases), que lleva el gen prpD1 o respectivamente un alelo del mismo. Además de ello, los cebadores contienen la secuencia para un sitio de corte de la endonucleasa de restricción EcoRI, que ha sido marcada mediante un subrayado en la secuencia de nucleótidos arriba representada.

El fragmento de ADN amplificado con una longitud de aproximadamente 1,63 kb, que lleva el alelo de prpD1 de la cepa DM1916, se identificó mediante una electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 %, se aisló a partir del gel y se purificó con los métodos usuales (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden).

La secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN amplificado o respectivamente del producto de la PCR fue determinada por la entidad Agowa (Berlín, Alemania) mediante una secuenciación. La secuencia del producto de la PCR está representada en la SEQ ID NO: 13. La secuencia de la región codificadora se representa adicionalmente en la SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoácidos de la correspondiente proteína metilcitrato deshidratasa, que se establece con ayuda del programa Patentin, está representada en la SEQ ID NO: 6.

En la posición 815 de la secuencia de nucleótidos de la región codificadora del alelo de prpD1 de la cepa DM1916 se encuentra la base timina (SEQ ID NO: 5). En la correspondiente posición del gen de tipo silvestre se encuentra la base citosina (SEQ ID NO: 1).

En la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la proteína metilcitrato deshidratasa de la cepa DM1916 se encuentra el aminoácido leucina (SEQ ID NO: 6). En la correspondiente posición de la proteína de tipo silvestre se encuentra el aminoácido prolina (SEQ ID NO: 2):

El alelo de prpD1, que contiene en la posición 815 de la región codificadora la base timina y que codifica de modo correspondiente una proteína de metilcitrato deshidratasa, que contiene el aminoácido leucina en la posición 272 de la secuencia de aminoácidos, se designa en lo sucesivo como el alelo de prpD1_P272L. En el caso de la designación "prpD1_P272L", P representa L-prolina, L representa L-leucina y 272 indica la posición del intercambio de aminoácidos (véanse las SEQ ID NO: 2 y 6).

El mutante de Corynebacterium glutamicum DM1916, que contiene L-leucina en la posición 272 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PrpD1, fue depositado el 15 de mayo de 2006 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania) como DSM 18258.

Ejemplo 4

Intercambio del gen de tipo silvestre prpD1 de la cepa DM416 por el alelo de prpD1_P272L

4.1 Construcción del vector de intercambio pk18mobsacB_prpD1_P272L

El fragmento de ADN descrito en el Ejemplo 3, producido mediante una PCR, con una longitud de aproximadamente 1,63 kb, que lleva el alelo de prpD1_P272L, se introdujo mediante una mutagénesis por intercambio mediando toma de ayuda del sistema sacB descrito en la cita de Schäfer y colaboradores (Gene, 14, 69-73 (1994)) en el cromosoma de la cepa de C. glutamicum DM416 descrita en el Ejemplo 1. Este sistema hace posible la producción o respectivamente selección de unos intercambios de alelos, que se efectúan mediante una recombinación homóloga.

Para esto, el fragmento de prpD1_P272L con un tamaño de aproximadamente 1,63 kb se disoció con la endonucleasa de restricción EcoRI, se identificó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 % y a continuación se aisló a partir del gel y se purificó con los métodos usuales (con el estuche QIAquick Gel Extraction Kit de la entidad Qiagen (Hilden, Alemania).

El vector de clonación movilizable pK18mobsacB fue digerido con la enzima de restricción EcoRI y los extremos fueron desfosforilados con una fosfatasa alcalina (Alkaline Phosphatase, de Boehringer Mannheim, Alemania). El vector preparado previamente de esta manera se mezcló con el fragmento de prpD1_P272L con una longitud de

aproximadamente 1,63 kb y la tanda se trató con el estuche T4 DNA Ligase Kit (de Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemania).

A continuación, la cepa de E. coli S17-1 (Simon y colaboradores, Bio/Technologie 1: 784-791, 1993) se transformó con la tanda de ligación (Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach, tomo 1, IRL-Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). La selección de las células portadoras del plásmido se efectuó por siembra en placas de la tanda de transformación sobre un agar LB (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), que había sido suplementado con 25 mg/l de kanamicina.

