CN101103104A - 棒状细菌mqo基因的等位基因 - Google Patents

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CN101103104A CNA200580046930XA CN200580046930A CN101103104A CN 101103104 A CN101103104 A CN 101103104A CN A200580046930X A CNA200580046930X A CN A200580046930XA CN 200580046930 A CN200580046930 A CN 200580046930A CN 101103104 A CN101103104 A CN 101103104A
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Abstract

本发明涉及棒状细菌mqo基因的突变体和等位基因，其编码苹果酸醌氧化还原酶，其氨基酸序列的第111位或相应位置含有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸，本发明还涉及使用包含这些等位基因的细菌经发酵制备氨基酸、优选制备L-赖氨酸、L-色氨酸和L-脯氨酸的方法。

Description

棒状细菌mqo基因的等位基因
本发明涉及编码苹果酸醌氧化还原酶(EC：1.1.99.16)变体的棒状细菌(coryneform bacteria)mqo基因的突变体和等位基因及使用包含这些等位基因的细菌制备氨基酸、特别是L-赖氨酸、色氨酸和L-脯氨酸的方法。
现有技术
氨基酸用于人用药物和制药工业，食品工业，特别是动物营养。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株、尤其谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的发酵而生产。由于其极其重要，已不断尝试改进生产方法。方法的改进可涉及发酵相关措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或例如通过离子交换层析对产物形式的加工，或微生物本身的固有性能特性。
为改良这些微生物的性能特性，可使用诱变、选择及突变体选择等方法，由此产生对抗代谢物有抗性或为调节重要性代谢物缺陷型并产生氨基酸的菌株。已知抗代谢物是赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于改善产L-氨基酸的棒杆菌菌株，其通过扩增单个氨基酸生物合成基因，并研究其对氨基酸生产的影响而进行。关于谷氨酸棒杆菌的遗传学、代谢和生物技术学的多个方面的综述可见于Pühler(chief ed.)，Journal ofBiotechnology 104(1-3)，1-338，2003。
谷氨酸棒杆菌苹果酸醌氧化还原酶编码基因的核苷酸序列由Molenaar et al.(European Journal of Biochemistry 254：395-403(1998))测定，并可以在国立医学图书馆的生物技术信息中心(NCBI)的数据库(Bethesda，MD，美国)中公开获得，登记号为AJ224946。
所述核苷酸序列也可见于专利申请WO01/00844中的序列No.569和序列No.571，以及专利申请EP-A-1108790中的序列No.3478、序列No.7065和序列No.7066。
EP1038969描述了由棒状细菌发酵生产L-氨基酸中的改良，其通过扩增mqo基因实现。
另一方面，WO02086137描述了通过弱化mqo基因实现的对棒状细菌的L-氨基酸生产的有益作用。在本申请中描述并被称作“等位基因672”的mqo基因的突变在mqo基因DNA序列的第672位携带腺嘌呤替代鸟嘌呤，这样导致在谷氨酸棒杆菌苹果酸醌氧化还原酶的氨基酸序列中的第224位形成终止密码子。本发明还描述了“等位基因1230”，其除等位基因672中的突变之外，还含有在mqo基因的核苷酸序列中第1230位的由胞嘧啶至胸腺嘧啶的转变。本申请进一步描述了通过整合诱变导致的基因中断(gene interruption)而引起的mqo基因的消除，由此导致相应菌株的L-赖氨酸生产增加。
棒状细菌中L-氨基酸的微生物生物合成是一个复杂且多层的系统，并与细胞中的多个其它代谢途径互相关联。因此不能对于完全消除或降低苹果酸醌氧化还原酶的催化活性是否能在改善不同步骤的L-氨基酸生产做出任何预测。因此需要活性程度不同的可用的苹果酸醌氧化还原酶变体。
为更明了起见，根据NCBI数据库提供的信息，编码谷氨酸棒杆菌苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因(野生型基因)的核苷酸序列在SEQ ID NO：1中描述，而其编码的苹果酸醌氧化还原酶的氨基酸序列在SEQ ID NO：2和4中描述。位于上游和下游的核苷酸序列在SEQ ID NO：3中示出。
发明目的
本发明人的目的是为生产氨基酸、特别是L-赖氨酸、L-色氨酸和L-脯氨酸提供改良的新方法。
发明内容
本发明涉及棒状细菌的突变体，它们是被产生的或分离的，优选分泌氨基酸并包含编码具有苹果酸醌氧化还原酶活性的多肽的基因或等位基因，其特征在于所述多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列在第111位或相应或相当位置含有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸。优选用L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置换L-丝氨酸。
所述棒状细菌优选是谷氨酸棒杆菌属。特别优选的是基于如下种的分泌氨基酸的菌株：
Corynebacterium efficiens，例如菌株DSM44549，
谷氨酸棒杆菌，例如菌株ATCC13032，
热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)，例如菌株FERM BP-1539，
产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)，例如菌株ATCC6871，
特别优选谷氨酸棒杆菌。
谷氨酸棒杆菌菌种的一些代表性菌株在现有技术中也已知为其它菌种名称。这些代表性菌株包括例如：
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870
百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)DSM20137
栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)ATCC17965
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067
乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869，以及
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
已知的分泌氨基酸的棒状细菌菌株例如是：
L-赖氨酸生产菌株：
谷氨酸棒杆菌DM58-1/pDM6(＝DSM4697)，在EP0358940中描述
谷氨酸棒杆菌MH20(＝DSM5714)，在EP0435132中描述
谷氨酸棒杆菌AHP-3(＝FermBP-7382)，在EP1108790中描述
热产氨棒状杆菌AJ12521(＝FERM BP-3304)，在US5,250,423中描述，
或者L-色氨酸生产菌株：
谷氨酸棒杆菌K76(＝FermBP-1847)，在US5,563,052中描述
谷氨酸棒杆菌BPS13(＝FermBP-1777)，在US5,605,818中描述
谷氨酸棒杆菌FermBP-3055，在US5,235,940中描述
关于这组细菌菌株的分类信息可见于Seiler(Journal of GeneralMicrobiology 129，1433-1477(1983)、Kmpfer and Kroppenstedt(Canadian Journal of Microbiology 42，989-1005(1996))、Liebl et al(International Journal of Systematic Bacteriology 41，255-260(1991)及US-A-5,250,434的描述。
具有ATCC名称的菌株可以得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)。具有DSM名称的菌株可得自德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Brunswick，Germany)。具有FERM名称的菌株可得自National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology(AIST Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba Ibaraki，Japan)。上述Corynebacterium thermoaminogenes菌株(FERM BP-1539、FERM BP-1540、FERM BP-1541和FERMBP-1542)在US-A5,250,434中描述。
