CN101080489B

CN101080489B - 棒状细菌gnd基因的等位基因及生产L-赖氨酸的方法

Info

Publication number: CN101080489B
Application number: CN2005800432466A
Authority: CN
Inventors: G·蒂尔巴赫; B·巴特; N·席施卡
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2004-12-18
Filing date: 2005-11-21
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2025-11-21
Also published as: US7563602B2; US7338790B2; CN101080489A; DK1824968T3; WO2006063660A8; US20060246554A1; DE102005032426A1; DE502005010816D1; ATE494365T1; BRPI0515788A; EP1824968A1; US20080131903A1; WO2006063660A1; EP1824968B1

Abstract

本发明涉及棒状细菌编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因的突变体和等位基因，所述酶在第329位或者氨基酸序列的相当位置上含有除L-缬氨酸以外的任何氨基酸，本发明还涉及通过使用含有这些等位基因的细菌发酵生产氨基酸、优选L-赖氨酸和L-色氨酸的方法。

Description

棒状细菌gnd基因的等位基因及生产L-赖氨酸的方法

本发明提供了棒状细菌(coryneformer Bakterien，coryneformbacteria)编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶(EC：1.1.1.44)变体的gnd基因的突变体和等位基因，以及使用含有这些等位基因的细菌生产氨基酸、特别是L-赖氨酸和色氨酸的方法。

现有技术

在人类医学、制药工业、食品工业以及特别在动物饲料中使用氨基酸。

已知提供发酵棒状细菌菌株、特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)可以生产氨基酸。因为其重要性，一直在进行改良生产方法的工作。对于所述方法的改良可以涉及与发酵有关的参数，如搅拌和氧供应，或者涉及营养培养基的组成，如发酵过程中的糖浓度，或者涉及对产物进行加工，如离子交换层析或者涉及微生物自身的固有性质。

为了改良这种微生物的性质，使用了诱变、选择和突变选择方法。这些方法产生了对抗代谢物有抗性或者对于调控而言是重要的代谢物是营养缺陷型的、并且生产氨基酸的菌株。已知的抗代谢物是赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)。

多年来，重组DNA技术的方法已经用于通过扩增各个氨基酸生物合成基因以及研究对氨基酸生产的作用来改良棒杆菌属的L-氨基酸生产菌株。谷氨酸棒杆菌的遗传学、代谢和生物技术许多不同方面的总结可见于Pühler(主编)，Journal of Biotechnology 104(1-3)，1-338，2003。

名为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)菌株ML-223(FERMBP-1497)的棒状细菌的编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因的核苷酸序列描述于JP-A-9-224662。谷氨酸棒杆菌的gnd基因的核苷酸序列可见于专利申请EP-A-1108790的序列No.1605、序列No.7063和序列No.7064。

关于gnd基因的其它核苷酸序列被保藏于国立医学图书馆(Bethesda，MD，USA)的国立生物技术信息中心(NCBI)的数据库中，登录号为AX253243、AX121689、AX065125、AX065127、AX127147和AX127148。

关于6-磷酸葡糖酸脱氢酶的重要性的生理学研究被如Sugimotoand Shiio(Agricultural and Biological Chemistry 51，1257-1263)和Moritz et al.(European Journal of Biochemistry 267，3442-3452(2000))所公开。

专利申请WO 01/71012描述了使用棒状细菌菌株，gnd基因的过表达在促进不同氨基酸、如L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-色氨酸的生产和制备中的作用。

编码谷氨酸棒杆菌的6-磷酸葡糖酸脱氢酶的核苷酸序列被保藏于日本的DNA数据库中(DDBJ，Mishima，Japanhttp://gib.genes.nig.ac.jp/single/index.php？spid＝Cglu_ATCC13032)，基因名称为Cgl1452。编码区位于所述基因组序列的相反链(gegenstrang)的第1530338位核苷酸至1531816位核苷酸。国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的数据库也可用于定位所述核苷酸序列。登录号AX127148中，在所述核苷酸序列的相反链的第30341位核苷酸至31816位核苷酸发现了6-磷酸葡糖酸脱氢酶的编码区。

为了清楚，根据DDJB和NCBI数据库的说明，编码谷氨酸棒杆菌的6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因(“野生型基因”)的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1，所编码的6-磷酸葡糖酸脱氢酶的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2和4。SEQ ID NO：3示出位于上游和下游的核苷酸序列。

发明目的

本发明的目的是提供用于改良生产氨基酸、特别是L-赖氨酸和L-色氨酸的新的措施。

发明描述

本发明提供了产生的或分离的、优选分泌氨基酸并含有编码具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性的多肽的基因或等位基因的棒状细菌的突变株，其特征在于所述多肽包含在329位或氨基酸序列的相应或相当位置存在除了L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸的氨基酸序列。优选用L-甲硫氨酸置换L-缬氨酸。

在棒状细菌的情况中，优选棒杆菌属细菌。特别优选基于如下物种的氨基酸分泌菌株：

Corynebacterium efficiens，如菌株DSM44549，

谷氨酸棒杆菌，如菌株ATCC13032，

热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)，如菌株FERM BP-1539，和

产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)，如菌株ATCC6871，

特别优选谷氨酸棒杆菌。

本领域也已知一些具有其它名称的谷氨酸棒杆菌的代表性菌株。这些包括例如：

嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium lilium)DSM20137

栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)ATCC17965

黄色短杆菌ATCC14067

乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869和

叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC14020。

棒状细菌的氨基酸分泌菌株的已知代表性菌株是例如：

L-赖氨酸生产菌株

EP 0 358 940中描述的谷氨酸棒杆菌DM58-1/pDM6(＝DSM4697)

EP 0 435 132中描述的谷氨酸棒杆菌MH20(＝DSM5714)

EP 1 108 790中描述的谷氨酸棒杆菌AHP-3(＝FermBP-7382)

US 5,250,423中描述的热产氨棒杆菌AJ12521(＝FERM BP-3304)

或者L-色氨酸生产菌株

US 5,563,052中描述的谷氨酸棒杆菌K76(＝FermBP-1847)

US 5,605,818中描述的谷氨酸棒杆菌BPS13(＝FermBP-1777)

US 5,235,940中描述的谷氨酸棒杆菌FermBP-3055。

关于这组细菌菌株的分类学分类信息可见于如Seiler(Journal ofGeneral Microbiology 129，1433-1477(1983)，

and Kroppenstedt(Canadian Journal of Microbiology 42，989-1005(1996))，Liebl et al.(International Journal of Systematic Bacteriology 41，255-260(1991)和US-A-5,250,434。

具有名称″ATCC″的菌株可以得自American Type CultureCollection(Manassas，VA，USA)。具有名称″DSM″的菌株可以得自Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ，Brunswick，Germany)。具有名称″FERM″的菌株可以得自NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology(AIST TsukubaCentral 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba Ibaraki，Japan)。US-A 5,250,434描述了所述的热产氨棒杆菌(FERM BP-1539，FERM BP-1540，FERM BP-1541和FERM BP-1542)菌株。

蛋白质氨基酸理解为在天然蛋白质，即在微生物、植物、动物和人类蛋白质中出现的氨基酸。其特别包括选自如下一组的L-氨基酸：L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。所述氨基酸也包括L-高丝氨酸。

术语蛋白质和多肽可以互换。

本发明的突变株优选分泌所述的蛋白质氨基酸，特别是L-赖氨酸。术语氨基酸也包括其盐，如在L-赖氨酸的情况下包括赖氨酸一氢氯化物或硫酸赖氨酸。

本发明还提供了含有编码一种多肽的gnd等位基因的棒状细菌突变株，该多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中在第329位上存在除L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸。优选用L-甲硫氨酸置换L-缬氨酸。

本发明还提供了含有编码一种多肽的gnd等位基因的棒状细菌的突变株，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并在相应于SEQ IDNO：2的氨基酸序列的第329位的位置上含有除L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸，优选为L-甲硫氨酸，所述基因包含与使用引物对通过聚合酶链反应(PCR)获得的多核苷酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，所述引物对的核苷酸序列每个都包含至少15个连续核苷酸，所述连续核苷酸选自SEQ ID NO：3的第1和226位之间的核苷酸序列和SEQ ID NO：3的第1866和1703位之间的互补核苷酸序列。这种合适的引物对的例子示于SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8以及SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。作为起始物质(″模板″DNA)，优选已特别用诱变剂处理的棒状细菌的染色体DNA。特别优选棒杆菌属细菌的染色体DNA，非常特别优选谷氨酸棒杆菌的染色体DNA。

本发明还提供了含有编码一种多肽的gnd等位基因的棒状细菌的突变株，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并包含具有相应于492个L-氨基酸的长度的氨基酸序列，其中在329位存在除了L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸，优选是L-甲硫氨酸。

本发明还提供了含有编码一种多肽的gnd等位基因的棒状细菌的突变株，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并在氨基酸序列的第324位至334位含有相应于SEQ ID NO：6的第324位至334位的氨基酸序列。优选所述被编码的多肽的氨基酸序列含有相应于SEQID NO：6的第313位至345位或者相应于SEQ ID NO：6的第297位至361位或者SEQ ID NO：6的第281位至377位或者SEQ IDNO：6的第265位至393位或者SEQ ID NO：6的第201位至457位或者SEQ ID NO：6第72位至492位或者SEQ ID NO：6的第2位至492位的氨基酸序列。非常特别优选所述被编码的蛋白质的长度包含492个氨基酸。

本发明还提供了含有编码一种多肽的gnd等位基因的棒状细菌的突变株，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并在第329位或氨基酸序列的相应位置上含有除L-缬氨酸以外的任何氨基酸，优选是用L-甲硫氨酸置换，且另外所述多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO：6的氨基酸序列至少90％、优选至少92％或者至少94％或者至少96％、及非常特别优选至少97％或至少98％或至少99％相同。

本发明还提供了含有编码一种多肽的gnd等位基因的棒状细菌的突变株，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并在第329位或氨基酸序列的相应位置上含有除L-缬氨酸以外的任何氨基酸，优选是用L-甲硫氨酸置换，且另外所述等位基因的核苷酸序列与SEQ IDNO：5的核苷酸序列至少90％、优选至少92％或者至少94％或者至少96％、及非常特别优选至少97％或者至少98％或者至少99％相同。

已知保守性氨基酸置换对酶活性仅产生微小的改变。因此，在本发明突变株中存在的编码具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性的多肽的gnd等位基因除了SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列还可以含有一(1)或多个保守性氨基酸置换。所述多肽优选含有不超过两个(2)、不超过三个(3)、不超过四个(4)或不超过五个(5)保守性氨基酸置换。

在芳香族氨基酸的情况中，保守性置换指苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的互相置换。在疏水性氨基酸的情况中，保守性置换指亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的互相置换。在极性氨基酸的情况中，保守性置换指谷氨酰胺和天冬酰胺的互相置换。在碱性氨基酸的情况中，保守性置换指精氨酸、赖氨酸和组氨酸的互相置换。在酸性氨基酸的情况中，保守性置换指天冬氨酸和谷氨酸的互相置换。在含羟基基团的氨基酸的情况中，保守性置换指丝氨酸和苏氨酸的互相置换。

在本发明中通过使用Clustal程序(Thompson et al.，Nucleic AcidsResearch 22，4637-4680(1994))对比氨基酸序列发现不同细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)、Corynebacterium efficiens、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)和除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)的6-磷酸葡糖酸脱氢酶的氨基酸序列含有由序列Leu-Bra-Asp-Val-Ile-Val-Asp组成的序列基序和由序列Ile-Aro-Arg-Ali-Gly-Cys-Ile-Ile-Arg-Ala组成的序列基序。标记″Bra″代表氨基酸Ile或Val，″Aro″代表Trp或Phe，标记″Ali″代表氨基酸Gly或Ala。

