CN101180314A - 棒状细菌opcA基因的等位基因 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码葡糖－6磷酸脱氢酶(EC：1.1.1.49)的OpcA亚基变体的opcA基因突变体和等位基因，以及涉及利用含有所述等位基因的细菌制备氨基酸，特别是L－赖氨酸和L－色氨酸的方法。

Description

棒状细菌opcA基因的等位基因
本发明涉及编码葡糖-6磷酸脱氢酶(EC：1.1.1.49)的OpcA亚基变体的opcA基因突变体和等位基因以及涉及利用含有所述等位基因的细菌制备氨基酸，特别是L-赖氨酸和L-色氨酸的方法。
背景技术
氨基酸应用于人类医学、制药工业、食品工业、特别是动物营养。
已知通过发酵棒状细菌菌株(特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum))制备氨基酸。因为其极大的重要性，因此在改良其生产方法方面作了坚持不懈的努力。在发酵相关措施例如搅拌和供氧、或者营养培养基的组成(例如发酵期间的糖浓度)、或者产品的加工形式(例如离子交换层析法)、或者微生物本身内在的性能特征方面都可以改良所述方法。
通过实施诱变、选择和突变体筛选的方法可以改良所述微生物的性能特征。这使得能够获得耐抗代谢物或者对有调节重要性的代谢物有营养缺陷并产生氨基酸的菌株。已知的抗代谢物是赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)。
多年以来，也已经采用重组DNA技术的方法，以便通过扩增个别氨基酸生物合成基因和研究其对氨基酸生成的作用来改良产L-氨基酸的棒状细菌菌株。在Pühler(主编)的Journal of Biotechnology 104(1-3)，1-338，2003中可以找到关于谷氨酸棒杆菌的遗传学、代谢和生物技术等各个方面的综述。
Moritz等(European Journal of Biochemistry 267，3442-3452(2000))报道了关于谷氨酸棒杆菌葡糖-6-磷酸脱氢酶的生理学和生物化学研究。根据Moritz等的研究，葡糖-6-磷酸脱氢酶是由Zwf亚基和OpcA亚基组成的。
Moritz等(European Journal of Biochemistry 267，3442-3452(2000))描述了一种测定葡糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性的方法。
通常在国立医学图书馆(Bethesda，MD，USA)的国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)可以得到编码谷氨酸棒杆菌葡糖-6-磷酸脱氢酶的OpcA亚基的基因的核苷酸序列，编号为AX121828。还可以在专利申请EP1108790中找到序列No.1744。
同样也可以利用其他的数据库，例如欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国和剑桥，UK)的核苷酸序列数据库或者瑞士生物信息学研究所(Swissprot，Geneva，Switzerland)的核苷酸序列数据库或者蛋白质信息资源数据库(PIR，Washington，DC，USA)的核苷酸序列数据库。
棒状细菌中L-氨基酸的微生物生物合成是一个复杂的系统，其在多个水平上与细胞内的各种其他代谢途径相关。因此不可能预测出突变是否改变了葡糖-6-磷酸脱氢酶的OpcA多肽，提高了L-氨基酸的产量。为了更加清楚，SEQ ID NO：1表示编码谷氨酸棒杆菌葡糖-6-磷酸脱氢酶的OpcA亚基的zwf基因(“野生型基因”)的核苷酸序列，所述序列依照NCBI数据库的信息；以及SEQ ID NO：2和4表示从所编码的葡糖-6-磷酸脱氢酶得到的氨基酸序列。另外，SEQ ID NO：3表示位于上游和下游的核苷酸序列。
发明目的
本发明人本身所设定的目的是提供产生增加量的氨基酸特别是L-赖氨酸和L-色氨酸的改良的微生物菌株。
发明内容
本发明涉及已经在体外和/或体内生成的或者已经分离到的棒状细菌的突变体，其优选地分泌氨基酸，并且其包含编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的OpcA亚基的基因或等位基因，其中所述多肽的氨基酸序列包含选自由下面的氨基酸组成的组中的单个氨基酸或氨基酸的组合：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸；
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸。
优选地是，所述氨基酸序列的107位的氨基酸为L-组氨酸；219位的氨基酸为L-天冬酰胺；233位的氨基酸为L-丝氨酸以及261位的氨基酸为L-组氨酸。
本发明的突变体中的多肽还可以被称作OpcA多肽、葡糖-6-磷酸脱氢酶的OpcA多肽、葡糖-6-磷酸脱氢酶的OpcA亚基、或OpcA多肽亚基。EP 1 108 790(见表1的SEQ ID NO：1744)也将OpcA多肽称作“葡糖-6-磷酸脱氢酶装配蛋白”。
在棒状细菌中，优选的是棒杆菌属。特别优选的是分泌氨基酸的菌株，其依据于下面的种：Corynebacterium efficiens(例如菌株DSM44549)、谷氨酸棒杆菌(例如菌株ATCC13032)、热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)  (例如菌株FERM BP-1 539)、和产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)(例如菌株ATCC6871)，非常特别优选的是谷氨酸棒杆菌。
在现有技术中，也已知谷氨酸棒杆菌的一些代表有不同的种名。这些代表包括例如嗜乙酰乙酸棒杆菌  (Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC13870、百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)DSM20137、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)ATCC17965、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869、和扩展短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC14020。
已知分泌氨基酸的棒状细菌菌株的代表实例是产L-赖氨酸菌株：EP0 358 940所述的谷氨酸棒杆菌DM58-1/pDM6(＝DSM4697)、Menkel等(Applied and Environmental Microbiology 55(3)，684-688(1989))所述的谷氨酸棒杆菌MH20-22B(＝DSM16835)、EP1108790所述的谷氨酸棒杆菌AHP-3(＝FermBP-7382)、US4,275,157所述的谷氨酸棒杆菌NRRL B-11474、US 5,250,423所述的热产氨棒杆菌AJ12521(＝FERM BP-3304)；或者产L-色氨酸株：US 5,563,052所述的谷氨酸棒杆菌K76(＝FermBP-1847)、US 5,605,818所述的谷氨酸棒杆菌BPS13(＝FermBP-1777)、和US 5,235,940所述的谷氨酸棒杆菌FermBP-3055。
在Seiler(Journal of General Microbiology 129，1433-1477(1983))、
Figure A20068001780600151
和Kroppenstedt(Canadian Journal of Microbiology 42，989-1005(1996))、Liebl等(International Journal of Systematic Bacteriology 41，255-260(1991))和US-A-5,250,434中可以找到关于这组细菌菌株的分类学分类信息。
可以从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)获得表示为“ATCC”的菌株。可以从德国微生物菌种保藏中心(DSMZ，Brunswick，德国)获得表示为“DSM”的菌株。可以从国立高等工业科学和技术研究所(AIST Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba Ibaraki，Japan)获得表示为“FERM”的菌株。US-A 5,250,434描述了所提及的热产氨棒杆菌菌株(FERM BP-1539、FERM BP-1540、FERM BP-1541和FERMBP-1542)。可以从农业研究专利菌种保藏中心(Agricultural ResearchService Patent Culture Collection)(ARS，Peoria，Illinois，US)获得表示为“NRRL”的菌株。
术语蛋白氨基酸表示天然蛋白质中存在的氨基酸，即在微生物、植物、动物和人类蛋白质中存在的氨基酸。这些氨基酸具体地包括选自由L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸组成的组中的L-氨基酸。L-氨基酸还包括L-高丝氨酸。
本发明的突变体优选地分泌所述蛋白氨基酸，特别是L-赖氨酸和L-色氨酸。术语氨基酸也包括它们的盐，例如对于氨基酸L-赖氨酸而言是盐酸赖氨酸(lysine monohydrochloride)或赖氨酸硫酸盐。
本发明还涉及棒状细菌突变体，其包含编码OpcA多肽的opcA等位基因，所述OpcA多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：2，所述序列包含一个或多个选自由下面的取代组成的组中的氨基酸取代：
a)用不同的蛋白氨基酸、优选地用L-组氨酸取代107位的L-酪氨酸；
b)用不同的蛋白氨基酸、优选地用L-天冬酰胺取代219位的L-赖氨酸；
c)用不同的蛋白氨基酸、优选地用L-丝氨酸取代233位的L-脯氨酸；
d)用不同的蛋白氨基酸、优选地用L-组氨酸取代261位的L-酪氨酸。
本发明还涉及棒状细菌的突变体，其包括编码OpcA多肽的opcA等位基因，其中所述多肽的氨基酸序列具有一个或多个选自由下面的氨基酸组成的组中的氨基酸：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸。
等位基因包含与通过利用引物对的聚合酶链反应(PCR)可获得的多核苷酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，所述引物对的核苷酸序列都要包含选自SEQ ID NO：3的1和334位之间的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸以及选自SEQ ID NO：3的1600和1292位之间的互补核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。这种类型引物对的实例是SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12表示的引物对opcA-A1和opcA-E1。优选的起始物质(模板DNA)是已经用诱变剂特别处理过的棒状细菌的染色体DNA。特别优选的是棒杆菌属的染色体DNA，以及非常特别优选的是谷氨酸棒杆菌的染色体DNA。
本发明还涉及棒状细菌突变体，其包含编码OpcA多肽的opcA等位基因，所述OpcA多肽包含长度对应于319个L-氨基酸的氨基酸序列，所述多肽的所述氨基酸序列具有一个或多个选自由下面的氨基酸组成的组中的氨基酸：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸。
本发明还涉及棒状细菌突变体，其包含编码OpcA多肽的opcA等位基因，所述OpcA多肽的氨基酸序列的107到261位的氨基酸序列是对应于SEQ ID NO：6的107到261位的氨基酸序列。优选地，所编码的多肽的氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO：6的98到270位或SEQ IDNO：6的83到285位或SEQ ID NO：6的63到305位或SEQ ID NO：6的38到315位或SEQ ID NO：6的8到315位或SEQ ID NO：6的2到315位或SEQ ID NO：6的2到317位或SEQ ID NO：6的2到319位的氨基酸序列。非常特别优选地，所编码多肽的长度包含319个氨基酸。
本发明还涉及棒状细菌突变体，其包含编码OpcA多肽的opcA等位基因，所述多肽的所述氨基酸序列具有一个或多个选自由下面的氨基酸组成的组中的氨基酸：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸，
而且其氨基酸序列与SEQ ID NO：6或2的氨基酸序列具有至少90％、优选地至少92％或至少94％或至少96％、以及非常优选地至少97％或至少98％或至少99％或100％的相同性。
本发明还涉及棒状细菌的突变体，其包含编码OpcA多肽的opcA等位基因，所述多肽的所述氨基酸序列具有一个或多个选自由下面的氨基酸组成的组中的氨基酸：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸，
而且所述opcA等位基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：5或1的核苷酸序列具有至少90％、优选地至少92％或至少94％或至少96％、以及非常优选地至少97％或至少98％或至少99％或100％的相同性。
SEQ ID NO：7给出了与SEQ ID NO：5的核苷酸序列具有至少99％的相同性的opcA等位基因的核苷酸序列的一个实例。除了胞嘧啶取代319位的胸腺嘧啶、胞嘧啶取代657位的腺嘌呤、胸腺嘧啶取代697位的胞嘧啶以及胞嘧啶取代781位的胸腺嘧啶的核苷酸取代外(见SEQ IDNO：5)，该opcA等位基因的核苷酸序列还具有胸腺嘧啶取代402位的胞嘧啶、胞嘧啶取代600位的胸腺嘧啶以及胞嘧啶取代648位的鸟嘌呤的核苷酸取代(见SEQ ID NO：7)。短语“胞嘧啶取代648位的鸟嘌呤”以及相似的短语都表示编码区的野生型序列的648位所具有的核碱基鸟嘌呤(见SEQ ID NO：1)已经被胞嘧啶(见SEQ ID NO：7)取代。
已知保守氨基酸取代只能不显著地变更酶活性。因此，除了SEQID NO：6表示的氨基酸序列外，本发明的突变体所含的以及编码包含一个或多个本发明的氨基酸取代的OpcA多肽的opcA等位基因还可以包含一个(1)或多个保守氨基酸取代。优选地，所述多肽包含不超过2个(2)、不超过3个(3)、不超过4个(4)或不超过5个(5)保守氨基酸取代。
对于芳香族氨基酸而言，当苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸彼此取代时，所述取代被认为是保守取代。对于疏水性氨基酸而言，当亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸彼此取代时，所述取代被认为是保守取代。对于极性氨基酸而言，当谷氨酰胺和天冬酰胺彼此取代时，所述取代被认为是保守取代。对于碱性氨基酸而言，当精氨酸、赖氨酸和组氨酸彼此取代时，所述取代被认为是保守取代。对于酸性氨基酸而言，当天冬氨酸和谷氨酸彼此取代时，所述取代被认为是保守取代。对于含羟基的氨基酸而言，当丝氨酸和苏氨酸彼此取代时，所述取代被认为是保守取代。
最后，本发明涉及棒状细菌突变体，其包含编码OpcA多肽的opcA等位基因，所述OpcA多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO：6。
已知宿主内在的酶(称作氨基肽酶)在蛋白合成期间去除末端的甲硫氨酸。
本发明也涉及opcA等位基因，其编码如SEQ ID NO：6所述的本发明的OpcA多肽以及包含一个或多个插入或缺失。所述多肽优选地包含不超过5个、不超过4个、不超过3个或不超过2个氨基酸插入或缺失。
这种类型的插入和缺失或保守氨基酸取代基本上不影响包含相应OpcA亚基的葡糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性。“基本上不影响”表示所提及的变体的酶活性与包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的OpcA多肽亚基的葡糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性之间的差异不超过10％、不超过7.5％、不超过5％、不超过2.5％或者不超过1％，所述序列包含一个或多个选自由下面取代组成的组中的氨基酸取代：
a)L-组氨酸取代107位的L-酪氨酸
b)L-天冬酰胺取代219位的L-赖氨酸
c)L-丝氨酸取代233位的L-脯氨酸，和
d)L-组氨酸取代261位的L-酪氨酸。
通过利用诱变物质例如N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(MNNG)、乙基甲烷磺酸酯(EMS)、5-溴尿嘧啶、或紫外线等传统体内诱变方法以棒状细菌细胞群可以制备出本发明的突变体。例如在普通细菌学方法手册(Gerhard等(编)，美国微生物学学会，Washington，DC，USA，1981)或Tosaka等(Agricultural and Biological Chemistry 42(4)，745-752(1978))或Konicek等(Folia Microbiologica 33，337-343(1988))中描述了诱变方法。常用诱变方法使用MNNG，包括MNNG浓度为50到500mg/l或更高浓度，最高到1g/l；孵育时间为1到30分钟；pH值为5.5到7.5。在这些条件下，活细胞的数目减少了近50％到90％或近50％到99％或近50％到99.9％或更多。
从经诱变的细胞群中取出突变体或细胞，并进行繁殖。优选地，在进一步的步骤中利用合适的营养培养基研究所述突变体或细胞在分批培养中分泌氨基酸(优选的是L-赖氨酸或L-酪氨酸)的能力。US6,221,636、US 5,840,551、US 5,770,409、US 5,605,818、US 5,275,940和US 4,224,409描述了合适的营养培养基和检测条件。在使用合适的robotplant的情况下，例如如Zimmermann等(VDI Berichte No.1841，VDI-Verlag，Düsseldorf，Germany 2004，439-443)或Zimmermann(ChemieIngenieur Technik 77(4)，426-428(2005))所述的那样，可以在短时间内研究大量的突变体。通过这种方式鉴定出比亲代菌株或未诱变的起始菌株向营养培养基或细胞内部分泌更多量氨基酸的突变体。这些突变体包括例如那些氨基酸分泌至少增加了0.5％的突变体。
随后，提供突变体的DNA或者从突变体中分离出DNA。通过利用引物对的聚合酶链反应合成出相应的多核苷酸，所述聚合酶链反应容许扩增本发明的opcA基因或opcA等位基因或者本发明的在OpcA多肽氨基酸序列的107、219、233和261位上发生了突变的突变体。优选地从那些突变体中分离出DNA，所述突变体比起始菌株分泌了或在细胞内积累了更多量的氨基酸。
至此，可以从位于本发明的突变的上游和下游的核苷酸序列以及从与之互补的核苷酸序列中选出任一引物对。引物对中的一个引物在此优选地包含选自SEQ ID NO：3的1和652位之间的核苷酸序列中的至少15个、至少18个、至少20个、至少21个或至少24个连续核苷酸。引物对中的相应的第二个引物包含选自SEQ ID NO：3的1600和1118位之间的互补核苷酸序列中的至少15个、至少18个、至少20个、至少21个或至少24个连续核苷酸。如果需要扩增编码区，那么引物对优选地选自SEQ ID NO：3的1和334位之间的核苷酸序列以及选自SEQ ID NO：3的1600和1292位之间的互补核苷酸序列。如果需要扩增部分编码区例如在SEQ ID NO：15和17所示的那部分，那么引物对优选地选自SEQID NO：3的335和652位之间的核苷酸序列以及选自SEQ ID NO：3的1291和1118位之间的互补核苷酸序列。
合适的引物对实例是SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的opcA-A1和opcA-E1引物对以及SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的opcA-int1和opcA-int2引物对。另外，可以给引物提供限制性内切酶的识别位点、生物素基团或现有技术中所述的其他附件。引物的总长度一般不超过30、40、50或60个核苷酸。
在通过PCR扩增方式从最初引入的DNA例如染色体DNA(模板DNA)中扩增所选序列(例如本发明的opcA等位基因)来制备多核苷酸的过程中常常采用热稳定的DNA聚合酶。这种类型的DNA聚合酶的实例是Qiagen(Hilden，Germany)所售的嗜热水生菌(Thermusaquaticus)Taq聚合酶、New England Biolabs(Frankfurt，Germany)所售的嗜热球菌(Thermococcus litoralis)Taq聚合酶、或者Stratagene(La Jolla，USA)所售的激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)Pfu聚合酶。优选的是具有校正活性的聚合酶。校正活性表示这些聚合酶能够识别出错误掺入的核苷酸并且通过更新的聚合作用纠正错误(Lottspeich和Zorbas，Bioanalytik，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany(1998))。具有校正活性的聚合酶的实例是Vent聚合酶和Pfu聚合酶。
根据产商所提供的信息设定反应混合物的条件。产商常常与聚合酶一起提供常用缓冲液，所述缓冲液常常具有浓度为10-100mM的Tris/HCl和浓度为6-55mM的KCl(pH值为7.5-9.3)。如果产商提供的缓冲液不含氯化镁，则加入浓度为0.5-10mM的氯化镁。此外，向反应混合物中加入浓度为0.1-16.6mM的脱氧核苷三磷酸。首先向反应混合物中引入终浓度为0.1-3μM的引物以及最佳拷贝数为102到105个拷贝的模板DNA。也可以使用106到107个拷贝。向反应混合物中加入2-5个单位的合适聚合酶。常用反应混合物的体积为20-100μl。
此外，可以向反应物中加入的添加物是牛血清白蛋白、Tween-20、凝胶、甘油、甲酰胺或DMSO(Dieffenbach和Dveksler，PCR Primer-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA 1995)。
常用的PCR方法(profile)是由三个不同的、连续重复的温度阶段组成的。首先，通过将温度提高到92℃-98℃4到10分钟来开始反应，以便变性最初引入的DNA。随后重复进行以下步骤：首先是在近92-98℃10-60秒变性最初引入的DNA的步骤；然后是引物与最初引入的DNA在特殊温度下结合的步骤，所述特殊温度(退火温度)取决于所述引物，经验上是从50℃到60℃，可以单独地计算出每个引物对的退火温度。技术人员可以在Rychlik等(Nucleic Acids Research 18(21)：6409-6412)中找到关于这方面的详细信息。随后，在每次PCR所示的聚合酶的最佳活性下进行延伸最初引入的引物的合成步骤(延伸)，通常在73℃到67℃、优选从72℃到68℃的范围内进行，取决于聚合酶。该延伸步骤的持续时间取决于聚合酶的性能和待扩增的PCR产品的长度。在经典PCR中，该步骤持续0.5-8分钟，优选的是2-4分钟。这3个步骤重复30到35次，如果合适可以重复50次。最终的4-10分钟的“延伸”步骤终止反应。以这种方式制备出的聚核苷酸也称作扩增子，术语核酸片段也很常用。