“蛋白质氨基酸”是指在天然蛋白质中存在的氨基酸，即在衍生自微生物、植物、动物和人的蛋白质中存在的氨基酸。这些氨基酸包括选自如下氨基酸组成的组的L-氨基酸：L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸。
本发明的突变体优选分泌上述蛋白质氨基酸，特别是L-赖氨酸。术语氨基酸还包括它们的盐，如在L-赖氨酸的情况中为赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明进一步涉及棒状细菌的突变体，其包含编码下述多肽的mqo等位基因，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性并包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，所述氨基酸序列中第111位是除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸。优选用L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置换L-丝氨酸。在适当情况中，所述多肽的氨基酸序列另外在第201位含有L-丙氨酸由其它蛋白质氨基酸、优选由L-丝氨酸的置换。
本发明另外涉及棒状细菌的突变体，其包含编码下述多肽的mqo等位基因，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性并在相应于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第111位的位置含有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸、优选L-苯丙氨酸或L-丙氨酸，其中所述mqo等位基因包含与可以使用引物对通过聚合酶链反应(PCR)获得的多核苷酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，所述引物对的核苷酸序列各自包含选自如下核苷酸序列的至少15个连续核苷酸：SEQ ID NO：3的第1-349位之间的核苷酸序列及SEQ IDNO：3的第2002-1850位之间的互补核苷酸序列。合适的引物对例如是SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，以及SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14。优选起始材料(模板DNA)是已经被处理、特别是用诱变剂处理的棒状细菌染色体DNA。具体优选的是棒杆菌属的染色体DNA，特别具体优选的是谷氨酸棒杆菌的染色体DNA。
本发明进一步涉及棒状细菌的突变体，其包含编码下述多肽的mqo等位基因，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性并包含长度相应于500个L-氨基酸的氨基酸序列，所述氨基酸序列第111位存在除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸、优选L-苯丙氨酸或者L-丙氨酸。在适当的情况中，所述多肽的氨基酸序列另外在第201位含有L-丙氨酸由另一种蛋白质氨基酸、优选L-丝氨酸的置换。
本发明进一步涉及棒状细菌的突变体，其包含编码下述多肽的mqo等位基因，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性并且在氨基酸序列的第106-116位包含相应于SEQ ID NO：6或8的第106-116位的氨基酸序列。编码的多肽的氨基酸序列优选含有相应于以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO：6或8的第96-126位，或者SEQ ID NO：6或8的第81-141位，或者SEQ ID NO：6或8的第66-156位，或者SEQ ID NO：6或8的第51-181位，或者SEQ ID NO：6、8或10的第21-201位，或者SEQ IDNO：6、8或10的第2-301位，或者SEQ ID NO：6、8或10的第2-401位，或者SEQ ID NO：6、8或10的第2-499位，或者SEQ ID NO：6、8或10的第2-500位。特别优选地，编码的蛋白质的长度为500个氨基酸。
本发明进一步涉及棒状细菌的突变体，其包含编码下述多肽的mqo等位基因，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性并且在其氨基酸序列第111位或相应位置含有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸，其中优选用L-丝氨酸由L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置换，此外其氨基酸序列与SEQ ID NO：6或8所示氨基酸序列具有至少90％、优选至少92％或者至少94％或者至少96％、及特别优选至少97％或至少98％或至少99％相同性。与SEQ ID NO：6或8所示序列具有至少99％相同性的氨基酸序列例如SEQ ID NO：10所示序列。这种苹果酸醌氧化还原酶多肽中除在第111位的氨基酸置换之外，在第201位的L-丙氨酸由L-丝氨酸置换。
本发明进一步涉及棒状细菌的突变体，其包含编码下述多肽的mqo基因，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性并且在其氨基酸序列的第111位或相应位置含有除L-丝氨酸之外的任何氨基酸，其中优选用L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置换，另外所述基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：5或7所示核苷酸序列具有至少90％、优选至少92％或者至少94％或者至少96％、特别优选至少97％或至少98％或至少99％相同性。与SEQ ID NO：5或7所示核苷酸序列具有至少99％相同性的mqo等位基因的核苷酸序列例如SEQ IDNO：9所示。这个mqo等位基因的核苷酸序列中除第331位胸腺嘧啶由鸟嘌呤置换之外，其第601位的鸟嘌呤由胸腺嘧啶置换(见SEQ ID NO：9)。
已知保守氨基酸取代仅以非常微小程度地改变酶活性。因此，存在于本发明的突变体中并编码具有苹果酸醌氧化还原酶活性的mqo等位基因除包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：10所示氨基酸序列之外还可含有一个(1)或多个保守氨基酸取代。所述多肽优选含有至多2个、3个、4个或至多5个保守氨基酸取代。
在芳香族氨基酸的情况中，当苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸彼此置换时称作保守取代。在疏水性氨基酸的情况中，当亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸彼此置换时称作保守取代。在极性氨基酸的情况中，当谷氨酰胺和天冬酰胺彼此置换时称作保守取代。在碱性氨基酸的情况中，当精氨酸、赖氨酸和组氨酸彼此置换时称作保守取代。在酸性氨基酸的情况中，当天冬氨酸和谷氨酸彼此置换时称作保守取代。在含有羟基基团的氨基酸的情况中，当丝氨酸和苏氨酸彼此置换时称作保守取代。
在本发明研究期间，通过使用Clustal程序(Thompson et al.，Nucleic Acids Research 22，4637-4680(1994))对比氨基酸序列观察到，不同细菌如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、Corynebacteriumefficiens、Corynebacterium diphtheriae、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和Bacillus halodurans的苹果酸醌氧化还原酶的氨基酸序列含有由Trp-Asn-Asn-Ala-Gly-Thr-Gly-His-Sal-Ala-Leu组成的序列基序及由Bra-Leu-Gly-Ali-Ser-Pro-Gly-Ala-Ser组成的序列基序。术语“Bra”代表氨基酸Ile或Leu，而术语“Sal”代表氨基酸Ser或Ala，术语“Ali”代表氨基酸Ala或Gly。
因此，优选地，这些棒状细菌的突变体包含编码下述的多肽的mqo等位基因，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性、包含选自Trp-Asn-Asn-Ala-Gly-Thr-Gly-His-Sal-Ala-Leu或Bra-Leu-Gly-Ali-Ser-Pro-Gly-Ala-Ser的至少一个氨基酸序列、并在氨基酸序列的第111位或相应位置具有除L-丝氨酸之外的任何氨基酸、优选L-苯丙氨酸或L-丙氨酸。在适当情况中，所述氨基酸序列另外在SEQ ID NO：2第201位的L-丙氨酸由另一蛋白质氨基酸、优选L-丝氨酸置换。