因此，优选含有编码一种多肽的gnd等位基因的棒状细菌的突变株，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并包含选自Leu-Bra-Asp-Val-Ile-Val-Asp和Ile-Aro-Arg-Ali-Gly-Cys-Ile-Ile-Arg-Ala的至少一个氨基酸序列并在第329位或者氨基酸序列的相应或者相当位置上含有除L-缬氨酸以外的任何氨基酸，优选是L-甲硫氨酸。

氨基酸序列基序Leu-Bra-Asp-Val-Ile-Val-Asp包含在例如SEQID NO：6的第262位至268位。氨基酸序列基序Ile-Aro-Arg-Ali-Gly-Cys-Ile-Ile-Arg-Ala包含在例如SEQ ID NO：6的第376位至385位。

最后，本发明提供了含有编码一种多肽的gnd等位基因的棒状细菌的突变株，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列。

已知末端甲硫氨酸在蛋白质合成过程中被宿主中称为氨基肽酶的固有的酶移除。

表述″相应于氨基酸序列的第329位的位置″或者″相当于氨基酸序列的第329位的位置″是指在被编码的所述多肽的N-末端区域(相对于SEQ ID NO：6的第329位)插入或缺失编码氨基酸的密码子导致所述位置和长度读数形式上在插入的情况中增加一个单位或者在缺失的情况中减少一个单位。例如，作为在SEQ ID NO：5的第2位缺失编码氨基酸L-脯氨酸的CCG密码子的结果，L-甲硫氨酸从第329位退回至第328位。同样，在所述被编码的多肽的C-末端区域(相对于第329位)插入或缺失编码氨基酸的密码子导致所述长度读数形式上在插入的情况中增加一个单位或者在缺失的情况中减少一个单位。这种相当的位置可以通过对比“排列”形式的氨基酸序列，例如借助于Clustal程序而容易地鉴定。这种插入和缺失对所述酶活性基本上无影响。″基本上无影响″指所述变体的酶活性与具有SEQ ID NO：6氨基酸序列的多肽的活性的不同不超过20％、不超过15％、不超过10％、不超过7.5％、不超过5％、不超过2.5％或者不超过1％。

因此本发明还提供了编码SEQ ID NO：6的多肽变体的gnd等位基因，所述变体含有一或多个插入和缺失。所述多肽优选含有不超过5个、不超过4个、不超过3个和不超过2个的氨基酸插入和缺失。

序列基序Leu-Bra-Asp-Val-Ile-Val-Asp和Ile-Aro-Arg-Ali-Gly-Cys-Ile-Ile-Arg-Ala优选不被这种插入/缺失所断裂(zerrissen)。

为了产生本发明的突变株，可以使用诱变物质用棒状细菌细胞群进行常规体内诱变方法，所述诱变物质如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)或者紫外线。诱变方法描述于例如Manual of Methodsfor General Bacteriology(Gerhard et al.(Eds.)，American Society forMicrobiology，Washington，DC，USA，1981)或者Tosaka et al.(Agricultural and Biological Chemistry 42(4)，745-752(1978))或者Konicek et al.(Folia Microbiologica 33，337-343(1988))中。使用MNNG的典型诱变涉及50至500mg/l浓度或者甚至更高浓度直至最大1g/l，并且温育时间从1至30分钟，pH从5.5至7.5。在这些条件下，存活细胞数减少大约50％至90％或者大约50％至99％或者大约50％至99.9％或更多。

突变株或细胞从突变的细胞群中取出并增殖。然后使用适当的营养培养基在一批培养物中测试它们分泌氨基酸、优选L-赖氨酸或L-色氨酸的活性。适当的营养培养基和测试条件描述于例如US6,221,636、US 6,632,644、WO 00/63388和WO 03/014330中。利用合适的自动化系统，如Zimmermann et al.(VDI Berichte No.1841，VDI-Verlag，Düsseldorf，Germany 2004，439-443)或者Zimmermann(Chemie Ingenieur Technik 77(4)，426-428(2005))所述，可以在短时间内测试大量的突变株。这样，鉴定突变株，与亲代菌株或者未突变的起始菌株相比，其向营养培养基中分泌增加量的氨基酸。它们包括例如氨基酸分泌增加至少0.5％的那些突变株。

然后从突变株制备或分离DNA并借助于聚合酶链反应使用引物对合成相应的多核苷酸，所述引物对可以扩增本发明的gnd基因或者 gnd等位基因或者本发明在氨基酸序列第329位的突变。优选从以增加方式分泌氨基酸的那些突变株中分离DNA。

为此，可以从位于本发明突变的上游和下游的核苷酸序列和与其互补的核苷酸序列中选择任何所需的引物对。引物对的一个引物优选包含选自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：19的第1和1210位之间核苷酸序列的至少15个、至少18个、至少20个、至少21或者至少24个连续核苷酸。引物对的相关第二个引物包含选自SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：19的第1866和1214位间互补核苷酸序列的至少15个、至少18个、至少20个、至少21个或至少24个连续核苷酸。如果需要扩增编码区，引物对优选选自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：19的第1和226位之间的核苷酸序列及SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：19的第1866和1703位之间的互补核苷酸序列。如果需要扩增部分编码区，例如SEQ ID NO：11和13所示，引物对优选选自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：19的第228和1210位之间的核苷酸序列及SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：19的第1701和1214位之间的互补核苷酸序列。

合适的引物对是例如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物对gnd-A1和gnd-E1或者SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的引物对gnd-FS1和gnd-FS-E。

而且引物可以具有限制酶识别位点，具有生物素基团或其它附件，如现有技术所述。引物的全长通常不超过30、40、50或60个核苷酸。

热稳定的DNA聚合酶通常用于通过扩增所选择的序列如本发明的gnd等位基因从最初使用的DNA例如染色体DNA通过PCR手段扩增产生多核苷酸。这种DNA聚合酶的例子是例如为Qiagen(Hilden，Germany)所销售的水生栖热菌(Thermus aquaticus)的Taq聚合酶、例如为New England Biolabs(Frankfurt，Germany)销售的海底嗜热球菌(Thermococcus litoralis)的Vent聚合酶或者例如为 Stratagene(La Jolla，USA)销售的激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的Pfu聚合酶。优选具有“校正”活性的聚合酶。″校正″活性指这些聚合酶能够识别不正确掺入的核苷酸并且通过重新聚合消除错误(Lottspeich and Zorbas，Bioanalytik，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany(1998))。具有″校正″活性的聚合酶的例子是Vent聚合酶和Pfu聚合酶。

根据生产商指导建立了反应批次的条件。聚合酶以及常规缓冲液通常由生产商提供，所述缓冲液通常具有浓度为10至100mM的Tris/HCl和6至55mM的KCL，pH 7.5-9.3。如果在生产商提供的缓冲液中不存在氯化镁，则加入浓度为0.5至10mM的氯化镁。还向反应批次中加入浓度为0.1至16.6mM的脱氧核苷三磷酸。在最佳情况中，反应批次中的引物终浓度为0.1至3μM，模板DNA为10²至10⁵ 拷贝。向反应批次中加入的适当的聚合酶的量为2至5单位。典型的反应批次体积为20至100μl。

可以向反应物中加入小牛血清白蛋白、Tween-20、明胶、甘油、甲酰胺或DMSO作为其它的添加剂(Dieffenbach and Dveksler，PCR Primer-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，USA 1995)。

典型的PCR过程由接连重复的三个不同的温度阶段组成。首先，开始将反应物温度升高至92℃-98℃，4至10分钟以变性所导入的DNA。然后重复进行：第一步，大约92至98℃，10至60秒以变性所导入的DNA，并使引物与所导入的DNA结合；在特定温度(″退火温度″)下的10至60秒的步骤，所述特定温度依赖于引物以及根据经验，从50℃至60℃并可以针对每个引物对分别进行计算。本领域技术人员在Rychlik et al.(Nucleic Acids Research 18(21)：6409-6412)中可以发现准确信息。最后，是在每种聚合酶最佳活性下的合成步骤，用于延长开始所使用的引物(″延伸″)，通常根据聚合酶所述最佳活性范围从73℃至67℃、优选从72℃至68℃。这个延伸步骤的时间依赖于聚合酶的效率和要扩增的PCR产物的长度。在典型的PCR中，这个步骤持续0.5至8分钟、优选2至4分钟。这三个步骤重复30至35次，任选直至50次。最后4至10分钟的″延伸″步骤完成反应。以此方式制备的多核苷酸也称为扩增物；通常也使用术语核酸片段和核酸分子。

本领域技术人员在关于PCR例如在″PCR-Strategies″(Innis，Felfand and Sninsky，Academic Press，Inc.，1995)、Diefenbach和Dveksler的″PCR Primer-a laboratory manual″(Cold Spring HarborLaboratory Press，1995)、Gait的″Oligonucleotide synthesis：A PracticalApproach″(IRL Press，Oxford，UK，1984)和Newton和Graham的″PCR″(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1994)的手册中可以发现更详细的信息。

然后，例如根据Sanger et al.(Proceedings of the NationalAcademies of Sciences，U.S.A.，74，5463-5467(1977))的链终止法和Zimmermann et al.(Nucleic Acids Research 18，1067pp(1990))所述的修饰方法确定核苷酸序列，特别分析该核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列。为此，将所述核苷酸序列输入将DNA序列翻译为氨基酸序列的程序。合适的程序例如是可得自专利局例如美国专利局(USPTO)的″Patentin″或者可得自互联网上ExPASy Proteomics服务器(Gasteiger et al.，Nucleic Acids Research 31，3784-3788(2003))上的″Translate Tool″。

如此，鉴定突变株，其gnd等位基因编码具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并且在第329位或者相应或相当位置上含有除L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸的蛋白质。优选用L-甲硫氨酸置换。

因此，本发明提供了棒状细菌的突变株，其可以通过如下步骤获得：

a)用诱变剂处理具有分泌氨基酸能力的棒状细菌，

b)分离并增殖a)中产生的突变株，

c)优选确定所述突变株的能力，其在培养基中分泌或者在细胞内积聚比a)中所用的棒状细菌多至少0.5％的氨基酸，

d)制备b)中获得的突变株的核酸，

e)使用聚合酶链反应、d)的核酸和引物对产生核酸分子，所述引物对由第一引物和第二引物组成，所述第一引物包含选自SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：19的第1和1210位之间核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，所述第二引物包含选自SEQ ID NO：3的第1866和1214位之间的互补核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，

f)确定e)中获得核酸分子的核苷酸序列，并确定所编码的氨基酸序列，

g)任选比较f)中确定的氨基酸序列和SEQ ID NO：6或18，及

h)鉴定含有编码一种多肽的多核苷酸的突变株，所述多肽在第329位或相当位置含有除L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸，优选是L-甲硫氨酸。

如此产生的突变株典型地含有所述gnd等位基因的一个(1)拷贝。

作为例子，本发明突变株的gnd等位基因的编码区示于SEQ IDNO：5。野生型基因的编码区示于SEQ ID NO：1。在第985位，SEQ ID NO：1含有核碱基鸟嘌呤，SEQ ID NO：5含有核碱基腺嘌呤。这种鸟嘌呤腺嘌呤转换的结果是编码氨基酸L-甲硫氨酸的密码子ATG在第985至987位形成。SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列还可以含有其它的碱基置换，这些置换是由于诱变处理而产生的但是其不表达为改变的氨基酸序列。这种突变本领域也称为沉默或者中性突变。这些沉默突变也可能也已经存在于用于进行诱变处理的棒状细菌中。所述的碱基置换例如是选自如下一组中的一或多个置换：93位鸟嘌呤代替胞嘧啶、375位腺嘌呤代替鸟嘌呤、510位腺嘌呤代替鸟嘌呤、612位鸟嘌呤代替胞嘧啶、786位鸟嘌呤代替腺嘌呤、813位胞嘧啶代替胸腺嘧啶、1014位鸟嘌呤代替胸腺嘧啶、1380 位胞嘧啶代替腺嘌呤、1470位鸟嘌呤代替胸腺嘧啶。SEQ ID NO：17示出了本发明含有共六个这种沉默突变的突变株的gnd等位基因的核苷酸序列。