技术人员例如在手册“PCR策略”(Innis、Felfand和Sninsky，Academic Press，Inc.，1995)、Diefenbach和Dveksler的教科书“PCR引物-实验室手册”(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)、Gait手册“寡核苷酸合成：实践方法”(IRL Press，Oxford，UK，1984)以及Newton和Graham的“PCR”(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1994)中可以找到进一步的关于PCR的说明和信息。
随后，例如用Sanger等(Proceedings of the National Academies ofSciences，U.S.A.，74，5463-5467(1977))的链终止法和Zimmermann等(Nucleic Acids Research 18，1067pp(1990))所示的修饰可以确定出核苷酸序列，以及分析所述核苷酸序列所编码的多肽，具体地是氨基酸序列。为了实现这个目的，将核苷酸序列输入到用于将DNA序列翻译成氨基酸序列的程序中。合适的程序实例是从专利局例如US专利和商标局(USPTO)可得到的程序“Patentin”和在万维网的WxPASy蛋白质组学服务器上可得到的“翻译工具”(Gasteiger et al.，Nucleic AcidsResearch 31，3784-3788(2003))。
通过这种方式鉴定出突变体，其opcA等位基因编码包含本发明的突变的OpcA多肽。
因此，本发明涉及棒状细菌的突变体，通过下面的步骤可以获得所述突变体：
a)用诱变剂处理能够分泌氨基酸的棒状细菌；
b)分离并繁殖在a)中生成的突变体；
c)优选地确定出所述突变体向培养基分泌或在细胞内部积累的氨基酸的量比a)所采用的棒状细菌至少多0.5％的能力；
d)提供在b)所获得的突变体的核酸；
e)利用来自d)的核酸、由包含选自SEQ ID NO：3的1和334位之间的核苷酸序列中的至少15个连续核苷酸的第一引物和包含选自SEQ ID NO：3的1600和1292位之间的互补核苷酸序列中的至少15个连续核苷酸的第二引物组成的引物对的聚合酶链反应制备出核酸分子/扩增子/核酸片段；
f)确定出在e)中所获得的核酸分子的核苷酸序列以及确定出所编码的氨基酸序列；
g)如果合适，比较在f)中所确定出的氨基酸序列和SEQ IDNO：6；和
h)鉴定出包含编码多肽的多核苷酸的突变体，所述多肽包含一个或多个选自由下面的氨基酸组成的组中的氨基酸：
i)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
ii)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
iii)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
iv)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸。
通过这种方式生成的突变体包括1个拷贝(1)的所述的opcA等位基因中的一种。本发明还涉及在此所述的方法。
SEQ ID NO：5举例描述了本发明的突变体的opcA等位基因的编码区。用SEQ ID NO：1描述野生型基因的编码区。
SEQ ID NO：1包含319到321位的编码氨基酸L-酪氨酸的TAT密码子。SEQ ID NO：5包含319位的核碱基胞嘧啶。该胸腺嘧啶-胞嘧啶转换造成了319到321位的编码氨基酸L-组氨酸的CAT密码子。
SEQ ID NO：1包含655到657位的编码氨基酸L-赖氨酸的AAA密码子。SEQ ID NO：5包含657位的核碱基胞嘧啶。该腺嘌呤-胞嘧啶转换造成了655到657位的编码氨基酸L-天冬酰胺的AAC密码子。
SEQ ID NO：1包含697到699位的编码氨基酸L-脯氨酸的CCA密码子。SEQ ID NO：5包含697位的核碱基胸腺嘧啶。该胞嘧啶-胸腺嘧啶转换造成了697到699位的编码氨基酸L-丝氨酸的TCA密码子。
SEQ ID NO：1包含781到783位的编码氨基酸L-酪氨酸的TAT密码子。SEQ ID NO：5包含781位的核碱基胞嘧啶。该胸腺嘌呤-胞嘧啶转换造成了781到783位的编码氨基酸L-组氨酸的CAT密码子。
另外，SEQ ID NO：5所描述的核苷酸序列还可以包含诱变处理所造成的碱基取代，但是所述碱基取代本身不会改变氨基酸序列。这样的取代在本领域也被称作沉默突变或中性突变。这些沉默突变同样可能已经存在于用于所述诱变处理的棒状细菌中。这些沉默突变的实例是402位的胞嘧啶-胸腺嘧啶转换、600位的胸腺嘧啶-胞嘧啶转换和648位的鸟嘌呤-胞嘧啶转换，如SEQ ID NO：7所述的那样。
用于诱变的棒状细菌优选地已经具有向周围的营养培养基或发酵肉汤内分泌所需氨基酸或者在细胞内部积累所需氨基酸的能力。
产L-赖氨酸的棒状细菌通常具有耐反馈的或去敏感的天冬氨酸激酶。耐反馈的天冬氨酸激酶表示天冬氨酸激酶比野生型对赖氨酸和苏氨酸的混合物或AEC(氨乙基半胱氨酸)和苏氨酸的混合物或单独赖氨酸或单独AEC的抑制作用具有更低的敏感性。编码这些去敏感的天冬氨酸激酶的基因或等位基因也被称作lysCFBR等位基因。现有技术(表1)描述了多种编码天冬氨酸激酶变体的lysCFBR等位基因，所述变体与野生型蛋白相比，其具有氨基酸取代。SEQ ID NO：19描述了NCBI数据库登录号为AX756575的谷氨酸棒杆菌野生型lysC基因的编码区，SEQ IDNO：20描述了所述基因编码的蛋白质。
表1
编码耐反馈的天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因
  等位基因名称   更多信息   参考文献   登录号
  lysCFBR E05108   JP 1993184366-A(序列1)   E05108
  lysCFBR E06825   lysC A279T   JP 1994062866-A(序列1)   E06825
  lysCFBR E06826   lysC A279T   JP 1994062866-A(序列2)   E06826
  lysCFBR E06827   JP 1994062866-A(序列3)   E06827
  lysCFBR E08177   JP 1994261766-A(序列1)   E08177
  lysCFBR E08178   lysC A279T   JP 1994261766-A(序列2)   E08178
  lysCFBR E08179   lysC A279V   JP 1994261766-A(序列3)   E08179
  lysCFBR E08180   lysC S301F   JP 1994261766-A(序列4)   E08180
  lysCFBR E08181   lysC T308I   JP 1994261766-A(序列5)   E08181
  lysCFBR E08182   JP 1994261766-A(序列6)   E08182
  lysCFBR E12770   JP 1997070291-A(序列13)   E12770
  lysCFBR E14514   JP 1997322774-A(序列9)   E14514
  lysCFBR E16352   JP 1998165180-A(序列3)   E16352
  lysCFBR E16745   JP 1998215883-A(序列3)   E16745
  lysCFBR E16746   JP 1998215883-A(序列4)   E16746
  lysCFBR I74588   US 5688671-A(序列1)   I74588
  lysCFBR I74589   lysC A279T   US 5688671-A(序列2)   I74589
  lysCFBR I74590   US 5688671-A(序列7)   I74590
  lysCFBR I74591   lysC A279T   US 5688671-A(序列8)   I74591
  lysCFBR I74592   US 5688671-A(序列9)   I74592
  lysCFBR I74593   lysC A279T   US 5688671-A(序列10)   I74593
  lysCFBR I74594   US 5688671-A(序列儿)   I74594
  lysCFBR I74595   lysC A279T   US 5688671-A(序列12)   I74595
  lysCFBR I74596   US 5688671-A(序列13)   I74596
  lysCFBR I74597   lysC A279T   US 5688671-A(序列14)   I74597
  lysCFBR X57226   lysC S301Y   EP0387527Kalinowski等，Molecular andGeneral  Genetics  224：317-324(1990)   X57226
  lysCFBR L16848   lysC G345D   Follettie和S inskeyNCBI核苷酸数据库(1990)   L16848
  lysCFBR L27125   lysC R320GlysC 345D   Jetten  et  al.，AppliedMicrobiology    Biotechnology43：76-82(1995)   L27125
  lysCFBR   lysC T311I   WO0063388(序列17)
  lysCFBR   lysC S301F   US3732144
  lysCFBR   lysC S381F   EP0435132
  lysCFBR   lysC S317A   US5688671(序列1)
  lysCFBR   lysC T380I   WO 01/49854
分泌L-赖氨酸的棒状细菌通常具有一个或多个表1所列的氨基酸取代。
优选的是下面的lysCFBR等位基因：lysC A279T(苏氨酸取代所编码的天冬氨酸激酶蛋白SEQ ID NO：20的279位的丙氨酸)、lysC A279V(缬氨酸取代所编码的天冬氨酸激酶蛋白SEQ ID NO：20的279位的丙氨酸)、lysC S301F(苯丙氨酸取代所编码的天冬氨酸激酶蛋白SEQ IDNO：20的301位的丝氨酸)、lysC T308I(异亮氨酸取代所编码的天冬氨酸激酶蛋白SEQ ID NO：20的308位的苏氨酸)、lysC S301Y(酪氨酸取代所编码的天冬氨酸激酶蛋白SEQ ID NO：20的308位的丝氨酸)、lysC G345D(天冬氨酸取代所编码的天冬氨酸激酶蛋白SEQ IDNO：20的345位的甘氨酸)、lysC R320G(甘氨酸取代所编码的天冬氨酸激酶蛋白SEQ ID NO：20的320位的精氨酸)、lysC T311I(异亮氨酸取代所编码的天冬氨酸激酶蛋白SEQ ID NO：20的311位的苏氨酸)、lysC S381F(苯丙氨酸取代所编码的天冬氨酸激酶蛋白SEQ ID NO：20的381位的丝氨酸)、和lysC S317A(丙氨酸取代所编码的天冬氨酸激酶蛋白SEQ ID NO：20的317位的丝氨酸)。
特别优选的是lysCFBR等位基因lysC T311I(异亮氨酸取代所编码的天冬氨酸激酶蛋白SEQ ID NO：20的311位的苏氨酸)和包含至少一个选自由A279T(苏氨酸取代所编码的天冬氨酸激酶蛋白SEQ ID NO：20的279位的丙氨酸)和S317A(丙氨酸取代所编码的天冬氨酸激酶蛋白SEQ ID NO：20的317位的丝氨酸)组成的组中的取代的lysCFBR等位基因。
DSMZ所保藏的保藏号为DSM16833的菌株DM1797具有lysCFBR等位基因lysC T311I。DM1797是谷氨酸棒杆菌ATCC13032的突变体。
NRRL所保藏的保藏号为NRRL B-11474的突变体含有包含氨基酸取代A279T的lysCFBR等位基因。
从菌株DM1797开始，用上面所述的方法分离出称作DM1825的突变体，其具有编码OpcA多肽的opcA等位基因，其中氨基酸序列的107位是L-组氨酸、219位是L-天冬酰胺、233位是L-丝氨酸和261位是L-组氨酸。DM1825突变体的opcA等位基因的编码区的核苷酸序列示为SEQ ID NO：7，所编码的多肽的氨基酸序列分别示为SEQ ID NO：8和10。SEQ ID NO：7包含胞嘧啶取代319位的胸腺嘧啶、胸腺嘧啶取代402位的胞嘧啶、胞嘧啶取代600位的胸腺嘧啶、胞嘧啶取代648位的鸟嘌呤、胞嘧啶取代657位的腺嘌呤、胸腺嘧啶取代697位的胞嘧啶和胞嘧啶取代781位的胸腺嘧啶。短语“胞嘧啶取代648位的鸟嘌呤”和相当的短语表示编码区的野生型序列的648位的鸟嘌呤(见SEQ IDNO：1)已经被胞嘧啶所取代(见SEQ ID NO：7)。
SEQ ID NO：9也表示位于SEQ ID NO：7的上游和下游的核苷酸序列。
另外，可以利用分泌L-赖氨酸的棒状细菌，所述细菌具有减活的高丝氨酸脱氢酶或高丝氨酸激酶或者具有现有技术已知的其他性能。
产L-色氨酸的棒状细菌通常具有耐反馈的或去敏感的邻氨基苯甲酸合成酶。术语耐反馈的邻氨基苯甲酸合成酶表示邻氨基苯甲酸合成酶比野生型合成酶对色氨酸或5-氟色氨酸(Matsui et al.，Journal ofBacteriology 169(11)：5330-5332(1987))或相似的类似物的抑制作用具有更低的敏感性(5到10％、10到15％或10到20％)。编码这些去敏感的邻氨基苯甲酸合成酶的基因或等位基因也被称作trpEFBR等位基因。例如，在US 6180373和EP0338474中描述了这种类型的突变体或等位基因的实例。
与所采用的起始菌株或亲代菌株相比较，所获得的突变体在发酵过程中显示出增加了所需氨基酸的分泌或生产。
本发明还涉及编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的OpcA多肽的分离的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包含一个或多个选自由下面的氨基酸组成的组中的氨基酸：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸。
可以从本发明的突变体中分离出本发明的多核苷酸。
此外还可以利用用于诱变opcA基因的体外方法。体外方法的用途包括将包括棒状细菌的opcA基因(优选的是现有技术所述的谷氨酸棒杆菌野生型基因)的分离的多核苷酸进行诱变处理。
分离的多核苷酸例如可以是分离的总DNA或染色体DNA或者是已经通过聚合酶链反应(PCR)制备出的opcA基因的扩增子。这些扩增子也被称作PCR产物；同样可以使用术语核酸片段。技术人员可以在Gait的手册：Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(IRL Press，Oxford，UK，1984)以及Newton和Graham的手册：PCR(SpektrumAkademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1994)中找到关于通过聚合酶链反应扩增DNA序列的说明。同样可以首先将待诱变的opcA基因整合到载体中，例如整合到噬菌体中或整合到质粒中。
合适的体外诱变方法是根据Miller(Miller，J.H.：A Short Course inBacterial Genetics.A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coliand Related Bacteria，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，1992)的羟胺处理、应用诱变寡核苷酸(T.A.Brown：Gentechnologie für Einsteiger[Genetic engineering for beginners]，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，1993和R.M.Horton：PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis，Molecular Biotechnology 3，93-99(1995))和应用利用具有高错误率的DNA聚合酶的聚合酶链反应。这种DNA聚合酶的实例是Stratagene(La Jolla，CA，USA)的MutazymeDNA聚合酶(GeneMorph PCR诱变试剂盒：No.600550)。
可以在现有技术和在已知的遗传学和分子生物学教科书中找到更多的关于在体内或体外生成突变的说明和综述，例如Knippers的教科书(“Molekulare Genetik”，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker的教科书(“Gene and Klone”，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或Hagemann的教科书(“Allgemeine Genetik”，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
本发明还涉及编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的OpcA多肽的分离的多核苷酸，所述氨基酸序列包含一个或多个选自由下面的取代组成的组中的氨基酸取代：
a)用不同的蛋白氨基酸、优选地用L-组氨酸取代107位的L-酪氨酸；
b)用不同的蛋白氨基酸、优选地用L-天冬酰胺取代219位的L-赖氨酸；
c)用不同的蛋白氨基酸、优选地用L-丝氨酸取代233位的L-脯氨酸；
d)用不同的蛋白氨基酸、优选地用L-组氨酸取代261位的L-酪氨酸。
本发明还涉及编码OpcA多肽的分离的多核苷酸，所述OpcA多肽包含长度为319个氨基酸的氨基酸序列并包含一个或多个选自下面氨基酸组的氨基酸：
a)107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
b)219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
c)233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
d)261位点的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸。
本发明还涉及编码OpcA多肽的分离的多核苷酸，所述OpcA多肽的氨基酸序列的107到261位包含对应于SEQ ID NO：6的107到261位的氨基酸序列。所编码的多肽的氨基酸序列优选地包含对应于SEQ IDNO：6的98到270位或SEQ ID NO：6的83到285位或SEQ ID NO：6的63到305位或SEQ ID NO：6的38到315位或SEQ ID NO：6的8到315位或SEQ ID NO：6的2到315位或SEQ ID NO：6的2到317位或SEQID NO：6的2到319位的氨基酸序列。所编码的多肽的长度最优选地包含319个氨基酸。
本发明还涉及编码OpcA多肽的分离的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列具有一个或多个选自下面氨基酸组的氨基酸：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸，
而且所述多核苷酸包含与通过利用引物对的聚合酶链反应(PCR)可获得的多核苷酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，其中所述引物对的每个引物的核苷酸序列都包含选自SEQ ID NO：3的1和334位之间的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸和选自SEQ ID NO：3的1600和1292位之间的互补核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12描述了合适的引物对的实例。优选的起始物质(模板DNA)是已经被诱变剂特别处理过的棒状细菌的染色体DNA。特别优选的是棒杆菌属的染色体DNA，非常特别优选的是谷氨酸棒杆菌的染色体DNA。
本发明还涉及在严格条件下与SEQ ID NO：5或7的互补核苷酸序列杂交并编码OpcA多肽的分离的多核苷酸，所述OpcA多肽的氨基酸序列具有一个或多个选自下面氨基酸组的氨基酸：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸。
技术人员可以在来自Boehringer Mannheim GmbH的手册“The DIGSystem User’s Guide for Filter Hybridization”(Mannheim，Germany，1993)和Liebl等(International Journal of Systematic Bacteriology 41：255-260(1991))中找到关于核酸或多核苷酸杂交的说明。在严格条件下进行杂交，即只有当探针即包含SEQ ID NO：5、7或9的互补核苷酸序列的多核苷酸和靶序列即探针所要处理或鉴定的多核苷酸具有至少90％的相同性时，才会形成杂交体。已知杂交的严格性(包括洗涤步骤的严格性)是受不同的缓冲液组成、温度和盐浓度所影响或决定的。与洗涤步骤相比较，一般以相对低的严格性进行杂交反应(HybaidHybridisation Guide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。
例如，对应于温度为近50℃-68℃的5xSSC缓冲液的缓冲液可以用于杂交反应。在这种情况下，探针也可以和与所采用的探针的核苷酸序列的相同性小于90％的多核苷酸杂交。这种杂交体是较不稳定的，通过在严格条件下进行洗涤将其去除。例如，通过降低盐浓度到2xSSC和如果合适随后降低到0.5xSSC(The DIG System User’s Guide for FilterHybridisation，Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany，1995)以及设定温度为近50℃-68℃、近52℃-68℃、近54℃-68℃、近56℃-68℃、近58℃-68℃、近60℃-68℃、近62℃-68℃、近64℃-68℃、近66℃-68℃可以实现这一点。优选的温度范围是近64℃-68℃或近66℃-68℃。如果合适，可以将盐浓度降低到对应于0.2xSSC或0.1xSSC的浓度。如果合适，SSC缓冲液包括浓度为0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)。通过按每步近1-2℃的幅度逐步地将杂交温度从50℃增加到68℃，可以分离出多核苷酸片段，所述片段与所采用的探针的序列或互补序列具有至少90％或至少91％、优选地至少92％或至少93％或至少94％或至少95％或至少96％、和非常特别优选地至少97％或至少98％或至少99％的相同性，以及所述片段编码包含本发明的氨基酸取代的OpcA多肽。用已知方法确定出通过这种方法所获得的多核苷酸的核苷酸序列。市场上可以得到“试剂盒”形式的关于杂交的进一步的说明(例如DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，Catalog No.1603558)。据此获得的核苷酸序列编码OpcA多肽，所述多肽与氨基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：2具有至少90％、优选地至少92％或至少94％或至少96％、和非常特别优选地至少97％或至少98％或至少99％的相同性，其包含一个或多个本发明的氨基酸取代。