氨基酸序列基序Trp-Asn-Asn-Ala-Gly-Thr-Gly-His-Sal-Ala-Leu例如存在于SEQ ID NO：6、8或10的第59-69位。氨基酸序列基序Bra-Leu-Gly-Ali-Ser-Pro-Gly-Ala-Ser例如存在于SEQ IDNO：6、8或10的第433-441位。
本发明最后涉及棒状细菌的突变体，其包含编码这样的多肽的mqo等位基因，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性及包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列。
已知宿主固有的酶即所谓的氨基肽酶，在蛋白质合成期间除去末端甲硫氨酸。
短语“相应于氨基酸序列第111位的位置”或者“相当于氨基酸序列中第111位的位置”是指通过使编码所编码多肽N末端区域中氨基酸(基于SEQ ID NO：6、8或10的第111位)的密码子的插入或缺失，位置规格和长度规格形式上增加(在插入情况中)或减少(在插入情况中)一个单位。例如，作为编码SEQ IDNO：5、7或8第2位L-丝氨酸的TCA密码子缺失的结果，L-苯丙氨酸或L-丙氨酸从第111位移至第110位。长度规格则为499个氨基酸。同样，由于使编码所编码多肽C末端区域中的氨基酸(基于第111位)的密码子的插入和缺失，长度规格形式上增加(在插入情况中)或减少(在缺失情况中)一个单位。这种性质的相当位置可通过序列排列对比氨基酸序列而易于鉴别，例如使用Clustal程序进行。所述酶活性不受这种插入或缺失的明显影响。“不受明显影响”是指所述变体的酶活性与具有SEQ IDNO：6或8或10所示氨基酸序列的多肽活性相比有至多10％、至多7.5％、至多5％、至多2.5％或者至多1％不同。
因此，本发明还涉及编码SEQ ID NO：6、8或10的多肽变体的mqo等位基因，所述多肽含有一或多个插入或缺失。所述多肽优选含有至多5、4、3或者2个氨基酸插入或缺失。
序列基序Trp-Asn-Asn-Ala-Gly-Thr-Gly-His-Sal-Ala-Leu和Bra-Leu-Gly-Ali-Ser-Pro-Gly-Ala-Ser优选不被这些插入/缺失所破坏。
可以使用传统的体外诱变方法，应用棒状细菌群和诱变物质如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)或者紫外光制备本发明的突变体。诱变方法在例如Manual of Methods for GeneralBacteriology(Gerhard et al.(Eds.)、American Society forMicrobiology，Washington，DC，USA，1981)或者Tosaka et al.(Agricultural and Biological Chemistry 42(4)，745-752(1978))或者Konicek et al(Folia Microbiologica 33，337-343(1988))中描述。使用MNNG的常见通常诱变包括浓度为50-500mg/l、或者至多1g/l的更高浓度，保温时间为1-30分钟，pH为5.5-7.5。在这些条件下，存活细胞的数目下降大约50％-90％，或者大约50％-99％，或者大约50％-99.9％或更多。
将突变体或细胞从经诱变的细胞群中移出并复制。接下来，例如借助于Ribolyser(Hybaid，Heidelberg，Germany)破坏所述细胞，例如使用Molenaar et al.(European Journal of Biochemistry 254：395-403(1998))所述方法确定胞内苹果酸醌氧化还原酶活性。这样可以鉴别与未经诱变的起始菌株相比其胞内苹果酸醌氧化还原酶活性降低至少30％、优选至少35％及特别优选至少40％的突变体。随后，在使用合适的营养培养基的分批培养中研究所述突变体分泌氨基酸、优选L-赖氨酸、L-色氨酸或L-脯氨酸的能力。合适的营养培养基及测试条件在US6,221,636，US5,840,551，US5,770,409，US5,605,818，US5,275,940和US4,224,409中描述。当使用合适的机器人装置时可以在短时间内研究大量的突变体，所述机器人装置在例如Zimmermann et al.(VDI reports No.1841，VDI-Verlag，Düsseldorf，Germany 2004，439-443)或者Zimmermann(Chemie Ingenenieur Technik 77(4)，426-428(2005))中描述。以这种方式，可以鉴别与亲代菌株或未经诱变的起始菌株相比，苹果酸醌氧化还原酶活性降低并且向营养培养基中分泌氨基酸的程度增加的突变体。这些突变体包括例如其氨基酸分泌增加至少0.5％的那些突变体。
随后，提供DNA或者从所述突变体中分离DNA，使用引物对利用聚合酶链反应合成相应多核苷酸，所述引物对使mqo基因、或者本发明的mqo等位基因或者本发明所述在氨基酸序列第111位的突变得以扩增。所述DNA优选分离自分泌氨基酸的程度增加的那些突变体。
为此目的，可以从位于本发明所述突变上游和下游的核苷酸序列中及从与其互补的核苷酸序列中选择任何引物对。在这点上，引物对的一个引物优选包含选自SEQ ID NO：3中第1-679位的核苷酸序列的至少15、至少18、至少20、至少21或至少24个连续核苷酸。引物对的另一个引物包含选自SEQ ID NO：3中第2002-953位的互补核苷酸序列的至少15、至少18、至少20、至少21或至少24个连续核苷酸。如果需要扩增编码区，则所述引物对优选选自SEQ ID NO：3的第1-349位的核苷酸序列，及选自SEQ ID NO：3的第2002-1850位的互补核苷酸序列。如果需要扩增编码区的一部分，如SEQ ID NO：15、17和19中的一部分，则引物对优选选自SEQ ID NO：3的第351-679位的核苷酸序列及选自SEQ ID NO：3的第1848-953位的互补核苷酸序列。
合适的引物对例如是SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所述的引物对mqo-起始引物和mqo-终止引物，或者SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所述的引物对mqo-A1和mqo-E1。
另外，可提供具有限制酶的识别位点、生物素基团或者本领域所述其它附属物的引物。引物的总长度通常至多30、至多40、至多50或至多60个核苷酸。
通常地，热稳定DNA聚合酶用于通过利用PCR从例如所选的序列最初存在于其中的染色体中扩增该所选的序列，所述序列如本发明的mqo等位基因来制备多核苷酸。这些DNA聚合酶例如是Qiagen公司(Hilden，Germany)销售的Thermus aquaticus Taq聚合酶，New England Biolabs公司(Frankfurt，Germany)销售的Thermococcus litoralis Vent聚合酶，或者Stratagene公司(LaJolla，USA)销售的Pyrococcus furiosus Pfu聚合酶。优选具有校对活性的聚合酶。校对活性是指这些聚合酶能识别已经错误掺入的核苷酸并通过重新聚合化而修正错误(Lottspeich and Zorbas，Bioanalytik[Bioanalysis]，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany(1998))。具有校正活性的聚合酶例如是Vent聚合酶和Pfu聚合酶。
反应混合物的条件根据厂商指导设定。聚合酶由厂商提供，通常一起提供常用的缓冲液，其浓度通常为10-100mM Tris/HCl及6-55mM KCl，pH7.5-9.3。如果厂商提供的缓冲液中没有氯化镁，则向其中加入0.5-10mM浓度的氯化镁。另外，向反应混合物中加入0.1-16.6mM浓度的三磷酸脱氧核苷。向反应培养基中导入终浓度为0.1-3μM的引物，优选模板DNA为102-105拷贝。也可以使用106-107拷贝。向反应混合物中加入2-5单位的合适聚合酶。常规的反应混合物体积为20-100μl。
作为进一步的补充，向反应混合物中可以加入牛血清白蛋白、Tween-20、凝胶、甘油、甲酰胺或者DMSO(Dieffenbach andDveksler，PCR Primer-A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，USA 1995)。