用语″510位腺嘌呤代替鸟嘌呤″-以及相似用语-是指编码区的野生型序列第510位存在的核碱基鸟嘌呤(见SEQ ID NO：1)被腺嘌呤置换(见SEQ ID NO：17)。

用于诱变的棒状细菌优选已经具有向周围营养培养基中或者发酵液中分泌所需氨基酸或者在细胞中积聚其的能力。

生产L-赖氨酸的棒状细菌典型地具有″反馈″抗性或者脱敏的天冬氨酸激酶。″反馈″抗性天冬氨酸激酶是指这样的天冬氨酸激酶，其与野生形式相比对于赖氨酸和苏氨酸的混合物或者AEC(氨基乙基半胱氨酸)和苏氨酸的混合物或者单独的赖氨酸或者单独的AEC的抑制具有更低的敏感性。编码这种脱敏的天冬氨酸激酶的基因或者等位基因也称为lysC^FBR等位基因。现有技术(表1)描述了大量编码天冬氨酸激酶变体的lysC^FBR等位基因，所述变体与野生型蛋白质相比具有氨基酸置换。相应于NCBI数据库的登录号AX756575的谷氨酸棒杆菌的野生型lysC基因的编码区示于SEQ ID NO：15并且该基因所编码的蛋白质示于SEQ ID NO：16。

表1

编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC^FBR等位基因

等位基因名称	其它信息	参考	登录号
				lysC^FBR-E05108		JP 1993184366-A (序列1)	E05108
lysC^FBR-E06825	lysC A279T	JP 1994062866-A (序列1)	E06825
				lysC^FBR-E06826	lysC A279T	JP 1994062866-A (序列2)	E06826
lysC^FBR-E06827		JP 1994062866-A (序列3)	E06827
				lysC^FBR-E08177		JP 1994261766-A (序列1)	E08177

[0090]

lysC^FBR-E08178	lysC A279T	JP 1994261766-A (序列2)	E08178
				lysC^FBR-E08179	lysC A279V	JP 1994261766-A (序列3)	E08179
lysC^FBR-E08180	lysC S301F	JP 1994261766-A (序列4)	E08180
				lysC^FBR-E08181	lysC T308I	JP 1994261766-A (序列5)	E08181
lysC^FBR-E08182		JP 1994261766-A (序列6)	E08182
				lysC^FBR-E12770		JP 1997070291-A (序列13)	E12770
lysC^FBR-E14514		JP 1997322774-A (序列9)	E14514
				lysC^FBR-E16352		JP 1998165180-A (序列3)	E16352
lysC^FBR-E16745		JP 1998215883-A (序列3)	E16745
				lysC^FBR-E16746		JP 1998215883-A (序列4)	E16746
lysC^FBR-I74588	lysC S317A	US 5688671-A (序列1)	I74588
				lysC^FBR-I74589	lysC A279T	US 5688671-A (序列2)	I74589
lysC^FBR-I74590		US 5688671-A (序列7)	I74590
				lysC^FBR-I74591	lysC A279T	US 5688671-A (序列8)	I74591
lysC^FBR-I74592		US 5688671-A (序列9)	I74592
				lysC^FBR-I74593	lysC A279T	US 5688671-A (序列10)	I74593
lysC^FBR-I74594		US 5688671-A (序列11)	I74594
				lysC^FBR-I74595	lysC A279T	US 5688671-A (序列12)	I74595
lysC^FBR-I74596		US 5688671-A (序列13)	I74596
				lysC^FBR-I74597	lysC A279T	US 5688671-A (序列14)	I74597

[0091]

lysC^FBR-X57226	lysC S301Y	EP0387527 Kalinowski et al.， Molecular and General Genetics 224：317-324(1990)	X57226
				lysC^FBR-L16848	lysC G345D	Follettie and Sinskey NCBI Nucleotide Database(1990)	L16848
lysC^FBR-L27125	lysC R320G lysC G345D	Jetten et al.，Applied Microbiology Biotechnology 43： 76-82(1995)	L27125
				lysC^FBR	lysC T311I	WO0063388 (序列17)
lysC^FBR	lysC S301F	US3732144
				lysC^FBR	lysC S381F	EP0435132
lysC^FBR	lysC S317A	US5688671 (序列1)
				lysC^FBR	lysC T380I	WO 01/49854

分泌L-赖氨酸的棒状细菌典型地具有一或多个表1所列的氨基酸置换。

优选如下的lysC^FBR等位基因：lysC A279T(所编码的SEQ IDNO：16的天冬氨酸激酶蛋白的第279位的丙氨酸用苏氨酸置换)、lysC A279V(所编码的SEQ ID NO：16的天冬氨酸激酶蛋白的第279位的丙氨酸用缬氨酸置换)、lysC S301F(所编码的SEQ ID NO：16的天冬氨酸激酶蛋白的第301位的丝氨酸用苯丙氨酸置换)、lysC T308I(所编码的SEQ ID NO：16的天冬氨酸激酶蛋白的第308位的苏氨酸用异亮氨酸置换)、lysC S301Y(所编码的SEQ ID NO：16的天冬氨酸激酶蛋白的第308位的丝氨酸用酪氨酸置换)、lysC G345D(所编码的SEQ ID NO：16的天冬氨酸激酶蛋白的第345位的甘氨酸用天冬氨酸置换)、lysC R320G(所编码的SEQ ID NO：16的天冬氨酸激酶蛋白的第320位的精氨酸用甘氨酸置换)、lysC T311I(所编码的SEQ ID NO：16的天冬氨酸激酶蛋白的第311位的苏氨酸用异亮氨酸置换)、lysC S381F(所编码的SEQ ID NO：16的天冬氨酸激酶蛋白的第381位的丝氨酸用苯丙氨酸置换)、lysC S317A(所编码的SEQ IDNO：16的天冬氨酸激酶蛋白的第317位的丝氨酸用丙氨酸置换)和lysC T380I(所编码的SEQ ID NO：22的天冬氨酸激酶蛋白的第380位的苏氨酸用异亮氨酸置换)。

特别优选lysC^FBR等位基因lysC T311I(所编码的SEQ ID NO：16的天冬氨酸激酶蛋白的第311位的苏氨酸用异亮氨酸置换)和含有选自A279T(所编码的SEQ ID NO：16的天冬氨酸激酶蛋白的第279位的丙氨酸用苏氨酸置换)和S317A(所编码的SEQ ID NO：16的天冬氨酸激酶蛋白的第317位的丝氨酸用丙氨酸置换)中至少一个置换的lysC^FBR等位基因。

保藏在DSMZ中的菌株DM1797中含有lysC^FBR等位基因lysCT311I。DM1797是谷氨酸棒杆菌ATCC13032的突变株。

如上所述，从菌株DM1797开始，分离了突变株，命名为DM1798，其含有编码一种多肽的gnd等位基因，所述多肽中氨基酸序列的第329位存在L-甲硫氨酸。突变株DM1798的gnd等位基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：17，而所编码的多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：18。除了SEQ ID NO：5的核苷酸序列第985位的鸟嘌呤-腺嘌呤转换外(该转换导致所编码的多肽的氨基酸序列第329位的氨基酸置换)，突变株DM1798的gnd等位基因含有如下沉默突变：510位的鸟嘌呤-腺嘌呤转换、612位的胞嘧啶-鸟嘌呤颠换、786位的腺嘌呤-鸟嘌呤转换、813位的胸腺嘧啶-胞嘧啶转换和1470位的胸腺嘧啶-鸟嘌呤颠换。

位于SEQ ID NO：17上游和下游的核苷酸序列示于SEQ IDNO：19。

另外，可以使用展示弱化的高丝氨酸脱氢酶或高丝氨酸激酶或具有其它性质如现有技术中已知的那些性质的分泌L-赖氨酸的棒状细菌。

产生L-色氨酸的棒状细菌典型地具有″反馈″抗性或脱敏的邻氨基苯甲酸合酶。″反馈″抗性邻氨基苯甲酸合酶是这样的邻氨基苯甲酸合酶，其与野生形式的相比对(5至10％、10％至15％或10％至20％)的色氨酸或5-氟色氨酸(Matsui et al.，Journal of Bacteriology 169(11)：5330-5332(1987))或相似类似物的抑制显示更低的敏感性。编码这种脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的基因或等位基因也指trpE^FBR等位基因。这种突变体或等位基因的例子描述于例如US 618037和EP0338474中。

与所用的起始菌株或者亲代菌株相比，所得的突变株在发酵过程中显示所需氨基酸的分泌或生产增加。

本发明还提供了编码一种多肽的分离的多核苷酸，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并在氨基酸序列的第329位或相应或相当位置上含有除L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸，优选用L-甲硫氨酸置换。

本发明的多核苷酸可以分离自本发明的突变株。

也可以使用体外方法诱变gnd基因。使用体外方法时，将含有棒状细菌gnd基因、优选是现有技术中所述的谷氨酸棒杆菌的野生型基因的分离的多核苷酸进行诱变处理。

分离的多核苷酸可以是例如分离的总DNA或染色体DNA以及通过聚合酶链反应(PCR)制备的gnd基因的扩增产物。这种扩增产物也称为PCR产物；通常也使用术语核酸分子和核酸片段。本领域技术人员可在例如如下的手册中获得通过聚合酶链反应扩增DNA序列的指导：Gait：Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(IRLPress，Oxford，UK，1984)和Newton and Graham：PCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1994)。也可以首先将要突变的gnd基因掺入载体、例如噬菌体或质粒中。

适当的体外诱变方法例如如Miller(Miller，J.H.：A Short Coursein Bacterial Genetics.A Laboratory Manual and Handbook forEscherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，1992)所述使用羟胺处理、使用诱变寡核苷酸(T.A.Brown：Gentechnologie für Einsteiger，Spektrum AkademischerVerlag，Heidelberg，1993 and R.M.Horton：PCR-MediatedRecombination and Mutagenesis，Molecular Biotechnology 3，93-99(1995))和使用应用显示高错误率的DNA聚合酶的聚合酶链反应。这种DNA聚合酶例如是Stratagene(LaJolla，CA，USA)的mutazymeDNA聚合酶(GeneMorph PCR Mutagenesis Kit，No.600550)。

在现有技术和已知的遗传学和分子生物学的教科书如Knippers的教科书(″Molekulare Genetik″，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker的教科书(″Gene und Klone″，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或者Hagemann的教科书(″Allgemeine Genetik″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)中可发现体内或体外产生突变的其它信息和综述。

本发明还提供了编码一种多肽的分离的多核苷酸，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中在氨基酸序列的第329位存在除L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸。优选用L-甲硫氨酸置换。

本发明还提供了编码一种多肽的分离的多核苷酸，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并包含长度为492个氨基酸的氨基酸序列，其中在第329位存在除L-缬氨酸以外的任何蛋白质L-氨基酸，优选是L-甲硫氨酸。

本发明还提供了编码一种多肽的分离的多核苷酸，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并在氨基酸序列的第324至334位含有相应于SEQ ID NO：6的第324至334位的氨基酸序列。所编码的多肽的氨基酸序列优选含有相应于SEQ ID NO：6的第313至345位或者SEQ ID NO：6的第297至361位或者SEQ ID NO：6的第281至377位或者SEQ ID NO：6的第265至393位或者SEQ ID NO：6的第201至457位或者SEQ ID NO：6的第72至492位或者SEQ IDNO：6的第2至492位的氨基酸序列。所编码的蛋白质的长度非常特别优选包含492个氨基酸。

本发明还提供了编码一种多肽的分离的多核苷酸，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并在氨基酸序列的第329位或相应或相当位置含有除L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸，优选是L-甲硫氨酸，并且所述多核苷酸包含与通过使用如下引物对的聚合酶链反应(PCR)获得的多核苷酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，所述引物对的核苷酸序列都包含选自如下核苷酸序列的至少15个连续核苷酸：SEQ ID NO：3的第1和226位之间的核苷酸序列和SEQ IDNO：3的第1866和1703位之间的互补核苷酸序列。合适的引物对的两个例子示于SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8以及SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。优选的起始物质(″模板″)是用诱变剂特别处理的棒状细菌的染色体DNA。特别优选棒杆菌属细菌的染色体DNA，非常特别优选谷氨酸棒杆菌的染色体DNA。