本发明还涉及编码OpcA多肽的分离的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列具有一个或多个选自下面组的氨基酸：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸，
并包含与氨基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：2具有至少90％、优选地至少92％或至少94％或至少96％、和非常特别优选地至少97％或至少98％或至少99％的相同性的氨基酸序列。
本发明还涉及编码OpcA多肽的分离的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列具有一个或多个选自下面组的氨基酸：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；和
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸，
而且所述多核苷酸包含与核苷酸序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：1具有至少90％、优选地至少92％或至少94％或至少96％、和非常特别优选地至少97％或至少98％或至少99％的相同性的核苷酸序列。
SEQ ID NO：7描述了编码本发明的OpcA多肽以及与SEQ ID NO：5的核苷酸序列具有至少99％的相同性的核苷酸序列的多核苷酸的实例。除了用胞嘧啶取代319位的胸腺嘧啶、胞嘧啶取代657位的腺嘌呤、胸腺嘧啶取代697位的胞嘧啶和胞嘧啶取代781位的胸腺嘧啶的核苷酸取代(见SEQ ID NO：5)之外，该opcA等位基因的核苷酸序列还具有用胸腺嘧啶取代402位的胞嘧啶、胞嘧啶取代600位的胸腺嘧啶和胞嘧啶取代648位的鸟嘌呤的核苷酸取代(见SEQ ID NO：7)。短语“用胞嘧啶取代648位的鸟嘌呤”和相当的短语表示野生型编码区序列(见SEQID NO：1)的648位的核碱基鸟嘌呤已经被胞嘧啶所取代(见SEQ IDNO：7)。
本发明还涉及编码OpcA多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：6。如果合适，所编码的多肽包含一个(1)或多个保守氨基酸取代。优选地，多肽包含不超过2个(2)、不超过3个(3)、不超过4个(4)或不超过5个(5)保守氨基酸取代。
本发明还涉及编码opcA多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：6，包含N或C末端的至少1个(1)氨基酸的延伸。该延伸具有不超过50个、40个、30个、20个、10个、5个、3个或2个氨基酸或氨基酸残基。
最后，本发明还涉及编码SEQ ID NO：6的多肽变体的opcA等位基因，所述变体包含一个或多个插入或缺失。这些插入或缺失优选地包含不超过5个、不超过4个、不超过3个或不超过2个氨基酸插入或缺失。
本发明还涉及包含核苷酸序列SEQ ID NO：5、7或9的分离的多核苷酸。
最后，本发明涉及包含DM1825突变体的opcA等位基因的分离的多核苷酸。
此外，本发明涉及包含本发明的opcA等位基因的部分编码区的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在任何情况下都包含部分编码区，所述编码区包含一个或多个本发明的氨基酸取代。术语“部分编码区”表示分离的多核苷酸缺少起始密码子(通常是ATG或GTG)或最后的编码密码子(在现在的情况下是对应于SEQ ID NO：5的955-957位的GTC)或者缺少两者。
更具体而言，包括核酸分子或DNA片段，其编码对应于SEQ IDNO：2的98到270位的至少一个氨基酸序列或者编码对应于SEQ IDNO：2的83到285位的至少一个氨基酸序列或者编码对应于SEQ IDNO：2的63到305位的至少一个氨基酸序列或者编码对应于SEQ IDNO：2的38到315位的至少一个氨基酸序列，所述氨基酸序列包含一个或多个选自下面组的氨基酸取代：
a)用不同的蛋白氨基酸、优选地用L-组氨酸取代SEQ ID NO：2的107位的L-酪氨酸；
b)用不同的蛋白氨基酸、优选地用L-天冬酰胺取代SEQ IDNO：2的219位的L-赖氨酸；
c)用不同的蛋白氨基酸，优选地用L-丝氨酸取代SEQ ID NO：2的233位的L-脯氨酸；
d)用不同的蛋白氨基酸，优选地用L-组氨酸取代SEQ ID NO：2的261位的L-酪氨酸。
优选的是编码对应于SEQ ID NO：6的98到270位或者至少对应于SEQ ID NO：6的83到285位或者至少对应于SEQ ID NO：6的63到305位或者至少对应于SEQ ID NO：6的38到315位或者至少对应于SEQ IDNO：6的8到315位的至少一个氨基酸序列的核酸分子。
SEQ ID NO：15同样描述了编码对应于SEQ ID NO：6的98到270位的氨基酸序列的读码框。SEQ ID NO：16描述了所述读码框编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：16的10位对应于SEQ ID NO：2、4、6、8或10的107位。SEQ ID NO：16的122位对应于SEQ ID NO：2、4、6、8或10的219位。SEQ ID NO：16的136位对应于SEQ ID NO：2、4、6、8或10的233位。SEQ ID NO：16的164位对应于SEQ ID NO：2、4、6、8或10的261位。
非常优选的是包含对应于SEQ ID NO：5或7的292到810位的至少一个核苷酸序列或者对应于SEQ ID NO：5或7的247到855位的至少一个核苷酸序列或者对应于SEQ ID NO：5或7的187到915位的至少一个核苷酸序列或者对应于SEQ ID NO：5或7的112到948位的至少一个核苷酸序列或对应于SEQ ID NO：5或7的22到948位的至少一个核苷酸序列的核酸分子。
SEQ ID NO：15描述了对应于SEQ ID NO：5的292到810位的读码框。SEQ ID NO：16描述了相应的所编码的氨基酸序列。SEQ ID NO：17描述了对应于SEQ ID NO：7的292到810位的读码框。SEQ ID NO：18描述了相应的所编码的氨基酸序列。
另外，本发明的读码框可以包含一个或多个造成一个或多个保守氨基酸取代的突变。突变优选地造成了不超过4％、不超过2％或不超过1％的保守氨基酸取代。本发明的读码框还可以包括一个或多个沉默突变。本发明的读码框优选地包含不超过4％、和特别优选地不超过2％到不超过1％的沉默突变。
本发明的分离的多核苷酸可以用于生成重组微生物菌株，与起始菌株或亲代菌株相比较，其以改良的方式向周围培养基释放氨基酸或者在细胞内部积累氨基酸。
向棒状细菌基因内整合突变的普用方法是等位基因取代，这也称作基因置换。该过程包括向所需的棒状细菌菌株内转移包括目的突变的DNA片段，并通过至少两个重组事件或交换(cross over)事件将所述突变整合到所需菌株的染色体内或者用突变序列置换所述菌株中的基因序列。
Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9，84-87(1991))利用该方法将携带缺失的lysA等位基因整合到谷氨酸棒杆菌染色体中，以取代野生型基因。用同样的方法将携带插入的lysA等位基因整合到谷氨酸棒杆菌染色体中，以取代野生型基因。
Figure A20068001780600391
等(Gene 145，69-73(1994))采用所述方法将缺失整合到谷氨酸棒杆菌hom-thrB操纵子中。Nakagawa等(EP 1108790)和Ohnishi等(Applied Microbiology and Biotechnology58(2)，217-223(2002))采用所述方法从分离的等位基因开始将各种突变整合到谷氨酸棒杆菌染色体中。通过这种方式，Nakagawa等成功地将称作Va159Ala的突变整合到高丝氨酸脱氢酶(hom)中，将称作Thr311Ile的突变整合到天冬氨酸激酶基因(分别是lysC和ask)内、将称作Pro458Ser的突变整合到丙酮酸羧化酶基因内(pyc)以及将称作Ala213Thr的突变整合到谷氨酸棒杆菌菌株的葡糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)中。
本发明的方法可以使用本发明的多核苷酸，其包含例如SEQ ID NO：5或7所述的整个编码区或者其包含部分编码区例如分别如SEQ ID NO：15和17所述的至少编码对应于SEQ ID NO：6的98到270位的氨基酸序列的核苷酸序列。对应于SEQ ID NO：15或17的部分编码区的长度是≥519个核碱基。优选的是那些长度≥747个核碱基的部分编码区，例如分别编码对应于SEQ ID NO：6和8的63到305位的至少一个氨基酸序列的核酸分子。非常特别优选的是那些长度≥834个核碱基的编码区的那些部分，例如分别编码对应于SEQ ID NO：6和8的38到315位的至少一个氨基酸序列的核酸分子。
在所述方法中，包含目的突变的DNA片段通常位于载体内，具体地是位于质粒内，如果有的话，所述质粒优选地只被提供突变的菌株有限程度地复制。所用的可以复制载体的辅助或中间宿主一般是埃希氏菌属细菌，优选的是大肠杆菌。
这种类型的质粒载体的实例是如
Figure A20068001780600401
等(Gene 145，69-73(1994))所述的pK*mob和pK*mobsacB载体例如pK18mobsacB以及在WO 02/070685和WO 03/014362中所述的载体。这些载体在大肠杆菌中是可复制的，但在棒状细菌中不可复制。特别适用的是包含条件显性负作用(negative dominant action)基因的载体，所述基因例如是杆菌属(Bacillus)的sacB基因(果聚糖蔗糖酶基因)或者大肠杆菌的galK基因(半乳糖激酶基因)。(条件显性负作用基因表示基因在特定条件下对宿主是不利的例如有毒的，但是在不同的条件下其对携带该基因的宿主没有负作用)。所述载体使得选择其中载体被清除出染色体的重组事件成为可能。Nakamura等(US-A-6,303,383)还描述了棒状细菌的温度敏感型质粒，其只能在低于31℃的温度下复制。
随后通过接合例如
Figure A20068001780600402
的方法(Journal of Bacteriology 172，1663-1666(1990))或通过转化例如Dunican和Shivnan的方法(Bio/Technology 7，1067-1070(1989))或者Thierbach等的方法(Applied Microbiology and Biotechnology 29，356-362(1988))将载体转移到棒状细菌。如果合适，也可以通过粒子轰击转移DNA。
通过引起整合的第一次交换事件和引起靶基因或靶序列切除形成重组细菌的合适的第二次交换事件的方式可以实现同源重组后的突变整合。
通过利用Southern印迹杂交法、聚合酶链反应、测序、荧光共振能转移法(FRET)(Lay et al.Clinical Chemistry 43，2262-2267(1997))或酶学法等等可以鉴定并表征出所获得的菌株。
因此，本发明还涉及用于制备棒状细菌的方法，其包括：
a)向棒状细菌转移本发明的多核苷酸；
b)用a)的多核苷酸置换编码具有107位的L-酪氨酸、219位的L-赖氨酸、233位的L-脯氨酸和261位的L-酪氨酸的氨基酸序列的opcA基因，所述a)的多核苷酸编码具有一个或多个选自由下面氨基酸组成的组中的氨基酸的氨基酸序列：
i)107位的不同的氨基酸，优选的是L-组氨酸；
ii)219位的不同的氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
iii)233位的不同的氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
iv)261位的不同的氨基酸，优选的是L-丝氨酸；和
c)繁殖通过步骤a)和b)获得的棒状细菌。
通过这种方式获得了重组棒状细菌，其包含取代了野生型opcA基因的本发明的一个(1)opcA等位基因。
本发明的另一个用于制备微生物的方法包括：
a)向微生物转移本发明的多核苷酸，其编码opcA多肽；
b)在所述微生物中复制所述多核苷酸；和
c)繁殖在步骤a)和b)中获得的微生物。
通过这种方式获得了重组微生物，其包括至少一个(1)拷贝或几个拷贝的本发明的多核苷酸，所述多核苷酸编码OpcA多肽，其中所述多肽的氨基酸序列具有一个或多个选自由下面的氨基酸组成的组中的氨基酸：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸。
因此，本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的宿主或宿主细胞，优选地涉及微生物，特别优选地涉及棒状细菌和埃希氏菌属细菌。本发明同样涉及通过使用分离的多核苷酸所制备的微生物。这种微生物或细菌也被称作重组微生物或重组细菌。本发明同样涉及包含本发明的多核苷酸的载体。最后，本发明同样涉及具有所述载体的宿主。
本发明的分离的多核苷酸同样可以用于实现其所编码的多肽的过表达。
过表达一般表示核糖核酸、蛋白质或酶的细胞内浓度或活性的增加。在本发明中，编码OpcA多肽的opcA等位基因或多核苷酸被过表达，其中所述多肽的氨基酸序列具有一个或多个选自由下面的氨基酸组成的组中的氨基酸：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸。
已知宿主内源的酶-“氨基肽酶”-能够切割(cleave)所生成的多肽的N末端氨基酸，具体地是N末端甲硫氨酸。
例如相应的多核苷酸的拷贝数增加至少一个拷贝可以实现所述基因产品的浓度或活性的增加。
增加拷贝数的普用方法包括将合适的基因或等位基因整合到载体中，载体优选地是质粒，其可以被棒状细菌所复制。合适的质粒载体的实例是pZ1(Menkel et al.，Applied and Environmental Microbiology(1989)64：549-554)或Tauch等(Journal of Biotechnology 99，79-91(2002))所述的pSELF载体。在Tauch等(Journal of Biotechnology 104，27-40(2003))中可以找到关于谷氨酸棒杆菌中的质粒的综述文章。
另一个实现过表达的常用方法是染色体基因扩增法。这个方法涉及向棒状细菌的染色体中插入至少一个附加拷贝的目的基因或等位基因。
在一个实施方式中，例如对于在Reinscheid等((Applied andEnvironmental Microbiology 60，126-132(1994)))所述的hom-thrB操纵子而言，在谷氨酸棒杆菌中不可复制的且包含目的基因的质粒被转移到棒状细菌。在通过交换事件的同源重组之后，所形成的菌株包含至少两个拷贝的所述基因或等位基因。
在WO 03/040373和US-2003-0219881-A1所述的另一个实施方式中，通过至少两个重组事件形式将一个或多个拷贝的目的基因插入到了谷氨酸棒状细菌染色体的所需位点。例如，通过这种方式可以将一个拷贝的编码L-赖氨酸不敏感的天冬氨酸激酶lysC等位基因插入到谷氨酸棒杆菌的gluB基因中。
在WO 03/014330和US-2004-0043458-A1所述的另一个实施方式中，在天然基因座上通过至少两个重组事件整合至少另一个拷贝的目的基因(优选地是与已经存在的基因或等位基因串联排列)。通过这种方式例如可以实现天然lysC基因座上的lysCFBR等位基因的串联重复。
另一种实现过表达的方法包括将合适的基因或等位基因与启动子或表达框功能性地(可操纵地连接)连接。在Patek等(Journal ofBiotechnology 104(1-3)，311-323(2003))的综述文章中描述了合适的谷氨酸棒杆菌的启动子实例。此外，还可以使用Amann等(Gene 69(2)，301-315(1988))以及Amann和Brosius(Gene 40(2-3)，183-190(1985))所述的公知的启动子T3、T7、SP6、M13、lac、tac和trc。这种启动子可以被插入到例如重组棒状细菌的本发明的opcA等位基因编码区的上游，通常是在距离起始密码子近1到500或1到334核苷酸的位置处。这种类型的启动子同样可以被天然地插入到本发明的突变体的opcA等位基因的上游。还可以连接本发明的分离的多核苷酸(其编码本发明的opcA多肽的变体)和启动子，并将所获得的表达单位整合到染色体外复制的质粒或整合到棒状细菌的染色体中。
另外，可以突变启动子和调节区或位于结构基因上游的核糖体结合位点。延长mRNA寿命的措施同样可以提高表达。阻止酶蛋白的降解同样还可以增强酶活性。或者，通过改变培养基组成和培养方法还可以过表达所述基因或等位基因。
基于起始微生物或亲代菌株中蛋白质的活性或浓度，过表达措施通常使得所述蛋白质的活性或浓度增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最高到不超过1000％或2000％。起始微生物或亲代菌株表示接受本发明措施的处理的微生物。
通过1维和2维蛋白质凝胶分离和其后用合适的评价软件对凝胶中蛋白质浓度的光学鉴定可以确定出蛋白质的浓度。对于棒状细菌而言，制备蛋白质凝胶和鉴定蛋白质的常用方法是Hermann等(Electrophoresis，22：1712-23(2001))所述的方法。同样可以通过利用对待检测蛋白具有特异性的抗体的Western印迹杂交(Sambrook et al.，Molecular cloning：a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)和其后利用合适的浓度确定软件(Lohaus和Meyer(1998)Biospektrum 5：32-39；Lottspeich，Angewandte Chemie 321：2630-2647(1999))的光学评价法确定出蛋白质浓度。
因此，本发明涉及用于过表达本发明的OpcA多肽的方法。本发明用于过表达的方法包括增加编码OpcA多肽变体的本发明的多核苷酸的拷贝数至少1个(1)或数个拷贝等等，所述变体具有包含一个或多个选自氨基酸组的氨基酸的氨基酸序列：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸。
本发明的另一个方法包括启动子与多核苷酸的功能性连接。
本发明还涉及增加了其细胞内部的本发明的OpcA多肽浓度的微生物。如果合适，所述微生物增强了其细胞内部的葡糖-6-磷酸脱氢酶活性。
提高L-氨基酸产量的附加优点是过表达本发明突变体或重组菌株中的特殊生物合成途径、糖酵解、anaplerotics、柠檬酸循环、戊糖磷酸循环和氨基酸输出的一个或多个酶，如果合适则过表达调节蛋白。通常优选地是使用内源性基因。
“内源性基因”或“内源性核苷酸序列”表示种群中存在的基因或核苷酸序列或等位基因。
因此，可以过表达用于制备L-赖氨酸的一个或多个选自由下面基因组成的组中的基因：
●编码二氢吡啶二羧酸合成酶的dapA基因，例如EP 0197335所述的谷氨酸棒杆菌野生型dapA基因。
●编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因，例如JP-A-09224661和EP-A-1108790所述的谷氨酸棒杆菌野生型zwf基因。
●US-2003-0175911-A1所述的谷氨酸棒杆菌zwf等位基因，其编码其中例如氨基酸序列的243位的L-丙氨酸已经被L-苏氨酸置换或者245位的L-天冬氨酸已经被L-丝氨酸取代的蛋白质。
●编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，例如DE-A-198 31 609和EP1108790所述的谷氨酸棒杆菌野生型pyc基因。
●EP 1 108 790所述的谷氨酸棒杆菌pyc等位基因，其编码其中氨基酸序列的458位的L-脯氨酸已经被L-丝氨酸取代的蛋白质。
●WO 02/31158所述的谷氨酸棒杆菌pyc等位基因，其编码权利要求1的蛋白质，该蛋白质带有一个或多个选自由用L-天冬氨酸置换153位的L-谷氨酸、L-丝氨酸取代位点182的L-丙氨酸、L-丝氨酸取代位点206的L-丙氨酸、L-精氨酸取代227位的L-组氨酸、甘氨酸取代452位的L-丙氨酸和L-谷氨酸取代1120位的L-天冬氨酸组成的组中的氨基酸取代(WO 02/31158的图2A详细说明了丙酮酸羧化酶的两个不同的起始位点，其位点相差17个氨基酸长度。因此，WO 02/31158的权利要求1的153位对应于WO 02/31158的图2A的170位，而权利要求1的182位对应于WO 02/31158的图2A的199位，权利要求1的206位对应于WO 02/31158的图2A的223位，权利要求1的227位对应于WO 02/31158的图2A的244位，权利要求1的452位对应于WO02/31158的图2A的469位，权利要求1的1120位对应于WO 02/31158的图2B的1137位。WO 02/31158的图2A还显示了位点472的G(甘氨酸)对A(丙氨酸)的氨基酸取代。根据图2A，具有N末端序列MTA的蛋白质的472位对应于具有N末端序列MST的蛋白质的455位。WO 02/31158的图2B还显示了具有N末端MTA的蛋白质的1133位的E(谷氨酸)对D(天冬氨酸)的取代。
●编码天冬氨酸激酶的lysC基因，例如EP-A-1108790的SEQID NO：281所述的谷氨酸棒杆菌野生型lysC基因(也见登录号AX120085和120365)和WO 01/00843的SEQ ID NO：25所述的谷氨酸棒杆菌野生型lysC基因(见登录号AX063743)。
●lysCFBR等位基因，具体地如表1所示，其编码耐反馈的天冬氨酸激酶变体。
●编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因，例如DE-A-19548222所述的谷氨酸棒杆菌野生型lysE基因。
●编码Zwa1蛋白的谷氨酸棒杆菌野生型zwa1基因(US6,632,644)。
除了使用本发明的opcA基因的等位基因外，为了生产L-赖氨酸，同时减弱或清除一个或多个选自由下面基因组成的组中的内源性基因也是有利的：
●编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因，例如US 6,586,214和US 6,465,238所述的谷氨酸棒杆菌pgi基因。
●编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因，例如EP-A-0131171所述的谷氨酸棒杆菌hom基因。
●编码高丝氨酸激酶的thrB基因，例如Peoples等(MolecularMicrobiology 2(1988)：63-72))所述的谷氨酸棒杆菌thrB基因。
●编码磷酸果糖激酶的pfkB基因，例如WO 01/00844所述的谷氨酸棒杆菌pfkB基因(序列号57)。
在此上下文中，术语“减弱”表示通过使用弱启动子或使用编码相应的低活性酶的基因或等位基因、或灭活相应的基因或酶(蛋白质)以及如果合适通过组合这些措施降低或消除微生物中相应DNA所编码的一种或多种酶(蛋白)的胞内活性。