PCR常规进程包括连续重复的三个不同温度步骤。首先，在4-10分钟将温度升高至92℃-98℃而开始反应，以使存在的DNA变性。然后以重复方式首先在大约92-98℃进行10-60秒以使得DNA变性，然后在特定温度(退火温度)进行10-60秒以使得所述引物与所述DNA结合，所述温度与引物有关，但已经通过经验确定为50℃-60℃，并可以针对每种引物对单独计算。技术人员可从Rychlik et al.(Nucleic Acids Research 18(21)：6409-6412)中发现这方面的准确资料。最后进行合成步骤，在对于各种情况规定的聚合酶的最佳活性条件下延伸所述引物(延伸)，根据聚合酶情况温度通常为73℃-67℃、优选72℃-68℃。这个延伸步骤的持续时间有赖于聚合酶的效率和被扩增的PCR产物的长度。在常规的PCR中，这个步骤持续0.5-8分钟、优选2-4分钟。这三个步骤重复30-35次，至多50次。最后进行4-10分钟的延伸步骤，反应结束。以这种方式制备的多核苷酸也称作扩增物；术语核酸片段和核酸分子也常使用。
技术人员在例如如下手册中可发现关于PCR方法的进一步指导和信息：PCR策略(Innis，Felfand and Sninsky，AcademicPress，Inc.，1995)、Diefenbach和Dveksler所著PCR引物实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)、Gait所著寡核苷酸合成实践方法(IRL Press，Oxford，UK，1984)及Newton和Graham所著PCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1994)。
随后确定核苷酸序列，例如使用Sanger et al.(Proceedings ofthe National Academies of Sciences，USA，74，5463-5467(1 977))所述并经Zimmermann et al.(Nucleic Acids Research 18，1067pp(1990))修改的链终止方法进行，分析由这个核苷酸序列编码的多肽，特别其氨基酸序列。为此，将所述核苷酸序列注入程序中以将DNA序列翻译成氨基酸序列。合适的程序例如是Patentin程序，该程序可得自专利事务所，例如美国专利事务所(USPTO)；或者程序Translate Tool，其可在全球信息网的ExPASy Proteomics服务器上获得(Gasteiger et al.，Nucleic Acids Research 31，3784-3788(2003))。
以这种方式，可以鉴别这样的突变体，其mqo等位基因编码具有苹果酸醌氧化还原酶活性并且在其氨基酸序列第111或相应或相当位置含有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸的多肽。优选L-丝氨酸由L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置换。在适当情况中，所述氨基酸序列在第201位或相应或相当位置另外含有L-丙氨酸由另一种蛋白质氨基酸优选L-丝氨酸的置换。
本发明因此涉及一种棒状细菌突变体，其特征在于所述突变体可通过如下步骤获得：
a)用诱变剂处理具有分泌氨基酸的能力的棒状细菌；
b)分离在a)步骤中产生的突变体并使其增殖，
c)优选确定突变体在培养基中分泌或在细胞内部浓缩的能力，与在a)步骤中使用的棒状细菌相比至少多0.5％的氨基酸
d)从在b)步骤中获得的突变体制备核酸，
e)使用聚合酶链反应、得自d)步骤的核酸及引物对制备核酸分子，所述引物对的第一个引物包含选自SEQ ID NO：3第1-394位的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，第二个引物包含选自SEQ ID NO：3第2002-1850位的互补核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，
f)确定e)步骤中获得的核酸分子的核苷酸序列，确定编码的氨基酸序列，
g)在适当情况中，将在f)步骤中确定的氨基酸序列与SEQ IDNO：6、8或10或者SEQ ID NO：15、17或19所示序列进行对比，
h)鉴别突变体，其含有编码下述多肽的多核苷酸，所述多肽在第111位或相当位置含有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸、优选L-苯丙氨酸或L-丙氨酸，并且在适当情况中在第201位或相当位置含有除L-丙氨酸之外的任何蛋白质氨基酸优选L-丝氨酸。
以这种方式产生的突变体通常含有gnd等位基因的一(1)个拷贝。
本发明突变体中mqo等位基因的编码区例如SEQ ID NO：5、7和9中描述的序列。野生型基因的编码区在SEQ ID NO：1中描述。SEQ ID NO：1在第332位含有核碱基胞嘧啶，在第33 1位具有核碱基胸腺嘧啶，在第601位具有核碱基鸟嘌呤。SEQ ID NO：1在第331-333位含有编码L-氨基酸的TCT密码子，在第601-603位含有编码L-丙氨酸的GCT密码子。SEQ ID NO：5在第332位含有核碱基胸腺嘧啶。作为这种胞嘧啶转换为胸腺嘧啶的结果，编码L-苯丙氨酸的密码子TTT在第331-333位形成。SEQID NO：7在第331位含有核碱基鸟嘌呤。作为这种胸腺嘧啶颠换为鸟嘌呤的结果，在第331-333位形成编码L-丙氨酸的密码子GCT。除在第331位的突变之外，SEQ ID NO：9在第601位含有核碱基胸腺嘧啶。由于这种鸟嘌呤颠换为硫胺的结果，在第601-603位形成编码L-丝氨酸的密码子TCT。除此之外，SEQ IDNO：5、7和9所示核苷酸序列可含有由于诱变处理所致的另外的碱基取代，但其表达不使得氨基酸序列发生任何改变。在科学界，这种突变也称作沉默或中性突变。这些沉默突变同样也可存在于用于诱变处理的棒状细菌中。
用于诱变的棒状细菌优选具有向其周围的营养培养基或发酵肉汤中分泌合意的氨基酸或者在细胞内部浓缩合意的氨基酸的能力。
产生L-赖氨酸的棒状细菌通常具有反馈抗性或者去敏感的(desensitized)天冬氨酸激酶。反馈抗性天冬氨酸激酶已知是这样的天冬氨酸激酶，其与野生型形式相比对于赖氨酸和苏氨酸的混合物或者AEC(氨乙基半胱氨酸)和苏氨酸的混合物或赖氨酸自身或者AEC自身的抑制作用的敏感性较低。编码这些不敏感的天冬氨酸激酶的基因或等位基因也称作lysCFBR等位基因。现有领域描述了许多编码与野生型蛋白质相比具有氨基酸取代的天冬氨酸激酶变体的lysCFBR等位基因(表1)。谷氨酸棒杆菌中相应于NCBI数据库中登记号AX756575的野生型lysC基因的编码区在SEQ IDNO：21中描述，而由这个基因编码的蛋白质在SEQ ID NO：22中描述。
表1：编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因
 等位基因名称 其他信息   参照 登录号
 lysCFBR-E05108   JP1993184366-A(序列1) E05108
 lysCFBR-E06825 lysC A279T   JP1994062866-A(序列1) E06825
 lysCFBR-E06826 lysC A279T   JP1994062866-A(序列2) E06826
 lysCFBR-E06827   JP1994062866-A(序列3) E06827
 lysCFBR-E08177   JP1994261766-A(序列1) E08177
 lysCFBR-E08178 lysC A279T   JP1994261766-A(序列2) E08178
 lysCFBR-E08179 lysC A279V   JP1994261766-A(序列3) E08179
 lysCFBR-E08180 lysC S301F   JP1994261766-A(序列4) E08180
 lysCFBR-E08181 lysC T308I   JP1994261766-A(序列5) E08181
 lysCFBR-E08182   JP1994261766-A(序列6) E08182
 lysCFBR-E12770   JP1997070291-A(序列13) E12770
 lysFBR-E14514   JP1997322774-A(序列9) E14514
 lysCFBR-E16352   JP1998165180-A(序列3) E16352
 lysCFBR-E16745   JP1998215883-A(序列3) E16745
 lysCFBR-E16746   JP1998215883-A(序列4) E16746
 lysCFBR-I74588   US5688671-A(序列1) I74588
 lysCFBR-I74589 lysC A279T   US5688671-A(序列2) I74589
 lysCFBR-I74590   US5688671-A(序列7) I74590
 lysCFBR-I74591 lysC A279T   US5688671-A(序列8) I74591
 lysCFBR-I74592   US5688671-A(序列9) I74592
lysCFBR-I7459 3 lysC A279T   US5688671-A(序列10) I74593
lysCFBR-I74594   US5688671-A(序列11) I74594
lysCFBR-I74595 lysC A279T   US5688671-A(序列12) I74595
lysCFBR-I74596   US5688671-A(序列13) I74596