本发明还提供了在严格条件下与互补于SEQ ID NO：5的核苷酸序列杂交并编码一种多肽的分离的多核苷酸，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并在氨基酸序列的第329位或相应或相当位置含有除L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸，优选是L-甲硫氨酸。

本领域技术人员可以在例如如下的手册中发现核酸或多核苷酸杂交的指导：″The DIG System Users Guide for Filter Hybridization″，Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim，Germany，1993)和Liebl et al.(International Journal of Systematic Bacteriology 41：255-260(1991))。杂交在严格条件下进行，即仅形成这样的杂交体，其中探针即包含与SEQ ID NO：5互补的核苷酸序列的多核苷酸和靶序列即用探针处理的多核苷酸至少90％相同。已知包括洗涤步骤在内的杂交的严格性被变化的缓冲液组成、温度和盐浓度影响或决定。与洗涤步骤相比，通常杂交反应用相对低的严格性进行(Hybaid Hybridisation Guide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。

例如，用于杂交反应，缓冲液可以相应于5x SSC缓冲液，温度大约50℃至68℃。在这种情况下，探针也可以与和所用探针的核苷酸序列小于90％相同性的多核苷酸杂交。这种杂交体较不稳定并在严格条件下通过洗涤除去。这可以例如通过将盐浓度降低至2x SSC并任选随后至0.5x SSC(The DIG System User′s Guide for FilterHybridisation，Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany，1995)、温度设定为大约50℃至68℃、大约52℃至68℃、大约54℃至68、大约56℃至68、大约58℃至68℃、大约60℃至68℃、大约62℃至68℃、大约64℃至68℃、大约66℃至68℃来实现。优选温度范围为大约64℃至68℃或大约66℃至68℃。任选可以降低盐浓度至相应于0.2x SSC或0.1x SSC的浓度。SSC缓冲液任选含有0.1％浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)。通过每步大约1至2℃的步骤逐步将杂交温度从50℃提高至68℃，可以分离与所用探针的序列至少90％或至少91％、优选至少92％或至少93％或至少94％或至少95％或至少96％及非常特别优选至少97％或至少98％或至少99％相同并且编码一种多肽的多核苷酸片段，所述多肽具有磷酸葡糖酸脱氢酶活性并且含有本发明的氨基酸置换。通过已知方法确定以此方式获得的多核苷酸的核苷酸序列。关于杂交的进一步指导可以所谓试剂盒的形式商购获得(例如DIG Easy Hyb，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，Catalog No.1603558)。如此获得的核苷酸序列编码具有磷酸葡糖酸脱氢酶活性并与SEQ ID NO：6的氨基酸序列至少90％、优选至少92％或至少94％或至少96％及非常特别优选至少97％或至少98％或至少99％相同并含有本发明的氨基酸置换的多肽。

本发明还提供了编码一种多肽的分离的多核苷酸，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并在氨基酸序列的第329位或相应或相当位置含有除L-缬氨酸以外的任何氨基酸，优选用L-甲硫氨酸置换，并且所述多肽包含额外与SEQ ID NO：6的氨基酸序列至少90％、优选至少92％或至少94％或至少96％及非常特别优选至少97％或至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。

本发明还提供了编码一种多肽的分离的多核苷酸，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并在氨基酸序列的第329位或相应或相当位置含有除L-缬氨酸外的任何氨基酸，优选用L-甲硫氨酸置换，并且所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：5的核苷酸序列额外至少90％、优选至少92％或至少94％或至少96％及非常特别优选至少97％或至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。

而且，优选编码一种多肽的那些分离的多核苷酸，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并在氨基酸序列的第329位或相应或相当位置含有除L-缬氨酸以外的任何氨基酸，优选是L-甲硫氨酸，并且所述多肽包含选自如下的至少一个序列基序或氨基酸序列：Leu-Bra-Asp-Val-Ile-Val-Asp和Ile-Aro-Arg-Ali-Gly-Cys-Ile-Ile-Arg-Ala。命名″Bra″表示氨基酸Ile或Val，″Aro″表示Trp或Phe以及命名″Ali″表示氨基酸Gly或Ala。

本发明还提供了编码一种多肽的分离的多核苷酸，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。被编码的多肽任选含有一个(1)或多个保守性氨基酸置换。所述多肽优选含有不超过两个(2)、不超过三个(3)、不超过四个(4)或不超过五个(5)的保守性氨基酸置换。

本发明还提供了编码一种多肽的分离的多核苷酸，所述多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，在N或C末端包括至少一个(1)氨基酸的延伸。这种延伸包含不超过50、40、30、20、10、5、3或2个氨基酸或氨基酸残基。

最后，本发明还提供了编码SEQ ID NO：6的多肽变体的gnd等位基因，所述多肽变体含有一或多个插入或缺失。其优选含有不超过5个、不超过4个、不超过3个或不超过2个的氨基酸插入或缺失。优选序列基序Leu-Bra-Asp-Val-Ile-Val-Asp和Ile-Aro-Arg-Ali-Gly-Cys-Ile-Ile-Arg-Ala不被这种插入/缺失所断裂。

本发明还提供了包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列的分离的多核苷酸，这个序列任选额外包含选自如下一组的一或多个碱基置换：93位鸟嘌呤代替胞嘧啶、375位腺嘌呤代替鸟嘌呤、510位腺嘌呤代替鸟嘌呤、612位鸟嘌呤代替胞嘧啶、786位鸟嘌呤代替腺嘌呤、813位胞嘧啶代替胸腺嘧啶、1014位鸟嘌呤代替胸腺嘧啶、1380位胞嘧啶代替腺嘌呤、1470位鸟嘌呤代替胸腺嘧啶。

最后，本发明提供了含有突变株DM1798的gnd等位基因的分离的多核苷酸。所述核苷酸序列示于SEQ ID NO.17并且所编码的多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：18。除了SEQ ID NO：5的核苷酸序列的第985位的鸟嘌呤-腺嘌呤颠换之外(该颠换导致所编码的蛋白质/多肽的氨基酸序列第329位的氨基酸置换)，突变株DM1798的gnd等位基因还含有如下沉默突变：510位的鸟嘌呤-腺嘌呤转换、612位的胞嘧啶-鸟嘌呤颠换、786位的腺嘌呤-鸟嘌呤转换、813位的胸腺嘧啶-胞嘧啶转换和1470位的胸腺嘧啶-鸟嘌呤颠换。

本发明还提供了包含本发明gnd等位基因的编码区的一部分的分离的多核苷酸，在任何情况下，所述分离的多核苷酸都包含在所编码的多肽的氨基酸序列的第329位含有氨基酸置换的编码区的部分。

特别包括一种核酸分子或DNA片段，其编码至少一个相应于SEQ ID NO.2的第313至345位的氨基酸序列、或者编码至少一个相应于SEQ ID NO：2的第297至361位的氨基酸序列、或者编码至少一个相应于SEQ ID NO：2的第281至377位的氨基酸序列、或者编码至少一个相应于SEQ ID NO：2的第265至393位的氨基酸序列、或者编码至少一个相应于SEQ ID NO：2的第201至457位的氨基酸序列、或者编码至少一个相应于SEQ ID NO：2的第102至492位的氨基酸序列、或者编码至少一个相应于SEQ ID NO：2的第72至492位的氨基酸序列，或者所述核酸分子或DNA片段含有一个相应的阅读框，其中在相应于SEQ ID NO：2的第329位的位置上存在除L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸，优选是L-甲硫氨酸。

下面示出了一个本发明阅读框的例子，其包含编码至少一个相应于SEQ ID NO：2第313至345位的氨基酸序列的多核苷酸，其中在相应于所述氨基酸序列的第329位的位置上存在除L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸：

cag ggc aac cta cct gca ggt gtc ctc acc gat ctg gaa gca ctt ggc nnn gac

Gln Gly Asn Leu Pro Ala Gly Val Leu Thr Asp Leu Glu Ala Leu Gly Xaa Asp

313 315 320 325 330

aag gca cag ttc gtc gaa gac gtt cgc cgt gca ctg tac gca tcc

Lys Ala Gln Phe Val Glu Asp Val Arg Arg Ala Leu Tyr Ala Ser

335 340 345

其也示于SEQ ID NO：11。这个阅读框所编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：12。

优选编码至少一个相应于SEQ ID NO：6的第313至345位、或者至少相应于SEQ ID NO：6的第297至361位、或者至少相应于SEQ ID NO：6的第281至377位、或者至少相应于SEQ ID NO：6的第265至393位、或者至少相应于SEQ ID NO：6的第201至457位、或者至少相应于SEQ ID NO：6的第102至492位、或者至少相应于SEQ ID NO：6的第72至492位的氨基酸序列的核酸分子。

如下示出了本发明的一个阅读框的例子，其包含至少编码相应于SEQ ID NO：5的第313至345位的氨基酸的多核苷酸：

cag ggc aac cta cct gca ggt gtc ctc acc gat ctg gaa gca ctt ggc atg gac

Gln Gly Asn Leu Pro Ala Gly Val Leu Thr Asp Leu Glu Ala Leu Gly Met Asp

313 315 320 325 330

aag gca cag ttc gtc gaa gac gtt cgc cgt gca ctg tac gca tcc

Lys Ala Gln Phe Val Glu Asp Val Arg Arg Ala Leu Tyr Ala Ser

335 340 345

其也示于SEQ ID NO：13。SEQ ID NO：14示出了这个阅读框编码的氨基酸序列。

非常特别优选包含至少一个相应于SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：17第937-1035位的核苷酸序列、或至少一个相应于SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：17第889-1083位的核苷酸序列、或至少一个相应于SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：17第841-1131位的核苷酸序列、或至少一个相应于SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：17第793-1179位的核苷酸序列、或至少一个相应于SEQ ID NO：5或SEQID NO：17第601-1372位的核苷酸序列、或至少一个相应于SEQID NO：5或SEQ ID NO：17第304-1476位的核苷酸序列、或至少一个相应于SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：17第214-1476位的核苷酸序列的核酸分子。

SEQ ID NO：11和13以核苷酸序列以及SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14以所编码的氨基酸序列举例示出的本发明的阅读框可以额外含有一或多个导致一或多个保守性氨基酸置换的突变。所述突变优选导致不超过4％、不超过2％或不超过1％的保守性氨基酸置换。本发明的阅读框还可含有一或多个沉默突变。本发明的阅读框优选含有不超过4％和特别优选不超过2％至不超过1％的沉默突变。

本发明的分离的多核苷酸可以用于产生微生物的重组株，其与起始或亲代株相比以改良的方式向周围培养基释放或者在细胞中聚积氨基酸。

广泛使用的向棒状细菌基因中掺入突变的方法是等位基因置换方法，其也称为″基因置换(gene replacement)″。在这个方法中，含有所研究的突变的DNA片段被转移进棒状细菌的所需菌株中，并通过至少两次重组事件或″交换″事件，将所述突变掺入所需菌株的染色体中或者所研究的菌株中存在的基因序列用所述突变序列置换。

Schwarzer and Pühler(Bio/Technology 9，84-87(1991)已用这个方法将携带一个缺失的lysA等位基因和携带一个插入的lysA等位基因掺入谷氨酸棒杆菌的染色体的野生型基因位置。

et al.(Gene145，69-73(1994))已用这个方法将一个缺失掺入谷氨酸棒杆菌的hom-thrB操纵子中。Nakagawa et al.(EP 1108790)已用这个方法将始自分离的等位基因的不同突变掺入谷氨酸棒杆菌的染色体中。以此方式，Nakagawa et al.成功将名为Val59Ala的突变掺入谷氨酸棒杆菌菌株的高丝氨酸脱氢酶基因(hom)中、将名为Thr311Ile的突变掺入谷氨酸棒杆菌菌株的天冬氨酸激酶基因(lysC或ask)中、将名为Pro458Ser的突变掺入谷氨酸棒杆菌菌株的丙酮酸羧化酶基因(pyc)中以及将名为Ala213Thr的突变掺入谷氨酸棒杆菌菌株的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(zwf)中。