作为使用这些用于实现减弱的措施的结果，相应蛋白质的活性或浓度一般被降低到野生型蛋白质的活性或浓度或起始微生物中蛋白质的活性或浓度的0到75％、0到50％、0到25％、0到10％或0到5％。
考虑用于生成减弱的突变是至少一个(1)碱基对或核苷酸的转换、易位、插入和缺失。根据突变所引起的氨基酸取代对酶活性的作用，所述突变被称作错义突变或无义突变。错义突变造成了蛋白质中的给定氨基酸被另一种氨基酸所取代，构成了氨基酸置换，特别是非保守氨基酸取代。该取代损害了蛋白质的功效或活性，并使其降低至0到75％、0到50％、0到25％、0到10％或0到5％的值。无义突变造成了终止密码子位于基因的编码区内，并因此使得翻译被过早地终止。基因内的至少一个碱基对的插入或缺失造成了移码突变，使得整合了不正确的氨基酸或者使得翻译被过早地终止。如果突变使得在编码区内形成了终止密码子，那么这也会造成翻译被过早地终止。
用于生成这些突变的说明属于现有技术以及包含于已知的遗传学和分子生物学教科书中，例如Knippers的教科书(“Molekulare Genetik”[Molecular Genetics]，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker的教科书(“Gene und Klone”[Genes and Clones]，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或Hagemann的教科书(“Allgemeine Genetik”[General Genetics]，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。在现有技术中描述了更多的措施。
通过本发明的措施获得的分离的棒状细菌表现出发酵过程中所需氨基酸的分泌量或产量要比最初采用的起始菌株或亲代菌株的分泌量或产量更高。
“分离的细菌”理解为被分离的或生成的本发明的突变体或重组细菌，特别是棒状细菌，以及包含编码OpcA多肽的opcA等位基因，所述多肽包含一个或多个107、219、233和261位所述的氨基酸取代。
关于选自包括产品浓度(每体积产品)、产品产率(消耗每份碳源所形成的产品)和产品形成(每体积和时间形成的产品)的组中的一个或多个参数或者其它过程参数及其结合，分离的细菌的性能或当使用这些细菌时的发酵过程的性能比起始菌株或亲代菌株的性能或当这些菌株时的发酵过程的性能高至少0.5％、至少1％、至少1.5％、或至少2％。
为了生产L-氨基酸，本发明的分离的棒状细菌可以被连续培养例如PCT/EP2004/008882所述的那样或者被分批或加料分批或重复加料分批不连续地培养。在Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik 1.Einführung indie Bioverfahrenstechnik[Bioprocess Technology 1.Introduction toBioprocess Technology](Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)或Storhas的教科书)Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors andPeripheral Equipment](Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))中可以找到关于已知培养方法的综述。
待用的培养培养基或发酵培养基必须合适地满足给定菌株的需要。美国细菌学学会(Washington D.C.，USA，1981)出版的手册“Manual ofMethods for General Bacteriology”给出了用于培养不同微生物的培养基的描述。术语培养培养基和发酵培养基或培养基可以互换。
所采用的碳源可以是糖类和碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、源自甜菜或甘蔗制品的含蔗糖溶液、淀粉、淀粉水解物和纤维素)、油和脂肪(例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油、脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如甘油、甲醇和乙醇)、和有机酸(例如乙酸)。这些物质可以单独使用或者混合使用。
所采用的氮源可以是有机含氮化合物(例如蛋白胨、酵母提取液、肉浸膏、麦芽提取物、玉米浆、豆粉和尿素)，或无机化合物(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)。氮源可以单独使用或混合使用。
所采用的磷源可以是磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。
培养培养基还必须含有盐例如金属(例如钠、钾、镁、钙和铁)的氯化物或硫酸盐，例如硫酸镁或硫酸铁，它们都是生长所必需的。最后，除了上述物质外，还要使用基本生长物质例如氨基酸(如高丝氨酸)和维生素(如硫胺素、生物素或泛酸)。除此之外，可以向培养培养基中加入合适的各氨基酸的前体。
可以按单次混合物的形式或者在培养期间按合适的方式将上述添加物加入到培养物中。
以合适的方式采用碱性化合物(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水)、或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)，以便控制培养物的pH值。通常将pH值调整到从6.0到9.0，优选的是从6.5到8。可以使用防沫剂(例如脂肪酸聚乙二醇酯)来控制泡沫形成。可以向培养基中加入选择性发挥作用的合适的物质(例如抗生素)，以便保持质粒的稳定性。为了保持有氧条件，将氧气或含氧气体混合物(例如空气)传送到培养物中。也可以使用富集了过氧化氢的液体。如果合适，在正压条件下进行发酵，例如在0.03到0.2MPa的压力下进行。培养物的温度通常是从20℃到45℃，以及优选的是从25℃到40℃。在分批培养中，持续培养直到已经形成了所需氨基酸的最大值。通常在从10个小时到160个小时内实现该目标。在连续培养中，更长的培养时间是可能的。
在US 6,221,636、US 5,840,551、US 5,770,409、US 5,605,818、US5,275,940和US 4,224,409等中描述了合适的发酵培养基。
在现有技术中披露了用于确定L-氨基酸的方法。例如可以通过如Spackman等(Analytical Chemistry，30(1958)，1190)所述的阴离子交换层析以及紧接其后的水合茚三酮衍生作用进行所述分析，或者通过如Lindroth等(Analytical Chemistry(1979)51：1167-1174)所述的反相HPLC进行所述分析。
本发明因此涉及用于制备L-氨基酸的方法，其包括：
a)在合适的培养基中发酵分离的棒状细菌，所述细菌包含编码OpcA多肽的基因，所述多肽具有一个或多个选自由下面的氨基酸组成的组中的氨基酸：
i)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
ii)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
iii)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
iv)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸。
b)L-氨基酸被积累于发酵肉汤内或者积累于分离的棒状细菌的细胞内。
然后收集通过这种方式所制备出的发酵肉汤，并优选地将其进一步加工成固体或液体产品。
发酵肉汤理解为其中微生物在特定的温度下被培养特定时间的发酵培养基。发酵培养基和/或在发酵期间所采用的培养基都含有所有的确保微生物繁殖和所需氨基酸生成的物质或组分。
在发酵结束时，所形成的发酵肉汤因此含有a)微生物细胞繁殖所形成的微生物的生物量；b)在发酵期间已经形成的所需氨基酸；c)在发酵期间已经形成的有机副产品；和d)所采用的一种/几种发酵培养基的成分或添加物例如维生素(如生物素)、氨基酸(如高丝氨酸)、或盐(例如硫酸镁)，这些物质不能被发酵所消耗。
有机副产品包括发酵所采用的微生物所生成的(如果合适)和分泌的(如果合适)除给定的所需L-氨基酸外的物质。这些副产品包括量比所需氨基酸少30％、20％或10％的L-氨基酸。它们也包括带有1到3个羧基的有机酸例如乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸或延胡索酸。最后，它们也包括糖类例如海藻糖。
适用于工业目的的常用发酵肉汤具有从40g/kg到180g/kg或从50g/kg到150g/kg的氨基酸含量。生物量的含量(即干重)一般是从20到50g/kg。
对于氨基酸L-赖氨酸而言，现有技术已经描述了4种主要的不同的产品形式。
一组含L-赖氨酸的产品包括纯化L-赖氨酸的浓缩的、水性的、碱性溶液(EP-B-0534865)。如US 6,340,486和US 6,465,025所述，另一组包括含L-赖氨酸发酵肉汤的水性的、酸性的、含生物量的浓缩物。公知的固体产品组包括纯化的或纯L-赖氨酸的粉状或结晶形式，其通常是以盐例如L-盐酸赖氨酸的形式存在。EP-B-0533039描述了另一组固体产品形式。除L-赖氨酸外，在该文件中所述的产品形式还包含在发酵制备中所用的且没有被消耗掉的大部分添加物，以及如果合适＞0％到100％所采用的微生物的生物量。
相应于不同的产品形式，已知有非常多的用于从发酵肉汤中收集、分离或纯化出L-氨基酸以制备出含L-氨基酸的产品或纯化的L-氨基酸的方法。
主要是离子交换层析法(如果合适，利用活性碳)和用于制备固体的纯L-氨基酸的结晶法。对于赖氨酸而言，这就形成了相应的碱或相应的盐例如一氢氯化物(Lys-HCl)或硫酸赖氨酸(Lys2-H2SO4)。
对于L-赖氨酸而言，EP-B-0534865描述了从发酵肉汤中制备出水性、碱性的含L-赖氨酸溶液的方法。在所述的方法中，从发酵肉汤中分离出生物量并将其舍弃。用碱例如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵调节pH值到9和11之间。在浓缩和冷却之后，通过结晶法从肉汤中分离出矿物质组分(无机盐)，将其用作肥料或舍弃。
在利用本发明的细菌制备赖氨酸的方法中，优选的是那些形成了含有发酵肉汤成分的产品的方法。这些产品特别适用作动物饲料添加剂。
根据要求，可以通过分离方法(例如离心、过滤或倾析、或这些方法的组合)完全或部分去除发酵肉汤中的生物量，或者所有的生物量都可以留在发酵肉汤内。如果合适，在合适的处理步骤中，例如通过热处理(加热)或通过加酸灭活生物量或含生物量的发酵肉汤。
生物量的化学组分是细胞被膜，例如肽聚糖和阿拉伯半乳聚糖、蛋白质或多肽(例如葡糖-6-磷酸脱氢酶多肽)、脂质和磷脂和核酸(DNA和RNA)(例如含有本发明突变的多核苷酸)，等等。作为灭活措施和/或进一步处理步骤(例如酸化、喷雾干燥、颗粒化等)的结果，核酸通常是长度为≥40-60bp、＞60-80bp、＞80-100bp、＞100-200bp、＞200-300bp、＞300-400bp、＞400-500bp、＞500-750bp、＞750-1000bp、＞1000-1250bp、＞1250-1500bp、＞1500-1750bp、＞1750-2000bp、＞2000-2500bp、＞2500-3000bp、＞3000-4000bp、＞4000-5000bp的片段形式。
在一个方法中，完全或实际上完全去除了生物量，使得没有(0％)或最多30％、最多20％、最多10％、最多5％、最多1％或最多0.1％的生物量残留于所制备的产品内。在另一个方法中，没有去除生物量或者只去除了痕量生物量，使得所有(100％)或超过70％、80％、90％、95％、99％或99.9％生物量仍残留于所制备的产品内。在本发明的一个方法中，因此去除了比例从≥0％到≤100％的生物量。
最后，在完全或部分去除生物量之前或之后，可以用无机酸(例如盐酸、硫酸或磷酸)、或有机酸(例如丙酸)将在发酵后所获得的发酵肉汤调整为酸性pH值(GB 1,439,728或EP 1 331 220)。当发酵肉汤含有全部生物量时，同样可以酸化发酵肉汤(US 6,340,486或US 6,465,025)。最后，通过加入亚硫酸氢钠(NaHSO3，GB 1,439,728)或另一种盐(例如亚硫酸的铵、碱金属或碱土金属盐)也可以稳定肉汤。
当分离出生物量时，可以部分或全部去除可能存在于发酵肉汤内的有机或无机固体。至少一些(＞0％)、优选地至少25％、特别优选地至少50％和非常特别优选地至少75％的溶解于发酵肉汤中的有机副产品和溶解于其中但未消耗掉的发酵培养基的成分(添加物)仍残留于产品内。如果合适，这些副产品和成分也完全(100％)或几乎完全即＞95％或＞98％地残留于产品内。在这种意义上，术语“发酵肉汤基底(fermentation broth basis)”表示包含至少一部分发酵肉汤成分的产品。
之后，用已知的方法(例如使用旋转式蒸发器、薄膜蒸发器或降膜式蒸发器、或反向渗透或纳米过滤的方式)从肉汤中萃取出水或者增稠或浓缩肉汤。然后可以利用冷冻干燥法、喷雾干燥法或喷雾颗粒化法或利用其他方法(例如在PCT/EP2004/006655所述的循环流化床法)将浓缩的发酵肉汤加工成可流动的产品，具体地是加工成细分粉末或优选地加工成粗糙颗粒。如果合适，通过筛选或除尘方式从所形成的颗粒中分离出所需的产品。
同样可以直接干燥发酵肉汤，即在没有任何先前的浓缩时就直接进行喷雾干燥或喷雾颗粒化。
“可流动的”理解为表示可以不受阻碍地从一系列具有不同大小的排出孔径的玻璃排出管中排出的粉末，即粉末至少可以不受阻碍地从5mm(毫米)孔径的管中排出(Klein：Seifen，
Figure A20068001780600541
，Fette，Wachse[Soaps，Oils，Fats and Waxes]94，12(1968))。
“细分”表示大多数粉末(＞50％)的粒度为直径从20到200μm。
“粗糙”表示大多数产品(＞50％)的粒度为直径从200到2000μm。
利用激光衍射光谱法可以确定粒度。R.H.Müller和R.Schuhmann、Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart(1996)的教科书“ in der Laborpraxis”[Particle Size Measurementin Laboratory Practice]或者M.Rhodes、Wiley&Sons(1998)的教科书“Introduction to Particle Technology”描述了相应的方法。
通过合适的压缩或颗粒化方法可以将可流动的、细分粉末依次转化成粗糙的、易流动的、可储存的以及很大程度上无尘的产品。
术语“无尘”表示产品只含有小比例(＜5％)的直径小于100μm的粒度。
在本发明的意义中，“可储存的”表示产品可以在干燥和阴凉的环境下被储存至少1(1)年或更长，优选的是至少1.5年或更长，特别优选的是至少2(2)年或更长，且没有给定氨基酸的任何显著丢失(＜5％)。
本发明因此也涉及用于从发酵肉汤中制备含L-氨基酸(优选的是L-赖氨酸或L-色氨酸)的产品(优选的是动物饲料添加剂)的方法，所述方法的特征在于以下步骤：
a)在发酵培养基中培养和发酵分泌L-氨基酸的棒状细菌，所述细菌具有至少一个编码OpcA多肽的opcA等位基因，所述多肽具有一个或多个选自由下面的氨基酸组成的组中的氨基酸：
i)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
ii)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
iii)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；
iv)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸。
b)去除0到100％重量的在发酵期间所形成的生物量，和
c)干燥在a)和/或b)中所获得的发酵肉汤，以便获得所需粉末形式或颗粒形式的产品。
如果合适，在步骤b)或c)之前，可以加入选自由硫酸、磷酸或盐酸组成的组中的酸。
优选地，在步骤a)或b)之后，去除含L-氨基酸的发酵肉汤中的水(浓缩)。
使用常用的在食品或饲料加工中常被用作结合剂、胶凝剂或增稠剂的物质的有机或无机辅料或载体物质(例如淀粉、凝胶、纤维素衍生物或相似的物质)、或与颗粒化或压缩(compact)相关的其他物质(例如硅酸、硅酸盐(EP0743016A)或硬脂酸盐)是有利的。
如WO 04/054381所述的那样，为所形成的颗粒的表面提供油更加有利。可以使用的油是矿物油、植物油或植物油的混合物。这些油的实例是大豆油、橄榄油和大豆油/卵磷脂混合物。通过同样的方式，硅油、聚乙二醇或羟乙基纤维素也是适用的。用所述油处理表面增加了产品的耐磨性以及降低了含尘量。产品中的油含量是饲料添加剂总量的0.02到2.0％重量、优选的是0.02到1.0％重量以及特别优选的是0.2到1.0％重量。
优选地，产品具有含量≥97％重量的直径从100到1800μm的粒度或者含量≥95％重量的直径从300到1800μm的粒度。粉尘即粒度＜100μm的颗粒的含量优选地是＞0到1％重量，特别优选的是最多0.5％重量。
或者，但是，产品也可以被吸附到有机的或无机的载体物质上，所述物质是饲料加工中已知的和惯用的物质，例如硅酸、硅酸盐、麦芽、糠、粗粉、淀粉、糖等，和/或产品可以被惯用的增稠剂或结合剂混合和稳定。在文献(Die Mühle+Mischfuttertechnik[The Grinding Mill+Mixed Feed Technology]132(1995)49，page 817)中描述了这个方面的应用实例和方法。
最后，通过如DE-C-4100920所述的利用膜成形剂(例如金属碳酸盐、硅酸、硅酸盐、藻酸盐、硬脂酸盐、淀粉、橡胶和纤维素醚)的涂敷法也可以将产品加工成其对动物胃(特别是反刍动物的胃)的消化作用保持稳定的状态。
为了设定产品中所需的氨基酸浓度，根据需要可以在加工期间加入适当的氨基酸，所述氨基酸可以是浓缩物形式或者很大程度上的纯物质形式或者是其液体或固体形式的盐。可以将后者单独地或混合地加入到所形成的发酵肉汤内或者加入到浓缩的发酵肉汤内，或者可以在干燥过程或颗粒化过程期间加入。
对于赖氨酸而言，优选地在制备含赖氨酸产品期间调整离子比例，使得根据下面公式计算出的离子比例的数值是从0.68到0.95，优选的是从0.68到0.90，如Kushiki等在US 20030152633中所述的那样：
2×[SO4 2-]+[Cl-]-[NH4 +]-[Na+]-[K+]-2×[Mg+]-2×[Ca2+]/[L-Lys]。
对于赖氨酸而言，已经通过这种方式制备出的基于发酵肉汤的固体产品的赖氨酸含量(赖氨酸碱)是产品干重的10％重量到70％重量或20％重量到70％重量，优选的是30％重量到70％重量和非常特别优选的是40％重量到70％重量。使得赖氨酸碱的最大含量达到71％重量、72％重量或73％重量也是可能的。
对于电中性氨基酸例如L-色氨酸而言，已经通过这种方式制备出的基于发酵肉汤的固体产品的氨基酸含量是至少5％重量、10％重量、20％重量或30％重量以及最大50％重量、60％重量、70％重量、80％重量、90％重量或最高95％重量。
固体产品的含水量最高是5％重量，优选的是最高4％重量，特别优选的是小于3％重量。
本发明因此涉及基于发酵肉汤的含L-赖氨酸的动物饲料添加剂，其具有下面的特点：
a)赖氨酸含量(碱)是至少10％重量到不超过73％重量；
b)含水量最高为5％重量，和
c)生物量含量对应于发酵肉汤所具有的生物量的至少0.1％，所述生物量是本发明的棒状细菌所形成的，且任选地是灭活的。
本发明还涉及基于发酵肉汤的含L-色氨酸的动物饲料添加剂，其具有下面的特点：
a)色氨酸含量是至少5％重量到不超过95％重量；
b)含水量最高为5％重量，和
c)生物量含量对应于发酵肉汤所具有的生物量的至少0.1％，所述生物量是本发明的棒状细菌所形成的，且任选地是灭活的。
被称作DM1797以及包含其天冬氨酸激酶的氨基酸取代lysC T311I的谷氨酸棒杆菌突变体于2004年10月28日被保藏于德国微生物菌种保藏中心[German Collection of Microorganisms and Cell Cultures](DSMZ，Brunswick，Germany)，保藏号为DSM 16833。
包含OpcA多肽氨基酸序列的107位的L-组氨酸、219位的L-组氨酸、233位的L-脯氨酸和261位的L-酪氨酸的本发明的谷氨酸棒杆菌突变体DM1825于2005年4月5日被保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ，Brunswick，Germany)，保藏号为DSM 17223。
实施例1
诱变产L-赖氨酸的菌株DM1797
谷氨酸棒杆菌DM1787用作以N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱变的亲代菌株。菌株DM1797是谷氨酸棒杆菌ATCC13032的耐氨乙基半胱氨酸突变体，其已经被保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)，保藏号为DSM16833。
菌株DM1797在Certomat BS-1型旋转振荡器(B.Braun BiotechInternational，Melsungen，Germany)上的100ml锥形瓶的10ml LB肉汤(Merck，Darmstadt，Germany)中33℃、200rpm培养24小时。然后离心去除培养物，将沉淀(pellet)重悬于10ml 0.9％NaCl溶液中，再次离心去除所获得的悬浮液，将所获得的沉淀收集于10ml 0.9％NaCl溶液中。在摇晃器上(见上)用400μg/ml MNNG、30℃、200prm处5ml这种细胞悬浮液15分钟。然后离心诱变混合物，将沉淀收集于10ml 2％硫代硫酸钠0.9％NaCl缓冲液(pH＝6.0)。然后，用0.9％NaCl按1∶1000、1∶10000和1∶100000的比例稀释细胞悬浮液，然后将一部分铺板(plate)于脑心琼脂(Merck，Darmstadt，Germany)上。通过这种方法分离到近2500个突变体。
实施例2
DM1797菌株突变体的性能测定
将实施例1中获得的突变体培养在适于生产赖氨酸的营养培养基中，并确定培养物上清液中的赖氨酸含量。
为此，首先将克隆在脑心琼脂板(Merck，Darmstadt，Germany)上、33℃下繁殖24个小时。从这些琼脂板培养物开始，每个接种预培养物(100ml锥形瓶中的10ml培养基)。预培养所用的培养基是MM。将预培养物在振荡器上33℃、240rpm孵育24个小时。用该预培养物接种主培养物，使得主培养物的起始OD(660nm)是0.1。主培养物也使用MM培养基。
MM培养基：
CSL                     5g/l
MOPS                    20g/l
葡萄糖(分开高压灭菌)    50g/l
盐：
(NH4)2SO4               25g/l
KH2PO4                  0.1g/l
MgSO4*7H2O              1.0g/l
CaCl2*2H2O              10mg/l
FeSO4*7H2O              10mg/l
MnSO4*H2O               5.0mg/l
生物素(无菌过滤)        0.3mg/l
硫胺*HCl(无菌过滤)      0.2mg/l
CaCO3                   25g/l