lysCFBR-I74597 lysC A279T   US5688671-A(序列14) I74597
lysCFBR-X57226 lysC S301Y   EP0387527Kalinowski etal.，Molecularand GeneralGenetics224：317-324(1990) X57226
lysCFBR-L16848 lysC G345D   Follettie andSinskeyNCBI NucleotideDatabase(1990) L16848
lysCFBR-L27125 lysC R320GlysC G345D   Jetten et al.，AppliedMicrobiologyBiotechnology43：76-82(1995) L27125
lysCFBR lysC T311I   WO0063388(序列17)
lysCFBR lysC S301F   US3732144
lysCFBR lysC S381F   EP0435132
lysCFBR lysC S317A   US5688671(序列1)
lysCFBR lysC T380I   WO01/49854
分泌L-赖氨酸的棒状细菌通常具有表1列出的一或多个氨基酸取代。
优选如下的lysCFBR等位基因：lysC A279T(SEQ ID NO：22所示编码的天冬氨酸激酶蛋白质中第279位丙氨酸由苏氨酸置换)，lysC A279V (SEQ ID NO：22所示编码的天冬氨酸激酶蛋白质中第279位丙氨酸由缬氨酸置换)，lysC S301F(SEQ ID NO：22所示编码的天冬氨酸激酶蛋白质中第301位丝氨酸由苯丙氨酸置换)，lysC T308I(SEQ ID NO：22所示编码的天冬氨酸激酶蛋白质中第308位苏氨酸由异亮氨酸置换)，lysC S301Y(SEQ ID NO：22所示编码的天冬氨酸激酶蛋白质中第308位丝氨酸由酪氨酸置换)，lysC G345D(SEQ ID NO：22所示编码的天冬氨酸激酶蛋白质中第345位甘氨酸由天冬氨酸置换)，lysC R320G(SEQ ID NO：22所示编码的天冬氨酸激酶蛋白质中第320位精氨酸由甘氨酸置换)，lysC T311I (SEQ ID NO：22所示编码的天冬氨酸激酶蛋白质中第311位苏氨酸由异亮氨酸置换)，lysC S381F(SEQ ID NO：22所示编码的天冬氨酸激酶蛋白质中第381位丝氨酸由苯丙氨酸置换)，lysC S317A(SEQ ID NO：22所示编码的天冬氨酸激酶蛋白质中第317位丝氨酸由丙氨酸置换)及lysC T380I(SEQ ID NO：22所示编码的天冬氨酸激酶蛋白质中第380位苏氨酸由异亮氨酸置换)。
特别优选的是lysCFBR等位基因lysC T311I(SEQ ID NO：22所示编码的天冬氨酸激酶蛋白质中第311位的苏氨酸由异亮氨酸置换)及含有选自如下至少一个取代的lysCFBR等位基因：A279T(SEQ ID NO：22所示编码的天冬氨酸激酶蛋白质中第279位丙氨酸由苏氨酸置换)和S317A(SEQ ID NO：22所示编码的天冬氨酸激酶蛋白质中第317位丝氨酸由丙氨酸置换)。
lysCFBR等位基因lysC T311I存在于保藏在DSMZ的菌株DM1797中。DM1797是谷氨酸棒杆菌ATCC13032的突变体。
称作DM1808的突变体，包含编码在氨基酸序列第111位存在L-苯丙氨酸的多肽的mqo等位基因，是以上述方式从菌株DM1797中分离的。突变体DM1808中mqo等位基因的核苷酸序列以SEQ ID NO：5示出，而编码的多肽的氨基酸序列以SEQ IDNO：6示出。
以同样方式发现这样的突变体，其包含编码在氨基酸序列第111位存在L-丙氨酸及在第201位存在L-丝氨酸的多肽的mqo等位基因。这种突变体中mqo等位基因的核苷酸序列以SEQ IDNO：9描述，而编码的多肽的氨基酸序列以SEQ ID NO：10描述。
除此之外，可以使用呈现弱化的高丝氨酸脱氢酶或者高丝氨酸激酶活性或者具有现有技术已知的其它性质的分泌L-赖氨酸的棒状细菌。
生产L-色氨酸的棒状细菌通常对于去敏感的邻氨基苯甲酸合酶具有反馈抗性。反馈抗性邻氨基苯甲酸合酶已知是与野生型形式相比对于色氨酸或5-氟色氨酸(Matsui et al.，Journal ofBacteriology 169(11)：5330-5332(1987))或相似的类似物的抑制作用呈现较低敏感性(5-10％、10％-15％或者10％-20％)的邻氨基苯甲酸合酶。编码这些去敏感的邻氨基苯甲酸合酶的基因或等位基因也称作trpEFBR等位基因。这些突变体或等位基因在例如US6180373和EP0338474中描述。
与应用的起始菌株或亲代菌株相比，所得突变体在发酵方法中呈现合意的氨基酸的分泌或生产增多。
本发明另外涉及分离的多核苷酸，其编码具有苹果酸醌氧化还原酶活性并在第111位或相应或相当位置含有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸的多肽，优选用L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置换。
本发明的多核苷酸可以分离自本发明的突变体。
进一步可以应用体外方法诱变mqo基因。当使用体外方法时，对含有棒状细菌基因、优选现有技术描述的谷氨酸棒杆菌野生型基因的分离的多核苷酸进行诱变处理。
所述分离的多核苷酸可例如是分离的总DNA或染色体DNA或者使用聚合酶链反应(PCR)制备的mqo基因的扩增产物。这种扩增产物也称作PCR产物；也常用术语核酸分子和核酸片段。熟练技术人员可在如下手册中发现关于使用聚合酶链反应扩增DNA序列的说明：Gait：Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(IRL Press，Oxford，UK，1984)及Newton and Graham：PCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1994)。同样也可以首先将待诱变的mqo基因掺入载体中，例如掺入噬菌体或质粒中。
合适的体外诱变方法包括用羟胺处理，如Miller(Miller，J.H.：A Short Course in Bacterial Genetics.A Laboratory Manual andHandbook for Escherichia coli and Related Bacteria，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1992)所述；使用致诱变寡核苷酸处理(T.A.Brown：Gentechnologie für Einsteiger[Recombinant DNA Technology for those entering the field]，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，1993 and R.M.Horton：PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis，MolecularBiotechnology 3，93-99(1995))及应用呈现较高误差率的DNA聚合酶时使用聚合酶链反应。这种DNA聚合酶例如是由Stratagene(La Jolla，CA，USA)提供的Mutazyme DNA聚合酶(GeneMorphPCR mutagenesis kit，No.600550)。
关于在体内或体外产生突变的进一步指导和综述可见于现有技术及已知的遗传和分子生物学教科书所描述，如Knippers(Molecular Genetics，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker(Genes and Clones，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或者Hagemann(General Genetics，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
本发明进一步涉及一种分离的多核苷酸，其编码具有苹果酸醌氧化还原酶活性及包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽，在所述氨基酸序列第111位具有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸。优选用L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置换。在适当情况中，所述多肽的氨基酸序列另外含有在第201位的L-丙氨酸由另一种氨基酸、优选L-丝氨酸的置换。
本发明进一步涉及一种分离的多核苷酸，其编码具有苹果酸醌氧化还原酶活性及包含长度为500个氨基酸的氨基酸序列的多肽，在所述氨基酸序列第111位具有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸，优选L-苯丙氨酸或L-丙氨酸。