对于本发明的方法，可以使用包含整个编码区如SEQ ID NO：5的本发明的多核苷酸或者包含编码区一部分的多核苷酸，所述编码区一部分例如是至少编码相应于SEQ ID NO：6第313至345位的氨基酸序列并示于SEQ ID NO：14的核苷酸序列。相应于SEQ IDNO：14的编码区部分长度为99个核碱基。优选长度≥195个核碱基的编码区部分，例如编码至少一个相应于SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：18第297至361位的氨基酸序列的核酸分子。特别优选长度≥291个核碱基的那些编码区部分，例如编码至少一个相应于SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：18第281至377位的氨基酸序列的核酸分子。

在这个方法中，含有所研究的突变的DNA片段典型地存在于优选不复制或者在所提供突变的菌株中只有限程度复制的载体、尤其是质粒中。作为其中载体可复制的辅助或中间宿主，通常使用埃希氏菌属的细菌，优选大肠杆菌。

这种质粒载体的例子是

et al.(Gene 145，69-73(1994))所述的pK*mob和pK*mobsacB载体，例如pK18mobsacB和WO02/070685和WO 03/014362所述的载体。这些能够在大肠杆菌中复制而不能在棒状细菌中复制。含有具有条件负显性活性(konditionalnegativ dominant wirkendes)的基因如例如芽孢杆菌属的sacB基因(果聚糖蔗糖酶基因)或者例如大肠杆菌的galK基因(半乳糖激酶)的载体特别适合。(具有条件负显性活性的基因是指这样一种基因，其在特定条件下对于宿主是不利的，例如是毒性的，但是在其它条件下对携带该基因的宿主具有阴性作用。)这些允许选择重组事件，在其间载体从染色体中被除去。Nakamura et al.(US-A-6,303,383)也描述了对于棒状细菌的温度敏感质粒，其仅能够在低于31℃的温度下复制。

然后将载体通过接合(例如

(Journal of Bacteriology 172，1663-1666(1990))的方法)或者通过转化(例如Dunican and Shivnan(Bio/Technology 7，1067-1070(1989))的方法或者Thierbach et al.(Applied Microbiology and Biotechnology 29，356-362(1988))的方法转移进棒状细菌中。DNA的转移还可以任选通过颗粒轰击完成。

通过在靶基因或靶序列中完成整合的第一次“交换”事件和完成切除的适当的第二次“交换”事件的同源重组之后，完成突变的掺入并获得了重组细菌。

对于鉴定和定性所得的菌株，可以使用例如Southern印迹杂交法、聚合酶链反应、序列确定、″荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer)″(FRET)法(Lay et al.Clinical Chemistry 43，2262-2267(1997))或者酶学方法。

本发明因此还提供了产生棒状细菌的方法，其中

a)将本发明的多核苷酸转移进棒状细菌中，

b)存在于所述棒状细菌染色体中的6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因(该基因编码在氨基酸序列的329位或相当位置上具有L-缬氨酸的氨基酸序列)用a)的编码在氨基酸序列的329位或相当位置上具有不同的L-氨基酸、优选是L-甲硫氨酸的氨基酸序列的多核苷酸置换，及

c)扩增步骤a)和b)获得的棒状细菌。

以此方式获得了含有本发明的gnd等位基因代替野生型gnd基因的重组棒状细菌。

本发明产生微生物的另一个方法的包括：

a)将编码具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性的多肽的本发明的多核苷酸转移进微生物中，

b)在所述微生物中复制所述多核苷酸，及

c)扩增步骤a)和b)获得的微生物。

以此方式获得了重组微生物，其含有本发明编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的多核苷酸的至少一个(1)拷贝或多个拷贝，所述6-磷酸葡糖酸脱氢酶在所述编码的蛋白质氨基酸序列的第329位或相当位置上含有除L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸，优选用L-甲硫氨酸置换。

因此，本发明还提供了含有本发明多核苷酸的宿主或宿主细胞，优选是微生物，特别优选是棒状细菌和埃希氏菌属的细菌。本发明也提供了使用分离的多核苷酸产生的微生物。这种微生物或细菌也称为重组微生物或重组细菌。以相同方式，本发明提供了含有本发明多核苷酸的载体。最后，本发明也提供了含有这些载体的宿主。

本发明的分离的多核苷酸还可以用于实现其所编码的多肽的过表达。

过表达通常是指核糖核酸、蛋白质或酶的胞内浓度或活性的增加。在本发明中，过表达编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd等位基因或多核苷酸，所述6-磷酸葡糖酸脱氢酶在所编码蛋白质的氨基酸序列第329位含有除L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸，优选用L-甲硫氨酸置换。

已知N-末端氨基酸，特别是N-末端甲硫氨酸可以通过宿主固有的称为氨肽酶的酶从所得多肽中切除。

基因产物浓度或活性的所述增加可以例如通过增加相应多核苷酸的拷贝数至少一个拷贝来实现。

广泛使用的增加拷贝数的方法包括将相应基因或等位基因掺入被棒状细菌复制的载体、优选质粒中。合适的质粒载体是例如pZ1(Menkel et al.，Applied and Environmental Microbiology(1989)64：549-554)或pSELF载体，如Tauch et al.(Journal of Biotechnology 99，79-91(2002))所述。关于谷氨酸棒杆菌中质粒的综述文章可见于Tauch et al.(Journal of Biotechnology 104，27-40(2003))。

另一个广泛使用的实现过表达的方法是染色体基因扩增法。在这个方法中，所述研究中的基因或等位基因的至少一个额外拷贝被插入棒状细菌的染色体中。

在例如Reinscheid et al.(Applied and Environmental Microbiology60，126-132)所述的关于hom-thrB操纵子的实施方案中，在谷氨酸棒杆菌中不能复制并含有所研究基因的质粒被转移进棒状细菌中。通过“交换”事件的同源重组之后，所得菌株含有至少两个拷贝的所研究基因或等位基因。

WO 03/040373和US-2003-0219881-A1所述的另一个实施方案中，一或多个拷贝的所研究基因通过至少两次重组事件插入谷氨酸棒杆菌染色体的所需位点中。以此方式，例如编码L-赖氨酸不敏感性天冬氨酸激酶的lysC等位基因拷贝被掺入谷氨酸棒杆菌的gluB基因中。

WO 03/014330和US-2004-0043458-A1所述的另一个实施方案中，所研究的基因的至少一个额外拷贝、优选相对于已经存在的基因或等位基因是串联排列的额外拷贝通过在天然位点的至少两次重组事件被掺入。以此方式，例如在天然lysC基因位点获得了lysC^FBR 等位基因的串联重复。

实现过表达的另一个方法包括将相应基因或等位基因可操纵地连接于启动子或表达盒。对于谷氨酸棒杆菌合适的启动子描述于例如Patek et al.(Journal of Biotechnology 104(1-3)，311-323(2003)的综述文章。也可以使用已知很长时间并被Amann et al.(Gene 69(2)，301-315(1988))和Amann and Brosius(Gene 40(2-3)，183-190(1985))所述的启动子T3、T7、SP6、M13、lac、tac和trc。这种启动子可以插入例如重组棒状细菌的gnd等位基因的上游，典型地距离起始密码子大约1至500个核苷酸，所述重组棒状细菌在第329位天然存在的氨基酸L-缬氨酸的位置上含有不同的蛋白质氨基酸。这种启动子自然也可以被插入本发明突变株的gnd等位基因的上游。也可以将编码本发明6-磷酸葡糖酸脱氢酶变体的本发明分离的多核苷酸和启动子连接并将所得表达单位掺入染色体外复制质粒或棒状细菌染色体中。

而且，可以突变位于结构基因上游的启动子和调节区域或核糖体结合位点。也可以通过延长mRNA的寿命来提高表达。另外，也可以通过阻止酶蛋白的降解来增强酶活性。或者，所研究的基因或等位基因的过表达可以通过改变培养基的组成和进行培养的方式来实现。

通过过表达，相应蛋白质/多肽的活性或浓度基于起始微生物或亲代菌株中蛋白质的活性或浓度通常增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最高1000％或2000％。起始微生物或亲代菌株是指对其进行本发明方法的微生物。

确定6-磷酸葡糖酸脱氢酶的酶活性的方法描述于Moritz et al.(European Journal of Biochemistry 267，3442-3452(2000))。

蛋白质的浓度可以在凝胶中通过单向和双向蛋白质凝胶分离及使用适当的评估软件随后光学鉴定蛋白质浓度而确定。在棒状细菌的情况中，制备蛋白质凝胶和鉴定蛋白质的一般方法是Hermann etal.(Electrophoresis，22：1712-23(2001))所述的方法。蛋白质浓度也可以使用针对所述要检测蛋白质的特异性抗体通过Western印迹杂交(Sambrook et al.，Molecular cloning：a laboratory manual.2^nd Ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)及使用适当的浓度确定软件随后光学评估来进行确定(Lohaus and Meyer(1998)Biospektrum 5：32-39；Lottspeich，Angewandte Chemie 111：2630-2647(1999))。

因此，本发明提供了过表达本发明6-磷酸葡糖酸脱氢酶的方法。本发明过表达方法包括例如增加本发明编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶变体的多核苷酸的拷贝数至少一个(1)或多个拷贝，在所述变体中所编码的氨基酸序列的第329位或相应位置存在除L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸。本发明的另一个方法包括将启动子可操纵地连接于多核苷酸。

本发明还提供了在其细胞内显示本发明6-磷酸葡糖酸脱氢酶变体的浓度或活性增加的微生物。

另外，在本发明的突变株或重组菌株中过表达一或多个所研究的生物合成途径的酶、糖酵解的酶、添补途径的酶、柠檬酸循环的酶、戊糖磷酸循环的酶、氨基酸输出的酶和任选调节蛋白质对于改良生产L-氨基酸可能是有利的。通常优选使用内源基因。

术语″内源基因″或″内源核苷酸序列″是指种群中存在的基因或核苷酸序列或等位基因。

因此，对于生产L-赖氨酸，可以过表达选自如下一组的一或多个基因

·编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因dapA，例如EP 0 197 335所述的野生型谷氨酸棒杆菌dapA基因，

·编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因zwf，例如JP-A-09224661和EP-A-1108790所述的野生型谷氨酸棒杆菌zwf基因，

·US-2003-0175911-A1所述的谷氨酸棒杆菌的zwf等位基因，其编码一种蛋白质，在所述蛋白质中例如氨基酸序列的第243位的L-丙氨酸被L-苏氨酸置换或其中245位的L-天冬氨酸被L-丝氨酸置换，

·编码丙酮酸羧化酶的基因pyc，例如DE-A-198 31 609和EP1108790所述的野生型谷氨酸棒杆菌pyc基因，

·EP 1 108 790所述的谷氨酸棒杆菌pyc等位基因，其编码一种蛋白质，其中氨基酸序列的第458位L-脯氨酸被L-丝氨酸置换，及

·WO 02/31158所述的谷氨酸棒杆菌的pyc等位基因，其编码权利要求1的携带选自如下一组的一或多个氨基酸置换的蛋白质：153位的L-谷氨酸被L-天冬氨酸置换，182位的L-丙氨酸被L-丝氨酸置换，206位的L-丙氨酸被L-丝氨酸置换，227位的L-组氨酸被L-精氨酸置换，452位的L-丙氨酸被甘氨酸置换，及1120位的L-天冬氨酸被L-谷氨酸置换(WO 02/31158的图2A指示了丙酮酸羧化酶的两个不同起始位置，其长度相差17个氨基酸。因此，WO 02/31158的权利要求1的153位相应于WO 02/31158的图2A的170位，权利要求1的182位相应于图2A的199位，权利要求1的206位相应于图2A的223位，权利要求1的227位相应于图2A的244位，权利要求1的452位相应于图2A的469位，权利要求1的1120位相应于图2B的1137位。WO 02/31158的图2A也示出了472位氨基酸置换A(丙氨酸)为G(甘氨酸)。具有N-末端序列MTA的蛋白质472位相应于图2A的具有N-末端序列MST的蛋白质的455位。WO 02/31158 的图2B也示出了具有N-末端MTA的蛋白质的1133位的氨基酸置换D(天冬氨酸)为E(谷氨酸)。)，