用氨水将CSL(玉米浆)、MOPS(morpholinopropanesulfonicacid，吗啉基丙磺酸)和盐溶液的pH值调整到7，并将其高压灭菌。之后，加入无菌底物和维生素溶液及经高压灭菌的干燥状态的CaCO3。
在100ml带挡板的锥形瓶的10ml培养基中进行培养。温度是33℃，转数是250rpm以及大气湿度是80％。
在24小时之后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich，Germany)在测量波长660nm处确定光密度(OD)。利用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)的氨基酸分析仪通过离子交换层析法和柱后衍生及水合茚三酮检测确定出所产生的赖氨酸的量。以增加赖氨酸产生为显著特点的一个突变体被称作DM1825。
表1
  菌株   OD(660)  赖氨酸-HCl(g/l)
  DM1797   12.3   3.5
  DM1825   12.2   3.7
实施例3
DM1825突变体的opcA基因的测序
通过Eikmanns等(Microbiology 140：1817-1828(1994))的方法从DM1825克隆中分离出染色体DNA。用聚合酶链反应扩增出携带有opcA基因的DNA片段。至此，将下面的寡核苷酸作为引物：
opcA-A1(SEQ ID NO：11)：5`cacctggcgc aggccataat 3`opcA-E1(SEQ ID NO：12)：5`cgcgtgcgcg tactacatca 3`
用MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成所示引物。所述引物使得能够扩增出携带有opcA基因的近1.05kb DNA片段。opcA-A1引物与对应于SEQ ID NO：3互补链的302到321位的区域结合。opcA-E1引物与对应于SEQ ID NO：3链的1335到1316位的区域结合。
用Phusion高保真DNA聚合酶(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)进行PCR反应。根据产商说明制备反应混合物，总体积为50μl的反应混合物包含10μl所加入的5x Phusion HF缓冲液、每种浓度为200μM的脱氧核苷三磷酸、浓度为0.5μM的引物、近50ng模板DNA和2单位Phusion聚合酶。通过加入水将体积调整到50μl。
首先将PCR混合物在98℃进行初始变性30秒钟。紧接着的是35个重复的98℃下20秒钟的变性步骤、60℃下20秒钟的引物与模板DNA的退火步骤和72℃下60秒钟的延伸引物的延伸步骤。在72℃下5分钟的终末延伸步骤之后，将PCR混合物进行琼脂糖凝胶电泳(0.8％琼脂糖)。鉴定出长度为近1.85kb的DNA片段，将其从凝胶中分离出来，并用Qiagen(Hilden，Germany)的QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。
用Agowa(Berlin，Germany)确定出所扩增的DNA片段或PCR产物的核苷酸序列。SEQ ID NO：7显示了所获得的opcA等位基因的编码区序列。SEQ ID NO：8显示了用Patentin程序所生成的相应的葡糖-6-磷酸脱氢酶蛋白的氨基酸序列。
DM1825突变体的opcA等位基因编码区的核苷酸序列包含319位的胞嘧啶、657位的胞嘧啶、697位的胸腺嘧啶和781位的胞嘧啶(见SEQ ID NO：5)。野生型基因(见SEQ ID NO：1)包含319位的胸腺嘧啶、657位的腺嘌呤、697位的胞嘧啶和781位的胸腺嘧啶。这些核碱基取代造成了所形成的氨基酸序列(比较SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6)中107、219、233和261位的氨基酸取代。这些突变在下文被称作opcAY107H、opcAK219N、opcAP233S和opcAY261H。此外，DM1825的opcA等位基因也包含402、600和648位的3个其他的核苷酸取代(见SEQ ID NO：7)，这些突变不会造成氨基酸取代(“沉默突变”)。
实施例4
置换载体pK18mobsacB_opcAaa4ex的构建
用聚合酶链反应扩增出包含opcA等位基因编码区的片段，所述编码区携带有突变opcAY107H、opcAK219N、opcAP233S和opcAY261H。实施例3所获得的染色体DNA作为模板。实施例3所用的寡核苷酸opcA-A1(SEQ ID NO：11)和opcA-E1(SEQ ID NO：12)被选作引物。
用Phusion高保真DNA聚合酶(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)进行PCR反应。如上组成反应混合物。如上进行PCR，除了一个例外：35个重复的72℃延伸步骤每个只进行30秒钟。
用Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)的Zero Blunt TOPO试剂盒将所扩增的带有DM1825 opcA等位基因编码区的近1.05kb DNA片段连接于pCR
Figure A20068001780600621
Blunt II-TOPO载体内。之后，根据试剂盒产商(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的说明，用连接混合物转化大肠杆菌菌株Top10(Grant et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)。通过将转化混合物铺板在加有25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Merck，Darmstadt，Germany)上选择出携带质粒的细胞。用Qiagen(Hilden，Germany)的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离出质粒DNA，并且通过限制性内切酶BamHI和EcoRI各处理1次以及之后的琼脂糖凝胶电泳(0.8％)检查DNA。质粒被称作pCRII_opcAaa4ex，图1显示了该质粒。
用限制性内切核酸酶EcoRI处理质粒，并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳的方式进行分级分离。随后从凝胶中分离出经这种方式的切割所去除的近1.05kb片段，并用Qiagen的QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。
通过这种方式纯化出的DNA片段包含所述的opcA突变，并且具有EcoRI相兼容末端(opcAaa4ex片段)。然后，将其整合到如
Figure A20068001780600622
等(Gene，145，69-73(1994))所述的可移动载体pK18mobsacB内，以便制备出可能的等位基因或突变取代。为此，用限制性内切酶EcoRI消化质粒pK18mobsacB，用碱性磷酸酶(碱性磷酸酶，Boehringer Mannheim，Germany)将其末端去磷酸化。将通过这种方式制备出的载体与opcAaa4ex片段混合，并用Ready-To-Go T4 DNA连接酶试剂盒(Amersham-Pharmacia，Freiburg，Germany)处理混合物。
随后，用连接混合物(Hanahan，In.DNA cloning.A practicalapproach.Vol.1.ILR-Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)转化大肠杆菌菌株S17-1(Simon et al.，Bio/Technologie 1：784-791，1993)。通过将转化混合物铺板在加有25mg/l卡那霉素的LB琼脂上(Sambrook etal.，Molecular Cloning：a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor，New York，1989)选择携带质粒的细胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并且通过酶BamHI和EcoRI各限制性酶切1次以及紧接其后的琼脂糖凝胶电泳检查DNA。质粒被称作pK18mobsacB_opcAaa4ex，图2显示了该质粒。
实施例5
向DM1797菌株内整合突变opcAY107H、opcAK219N、opcAP233S和opcAY261H
遵照
Figure A20068001780600631
等(Journal of Microbiology 172：1663-1666(1990))的方案，通过接合将实施例4所述的pK18mobsacB_opcAaa4ex载体转移到所述的谷氨酸棒杆菌菌株DM1797内。所述载体在DM1797内不能自我复制，并且只有当重组事件使得其被整合到染色体内时，其才能被保持在细胞内。通过将接合混合物铺板于加有25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB琼脂上来进行转接合子(即含有整合了的pK18mobsacB opcAaa4ex的克隆)的选择。然后，将耐卡那霉素的转接合子划线接种到加有卡那霉素(25mg/l)的LB琼脂板上，并在33℃下孵育24小时。通过将未选择的克隆在LB液体培养基中培养30小时，然后将其划线接种到加有10％蔗糖的LB琼脂上，并在33℃下孵育24小时，以便选择出其中质粒已经被第二次重组事件切掉的突变体。
与起始质粒pK18mobsacB相同，除了卡那霉素耐药基因外，质粒pK18mobsacB opcAaa4ex还包含一个拷贝的编码枯草杆菌果聚糖蔗糖酶的sacB基因。蔗糖可诱导的sacB基因的表达使得形成了果聚糖蔗糖酶，其催化了对谷氨酸棒状细菌有毒的产物果聚糖的合成。因此，只有那些其中所整合的pK18mobsacB_opcAaa4ex已经被第二次重组事件所切掉的克隆才能在加有蔗糖的LB琼脂上生长。根据第二次重组事件相对于突变位点的位置，切割使得等位基因取代或突变整合或原始拷贝仍保留在宿主染色体内。
随后，筛选出其中已经发生了所需突变即整合了突变opcAY107H、opcAK219N、opcAP233S和opcAY261H的克隆。为此，确定出20个具有“在蔗糖存在的情况下生长”和“在卡那霉素存在的情况下不生长”表型的克隆的opcA基因的序列。通过这种方式鉴定出了带有突变opcAY107H、opcAK219N、opcAP233S和opcAY261H的克隆。该菌株被称作谷氨酸棒杆菌DM1797_opcAaa4ex。
实施例6
DM1797_opcAaa4ex菌株性能和DM1797亲代菌株性能的比较。
如实施例2所述的进行性能测定。与DM1797相比较，DM1797_opcAaa4ex菌株表现出赖氨酸分泌的增加，这与DM1825(见表1)相似。
附图说明：
图1：质粒pCRIi_opcAaa4ex的图谱。
图2：质粒pK18mobsacB_opcAaa4ex的图谱。
所用的简写和名称具有下面的含义。给定的碱基对数(bp)是在测量的可重复性内所得到的近似值。
pUC       pUC复制起点
Kan：     卡那霉素耐药基因
EcoRI：   EcoRI限制性酶切位点
BamHI：   BamHI限制性酶切位点
opcA：    所克隆的包含DM1825突变体的opcA等位基因编码区的
DNA片段
sacB：    sacB基因
RP4-mob： 具有转移复制起点(oriT)的mob区
oriV：    复制起点V
序列表
<110>德古萨有限责任公司
<120>棒状细菌opcA基因的等位基因
<130>050109BT
<160>20
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>960
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(957)
<223>opcA Wildtyp-Gen
<400>1
atg atc ttt gaa ctt ccg gat acc acc acc cag caa att tcc aag acc     48
Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thr
1               5                   10                  15
cta act cga ctg cgt gaa tcg ggc acc cag gtc acc acc ggc cga gtg     96
Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly Arg Val
            20                  25                  30
ctc acc ctc atc gtg gtc act gac tcc gaa agc gat gtc gct gca gtt    144
Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val
        35                  40                  45
acc gag tcc acc aat gaa gcc tcg cgc gag cac cca tct cgc gtg atc    192
Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile
    50                  55                  60
att ttg gtg gtt ggc gat aaa act gca gaa aac aaa gtt gac gca gaa    240
Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu
65                  70                  75                  80
gtc cgt atc ggt ggc gac gct ggt gct tcc gag atg atc atc atg cat    288
VaL Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile Met His
                85                  90                  95
ctc aac gga cct gtc gct gac aag ctc cag tat gtc gtc aca cca ctg    336
Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln Tyr Val Val Thr Pro Leu
            100                 105                 110
ttg ctt cct gac acc ccc atc gtt gct tgg tgg cca ggt gaa tca cca    384
Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro
        115                 120                 125
aag aat cct tcc cag gac cca att gga cgc atc gca caa cga cgc atc    432
Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile
    130                 135                 140
act gat gct ttg tac gac cgt gat gac gca cta gaa gat cgt gtt gag    480
Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu
145                 150                 155                 160
aac tat cac cca ggt gat acc gac atg acg tgg gcg cgc ctt acc cag    528
Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln
                165                 170                 175
tgg cgg gga ctt gtt gcc tcc tca ttg gat cac cca cca cac agc gaa    576
Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu
            180                 185                 190
atc act tcc gtg agg ctg acc ggt gca agc ggc agt acc tcg gtg gat    624
Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp
        195                 200                 205
ttg gct gca ggc tgg ttg gcg cgg agg ctg aaa gtg cct gtg atc cgc    672
Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg
    210                 215                 220
gag gtg aca gat gct ccc acc gtg cca acc gat gag ttt ggt act cca    720
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
ctg ctg gct atc cag cgc ctg gag atc gtt cgc acc acc ggc tcg atc    768
Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile
                245                 250                 255
atc atc acc atc tat gac gct cat acc ctt cag gta gag atg ccg gaa    816
Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu
            260                 265                 270
tcc ggc aat gcc cca tcg ctg gtg gct att ggt cgt cga agt gag tcc    864
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser
        275                 280                 285
gac tgc ttg tct gag gag ctt cgc cac atg gat cca gat ttg ggc tac    912
Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
    290                 295                 300
cag cac gca cta tcc ggc ttg tcc agc gtc aag ctg gaa acc gtc taa    960
Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305                 310                 315
<210>2
<211>319
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>2
Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly Arg Val
            20                  25                  30
Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val
        35                  40                  45
Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile
    50                  55                  60
Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu
65                  70                  75                  80
Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile Met His
                85                  90                  95
Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln Tyr Val Val Thr Pro Leu
            100                 105                 110
Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro
        115                 120                 125
Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile
    130                 135                 140
Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu
145                 150                 155                 160
Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln
                165                 170                 175
Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu
            180                 185                 190
Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp
        195                 200                 205
Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg
    210                 215                 220