本发明进一步涉及一种分离的多核苷酸，其编码具有苹果酸醌氧化还原酶活性且其氨基酸序列第106-116位含有相应于SEQID NO：6或8的第106-116位的氨基酸序列。编码的多肽的氨基酸序列优选含有相应于以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO：6或8第96-126位、或者SEQ ID NO：6或8第81-141位、或者SEQID NO：6或8第66-156位、或者SEQ ID NO：6或8第51-181位、或者SEQ ID NO：6、8或10第21-201位、或者SEQ IDNO：6、8或10第2-301位、或者SEQ ID NO：6、8或10第2-401位、或者SEQ ID NO：6、8或10第2-499位、或者SEQ IDNO：6、8或10第2-500位。特别优选的是所编码多肽的长度为500个氨基酸。
本发明进一步涉及一种分离的多核苷酸，其编码这样的多肽，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性及在氨基酸序列第111位或相应或相当位置含有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸优选L-苯丙氨酸或L-丙氨酸，并且包含与可通过聚合酶链反应(PCR)使用引物对获得的多核苷酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，所述引物对的核苷酸序列在每种情况中均包含选自SEQ ID NO：3第1-349位的核苷酸序列及SEQ ID NO：3第2002-1850位的互补核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。合适的引物对的两个实例在SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12及在SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14中描述。应用的起始材料(模板)是优选已经经过致诱变处理的棒状细菌的染色体DNA。特别优选的是棒杆菌属的染色体DNA，非常优选的是谷氨酸棒杆菌的染色体DNA。
本发明进一步涉及一种分离的多核苷酸，其在严格条件下与和SEQ ID NO：5、7或9互补的核苷酸序列杂交，并编码这样的多肽，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性且在氨基酸序列第111位或相应或相当位置含有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸优选L-苯丙氨酸或L-丙氨酸，并且所述多肽在适当情况中在相应于第201位的位置含有除L-丙氨酸之外的任何蛋白质氨基酸、优选L-丝氨酸。
技术人员可在如下手册中发现关于核酸或多核苷酸杂交的指导：由Boehringer Manheim GmbH(Mannheim，Germany，1993)出版的The DIG System Users Guide for Filter Hybridization，及Liebl et al.(International Journal of Systematic Bacteriology 41：255-260(1991))。杂交是在严格条件下进行，即形成的杂交体是这样的，其中探针即包含SEQ ID NO：5、7或9的互补核苷酸序列的多核苷酸与靶序列即用探针处理的多核苷酸是至少90％相同的。已知所述杂交包括洗涤步骤的严格性受到缓冲液成分、温度和盐浓度改变的影响或由其决定。所述杂交反应通常在与洗涤步骤相比较低的严格性下进行(Hybaid Hybridisation Guide，HybaidLimited，Teddington，UK，1996)。
可以使用例如相应于5×SSC缓冲液的缓冲液、在大约50℃-68℃温度下进行杂交反应。在这个反应中，探针也可以与同所应用探针核苷酸序列的相同性低于90％的多核苷酸发生杂交。这些杂交体稳定较差，可通过在严格条件下洗涤除去。这可以例如通过将盐浓度降低至2×SSC，在适当情况中随后降低至0.5×SSC(The DIG System User’s Guide for Filter Hybridisation，BoehringerManheim GmbH(Mannheim，Germany，1995)，且温度设定在大约50℃-68℃、大约52℃-68℃、大约54℃-68℃、大约56℃-68℃、大约58℃-68℃、大约60℃-68℃、大约62℃-68℃、大约64℃-68℃或者大约66℃-68℃来实现。优选大约64℃-68或者大约66℃-68℃的温度范围。在适当情况中，可以将盐浓度降低至相应于0.2×SSC或0.1×SSC的浓度。在适当情况中，SSC缓冲液含有0.1％浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)。通过将杂交温度以大约1-2℃的梯度从50℃逐步增加至68℃，可以分离这样的多核苷酸片段，其与应用的探针序列或其互补序列具有至少90％或91％、优选至少92％或93％、94％、95％、96％、特别优选至少97％、或98％或者至少99％相同性并编码具有苹果酸醌氧化还原酶活性且含有本发明所述氨基酸取代的多肽。使用已知方法确定以这种方式获得的多核苷酸的核苷酸序列。关于杂交的进一步指导可以试剂盒形式商购获得(例如Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany提供的DIG Easy Hyb，目录号No.1603558)。由此获得的核苷酸序列编码这样的多肽，其具有苹果酸醌氧化还原酶活性，与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示氨基酸序列具有至少90％、优选至少92％、至少94％、至少96％、及特别优选至少97％、或者至少98％、或者至少99％相同性，并含有本发明所述氨基酸取代。
本发明进一步涉及一种分离的多核苷酸，其编码这样的多肽，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性、在氨基酸序列第111位含有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸优选L-苯丙氨酸或L-丙氨酸、并包含与SEQ ID NO：6或8的氨基酸序列至少90％、优选至少92％、或者至少94％、至少96％、及特别优选至少97％或至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。具有苹果酸醌氧化还原酶活性及包含与SEQ ID NO：8所示序列至少99％相同的氨基酸序列的多肽在例如SEQ ID NO：10中所描述。
本发明进一步涉及一种分离的多核苷酸，其编码这样的多肽，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性、在氨基酸序列第111位含有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸优选L-苯丙氨酸或L-丙氨酸、并包含与SEQ ID NO：5或7的核苷酸序列至少90％、优选至少92％、或者至少94％、至少96％、及特别优选至少97％或至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。编码本发明具有苹果酸醌氧化还原酶活性及具有与SEQ ID NO：7所示序列至少99％相同的核苷酸序列的多肽在例如SEQ ID NO：9中所描述。
除此之外，优选分离的多核苷酸，其编码这样的多肽，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性、在氨基酸序列第111位或相应或相当位置含有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸优选L-苯丙氨酸或L-丙氨酸及包含选自Trp-Asn-Asn-Ala-Gly-Thr-Gly-His-Sal-Ala-Leu和Bra-Leu-Gly-Ali-Ser-Pro-Gly-Ala-Ser的至少一个序列基序或一个氨基酸序列。“Bra”是指氨基酸Ile或Leu，而“Sal”是指氨基酸Ser或Ala，“Ali”是指氨基酸Ala或Gly。
本发明进一步涉及分离的多核苷酸，其编码具有苹果酸醌氧化还原酶活性及包含SEQ ID NO：6、8或10所示氨基酸序列的多肽。在适当情况中，编码的多肽含有一(1)个或多个保守氨基酸取代。优选所述多肽含有至多2个、3个、4个或至多5个保守氨基酸取代。
本发明进一步涉及一种分离的多核苷酸，其编码这样的多肽，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性及包含SEQ IDNO：6、8或10所示氨基酸序列，其中包括在N或C末端的至少一个氨基酸的延伸。这种延伸不超过50、40、30、20、10、5、3或2个氨基酸残基。
本发明最后还涉及mqo等位基因，其编码SEQ ID NO：6、8或10的多肽变体，所述变体含有一或多个插入或缺失。这些变体含有至多5、至多4、至多3或至多2个氨基酸插入或缺失。序列基序Trp-Asn-Asn-Ala-Gly-Thr-Gly-His-Sal-Ala-Leu和Bra-Leu-Gly-Ali-Ser-Pro-Gly-Ala-Ser优选不被这些插入/缺失破坏。