El ADN de plásmido fue aislado a partir de un transformante con ayuda del estuche QIAprep Spin Miniprep Kit de la entidad Qiagen y fue comprobado mediante una disociación por restricción con la enzima PstI y mediante una subsiguiente electroforesis en un gel de agarosa. El plásmido es denominado pK18mobsacB_prpD1_P272L y se representa en la Figura 1.

4.2 Intercambio de alelos

El vector pK18mobsacB_prpD1_P272L mencionado en el Ejemplo 4.1 fue transferido por conjugación a la cepa DM416 de C. glutamicum de acuerdo con el protocolo de Schäfer y colaboradores (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990). El vector no se puede replicar de manera autónoma en DM416 y permanece conservado en la célula solamente cuando él se presenta integrado en el cromosoma como consecuencia de un suceso de recombinación. La selección de unos transconjugantes, es decir de unos clones con el pK18mobsacB_prpD1_P272L integrado, se efectuó mediante siembra en placas de la tanda de conjugación sobre un agar LB (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edición Cold Spring Harbor, New York, 1989), que había sido suplementado con 15 mg/l de kanamicina y 50 mg/l de ácido nalidíxico. Los transconjugantes resistentes frente a kanamicina fueron extendidos como un frote sobre unas placas de agar LB con 25 mg/l de kanamicina, y se incubaron durante 24 horas a 33°C. Para realizar la selección de unos mutantes, en los que, como consecuencia de un segundo suceso de recombinación había tenido lugar la escisión del plásmido, los clones fueron cultivados durante 30 horas de un modo no selectivo en un medio LB líquido, a continuación fueron extendidos como un frote sobre un agar LB, con sacarosa al 10 %, y fueron incubados durante 16 horas.

El plásmido pK18mobsacB_prpD1_P272L, al igual que el plásmido de partida pK18mobsacB, junto al gen de resistencia a kanamicina, contiene una copia del gen sacB que codifica la levano sucrasa procedente de Bacillus subtilis. La expresión inducible por sucrosa conduce a la formación de la levano sucrasa, que cataliza la síntesis del producto levano, que es tóxico para C. glutamicum. Sobre un agar LB suplementado con sucrosa (= sacarosa) crecen por lo tanto sólo aquellos clones, en los que el pK18mobsacB_prpD1_P272L integrado se ha escindido como consecuencia de un segundo suceso de recombinación. En dependencia de la localización del segundo suceso de recombinación en lo que respecta al sitio de la mutación tiene lugar en el caso de la escisión el intercambio de alelos

o respectivamente la incorporación de la mutación, o la copia original permanece en el cromosoma del anfitrión.

Aproximadamente desde 40 hasta 50 clones fueron ensayados en cuanto al fenotipo "crecimiento en presencia de sucrosa" y "ausencia de crecimiento en presencia de kanamicina". En el caso de 4 colonias, que contenían el fenotipo "crecimiento en presencia de sucrosa" y "ausencia de crecimiento en presencia de kanamicina", se secuenció un segmento del gen prpD1, que cubre a la mutación P272L, partiendo del cebador de secuenciación pr1-2 (que corresponde a la secuencia de nucleótidos en las posiciones 424-443 de la región codificadora del gen prpD1 procedente de la SEQ ID NO: 1), de la entidad Agowa (Berlin, Alemania), con el fin de detectar si se presenta la mutación del alelo de prpD1_P272L en el cromosoma. El cebador pr1-2 utilizado fue sintetizado para esto por la entidad Agowa:

De esta manera se identificó un clon, que en la posición 815 de la región codificadora del gen prpD1 contiene la base timina y que por consiguiente posee el alelo de prpD1_P272L. Este clon es designado como la cepa DM416prpD1_P272L.

Ejemplo 6

Comparación del rendimiento de la cepa DM416prpD1_P272L con la cepa de partida DM416.

El ensayo de rendimiento de la cepa DM416prpD1_P272L de C. glutamicum obtenida en el Ejemplo 5 se llevó a cabo tal como se ha descrito en el Ejemplo 2. El resultado del ensayo se representa en la Tabla 2.