·编码天冬氨酸激酶的lysC基因，例如EP-A-1108790的SEQID NO：281所述的野生型谷氨酸棒杆菌lysC基因(也见登录号AX120085和120365)及WO 01/00843的SEQ ID NO：25所述的基因(见登录号AX063743)，

·编码反馈抗性天冬氨酸激酶变体、特别是表1的lysC^FBR等位基因，

·编码赖氨酸输出蛋白的基因lysE，例如DE-A-195 48 222所述的野生型谷氨酸棒杆菌lysE基因，

·编码Zwa1蛋白的野生型谷氨酸棒杆菌基因zwa1(US6,632,644)。

除了使用本发明的gnd基因的等位基因，同时弱化或排除选自如下一组的一或多个内源基因对于生产L-赖氨酸可能也是有利的：

·编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的基因pgi，例如US 6,586,214和US 6,465,238所述的谷氨酸棒杆菌pgi基因，

·编码果糖-6-二磷酸醛缩酶的基因fda，例如von der Osten et al.(Molecular Microbiology 3(11)，1625-1637(1989))所述的登录号为X17313的谷氨酸棒杆菌fda基因，

·编码高丝氨酸脱氢酶的基因hom，例如EP-A-0131171所述的谷氨酸棒杆菌hom基因，

·编码高丝氨酸激酶的基因thrB，例如Peoples et al.(MolecularMicrobiology 2(1988)：63-72))所述的谷氨酸棒杆菌thrB基因及

·编码磷酸果糖激酶的基因pfkB，例如WO 01/00844所述的谷氨酸棒杆菌pfkB基因(序列号57)。

本文术语″弱化″是指通过例如使用弱启动子或使用编码具有低水平活性的相应酶的基因或等位基因或通过使相应基因或酶(蛋白质)失活及任选地组合这些方法来降低或排除微生物内相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性。

通过弱化方法，相应蛋白质的活性或浓度通常降低至野生型蛋白质的活性或浓度或起始微生物中蛋白质的活性或浓度的0至75％、0至50％、0至25％、0至10％或0至5％。

对于产生弱化的突变，考虑转换、颠换、插入和缺失至少一个(1)碱基对或核苷酸。根据突变引起的氨基酸置换对酶活性的作用，使用术语错义突变或无义突变。错义突变导致蛋白质中特定氨基酸被另一个置换，所述氨基酸置换尤其是非保守性氨基酸置换。因而蛋白质的功能性能力或活性被损害并降低至0至75％、0至50％、0至25％、0至10％或0至5％。无义突变在所述基因编码区中产生了终止密码子，因此翻译中断提前。由于不正确的氨基酸掺入或翻译中断提前，基因中插入或缺失至少一个碱基对导致移码突变。如果由于突变在编码区中形成了终止密码子，这也导致翻译中断提前。缺失至少一个(1)或多个密码子也典型导致酶活性的完全丧失。

产生这种突变的指导构成了现有技术的一部分并可以见于已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Knippers(″Molekulare Genetik″，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)和Winnacker(″Gene und Klone″，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或Hagemann(″Allgemeine Genetik″，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1986)的教科书。现有技术描述了其它方法。

通过本发明的方法获得的分离的棒状细菌与所用的起始菌株或亲代菌株相比显示了胞内NADPH供应增加和/或发酵方法中所需氨基酸的分泌或生产增加。

分离的细菌是指本发明的分离的或产生的突变株或重组细菌，尤其是棒状细菌，其含有编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd等位基因，该酶在氨基酸序列的第329位含有所需的氨基酸置换。

相对于起始菌株或亲代菌株或使用所述菌株的发酵方法，分离的细菌的性能或使用分离的细菌的发酵方法的性能在选自产物浓度(每体积的产物)、产物产量(每消耗的碳源形成的产物)和产物形成(每体积和时间形成的产物)或其它方法参数及其组合中的一或多个参数方面提高至少0.5％、至少1％、至少1.5％或至少2％。

为生产L-氨基酸，本发明分离的棒状细菌可连续生产-如例如PCT/EP2004/008882所述-或通过分批方法或通过补料分批(fedbatch)或重复补料分批方法(repeated fed batch verfahren)不连续生产。已知培养方法的一般总结在教科书Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(ViewegVerlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))中可获得。

使用的培养基或发酵培养基必须以适当方式满足所研究菌株的要求。用于不同微生物的培养基的描述可见于手册″Manual ofMethods for General Bacteriology″，American Society for Bacteriology(Washington D.C.，USA，1981)。术语培养基和发酵培养基可互相交换使用。

可以用作碳源的是糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、来自甜菜或甘蔗生产的含蔗糖溶液、淀粉、淀粉水解产物和纤维素，油和脂肪，例如大豆油、葵花油、落花生油和椰子油，脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇，例如丙三醇、甲醇和乙醇，和有机酸，例如乙酸。这些物质可以单独使用或以混合物的形式使用。

可以用作氮源的是有机含氮化合物，例如胨、酵母提取物、肉膏、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或者无机化合物，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独使用或以混合物的形式使用。

可以用作磷源的是磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。

培养基也必须含有对于生长是必需的盐，例如以金属例如钠、钾、镁、钙和铁的氯化物或硫化物的形式，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质，还可以使用生长必需物质，如氨基酸，例如高丝氨酸，和维生素，例如硫胺素、生物素或泛酸。特定氨基酸的适当前体也可以加入培养基中。

所述物质可以单批的形式加入培养物中，或者其在培养过程中适当地补加。

为了控制培养物的pH，碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或酸性化合物如磷酸或硫酸可以方便使用。pH通常调节至6.0至9.0，优选6.5至8。为了控制泡沫的产生，可以使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定性，可以向培养基中加入具有选择作用的适当物质，例如抗生素。为了维持有氧条件，可以向培养物中导入氧气或含氧气体混合物，例如空气。也可以使用添加了过氧化氢的液体。任选发酵在过压下进行，例如在0.03至0.2MPa的压力下进行。培养物的温度通常为20℃至45℃及优选从25℃至40℃。在分批方法中，持续培养直至形成了最大量的所需氨基酸。这个目的通常在10小时至160小时内完成。在连续方法中，培养时间可以更长。

适当的发酵培养基的例子见于例如专利说明书5,770,409、US5,840,551和US 5,990,350或US 5,275,940。

现有技术已知确定L-氨基酸的方法。所述分析可以例如Spackman et al.(Analytical Chemistry，30，(1958)，1190)所述通过阴离子交换层析及随后的茚三酮衍生化来进行，或者其可以通过反相HPLC来进行，如Lindroth et al.(Analytical Chemistry(1979)51：1167-1174)所述。

因此，本发明提供了生产L-氨基酸的方法，其中

a)在适当的培养基中发酵分离的棒状细菌，所述细菌含有编码具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性的蛋白质的基因，其中在蛋白质的氨基酸序列的第329位或相应位置的L-缬氨酸被不同的蛋白质氨基酸置换，及

b)在发酵液或分离的棒状细菌的细胞中浓缩L-氨基酸。

然后将以此方式产生的发酵液进一步加工以形成固体或液体产物。

发酵液是指发酵培养基，其中在某个温度微生物被培养了一段时间。发酵培养基或发酵过程中使用的培养基含有保证微生物扩增和所需氨基酸形成的所有物质或成分。

当发酵完成时，所得的发酵液相应含有a)由于微生物细胞的扩增而形成的微生物的生物量，b)发酵过程中形成的所需氨基酸，c)发酵过程中形成的有机副产物，及d)发酵中未被消耗的所用发酵培养基或所用物质的成分，例如维生素如生物素，氨基酸如高丝氨酸或盐如硫酸镁。

有机副产物包括发酵中所用的微生物除了特定所需L-氨基酸以外而产生的、任选分泌的物质。其包括L-氨基酸，其与所需氨基酸相比小于30％、20％或10％。其也包括携带一至三个羧基基团的有机酸，例如乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸或反丁烯二酸。最后，其也包括糖，例如海藻糖。

典型的适于工业目的的发酵液氨基酸含量为40g/kg至180g/kg或从50g/kg至150g/kg。生物量(如干生物量(getrocknetebiomasse))的含量通常为20至50g/kg。

在L-赖氨酸的情况中，基本上形成了本领域已知的四种不同产物。

一组含L-赖氨酸的产物包括纯化的L-赖氨酸的浓缩的、含水的碱性溶液(EP-B-0534865)。例如US 6,340,486和US 6,465,025所述的另一组包含含L-赖氨酸的发酵液的含水酸性含生物量的浓缩物。最熟知的固体产物组包含粉末或结晶形式的纯化的或纯L-赖氨酸，其典型地以盐例如L-赖氨酸一氢氯化物的形式存在。另一组固体产物形式描述于例如EP-B-0533039。其中描述的产物形式除了L-赖氨酸还含有发酵生产中使用的、没有消耗的多数物质，任选所用微生物的生物量的量从＞0％至100％。

相应于不同产物形式，已知许多不同方法用于从发酵液中收集、分离或纯化L-氨基酸以生产含L-氨基酸的产物或纯化的L-氨基酸。

为生产固体、纯的L-氨基酸，主要使用离子交换层析方法，任选使用活化的碳，和结晶方法。在赖氨酸的情况中，这些方法产生了相应的碱或相应的盐，例如一氢氯化物(Lys-HCl)或硫酸赖氨酸(Lys₂-H₂SO₄)。

在赖氨酸的情况下，EP-B-0534865描述了用于从发酵液中生产含水的碱性的含L-赖氨酸溶液的方法。在其中所述的方法中，生物量从发酵液中分离并丢弃。通过碱例如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵建立9至11的pH值。浓缩和冷却后，矿物成分(无机盐)通过结晶从液体中分离并且作为用作肥料或丢弃。

在本发明的使用所述细菌生产赖氨酸的方法中，优选那些产生含有发酵液成分的产物的方法。这些特别用作动物饲料添加剂。

根据要求，通过分离方法例如离心、过滤、倾析或其组合从发酵液中除去所有或部分生物量，或者所用生物量可以留在其中。所述生物量或含生物量的发酵液在适当的方法步骤中任选被失活，例如通过热处理(加热)或通过加入酸。

在一种方法中，所有或实质上所用生物量被除去，以此没有生物量(0％)或不超过30％、不超过20％、不超过10％、不超过5％、不超过1％或不超过0.1％的生物量保留在所生产的产物中。在另一个方法中，生物量未被除去或者仅有少部分被除去，以此所有生物量(100％)或超过70％、80％、90％、95％、99％或99.9％的生物量保留在所生产的产物中。因此在本发明的方法中，生物量被除去的量为≥0％至≤100％。

最后，在除去所有或一些生物量之前或之后，发酵后获得的发酵液可使用无机酸例如盐酸、硫酸或磷酸或有机酸例如丙酸调节至酸性pH值(GB 1,439,728或EP 1 331 220)。也可以酸化其中含有所有生物量的发酵液。最后，也可以通过加入亚硫酸氢钠(NaHSO₃，GB1,439,728)或者另一种盐例如亚硫酸的铵盐或者碱或碱土金属盐稳定所述液体。

当分离所述生物量时，发酵液中含有的任何有机或无机固体任选被部分或完全除去。发酵液中溶解的有机副产物和未被消耗的发酵培养基的溶解的成分(所用物质)至少部分(＞0％)保留在产物中，优选量为至少25％、特别优选量为至少50％和非常特别优选量为至少75％。其任选也可以完全(100％)或实质上完全即＞95％或＞98％保留在产物中。在本文中，术语″基于发酵液″是指产物含有至少发酵液的成分的一部分。