本发明进一步涉及一种分离的多核苷酸，其包含SEQ IDNO：5、7或9所示核苷酸序列。
本发明最后涉及一种分离的多核苷酸，其包含突变体DM1808的mqo等位基因。
本发明还涉及一种分离的多核苷酸，其包含本发明mqo等位基因的一部分编码区，在每种情况中所述分离的多核苷酸包含在编码的多肽的氨基酸序列中第111位含有氨基酸取代的编码区部分。
特别地，所述多核苷酸包含核酸分子或DNA片段，其编码相应于SEQ ID NO：2第95-127位的至少一个氨基酸序列、或者编码相应于SEQ ID NO：2第79-144位的至少一个氨基酸序列、或者编码相应于SEQ ID NO：2第62-160位的至少一个氨基酸序列、或者编码相应于SEQ ID NO：2第45-177位的至少一个氨基酸序列、或者编码相应于SEQ ID NO：2第27-194位的至少一个氨基酸序列、或者编码相应于SEQ ID NO：2第11-211位的至少一个氨基酸序列、或者编码相应于SEQ ID NO：2第2-250位的至少一个氨基酸序列、或者编码相应于SEQ ID NO：2第2-375位的至少一个氨基酸序列、或者编码相应于SEQ ID NO：2第2-495位的至少一个氨基酸序列，或者包含相应的读框，其中在相应于SEQ ID NO：2第111位的位置具有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸优选L-苯丙氨酸或L-丙氨酸，并且在适当情况中在相应于第201位的位置存在除L-丙氨酸之外的任何蛋白质氨基酸，优选L-丝氨酸。
本发明读框的实例如下所示，其中包含这样的多核苷酸，所述多核苷酸编码至少SEQ ID NO：2的第95-127位氨基酸序列，并且在所述氨基酸序列第111位的相应位置存在除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸：
cag gtt tcc cgt cag ttc tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg nnn
Gln Val Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Xaa
95                  100                 105                 110
gat cct aag gaa ttc atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc cag
Asp Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln
            115                 120                 125
其也示作SEQ ID NO：15。由这个读框编码的氨基酸序列示作SEQ ID NO：16。
优选的核酸分子编码至少一种下述的氨基酸序列，所述氨基酸序列相应于SEQ ID NO：6、8或10的第95-127位，或者至少相应于SEQ ID NO：6、8或10的第79-144位，或者至少相应于SEQ ID NO：6、8或10的第62-160位，或者至少相应于SEQ IDNO：6、8或10的第45-177位，或者至少相应于SEQ ID NO：6、8或10的第27-194位，或者至少相应于SEQ ID NO：6、8或10的第11-211位，或者至少相应于SEQ ID NO：6、8或10的第2-250位，或者至少相应于SEQ ID NO：6、8或10第的2-375位，或者至少相应于SEQ ID NO：6、8或10的第2-495位。
包含编码至少相应于SEQ ID NO：6第95-127位的氨基酸序列的多核苷酸的本发明读框的实例如下所示：
cag gtt tcc cgt cag ttc tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg ttt
Gln Val Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Phe
95                  100                 105                 110
gat cct aag gaa ttc atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc cag
Asp Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln
            115                 120                 125
所述读框也示作SEQ ID NO：17。SEQ ID NO：18示出由这个读框编码的氨基酸序列。
包含编码至少相应于SEQ ID NO：8或10第95-127位的氨基酸序列的多核苷酸的本发明读框的实例如下所示：：
cag gtt tcc cgt cag ttc tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg gct
Gln Val Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ala
95                  100                 105                 110
gat cct aag gaa ttc atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc  cag
Asp Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln
            115                 120                 125
所述读框也示作SEQ ID NO：19。SEQ ID NO：20示出由这个读框编码的氨基酸序列。
特别优选的核酸分子包含相应于SEQ ID NO：5、7或9第283-381位的至少一个核苷酸序列，或者相应于SEQ ID NO：5、7或9第235-432位的至少一个核苷酸序列，或者相应于SEQ IDNO：5、7或9第184-480位的至少一个核苷酸序列，或者相应于SEQ ID NO：5、7或9第133-531位的至少一个核苷酸序列，或者相应于SEQ ID NO：5、7或9第85-582位的至少一个核苷酸序列，或者相应于SEQ ID NO：5、7或9第28-630位的至少一个核苷酸序列，或者相应于SEQ ID NO：5、7或9第4-753位的至少一个核苷酸序列，或者相应于SEQ ID NO：5、7或9第4-1125位的至少一个核苷酸序列，或者相应于SEQ ID NO：5、7或9第4-1485位的至少一个核苷酸序列。
除此之外，本发明的读框，例如显示为SEQ ID NO：15、17和19中所示核苷酸序列并在SEQ ID NO：16、18和SEQ ID NO：20中显示为所编码氨基酸序列的形式，所述读框可含有一或多个突变，导致一或多个保守氨基酸取代。优选所述突变导致至多4％、至多2％或者至多1％的保守氨基酸突变。另外，本发明的读框可含有一或多个沉默突变。优选本发明的读框含有至多4％、特别优含有一或多个沉默突变。优选本发明的读框含有至多4％、特别优选至多2％到至多1％的沉默突变。
本发明的分离的多核苷酸可用于制备微生物的重组菌株，其以优于起始或亲代菌株的方式向其周围的培养基中释放氨基酸或者在细胞内部积聚氨基酸。
在棒状细菌基因中掺入突变的普遍使用的方法是等位基因取代，也称作“基因置换”。在这种方法中，将含有感兴趣的突变的DNA片段转移进合意的棒状细菌菌株中，并通过至少两次重组事件或“交换”事件在合意菌株的染色体中掺入突变，或者将存在于所述菌株中的基因序列用突变的序列置换。
Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9，84-87(1991)使用这种方法向谷氨酸棒杆菌染色体中掺入携带缺失的lysA等位基因及掺入携带插入的lysA等位基因以置换野生型基因。Schfer等(Gene145，69-73(1994))使用这种方法在谷氨酸棒杆菌hom-thrB操纵子中掺入缺失。Nakagawa等(EP1108790)使用这种方法基于分离的等位基因向谷氨酸棒杆菌染色体中掺入多种突变。以这种方式，Nakagawa等成功地在谷氨酸棒杆菌中将称作Val59Ala的突变掺入高丝氨酸脱氢酶基因(hom)中，将称作Thr311Ile的突变掺入天冬氨酸激酶基因(lysC或ask)中，将称作Pro458Ser的突变掺入丙酮酸羧化酶基因(pyc)中及将称作Ala213Thr的突变掺入葡萄糖六磷酸脱氢酶基因(zwf)中。
本发明的多核苷酸可用于本发明的方法中，所述多核苷酸包含完整的编码区，例如SEQ ID NO：5、7或9所示，或者包含一部分编码区，例如编码至少相应于SEQ ID NO：6、8或10第95-127位的氨基酸序列的核苷酸序列，其在SEQ ID NO：15、17或19中示出。根据SEQ ID NO：15、17和19的部分编码区的长度为99个核碱基。优选长度≥195个核碱基的这部分编码区，如编码至少相应于SEQ ID NO：6、8或10第79-144位氨基酸序列的核酸分子。特别优选长度≥295个核碱基的这部分编码区，如编码至少相应于SEQ ID NO：6、8或10第62-160位氨基酸序列的核酸分子。