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile
                245                 250                 255
Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu
            260                 265                 270
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser
        275                 280                 285
Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
    290                 295                 300
Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305                 310                 315
<210>3
<211>1600
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(335)..(1291)
<223>opcA Wildtyp-Gen
<400>3
gtgtgctcat ccgcttcggt tccaaggttc caggttctgc catggaagtc cgtgacgtca     60
acatggactt ctcctactca gaatccttca ctgaagaatc acctgaagca tacgagcgcc    120
tcattttgga tgcgctgtta gatgaatcca gcctcttccc taccaacgag gaagtggaac    180
tgagctggaa gattctggat ccaattcttg aagcatggga tgccgatgga gaaccagagg    240
attacccagc gggtacgtgg ggtccaaaga gcgctgatga aatgctttcc cgcaacggtc    300
acacctggcg caggccataa tttaggggca aaaa atg atc ttt gaa ctt ccg gat    355
                                      Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp
                                       1              5
acc acc acc cag caa att tcc aag acc cta act cga ctg cgt gaa tcg      403
Thr Thr Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thr Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser
        10                 15                 20
ggc acc cag gtc acc acc ggc cga gtg ctc acc ctc atc gtg gtc act      451
Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly Arg Val Leu Thr Leu Ile Val Val Thr
    25                 30                 35
gac tcc gaa agc gat gtc gct gca gtt acc gag tcc acc aat gaa gcc      499
Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala
40                 45                 50                 55
tcg cgc gag cac cca tct cgc gtg atc att ttg gtg gtt ggc gat aaa      547
Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile Ile Leu Val Val Gly Asp Lys
                60                 65                 70
act gca gaa aac aaa gtt gac gca gaa gtc cgt atc ggt ggc gac gct      595
Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala
            75                 80                 85
ggt gct tcc gag atg atc atc atg cat ctc aac gga cct gtc gct gac      643
Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile Met His Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp
        90                  95                  100
aag ctc cag tat gtc gtc aca cca ctg ttg ctt cct gac acc ccc atc      691
Lys Leu Gln Tyr Val Val Thr Pro Leu Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile
    105                 110                 115
gtt gct tgg tgg cca ggt gaa tca cca aag aat cct tcc cag gac cca     739
Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro
120                 125                 130                 135
att gga cgc atc gca caa cga cgc atc act gat gct ttg tac gac cgt     787
Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg
                140                 145                 150
gat gac gca cta gaa gat cgt gtt gag aac tat cac cca ggt gat acc     835
Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr
            155                 160                 165
gac atg acg tgg gcg cgc ctt acc cag tgg cgg gga ctt gtt gcc tcc     883
Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser
        170                 175                 180
tca ttg gat cac cca cca cac agc gaa atc act tcc gtg agg ctg acc     931
Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr
    185                 190                 195
ggt gca agc ggc agt acc tcg gtg gat ttg gct gca ggc tgg ttg gcg     979
Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala
200                 205                 210                 215
cgg agg ctg aaa gtg cct gtg atc cgc gag gtg aca gat gct ccc acc    1027
Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr
                220                 225                 230
gtg cca acc gat gag ttt ggt act cca ctg ctg gct atc cag cgc ctg    1075
Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu
            235                 240                 245
gag atc gtt cgc acc acc ggc tcg atc atc atc acc atc tat gac gct    1123
Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala
        250                 255                 260
cat acc ctt cag gta gag atg ccg gaa tcc ggc aat gcc cca tcg ctg    1171
His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu
    265                 270                 275
gtg gct att ggt cgt cga agt gag tcc gac tgc ttg tct gag gag ctt    1219
Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu
280                 285                 290                 295
cgc cac atg gat cca gat ttg ggc tac cag cac gca cta tcc ggc ttg    1267
Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr Gln His Ala Leu Ser Gly Leu
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tcc agc gtc aag ctg gaa acc gtc taaggagaaa tacaacacta tggttgatgt   1321
Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
            315
agtacgcgca cgcgatactg aagatttggt tgcacaggct gcctccaaat tcattgaggt  1381
tgttgaagca gcaactgcca ataatggcac cgcacaggta gtgctcaccg gtggtggcgc  1441
cggcatcaag ttgctggaaa agctcagcgt tgatgcggct gaccttgcct gggatcgcat  1501
tcatgtgttc ttcggcgatg agcgcaatgt ccctgtcagt gattctgagt ccaatgaggg  1561
ccaggctcgt gaggcactgt tgtccaaggt ttctatccc                         1600
<210>4
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<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
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Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly Arg Val
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Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val
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Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile
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Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu
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Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile Met His
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Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln Tyr Val Val Thr Pro Leu
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Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro
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Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu
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Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg
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Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val
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att ttg gtg gtt ggc gat aaa act gca gaa aac aaa gtt gac gca gaa    240
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aag aat cct tcc cag gac cca att gga cgc atc gca caa cga cgc atc    432
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Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln His Val Val Thr Pro Leu
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Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro
        115                 120                 125
Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile
    130                 135                 140
Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu
145                 150                 155                 160
Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln
                165                 170                 175
Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu
            180                 185                 190
Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp
        195                 200                 205
Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Asn Val Pro Val Ile Arg
    210                 215                 220
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Ser Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile
                245                 250                 255
Ile Ile Thr Ile His Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu
            260                 265                 270
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser
        275                 280                 285
Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
    290                 295                 300
Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305                 310                 315
<210>9
<211>1600
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(335)..(1291)
<223>opcA-Allel
<220>
<221>mutation
<222>(653)..(653)
<223>T->C Transition
<220>
<221>mutation
<222>(736)..(736)
<223>C->T Transition
<220>
<221>mutation
<222>(934)..(934)
<223>T->C Transition
<220>
<221>mutation
<222>(982)..(982)
<223>G->C Transversion
<220>
<221>mutation
<222>(991)..(991)
<223>A->C Transversion
<220>
<221>mutation
<222>(1031)..(1031)
<223>C->T Transition
<220>
<221>mutation
<222>(1115)..(1115)
<223>T->C Transition
<400>9
gtgtgctcat ccgcttcggt tccaaggttc caggttctgc catggaagtc cgtgacgtca     60
acatggactt ctcctactca gaatccttca ctgaagaatc acctgaagca tacgagcgcc    120
tcattttgga tgcgctgtta gatgaatcca gcctcttccc taccaacgag gaagtggaac  180
tgagctggaa gattctggat ccaattcttg aagcatggga tgccgatgga gaaccagagg  240
attacccagc gggtacgtgg ggtccaaaga gcgctgatga aatgctttcc cgcaacggtc  300
acacctggcg caggccataa tttaggggca aaaa atg atc ttt gaa ctt ccg gat  355
                                      Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp
                                      1               5
acc acc acc cag caa att tcc aag acc cta act cga ctg cgt gaa tcg    403
Thr Thr Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thr Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser
        10                  15                  20
ggc acc cag gtc acc acc ggc cga gtg ctc acc ctc atc gtg gtc act    451
Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly Arg Val Leu Thr Leu Ile Val Val Thr
    25                  30                  35
gac tcc gaa agc gat gtc gct gca gtt acc gag tcc acc aat gaa gcc    499
Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala
40                  45                  50                  55
tcg cgc gag cac cca tct cgc gtg atc att ttg gtg gtt ggc gat aaa    547
Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile Ile Leu Val Val Gly Asp Lys