Tabla 2

Cepa: DO (660 nm) Lisina-HCl (g/l)

DM416: 6,2 1,40

DM416prpD1_P272L: 6,2 1,64

Breve descripción de la Figura: 5 Figura 1: Mapa del plásmido pK18mobsacB_prpD1_P272L.

Las abreviaturas utilizadas y las denominaciones tienen los siguientes significados. En el caso de la indicación de los números de pares de bases se trata de unos valores aproximados, que se obtuvieron dentro del marco de la 10 reproducibilidad de las mediciones.

Kan: gen de resistencia a kanamicina

EcoRI: sitio de corte de la enzima de restricción EcoRI 15 PstI: sitio de corte de la enzima de restricción PstI

prpD1: alelo de prpD1_P272L

20 sacB: gen sacB

RP4-mob: región mob con el origen de la replicación para la transferencia (oriT)

oriV: origen de la replicación V 25

LISTA DE SECUENCIAS:

<110> Evonik Degussa GmbH

5 <120> Alelos del gen prpD1 procedentes de bacterias corineformes

<130> 2006E00233

<160> 20 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1497 15 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>: CDS 20 <222> (1)..(1494)

<223> gen prpD1 de tipo silvestre

<220>

<221>: característica variada 25 <222> (815)..(815)

<223> citosina

<400> 1

<210> 2

<211> 498

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 2

<210> 3

<221> 3000

<222>: ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> característica variada

<222>: (1) .. (750) 10 <223> secuencia situada corriente arriba de la CDS

<220>

<221> CDS

<222>: (751)..(2244) 15 <223> gen prpD1 de tipo silvestre

<220>

<221> característica variada

<222>: (1565)..(1565) 20 <223> citosina

<220>

<221> característica variada

<222>: (2245)..(3000) 25 <223> secuencia situada corriente arriba de la CDS

<400> 3

<210> 4

<211> 498

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 4

<210> 5

<211> 1497

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222>: (1) .. (1494) . 10 <223> alelo de prpD1

<220>

<221> mutación

<222>: (815) .. (815) 15 <223> transición C -> T

<400> 5

<210> 6

<211> 498

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 6

<210> 7

<211> 3000 5 <212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>: característica variada 10 <222> (1)..(750)

<223> secuencia situada corriente arriba de la CDS

<220>

<221>: fijación del cebador 15 <222> (661)..(680)

<223> sitio de fijación del cebador prpD1_XL_A1

<220>

<221>: CDS 20 <222> (751)..(2244)

<223> alelo de prpD1

<220>

<221>: mutación 25 <222> (1565)..(1565)

<223> transición C -> T

<220>

<221>: característica variada 30 <222> (2245)..(3000)

<223> secuencia situada corriente arriba de la CDS

<220>

<221>: fijación del cebador 35 <222> (2258)..(2277)

<223> sitio de fijación del cebador prpD1_XL_E1

<400> 7

<210> 8

<211> 498

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 8

<210> 9

<211> 28

<212> ADN 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador prpD1_XL-A1

10 <220>

<221> característica variada

<222> (1)..(2)

<220> 15 <221> característica variada

<222> (3).. (8)

<223> sitio de corte por restricción con EcoRI

<400> 9 20 gcgaattcta aactgcgtga ggttgtgg

<210> 10

<211> 28

<212> ADN 25 <213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador prpD1_XL_E1

30 <220>

<221> característica variada

<222> (1)..(2)

<220> 35 <221> característica variada

<222> (3).. (8)

<223> sitio de corte por restricción con EcoRI

40 <400> 10 gcgaattctc cccacatcaa caccattc

<210> 11

<211> 1263

<212> ADN

<213> Corynebacterium glutamicum

5 <220>

<221> CDS

<222> (1).. (1263)

<223> gen lysC de tipo silvestre

10 <400> 11

<210> 12

<211> 421

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 12

5: <210> 13 <211> 1633 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum

10 15 20: <220> <221> característica variada <222> (1)..(2) <220> <221> característica variada <222> (1)..(1633) <223> producto de la PCR <220> <221> estructura variada <222> (3)..(8) <223> sitio de corte por restricción con EcoRI <220> <221> CDS <222> (99)..(1592)