使用已知方法例如借助于旋转蒸发器、薄层蒸发器、降膜蒸发器、通过反渗透或者通过纳米过滤从液体中除去水份或者使液体浓稠或浓缩。这种浓缩的发酵液然后可以通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾粒化的方法或者其它方法例如PCT/EP2004/006655的循环流化床加工以形成易流动产物，尤其是形成细粒粉末或优选粗糙颗粒。所需的产物任选通过筛分或灰尘分离分离自所得的颗粒。

也可以通过喷雾干燥或喷雾粒化直接干燥发酵液，即没有预先的浓缩。

术语″易流动″是指在一系列具有不同大小的出口开口的玻璃排出容器中，至少无阻碍通过具有5mm(毫米)开口的容器的粉末(Klein：Seifen，Ole，Fete，Wachse 94，12(1968))。

″细粒″指其中主要部分(＞50％)具有20至200μm直径的粒度的粉末。

″粗糙″指其中主要部分(＞50％)具有200至2000μm直径的粒度的产物。

粒度可以使用激光衍射光谱测定法的方法确定。相应方法描述于教科书″ in der Laborpraxis″，R.H.Müllerand R.Schuhmann，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart(1996)或者教科书″Introduction to Particle Technology″，M.Rhodes，VerlagWiley&Sons(1998)。

易流动、细粒粉末通过适当的压制或者粒化方法依次可以被转化为粗糙、易于流动、耐储存和大部分无灰尘的产物。

术语″无灰尘″指产物仅有小部分(＜5％)粒度低于100μm直径。

本发明文中的″耐储存″指可以在干燥阴凉环境下储存至少一(1)年或更长、优选至少1.5年或更长、特别优选两(2)年或更长而所研究的特定氨基酸没有任何实质损失(＜5％)的产物。

因此本发明还提供了从发酵液生产一种产物优选是含有L-氨基酸、优选L-赖氨酸或L-色氨酸的动物饲料添加剂的方法，特征在于如下步骤

a)在发酵培养基中培养和发酵棒状细菌，其分泌L-氨基酸并含有至少一个gnd等位基因，该基因编码一种多肽，该多肽具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性并包含其中在第329位或相当位置上存在除L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸的氨基酸序列，

b)除去发酵过程中形成的生物量的量0至100wt％，及

c)干燥a)和/或b)获得的发酵液以获得所需粉末或颗粒形式的产物，

其中在步骤b)或c)之前任选加入选自硫酸、磷酸和盐酸的酸。

步骤a)或b)后，优选从含L-氨基酸的发酵液中除去水份(浓缩)。

粒化或压制过程中，使用常规的有机或无机辅助物质或载体如淀粉、明胶、纤维素衍生物或相似物质如在加工食品或饲料中常规使用的粘合剂、胶凝剂或增稠剂、或者其它物质例如二氧化硅、硅酸盐(EP0743016A)和硬脂酸盐是有利的。

如WO 04/054381所述，向所得颗粒的表面提供油也是有利的。油可以使用矿物油、植物油或植物油混合物。这种油的例子是豆油、橄榄油、豆油/卵磷脂混合物。以相似方式，硅油、聚乙二醇或羟乙基纤维素也是合适的。通过用所述油处理表面，获得了产物的升高的抗磨损性并且减少了灰尘含量。基于饲料添加剂的总量，产物中油的含量为0.02至2.0wt.％、优选0.02至1.0wt.％及非常特别优选0.2至1.0wt.％。

优选具有100至1800μm粒度的比例≥97wt.％或者具有300至1800μm直径的粒度的比例≥95wt.％的产物。灰尘即粒度＜100μm的颗粒的比例优选＞0至1wt.％、特别优选不超过0.5wt.％。

然而，或者也可以将产物加到在饲料加工中已知并是常规的有机或无机载体上，例如二氧化硅、硅酸盐、谷粒、糠、粗磨粉、淀粉、糖等，和/或将产物和常规的增稠剂或粘合剂混合并使其稳定。应用例子和方法描述于文献(Die Mühle+Mischfuttertechnik 132(1995)49，page 817)。

最后，也可以通过使用成膜剂例如金属碳酸盐、二氧化硅、硅酸盐、藻酸盐、硬脂酸盐、淀粉、树胶和纤维素醚的包被方法使产物处于对于动物胃、尤其是反刍动物胃的消化是稳定的状态，如DE-C-4100920所述。

为在产物中获得所需的氨基酸浓度，如需要，可以在所述方法中以浓缩物的形式或任选地以大部分纯物质的形式或其液体或固体形式的盐的形式加入适当的氨基酸。这些也可以单独加入或者作为混合物加入到所得的或浓缩的发酵液中，或者在干燥或粒化方法中加入。

在赖氨酸的情况中，调节生产含赖氨酸产物的过程中离子比例使得根据下式的离子比例为0.68至0.95、优选0.68至0.90，

2x[SO₄ ^2-]+[Cl^-]-[NH₄ ⁺]-[Na⁺]-[K⁺]-2x[Mg⁺]-2x[Ca²⁺]/[L-Lys]，

如Kushiki et al.在US 20030152633中所述。

在赖氨酸的情况中，以此方式生产的基于发酵液的固体产物的赖氨酸含量(作为赖氨酸碱(lysinbase))基于产物干重为10wt.％至70wt.％或20wt.％至70wt.％、优选30wt.％至70wt.％及非常特别优选40wt.％至70wt.％。赖氨酸碱的最大含量可以为71wt.％、72wt.％、73wt.％。

在电中性氨基酸如L-色氨酸的情况中，以此方式生产的基于发酵液的固体产物的氨基酸含量为至少5wt.％、10wt.％、20wt.％、30wt.％及不超过50wt.％、60wt.％、70wt.％、80wt.％、90wt.％或直至95wt.％。

固体产物中水含量多至5wt.％、优选多至4wt.％及特别优选少于3wt.％。

命名为DM1797的谷氨酸棒杆菌突变株于2004年10月28日保藏在德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismenund Zellkulturen，DSMZ，Brunswick，Germany)，保藏号为DSM16833，其在天冬氨酸激酶中含有氨基酸置换lysC T311I。

本发明的谷氨酸棒杆菌DM1798突变株于2004年10月28日保藏在德国微生物保藏中心(DSMZ，Brunswick，Germany)，保藏号为DSM 16834，其含有氨基酸置换gnd V329M。

实施例1

诱变产L-赖氨酸菌株DM1797

谷氨酸棒杆菌菌株DM1797用作使用N-甲基N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱变的起始菌株。菌株DM1797是谷氨酸棒杆菌ATCC13032的氨乙基半胱氨酸抗性突变株并且已被保藏于德国微生物保藏中心，保藏号DSM16833(DSMZ，Brunswick，Germany)。

在100ml锥形烧瓶中含有的10ml的LB肉汤(Merck，Darmstadt，Germany)中在33℃、200rpm的Certomat BS-1型旋转摇床(B.BraunBiotech International，Melsungen，Germany)上将菌株DM1797培养24小时。然后离心培养物，重悬沉淀于10ml 0.9％的NaCl溶液，再次离心所得的悬浮液，并将所得的沉淀溶于10ml 0.9％NaCl溶液。5ml这种细胞悬浮液在30℃和200rpm的摇床(如上)上用400μg/ml的MNNG处15分钟。然后离心诱变批次并将沉淀溶于在0.9％NaCl缓冲液中的10ml的2％硫代硫酸钠中(pH＝6.0)。然后用0.9％NaCl溶液以1∶1000、1∶10,000和1∶100,000的比例稀释细胞悬浮液并将等份溶液铺板在脑心琼脂上(Merck，Darmstadt，Germany)。以此方式分离了大约2500个突变株。

实施例2

测试菌株DM1797突变株的效率

实施例1中获得的突变株在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养上清中的赖氨酸含量。

为此，将克隆首先在脑心琼脂平板(Merck，Darmstadt，Germany)上在33℃增殖24小时。从这些琼脂平板培养物开始，在每种情况中都接种预培养物(在100ml的锥形烧瓶中10ml培养基)。MM培养基用作预培养物的培养基。在33℃和240rpm的摇床上接种预培养物24小时。从这种预培养物接种主培养物，以便主培养物的最初OD(660nm)为0.1OD。MM培养基也用于主培养物。

MM培养基

CSL 5g/l

MOPS 20g/l

葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/l

盐：

(NH₄)₂SO₄) 25g/l

KH₂PO₄ 0.1g/l

MgSO₄*7H₂O 1.0g/l

CaCl₂*2H₂O 10mg/l

FeSO₄*7H₂O 10mg/l

MnSO₄*H₂O 5.0mg/l

生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l

硫胺*HCl(过滤灭菌) 0.2mg/l

CaCO₃ 25g/l

CSL(玉米浆)、MOPS(吗啉代丙烷磺酸)和盐溶液用氨水调节为pH7并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液以及干燥的高压灭菌的CaCO₃。

在100ml带隔板的锥形烧瓶中的10ml体积中进行培养。温度为33℃、旋转速度为250rpm及湿度为80％。

24小时后，使用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm的测量波长下确定光密度(OD)。使用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)的氨基酸分析仪通过离子交换层析以及用茚三酮检测柱后衍生化来确定形成的赖氨酸的量。通过增加的赖氨酸形成来区分的一个突变株命名为DM1798。

表1

菌株	OD(660)	赖氨酸HCl(g/l)
			DM1797	9.2	2.2
DM1798	9.2	2.4

实施例3

突变株DM1798的gnd基因的测序

通过Eikmanns et al.(Microbiology 140：1817-1828(1994))所述方法从克隆DM1798分离染色体DNA。通过聚合酶链反应，扩增携带gnd基因的DNA片段。如下寡核苷酸用作用于此的引物：gnd-A1(SEQ ID NO：7)：5`ccataattggcgttgttgag 3`gnd-E1(SEQ ID NO：8)：5`cgcaaggttattggaacaag 3`

通过MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成所示引物。其允许扩增携带gnd基因、长度为大约1.85kb的DNA片段。引物gnd-A1结合相应于与SEQ ID NO：3互补的链的第1至20位的区域。引物gnd-E1结合相应于SEQ ID NO：3的链的第1866至1847位的区域。

使用Phusion高保真DNA聚合酶(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)进行PCR反应。根据厂商指导和制备反应批次并且总体积为50μl，其含有同时提供的10μl的5x Phusion HF缓冲液、每种浓度为200μM的脱氧核苷三磷酸、浓度为0.5μM的引物、大约50ng的模板DNA和2单位的Phusion聚合酶。通过加H₂O调节体积为50μl。

首先将PCR批次在98℃进行起始变性30秒。然后重复35次：变性步骤：98℃，20描述；引物结合导入的DNA的步骤：60℃，20秒和延长引物的延伸步骤：72℃，60秒。在72℃、5分钟的最终延伸步骤之后，将PCR批次进行琼脂糖凝胶电泳(0.8％琼脂糖)。长度为大约1.85kb的DNA片段被鉴定，从凝胶中分离并使用Qiagen(Hilden，Germany)的QIAquick Gel Extraction Kit纯化。

扩增的DNA片段或PCR产物的核苷酸序列通过Agowa(Berlin，Germany)确定。获得的gnd等位基因的编码区序列示于SEQ IDNO：17。通过Patentin程序获得的相关的6-磷酸葡糖酸脱氢酶蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：18。