                60                  65                  70
act gca gaa aac aaa gtt gac gca gaa gtc cgt atc ggt ggc gac gct    595
Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala
            75                  80                  85
ggt gct tcc gag atg atc atc atg cat ctc aac gga cct gtc gct gac    643
Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile Met His Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp
        90                  95                  100
aag ctc cag cat gtc gtc aca cca ctg ttg ctt cct gac acc ccc atc    691
Lys Leu Gln His Val Val Thr Pro Leu Leu Leu Pro Asp Thr pro Ile
    105                 110                 115
gtt gct tgg tgg cca ggt gaa tca cca aag aat cct tcc cag gat cca    739
Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro
120                 125                 130                 135
att gga cgc atc gca caa cga cgc atc act gat gct ttg tac gac cgt    787
Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg
                140                 145                 150
gat gac gca cta gaa gat cgt gtt gag aac tat cac cca ggt gat acc    835
Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr
            155                 160                 165
gac atg acg tgg gcg cgc ctt acc cag tgg cgg gga ctt gtt gcc tcc    883
Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser
        170                 175                 180
tca ttg gat cac cca cca cac agc gaa atc act tcc gtg agg ctg acc    931
Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr
    185                 190                 195
ggc gca agc ggc agt acc tcg gtg gat ttg gct gca ggc tgg ttg gcg    979
Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala
200                 205                 210                 215
cgc agg ctg aac gtg cct gtg atc cgc gag gtg aca gat gct ccc acc      1027
Arg Arg Leu Asn Val Pro Val Ile Arg Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr
                220                 225                 230
gtg tca acc gat gag ttt ggt act cca ctg ctg gct atc cag cgc ctg      1075
Val Ser Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu
            235                 240                 245
gag atc gtt cgc acc acc ggc tcg atc atc atc acc atc cat gac gct      1123
Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile Ile Ile Thr Ile His Asp Ala
        250                 255                 260
cat acc ctt cag gta gag atg ccg gaa tcc ggc aat gcc cca tcg ctg      1171
His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu
    265                 270                 275
gtg gct att ggt cgt cga agt gag tcc gac tgc ttg tct gag gag ctt      1219
Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu
280                 285                 290                 295
cgc cac atg gat cca gat ttg ggc tac cag cac gca cta tcc ggc ttg      1267
Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr Gln His Ala Leu Ser Gly Leu
                300                 305                 310
tcc agc gtc aag ctg gaa acc gtc taaggagaaa tacaacacta tggttgatgt     1321
Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
            315
agtacgcgca cgcgatactg aagatttggt tgcacaggct gcctccaaat tcattgaggt    1381
tgttgaagca gcaactgcca ataatggcac cgcacaggta gtgctcaccg gtggtggcgc    1441
cggcatcaag ttgctggaaa agctcagcgt tgatgcggct gaccttgcct gggatcgcat    1501
tcatgtgttc ttcggcgatg agcgcaatgt ccctgtcagt gattctgagt ccaatgaggg    1561
ccaggctcgt gaggcactgt tgtccaaggt ttctatccc                           1600
<210>10
<211>319
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>10
Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly Arg Val
            20                  25                  30
Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val
        35                  40                  45
Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile
    50                  55                  60
Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu
65                  70                  75                  80
Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile Met His
                85                  90                  95
Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln His Val Val Thr Pro Leu
            100                 105                 110
Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro
        115                 120                 125
Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile
    130                 135                 140
Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu
145                 150                 155                 160
Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln
                165                 170                 175
Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu
            180                 185                 190
Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp
        195                 200                 205
Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Asn Val Pro Val Ile Arg
    210                 215                 220
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Ser Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile
                245                 250                 255
Ile Ile Thr Ile His Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu
            260                 265                 270
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser
        275                 280                 285
Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
    290                 295                 300
Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305                 310                 315
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>Primer opcA-A1
<400>11
cacctggcgc aggccataa t               20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>Primer opcA-E1
<400>12
cgcgtgcgcg tactacatca                20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>Primer opcA-int1
<400>13
acggacctgt cgctgacaag                20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>Primer opcA-int2
<400>14
cggattccgg catctctacc                20
<210>15
<211>519
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(519)
<223>Leseraster
<220>
<221>mutation
<222>(28)..(28)
<223>C an Position 28entspricht C an Position 319 von SEQ ID NO：5
<220>
<221>mutation
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<223>C an Position 366 enspricht C an Position 657 von SEQ ID NO：5
<220>
<221>mutation
<222>(406)..(406)
<223>T an Position 406entspricht T an Position 697 von SEQ ID NO：5
<220>
<221>mutation
<222>(490)..(490)
<223>C an Position 490 entspricht C an Position 781 von SEQ ID NO：5
<400>15
aac gga cct gtc gct gac aag ctc cag cat gtc gtc aca cca ctg ttg     48
Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln His Val Val Thr Pro Leu Leu
1               5                   10                  15
ctt cct gac acc ccc atc gtt gct tgg tgg cca ggt gaa tca cca aag     96
Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro Lys
            20                  25                  30
aat cct tcc cag gac cca att gga cgc atc gca caa cga cgc atc act    144
Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile Thr
        35                  40                  45
gat gct ttg tac gac cgt gat gac gca cta gaa gat cgt gtt gag aac    192
Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu Asn
    50                  55                  60
tat cac cca ggt gat acc gac atg acg tgg gcg cgc ctt acc cag tgg    240
Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln Trp
65                  70                  75                  80
cgg gga ctt gtt gcc tcc tca ttg gat cac cca cca cac agc gaa atc    288
Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu Ile
                85                  90                  95
act tcc gtg agg ctg acc ggt gca agc ggc agt acc tcg gtg gat ttg    336
Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp Leu
            100                 105                 110
gct gca ggc tgg ttg gcg cgg agg ctg aac gtg cct gtg atc cgc gag    384
Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Asn Val Pro Val Ile Arg Glu
        115                 120                 125
gtg aca gat gct ccc acc gtg tca acc gat gag ttt ggt act cca ctg    432
Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Ser Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro Leu
    130                 135                 140
ctg gct atc cag cgc ctg gag atc gtt cgc acc acc ggc tcg atc atc    480
Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile Ile
145                 150                 155                 160
atc acc atc cat gac gct cat acc ctt cag gta gag atg                519
Ile Thr Ile His Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met
                165                 170
<210>16
<211>173
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>16
Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln His Val Val Thr Pro Leu Leu
1               5               10                  15
Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile Thr
        35                  40                  45
Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu Asn
    50                  55                  60
Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln Trp
65                  70                  75                  80
Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu Ile
                85                  90                  95
Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Asn Val Pro Val Ile Arg Glu
        115                 120                 125
Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Ser Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro Leu
    130                 135                 140
Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile Ile
145                 150                 155                 160
Ile Thr Ile His Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met
                165                 170
<210>17
<211>519
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(519)
<223>Leseraster
<220>
<221>mutation
<222>(28)..(28)
<223>C an Position 28 entspricht C an Position 319 von SEQ ID NO：7
<220>
<221>mutation
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<223>T an Position 111 entspricht T an Position 402von SEQ ID NO：7.