25: <220> <221> mutación <222> (913)..(913) <223> transición C -> T

30: <220> <221> estructura variada <222> (1626)..(1631) <223> sitio de corte por restricción con EcoRI

35: <220> <221> característica variada <222> (1632)..(1633)

<400> 13

<210> 14

<211> 498

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 14

<210> 15

<211> 1311

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1308) 10 <223> gen iLvA de tipo silvestre

<400> 15

<210> 16

<211> 436

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 16

<210> 17

<211> 120

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222>: (1)..(120) 10 <223> parte de la región codificadora del alelo de prpD1

<220>

<221> característica variada

<222>: (61)..(63) 15 <223> n esa, c, g ót

<400> 17

<210> 18 20 <211> 40

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<220> 25 <221> característica variada

<222> (21)..(21)

<223> El "Xaa" en la posición 21 representa Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, val, Gln, His, Leu, Tyr, Trp, Cys o Phe.

30 <400> 18 <210> 19

<211> 120

<212> ADN 5 <213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (120) 10 <223> una parte de la región codificadora del alelo de prpD1

<400> 19

<210> 20 15 <211> 40

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 20

Claims

REIVINDICACIONES

1. Mutantes aislados de bacterias corineformes, que contienen un gen, que codifica un polipéptido con una actividad de 2-metilcitrato deshidratasa, caracterizados por que el polipéptido contiene L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2

o por que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272.
2.

Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizados por que en el caso de las bacterias corineformes se trata de una bacteria escogida entre el conjunto que se compone de Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes y Corynebacterium aminogenes, de manera preferida de Corynebacterium glutamicum.
3.

Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizados por que se trata de unas bacterias que segregan L-aminoácidos, de manera preferida de unas bacterias que segregan Llisina, L-valina, L-isoleucina, L-triptófano o L-homoserina.
4.

Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizados por que el gen comprende una secuencia de nucleótidos, que es idéntica a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido, que es obtenible mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediando utilización de un ADN que se ha obtenido a partir de una bacteria corineforme y mediando utilización de un par de cebadores, que se compone de un primer cebador, que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos escogidos a partir de la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1 y 750 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7, y de un segundo cebador, que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos escogidos a partir de la secuencia de nucleótidos complementaria entre las posiciones 3.000 y 2.245 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7, o

por que el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácidos con una longitud correspondiente a 498 L-aminoácidos, o

por que el polipéptido codificado desde la posición 252 hasta 291 de la secuencia de aminoácidos contiene la secuencia correspondiente a las posiciones 252 hasta 291 de la SEQ ID NO: 6, o

por que el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en por lo menos un 90 % a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y que contiene L-leucina en la posición 272, o

por que el gen comprende una secuencia de nucleótidos, que es idéntica en por lo menos un 90 % a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.
5. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizados por que la proteína codificada comprende una secuencia de aminoácidos escogida entre el conjunto que se compone de

a) una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6,

b) una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 inclusive como máximo 5 intercambios conservativos de aminoácidos, y

c) una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 inclusive como máximo 5 inserciones o supresiones de aminoácidos.
6.

Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizados por que el gen comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 o de la SEQ ID NO: 7.
7.

Polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, que contiene L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2

o que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición 272.
8. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por que el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácidos con una longitud de 498 aminoácidos, o

por que el polipéptido codificado contiene, desde las posiciones 252 hasta 291 de la secuencia de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 252 hasta 291 de la SEQ ID NO: 6, o

por que el polinucleótido aislado es idéntico a la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido, que es obtenible mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediando utilización de un ADN que se ha obtenido a partir de una bacteria corineforme y mediando utilización de un par de cebadores, que se compone de un primer cebador, que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos escogidos a partir de la secuencia de nucleótidos situada entre las posiciones 1 y 750 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7, y de un segundo cebador, que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos escogidos a partir de la secuencia de nucleótidos complementaria entre las posiciones 3.000 y 2.245 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 7, o

por que el polinucleótido aislado con una secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO: 5 se hibrida en condiciones rigurosas, o

por que el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en por lo menos un 90 % a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, o

por que el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos, que es idéntica en por lo menos un 90 % a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, o

por que la proteína codificada comprende una secuencia de aminoácidos, escogida entre el conjunto que se compone de

a) una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6,

b) una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6, inclusive como máximo 5 intercambios conservativos de aminoácidos, y

c) una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6, inclusive como máximo 5 inserciones o supresiones de aminoácidos.
9.

Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, caracterizado por que el polipéptido codificado comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.
10.

Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado por que él comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.
11.

Un polinucleótido aislado, que comprende una molécula de ácido nucleico, que codifica por lo menos un marco de lectura con una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 252 hasta 291 de la SEQ ID NO: 2, estando contenida L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la SEQ ID NO: 2.
12.

Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado por que él codifica por lo menos un marco de lectura con una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 252 hasta 291 de la SEQ ID NO: 6, o

por que la secuencia de aminoácidos contiene uno o varios intercambios conservativos de aminoácidos, no concerniendo los intercambios conservativos de aminoácidos a la posición 272, o

por que el polinucleótido aislado contiene una o varias mutaciones mudas o,

el polinucleótido aislado comprende por lo menos la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones

1.504 hasta 1.623 de la SEQ ID NO: 7.
13.

Un microorganismo recombinante, que contiene el polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 7 hasta 12.
14.

Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que se trata de una bacteria corineforme o de una bacteria del género Escherichia, de manera preferida del género Corynebacterium y de manera especialmente preferida de la especie Corynebacterium glutamicum.
15.

Un vector, que contiene el polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 7 hasta 12.
16.

Un microorganismo recombinante, que contiene el vector de acuerdo con la reivindicación 15.
17.

Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado por que se trata de una bacteria corineforme o de una bacteria del género Escherichia, de manera preferida

del género Corynebacterium y de manera especialmente preferida

de la especie Corynebacterium glutamicum.
18. Procedimiento para la producción de L-lisina caracterizado por que

a) se fermenta una bacteria corineforme aislada en un medio adecuado, conteniendo la bacteria por lo menos una copia de un gen, que codifica un polipéptido con una actividad enzimática de 2-metilcitrato deshidratasa, conteniendo el polipéptido L-leucina en la posición correspondiente a la posición 272 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2

o comprendiendo el polipéptido la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en la que en la posición 272 está contenida L-leucina, y

b) el L-aminoácido se enriquece en el caldo de fermentación o en las células de la bacteria.
19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado por que en el caso de la bacteria corineforme aislada se trata de un mutante de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 6, o

se trata de una bacteria corineforme recombinante, que contiene un polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 7 hasta 12 o que se había producido mediando utilización del mismo, o

por que se aísla o recoge el L-aminoácido, y de manera preferida se purifica.
20. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado por que se aísla o recoge L-lisina en común con unos componentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa (> 0 hasta 100 %), o

por que

a) a partir del caldo de fermentación obtenido a partir de la etapa b) de la reivindicación 18 se elimina la biomasa formada en una proporción de 0 a 100 %, y

b) a partir del caldo obtenido en la etapa a) se produce un producto que está esencialmente seco y conformado, mediante un método escogido entre el conjunto que se compone de una granulación, una compactación, una desecación por atomización y una extrusión.
21. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizado por que al caldo de fermentación, antes o después de la etapa a), se le añade un ácido escogido entre el conjunto que se compone de ácido sulfúrico, ácido clorhídrico y ácido fosfórico, o

por que a partir del caldo obtenido antes o después de la etapa a), se elimina agua, o

por que el producto conformado obtenido en o durante la etapa b) es rociado con un aceite.
22. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado por que se llevan a cabo las siguientes etapas:

a) filtración del caldo de fermentación, de manera preferida con un filtro de membrana, de tal manera que se obtenga un lodo que contiene una biomasa y un material filtrado,

b) aumento de la concentración del material filtrado, preferiblemente de tal manera que se obtenga un contenido de materiales sólidos de 48 a 52 % en peso,

c) granulación del material concentrado obtenido en la etapa b), de manera preferida a una temperatura de

50°C a 62°C, y

d) revestimiento del granulado obtenido en la etapa c) con uno o varios del/de los agente(s) de revestimiento (en inglés "coating agent(s)).

Figura 1: Plásmido pK18mbosacB_prpD1_P272L