突变株DM1798的gnd等位基因的编码区的核苷酸序列在第985位含有核碱基腺嘌呤(见SEQ ID NO：5)。野生型基因(见SEQ IDNO：1)在这个位置含有核碱基鸟嘌呤。这种鸟嘌呤-腺嘌呤转换导致所得氨基酸序列的第329位的缬氨酸氨基酸置换为甲硫氨酸。这种突变下文称为gndV329M。而且，DM1798的gnd等位基因也含有不导致氨基酸置换(“沉默突变“)的5个另外的核苷酸置换：510位的鸟嘌呤-腺嘌呤转换、612位的胞嘧啶-鸟嘌呤颠换、786位的腺嘌呤-鸟嘌呤转换、813位的胸腺嘧啶-胞嘧啶转换和1470位的胸腺嘧啶-鸟嘌呤颠换。

实施例4

构建置换载体pK18mobsacB_gndV329M

通过聚合酶链反应，扩增称为内部片段或内部区域的、携带突变gndV329M的gnd等位基因的编码区的一部分。实施例3中获得的染色体DNA用作模板。选择以下寡核苷酸作为PCR的引物：

gnd-int1-eco(SEQ ID NO：20)：5`ctag-gaattc-ttcgtcggtgctggtatctc 3`

gnd-int2-eco(SEQ ID NO：21)：5`ctag-gaattc-gtcgatgcgcttgtaggtgt 3`

其由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成并且其可以扩增长度为大约1kb的编码区的DNA片段。引物gnd-int1-eco的第11至30位核苷酸结合相应于与SEQ ID NO：3互补的链的第629至648位的区域。SEQ IN NO：3的第629和648相应于SEQ ID NO：1的第403和422位。引物gnd-int2-eco的第11至30位核苷酸结合相应于SEQ ID NO：3的链的第1648至1629位的区域。SEQ ID NO：3的第1648和1629位相应于SEQ ID NO：1的第1422和1403位。引物另外还含有限制性内切核酸酶EcoRI的切割位点序列，其在如上所示的核苷酸序列中以下划线标出。

使用Phusion高保真DNA聚合酶(New England Biolabs，Frankfurt，Germany)进行PCR反应。反应批次具有上述组成。如上进行PCR，除了一个例外：在35次重复中72℃的延伸步骤每次只进行30秒。

用限制性内切核酸酶EcoRI处理大约1kb长的扩增物并在0.8％琼脂糖凝胶中通过电泳鉴定。然后从凝胶中将其分离并使用Qiagen的QIAquick Gel Extraction Kit纯化。

如此纯化的DNA片段含有所述的gndV329M突变并具有EcoRI-相容末端(gndV329M片段)。然后将其掺入

et al.(Gene，145，69-73(1994)所述的可移动载体pK18mobsacB中以允许等位基因或突变置换。最终，pK18mobsacB用限制性酶EcoRI消化并且末端用碱性磷酸酶去磷酸化(Boehringer Mannheim，Germany)。如此制备的载体与gndV329M片段混合并且批次用Ready-To-Go T4 DNA LigaseKit(Amersham-Pharmacia，Freiburg，Germany)处理。

然后用连接批次转化(Hanahan，in DNA cloning.A practicalapproach.Vol.1.ILR-Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)大肠杆菌菌株S17-1(Simon et al.，Bio/Technologie 1：784-791，1993)。通过在已补加了25mg/l卡那霉素的LB琼脂上铺板转化批次进行携带质粒的细胞的选择(Sambrock et al.，Molecular Cloning，a laboratorymanual.2nd ed.Cold Spring Harbor，New York，1989)。

从转化体中借助于Qiagen的QIAprep Spin Miniprep Kit分离质粒DNA并通过酶HindIII的限制性切割和随后的琼脂糖凝胶电泳测试。质粒命名为pK18mobsacB_gndV329M，并示于图1。

实施例5

将突变gndV329M掺入菌株DM1797

根据

et al.(Journal of Microbiology 172：1663-1666(1990))所述的方案，通过接合将实施例4中所述的载体pK18mobsacB_gndV329M转移进谷氨酸棒杆菌菌株DM1797中。载体自身不能在DM1797中复制并且只有在其由于重组事件整合进染色体时才能保留在细胞中。通过在补加了25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB琼脂上铺板接合批次来进行转接合子即具有整合的 pK18mobsacB_gndV329M的克隆的选择。然后将卡那霉素抗性转接合子铺在补加了卡那霉素(25mg/l)的LB琼脂平板上并在33℃下温育24小时。为了选择由于二次重组事件发生质粒切除的突变体，将克隆在LB液体培养基中非选择性培养30小时，然后铺在补加了10％蔗糖的LB琼脂上并在33℃温育24小时。

质粒pK18mobsacB_gndV329M，如起始质粒pK18mobsacB一样，除了卡那霉素抗性基因还含有编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的sacB基因的拷贝。由蔗糖可诱导的sacB基因的表达导致形成果聚糖蔗糖酶，其催化产物果聚糖的合成，果聚糖对于谷氨酸棒杆菌是毒性的。因此，只有整合的pK18mobsacB_gndV329M由于二次重组事件被切除的那些克隆才能生长在补加了蔗糖的LB琼脂上。根据二次重组事件相对于突变位点的位置，在切除过程中发生等位基因置换或突变掺入，或者原始拷贝保留在宿主的染色体中。

然后寻找发生了所需置换即掺入突变gndV329M的克隆。为此，对10个具有“在存在蔗糖时生长”和“在存在卡那霉素时不生长”表型的克隆确定了gnd基因的序列。如此，鉴定了携带突变gndV329M的克隆。这个菌株被命名为谷氨酸棒杆菌DM1797_gndV329M。

实施例6

比较菌株DM1797_gndV329M和起始菌株DM1797的效率

如实施例2所述进行效率测试。测试结果示于表表2。

表2

菌株	OD(660)	赖氨酸HCl(g/l)
			DM1797	9.3	2.1
DM1797_gndV329M	9.3	2.3

[0318] 附图简述：

图1：质粒pK18mobsacB_gndV329M图

所用简写和命名具有如下含义。当给出碱基对(bp)数时，这是在可重复测量范围内获得的大约值。

Kan：卡那霉素抗性基因

EcoRI：限制酶EcoRI的切割位点

HindIII：限制酶HindIII的切割位点

′gnd′：含有突变株DM1798的gnd等位基因的内部区

域的克隆的DNA片段

sacB： sacB基因

RP4-mob：具有用于转移的复制起点(oriT)的mob区域

oriV：复制起点V

Claims

1.含有编码一种多肽的基因的棒状细菌的分离株，其中所述多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列第329位的氨基酸替换为L-甲硫氨酸所构成的氨基酸序列组成，其中所述细菌是谷氨酸棒杆菌。

2.权利要求1的棒状细菌，其中所述细菌分泌L-氨基酸。

3.权利要求2的棒状细菌，其中所述细菌分泌L-赖氨酸。

4.权利要求1-3任一项的棒状细菌，其中所述基因包含与使用从棒状细菌获得的DNA及引物对通过聚合酶链反应（PCR）获得的多核苷酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，所述引物对由第一引物和第二引物组成，所述第一引物由选自SEQ ID NO：3的第1和226位之间的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸组成，所述第二引物由选自SEQ ID NO：3的第1866和1703位之间的互补核苷酸序列的至少15个连续核苷酸组成。

5.权利要求1-3任一项的棒状细菌，其中所述基因由与SEQ IDNO：5的核苷酸序列相同的核苷酸序列组成。

6.权利要求1-3任一项的棒状细菌，其中所述基因由在SEQ IDNO：5中导入下列的至少一或多个置换形成的核苷酸序列组成：93位的鸟嘌呤代替胞嘧啶、375位的腺嘌呤代替鸟嘌呤、510位的腺嘌呤代替鸟嘌呤、612位的鸟嘌呤代替胞嘧啶、786位的鸟嘌呤代替腺嘌呤、813位的胞嘧啶代替胸腺嘧啶、1014位的鸟嘌呤代替胸腺嘧啶、1380位的胞嘧啶代替腺嘌呤、1470位的鸟嘌呤代替胸腺嘧啶。

7.权利要求6的棒状细菌，其中所述基因由SEQ ID NO：17的核苷酸序列组成。

8.一种分离的多核苷酸，其中被其编码的多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列第329位的氨基酸替换为L-甲硫氨酸所构成的氨基酸序列组成。

9.权利要求8的分离的多核苷酸，其中其与使用从棒状细菌获得的DNA和引物对通过聚合酶链反应（PCR）获得的多核苷酸的核苷酸序列相同，所述引物对由第一引物和第二引物组成，所述第一引物由选自SEQID NO：3的第1和226位之间的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸组成，所述第二引物由选自SEQ ID NO：3的第1866和1703位之间的互补核苷酸序列的至少15个连续核苷酸组成，其中所述细菌是谷氨酸棒杆菌。

10.权利要求8的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸由与SEQ IDNO：5的核苷酸序列相同的核苷酸序列组成。

11.权利要求8的分离的多核苷酸，其中所述核苷酸序列由在SEQ IDNO：5中导入选自如下一组的一或多个碱基置换形成的核苷酸序列组成：93位的鸟嘌呤代替胞嘧啶、375位的腺嘌呤代替鸟嘌呤、510位的腺嘌呤代替鸟嘌呤、612位的鸟嘌呤代替胞嘧啶、786位的鸟嘌呤代替腺嘌呤、813位的胞嘧啶代替胸腺嘧啶、1014位的鸟嘌呤代替胸腺嘧啶、1380位的胞嘧啶代替腺嘌呤、1470位的鸟嘌呤代替胸腺嘧啶。

12.权利要求11的分离的多核苷酸，其中所述核苷酸序列由SEQ IDNO：17组成。

13.一种生产重组棒状细菌的方法，其中

a)将权利要求8至12任一项的分离的多核苷酸转移进棒状细菌，其中所述细菌是谷氨酸棒杆菌，

b)将存在于所述谷氨酸棒杆菌染色体中的、编码在氨基酸序列的第329位具有L-缬氨酸的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的基因置换为编码在第329位具有L-甲硫氨酸的氨基酸序列的a）的多核苷酸，及

c)增殖步骤a)和b)获得的棒状细菌。

14.一种重组微生物，其含有权利要求8至12任一项的分离的多核苷酸，其中所述细菌是谷氨酸棒杆菌。

15.一种载体，其含有权利要求8至12任一项的分离的多核苷酸。

16.一种重组微生物，其含有权利要求15的载体，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌。

17.一种在微生物中过表达由SEQ ID NO:2的氨基酸序列第329位的氨基酸替换为L-甲硫氨酸所构成的氨基酸序列组成的多肽的方法，其中

a)所述微生物中权利要求8至12任一项的多核苷酸的拷贝数增加至少一个拷贝或启动子可操纵地连接至编码所述多肽的多核苷酸，及

b)增殖所得的微生物，

其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌。

18.一种生产L-赖氨酸的方法，其中

a)将分离的棒状细菌在适当的培养基中发酵，其中所述细菌含有编码一种蛋白质的基因，该蛋白质由SEQ ID NO:2的氨基酸序列第329位的L-缬氨酸替换为L-甲硫氨酸所构成的氨基酸序列组成，其中所述细菌是谷氨酸棒杆菌，及

b)在发酵液或细菌细胞中富集所述L-赖氨酸。

19.权利要求18的方法，其中所述分离的棒状细菌是权利要求1至7任一项的细菌。

20.权利要求18的方法，其中所述分离的棒状细菌是含有权利要求8至12任一项的分离的多核苷酸的重组棒状细菌。

21.权利要求18的方法，其中分离或收集所述L-赖氨酸。

22.权利要求21的方法，其中纯化所述L-赖氨酸。

23.权利要求18的方法，其中

c)从权利要求18的步骤b)中获得的发酵液中除去0至100%所形成的生物量，及

d)通过选自粒化、压制、喷雾干燥和挤出的方法从步骤c)获得的液体中生产基本上干燥和成形的产物。

24.权利要求23的方法，其中在步骤c)之前或之后向发酵液中加入选自如下的酸：硫酸、盐酸和磷酸。

25.权利要求23的方法，其中从步骤c)之前或之后获得的液体中除去水。

26.权利要求23的方法，其中将在步骤d)中获得的所述成形产物用油进行喷雾。