<220>
<221>mutation
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<223>C an Position 309 entspricht C an Position  600 von SEQ ID NO：7
<220>
<221>mutation
<222>(357)..(357)
<223>C an Position 357 entspricht C an Position 648 von SEQ ID NO：7
<220>
<221>mutation
<222>(366)..(366)
<223>C an Position 366 entspricht C an Position 657 von SEQ ID NO：7
<220>
<221>mutation
<222>(406)..(406)
<223>T an Position  406 entspricht T an position 697 von SEQ ID NO：7
<220>
<221>mutation
<222>(490)..(490)
<223>C an Position 490 entspricht C an Position 781 von SEQ ID NO：7
<400>17
aac gga cct gtc gct gac aag ctc cag cat gtc gtc aca cca ctg ttg    48
Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln His Val Val Thr Pro Leu Leu
1               5                   10                  15
ctt cct gac acc ccc atc gtt gct tgg tgg cca ggt gaa tca cca aag    96
Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro Lys
            20                  25                  30
aat cct tcc cag gat cca att gga cgc atc gca caa cga cgc atc act    144
Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile Thr
        35                  40                  45
gat gct ttg tac gac cgt gat gac gca cta gaa gat cgt gtt gag aac    192
Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu Asn
    50                  55                  60
tat cac cca ggt gat acc gac atg acg tgg gcg cgc ctt acc cag tgg    240
Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln Trp
65                  70                  75                  80
cgg gga ctt gtt gcc tcc tca ttg gat cac cca cca cac agc gaa atc    288
Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu Ile
                85                  90                  95
act tcc gtg agg ctg acc ggc gca agc ggc agt acc tcg gtg gat ttg    336
Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp Leu
            100                 105                 110
gct gca ggc tgg ttg gcg cgc agg ctg aac gtg cct gtg atc cgc gag    384
Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Asn Val Pro Val Ile Arg Glu
        115                 120                 125
gtg aca gat gct ccc acc gtg tca acc gat gag ttt ggt act cca ctg    432
Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Ser Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro Leu
    130                 135                 140
ctg gct atc cag cgc ctg gag atc gtt cgc acc acc ggc tcg atc atc    480
Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile Ile
145                 150                 155                 160
atc acc atc cat gac gct cat acc ctt cag gta gag atg                519
Ile Thr Ile His Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met
                165                 170
<210>18
<211>173
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>18
Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln His Val Val Thr Pro Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile Thr
        35                  40                  45
Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu Asn
    50                  55                  60
Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln Trp
65                  70                  75                  80
Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu Ile
                85                  90                  95
Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Asn Val Pro Val Ile Arg Glu
        115                 120                 125
Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Ser Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro Leu
    130                 135                 140
Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile Ile
145                 150                 155                 160
Ile Thr Ile His Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met
                165                 170
<210>19
<211>1263
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1263)
<223>lysC-Wildtypgen
<400>19
gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg     48
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1               5                   10                  15
gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct     96
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
            20                  25                  30
gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat    144
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
        35                  40                  45
gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt    192
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
    50                  55                  60
gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc    240
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65                  70                  75                  80
gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg    288
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
                85                  90                  95
ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc    336
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
            100                 105                 110
att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc    384
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
        115                 120                 125
aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc    432
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
    130                 135                 140
gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg    480
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                 155                 160
ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt    528
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
                165                 170                 175
gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag    576
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
            180                 185                 190
ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc    624
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
        195                 200                 205
tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat    672
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
    210                 215                 220
gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg    720
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc    768
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
                245                 250                 255
ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att    816
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
            260                 265                 270
tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat    864
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
        275                 280                 285
gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa    912
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
    290                 295                 300
gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc    960
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305                 310                 315                 320
cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc   1008
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
                325                 330                 335
aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct    1056
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
            340                 345                 350
ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg    1104
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
        355                 360                 365
cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt    1152
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
    370                 375                 380
att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca    1200
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                 390                 395                 400
ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat    1248
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
                405                 410                 415
gca ggc acc gga cgc                                                1263
Ala Gly Thr Gly Arg
            420
<210>20
<211>421
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>20
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1               5                   10                  15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
            20                  25                  30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
        35                  40                  45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
    50                  55                  60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65                  70                  75                  80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
                85                  90                  95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
            100                 105                 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
         115                 120                 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
    130                 135                 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                 155                 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
                165                 170                 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
            180                 185                 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
        195                 200                 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
    210                 215                 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
                245                 250                 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
            260                 265                 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
        275                 280                 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
    290                 295                 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305                 310                 315                 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
                325                 330                 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
            340                 345                 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
        355                 360                 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
    370                 375                 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                 390                 395                 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
                405                 410                 415
Ala Gly Thr Gly Arg

Claims (62)

1.分离的棒状细菌突变体，其包含编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的OpcA多肽的基因，其中所述多肽的氨基酸序列包含选自由下面的氨基酸组成的组中的单个氨基酸或氨基酸的组合：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸；和
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸。
2.权利要求1的棒状细菌突变体，其中棒状细菌是选自由Corynebacterium efficiens、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)和产氨棒杆菌(Corynebacterium aminogenes)组成的组中的细菌。
3.权利要求2的棒状细菌突变体，其是谷氨酸棒杆菌。
4.权利要求1、2或3的棒状细菌突变体，其是分泌L-氨基酸的细菌。
5.权利要求4的棒状细菌突变体，其是分泌L-赖氨酸或L-色氨酸的细菌。
6.权利要求1到5中任一项的棒状细菌突变体，其中所述氨基酸单个地或组合地选自由下面的氨基酸组成的组：
a)107位的L-组氨酸；
b)219位的L-天冬酰胺；
c)233位的L-丝氨酸；和
d)261位的L-组氨酸。
7.权利要求1到5中任一项的棒状细菌突变体，其中具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽中的所述氨基酸已经被取代。
8.权利要求6的棒状细菌突变体，其中具有氨基酸序列SEQID NO：2的多肽中的所述氨基酸已经被取代。
9.权利要求1到8中任一项的棒状细菌突变体，其中所述基因包含与使用从棒状细菌中获得的DNA以及使用一引物对通过聚合酶链反应(PCR)获得的多核苷酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，其中所述引物对由包括选自SEQ ID NO：3的1和334位之间的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的第一引物和包括选自SEQ ID NO：3的1600和1292位之间的互补核苷酸序列的至少1 5个连续核苷酸的第二引物组成。
10.权利要求1到6或9中任一项的棒状细菌突变体，其中所编码的多肽包含长度对应于319个L-氨基酸的氨基酸序列。
11.权利要求1到6或9到10中任一项的棒状细菌突变体，其中所编码的多肽的氨基酸序列的107到261位包含对应于SEQ ID NO：6的107到261位的氨基酸序列。
12.权利要求1到6或9到11中任一项的棒状细菌突变体，其中所编码的多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO：6具有至少90％的相同性的氨基酸序列。
13.权利要求1到6或9到11中任一项的棒状细菌突变体，其中所述基因包含与核苷酸序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7具有至少90％的相同性的核苷酸序列。
14.权利要求1或6的棒状细菌突变体，其中所编码的蛋白质包含选自由下面的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列：
a)氨基酸序列SEQ ID NO：6；
b)氨基酸序列SEQ ID NO：6，包含一个或多个保守氨基酸取代；和
c)氨基酸序列SEQ ID NO：6，包含一个或多个氨基酸插入或缺失。
15.权利要求13的棒状细菌突变体，其中所述基因包含与SEQID NO：5或SEQ ID NO：7具有100％相同性的核苷酸序列。
16.权利要求1到8和10到15中任一项的棒状细菌突变体，其中所述突变体是通过下面的步骤获得的：
a)用诱变剂处理能够分泌氨基酸的棒状细菌；
b)分离并繁殖在a)中产生的突变体；
c)提供来自在b)中获得的突变体的核酸；
d)使用来自c)的核酸和一引物对用聚合酶链反应制备核酸分子，所述引物对由包含选自SEQ ID NO：3的1和334位之间的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的第一引物和包含选自SEQ ID NO：3的1600和1292位之间的互补核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的第二引物组成；
e)确定在d)中获得的核酸分子的核苷酸序列，并确定出所编码的氨基酸序列；
f)如果合适，比较在e)中确定的氨基酸序列和SEQ ID NO：6；和
g)鉴定包含编码一多肽的多核苷酸的突变体，所述多肽包含一个或多个选自下面的氨基酸组成的组中的氨基酸：氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸；氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸；氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸；和氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸。
17.权利要求16的棒状细菌突变体，其中在步骤b)之后选择能够在培养基中分泌或在细胞内部积累所需L-氨基酸比在权利要求17的步骤a)中所采用的棒状细菌至少多0.5％的突变体。
18.编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的OpcA多肽的分离的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包含选自由下面的氨基酸组成的组中的单个氨基酸或氨基酸的组合：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸；和
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸。
19.权利要求18的分离的多核苷酸，其中所编码蛋白质的氨基酸单个地或组合地选自由下面氨基酸组成的组：
a)107位的L-组氨酸；
b)219位的L-天冬酰胺；
c)233位的L-丝氨酸；和
d)261位的L-组氨酸。
20.权利要求18的分离的多核苷酸，其中具有氨基酸序列SEQID NO：2的多肽中的所述氨基酸已经被取代。
21.权利要求18到20中任一项的分离的多核苷酸，其中所编码的多肽包含长度为319个氨基酸的氨基酸序列。
22.权利要求18到20中任一项的分离的多核苷酸，其中所编码的多肽的氨基酸序列的107到261位包含对应于SEQ ID NO：6的107到261位的氨基酸序列。
23.权利要求18到20中任一项的分离的多核苷酸，其与使用从棒状细菌获得的DNA以及使用一引物对通过聚合酶链反应(PCR)获得的多核苷酸的核苷酸序列相同，其中所述引物对由包含选自SEQ IDNO：3的1和334位之间的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的第一引物和包含选自SEQ ID NO：3的1600和1292位之间的互补核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的第二引物组成。
24.权利要求18到20中任一项的分离的多核苷酸，其在严格条件下与SEQ ID NO：5的互补核苷酸序列杂交，所述严格条件包括利用相应于2xSSC的缓冲液在52℃到68℃温度下的洗涤步骤。
25.权利要求18到20中任一项的分离的多核苷酸，其中所编码的多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO：6具有至少90％的相同性的氨基酸序列。
26.权利要求18到20中任一项的分离的多核苷酸，其包含与核苷酸序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7具有至少90％的相同性的核苷酸序列。
27.权利要求18到20中任一项的分离的多核苷酸，其中所编码的蛋白质包含选自由下面的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列：
a)氨基酸序列SEQ ID NO：6；
b)氨基酸序列SEQ ID NO：6，包含一个或多个保守氨基酸取代，和
c)氨基酸序列SEQ ID NO：6，包含一个或多个氨基酸插入或缺失。
28.权利要求20或27中任一项的分离的多核苷酸，其中所编码的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：6。
29.权利要求26的分离的多核苷酸，其中核苷酸序列包含SEQID NO：5或SEQ ID NO：7。
30.一种分离的多核苷酸，其包含一核酸分子，所述核酸分子编码至少一个具有对应于SEQ ID NO：2的98到270位的氨基酸序列的读码框，所述序列包含一个或多个选自由下面的氨基酸取代组成的组中的氨基酸取代：
a)用不同的蛋白氨基酸取代107位的L-酪氨酸；
b)用不同的蛋白氨基酸取代219位的L-赖氨酸；
c)用不同的蛋白氨基酸取代233位的L-脯氨酸；和
d)用不同的蛋白氨基酸取代261位的L-酪氨酸。
31.权利要求30的分离的多核苷酸，其中所述序列在一个或多个位点已经被取代，所述序列包含：
a)107位的L-组氨酸；
b)219位的L-天冬酰胺；
c)233位的L-丝氨酸；和/或
d)261位的L-组氨酸。
32.权利要求30的分离的多核苷酸，其编码至少一个具有对应于SEQ ID NO：2的98到270位的氨基酸序列的读码框。
33.权利要求30的分离的多核苷酸，其中除107、219、233和261位外，所述氨基酸序列包含一个或多个位点的保守氨基酸取代。
34.权利要求30的分离的多核苷酸，其包含一个或多个沉默突变。
35.权利要求29的分离的多核苷酸，其至少包含对应于SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：7的292到810位的核苷酸序列。
36.用于制备重组棒状细菌的方法，其包括：
a)向棒状细菌转移权利要求18到29或31到35中任一项的分离的多核苷酸；
b)用a)的多核苷酸置换存在于所述棒状细菌染色体中的opcA基因，所述opcA基因编码具有107位为L-酪氨酸、219位为L-赖氨酸、233位为L-脯氨酸和261位为L-酪氨酸的氨基酸序列的多肽，所述a)的多核苷酸编码具有其中一个或多个位点的氨基酸已经被取代的氨基酸序列的多肽，所述位点选自：
i)107位，优选地用L-组氨酸取代；
ii)219位，优选地用L-天冬酰胺取代；
iii)233位，优选地用L-丝氨酸取代；和
iv)261位，优选地用L-组氨酸取代；以及
c)繁殖通过步骤a)和b)获得的棒状细菌。
37.权利要求36的方法，其中使用权利要求18到29中任一项的分离的多核苷酸。
38.权利要求36的方法，其中使用权利要求31到35中任一项的分离的多核苷酸。
39.用于制备重组微生物的方法，其包括：
a)向微生物转移权利要求18到29或31到35中任一项的分离的多核苷酸；
b)在所述微生物中复制所述分离的多核苷酸；和
c)繁殖通过步骤a)和b)获得的微生物。
40.一种重组微生物，其包含权利要求18到29或31到35中任一项的分离的多核苷酸。
41.权利要求40的重组微生物，其是棒状细菌或埃希氏菌属细菌。
42.权利要求41的重组微生物，其中所述棒状细菌是棒杆菌属。
43.权利要求41的重组微生物，其中所述棒杆菌属细菌是谷氨酸棒杆菌。
44.一种载体，其包含权利要求18到29或31到35的分离的多核苷酸。
45.一种重组微生物，其包含权利要求44的载体。
46.权利要求45的重组微生物，其是棒状细菌或埃希氏菌属细菌。
47.权利要求46的重组微生物，其中所述棒状细菌是棒杆菌属。
48.权利要求47的重组微生物，其中所述棒杆菌属细菌是谷氨酸棒杆菌。
49.用于在微生物中过表达OpcA多肽的方法，所述方法包括将所述微生物的权利要求18到29或31到35中一项或多项的多核苷酸的拷贝数增加至少一个拷贝。
50.用于在微生物中过表达OpcA多肽的方法，所述方法包括将启动子或表达盒功能性地连接于编码OpcA多肽的多核苷酸，所述多肽具有包含一个或多个选自由下面的氨基酸组成的组中的氨基酸的氨基酸序列：
a)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
b)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
c)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；和
d)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸。
51.用于制备L-氨基酸的方法，其包括：
a)在合适的培养基中发酵分离的棒状细菌，所述细菌具有至少一个拷贝的编码OpcA多肽的多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列具有包括一个或多个选自由下面的氨基酸组成的组中的氨基酸：
i)所述氨基酸序列的107位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸；
ii)所述氨基酸序列的219位的除L-赖氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-天冬酰胺；
iii)所述氨基酸序列的233位的除L-脯氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-丝氨酸；和
iv)所述氨基酸序列的261位的除L-酪氨酸以外的任何蛋白氨基酸，优选的是L-组氨酸，和
b)浓缩发酵肉汤或所述细菌细胞中的所需的L-氨基酸。
52.权利要求51的方法，其中分离的棒状细菌是权利要求1到17中一项或多项的突变体。
53.权利要求51的方法，其中分离的棒状细菌是权利要求40到48中一项或多项的重组棒状细菌。
54.权利要求51到53中任一项的方法，其中分离或收集所需的L-氨基酸。
55.权利要求54的方法，其中纯化所需的L-氨基酸。
56.权利要求51到54中任一项的方法，其中与发酵肉汤的组分和/或生物量(＞0到100％)一起分离或收集所需的L-氨基酸。
57.权利要求51的方法，其包括：
a)从在权利要求51的步骤b)中获得的发酵肉汤中去除0到100％量的所产生的生物量，和
b)用选自由颗粒化、压缩、喷雾干燥和挤出组成的组中的方法从通过这种方法所获得的肉汤中制备出基本上干燥和成形的产品。
58.权利要求57的方法，其中在步骤a)之前或之后向发酵肉汤中加入选自由硫酸、盐酸和磷酸组成的组中的酸。
59.权利要求57的方法，其中在步骤a)之前或之后去除肉汤中的水。
60.权利要求57的方法，其中用油喷雾在步骤b)中或期间获得的成形产品。
61.基于发酵肉汤的含L-赖氨酸的动物饲料添加剂，其具有以下特征：
a)赖氨酸含量(碱)是至少10％重量到不超过73％重量；
b)含水量最高为5％重量，和
c)生物量含量对应于发酵肉汤所具有的生物量的至少0.1％，所述生物量是通过权利要求1到17或40到43或45到48中任一项的细菌所形成的，且任选地是灭活的。
62.基于发酵肉汤的含L-色氨酸的动物饲料添加剂，其具有以下特征：
a)色氨酸含量是至少5％重量到不超过95％重量；
b)含水量最高为5％重量，和
c)生物量含量对应于发酵肉汤所具有的生物量的至少0.1％，所述生物量是通过权利要求1到17或40到43或45到48中一项或多项的细菌所形成的，且任选地是灭活的。
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