在这种方法中，含有感兴趣的突变的DNA片段通常存在于载体中，具体存在于质粒中，所述载体或质粒优选在将对其提供突变的菌株中不复制，或者仅以有限程度复制。通常地，埃希氏菌(Escherichia)属的细菌、优选大肠杆菌菌种，用作辅助或中间宿主，所述载体在其中可以复制。
这些质粒载体例如是pK*mob和pK*mobsacB载体，如Schfer等(Gene 145，69-73(1994))所述的pK18mobsacB及WO02/070685和WO03/014362中描述的载体。这些载体可以在大肠杆菌中复制，但在棒状细菌中不复制。特别合适的是含有以条件性负显性方式作用的基因的载体，所述基因如芽孢杆菌(Bacillus)中的sacB基因(果聚糖蔗糖酶基因)或者大肠杆菌中的galK(半乳糖激酶)基因。(以条件性负显性方式作用的基因是指在特定条件下对携带该基因的宿主不利例如有毒性、但是在其它条件下对该宿主无任何负作用的基因)。这些载体可以选择其中所述载体从染色体中消除的重组事件。另外，Nakamura等(US-A-6,303,383)已经针对棒状细菌描述了仅在低于31℃的温度复制的温度敏感性质粒。
随后将载体转移进棒状细菌中，可根据例如Schfer(Journalof Bacteriology 172，1663-1666(1990))所述方法通过接合，或者根据例如Dunican和Shivnan(Bio/Technology 7，1067-1070(1989))所述方法或者Thierbach等(Applied Microbiology andBiotechnology 29，356-362(1988))所述方法通过转化进行。在适当情况中，所述DNA也可以通过粒子轰击方式转移。
在同源重组后，通过在靶基因或靶序列中导致整合的第一次交换事件及导致切除的适当的第二次交换事件，掺入了突变及获得重组的细菌。
可以使用Southern印迹杂交、聚合酶链反应或者序列测定或者荧光共振能量转移(FRET)方法(Lay et al.Clinical Chemistry 43，2262-2267(1997))或者酶学方法等方法，鉴别并鉴定所得菌株。
因此，本发明还涉及一种制备棒状细菌的方法，其中：
a)将本发明的多核苷酸转移进棒状细菌中，
b)将存在于所述棒状细菌染色体中并编码在氨基酸序列第111位或相应位置含有L-丝氨酸的氨基酸序列的苹果酸醌氧化还原酶基因用来自a)的多核苷酸置换，所述多核苷酸编码在氨基酸序列第11 1位或相应位置具有另一种L-氨基酸、优选L-苯丙氨酸或L-丙氨酸的氨基酸序列，并且在适当情况中所述氨基酸序列在第201位具有除L-丙氨酸之外的任何蛋白质氨基酸、优选L-丝氨酸，
c)增殖在步骤a)和b)中获得的棒状细菌。
由此产生了重组棒状细菌，其包含本发明的mqo等位基因，所述mqo等位基因代替了野生型mqo基因。
本发明的另一种制备微生物的方法，包括：
a)将编码具有苹果酸醌氧化还原酶活性的本发明的多核苷酸转移进微生物中，
b)在所述微生物中复制所述多核苷酸，
c)使在步骤a)和b)中获得的微生物增殖。
由此产生了重组微生物，所述微生物包含本发明多核苷酸的至少一(1)个或几个拷贝，所述多核苷酸编码苹果酸醌氧化还原酶，该酶在所编码多肽的氨基酸序列第111位或相当位置含有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸，优选用L-苯丙氨酸及L-丙氨酸置换。在适当情况中，所述多肽在第201位或相当位置含有除L-丙氨酸之外的任何蛋白质氨基酸，优选L-丝氨酸。
因此，本发明还涉及包含本发明多核苷酸的宿主或宿主细胞，优选微生物，具体优选棒状细菌和埃希氏菌属细菌。本发明还涉及使用分离的多核苷酸制备的微生物。这些微生物或细菌也称作重组微生物或重组细菌。同样，本发明涉及含有本发明多核苷酸的载体。最后，本发明还涉及包含这些载体的宿主。
在适当情况中，本发明分离的多核苷酸可用于实现其编码的蛋白质/多肽的过表达。
“过表达”通常是指核糖核酸、蛋白质或酶的胞内浓度或活性增加。在本发明的情况中，下述编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo等位基因或多核苷酸被过表达，所述mqo等位基因或多核苷酸在其所编码多肽的氨基酸序列第111位含有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸、优选用L-苯丙氨酸或L-丙氨酸置换。在适当情况中，编码的蛋白质在氨基酸序列第201位还含有L-丙氨酸由另一种蛋白质氨基酸、优选L-丝氨酸的置换。
已知N末端的氨基酸、具体是N-末端的甲硫氨酸可以通过酶从形成的多肽中切除，所述酶即为宿主固有的氨基肽酶。
上述基因产物的浓度或活性的增加可例如通过使相应多核苷酸的拷贝数增加至少一个拷贝而实现。
广泛应用的增加拷贝数的方法包括将相应基因或等位基因掺入由棒状细菌复制的载体、优选质粒中。合适的质粒载体例如是pZ1(Menkel et al.，Applied and Environmental Microbiology(1989)64：549-554)或者Tauch et al.(Journal of Biotechnology 99，79-91(2002))所述的pSELF载体。关于谷氨酸棒杆菌中质粒的综述文章可见Tauch et al.(Joukrnal of Biotechnology 104，27-40(2003))所述。
另一种广泛应用的实现过表达的方法是染色体基因扩增方法。在这种方法中，感兴趣的基因或等位基因的至少一个额外的拷贝被插入棒状细菌的染色体中。
在一个实施方案中，如在例如Reinscheid et al.(Applied andEnvironmental Microbiology 60，126-132)对于hom-thrB操纵子的情况的描述中，将在谷氨酸棒杆菌中不复制并含有感兴趣的基因的质粒转移进棒状细菌中。在通过交换事件进行同源重组后，所得菌株包含至少两个拷贝的相关基因或等位基因。
在WO03/040373和US-2003-0219881-A1描述的另一实施方案中，通过至少两次重组事件将感兴趣的基因的一或多个拷贝插入谷氨酸棒杆菌中合意的位点。以这种方式，编码L-赖氨酸去敏感的天冬氨酸激酶的LysC等位基因的拷贝掺入谷氨酸棒杆菌gluB基因中。
在WO03/014330和US-2004-0043458-A1描述的另一个实施方案中，通过至少两次重组事件将感兴趣的基因的至少一个额外的拷贝掺入天然位点，优选以与已经存在的基因或等位基因串联的形式掺入。以这种方式，在例如天然lysC基因的基因座实现lysCFBR等位基因的串联复制。
实现过表达的另一种方法包括将相应基因或等位基因与启动子或表达盒功能性(可操纵地)连接。对于谷氨酸棒杆菌的合适启动子在例如Patek et al.(Journal of Biotechnology 104(1-3)，311-323(2003)的综述性文章中描述。另外可以使用熟知的启动子T3、T7、SP6、M13、lac、tac和trc，所述启动子在Amann et al.(Gene 69(2)，301-315(1988))和Amann and Brosius(Gene 40(2-3)，183-190(1985))中描述。这种启动子可例如插入重组棒状细菌的mqo等位基因上游，通常与起始密码子距离大约1-500个核苷酸，所述重组棒状细菌含有另一种蛋白质氨基酸代替天然存在第111位的L-丝氨酸。这种启动子当然可以也插入本发明突变体的mqo等位基因的上游。另外可以将编码本发明苹果酸醌氧化还原酶变体的分离的多核苷酸与启动子连接，将所得表达单位掺入染色体外复制型质粒或者掺入棒状细菌的染色体中。
除此之外，可以使位于结构基因上游的所述启动子和调节区或者核糖体接合位点发生突变。通过延长mRNA的寿命也可以改善表达。另外，所述酶的活性通过防止酶蛋白被分解而增强。另外，相关基因或等位基因的过表达也可以通过改变培养基成分和进行培养的方式而实现。
通常地，实现过表达的措施使得相应蛋白质/多肽的活性或浓度基于起始微生物或亲代菌株中蛋白质的活性或浓度增加至少10％、25％、50％，75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，或者最多直至1000％或2000％。起始微生物或亲代菌株是指对其应用本发明措施的微生物。
测定苹果酸醌氧化还原酶的酶活性的方法在Molenaar et al.(Journal of Bacteriology 182(24)，6884-6891(2000))中描述。
蛋白质的浓度可以通过一维或二维蛋白质凝胶分级分离及随后使用适当的分析软件对蛋白质浓度进行光学鉴定而测定。为了在棒状细菌情况中制备蛋白质凝胶以及鉴定所述蛋白质，常用的方法是Hermann et al.(Electrophoresis，22：1712-23(2001))所述方法。蛋白质浓度也可以通过Western印迹杂交使用特异于被检测的蛋白质的抗体来确定(Sambrook et al.，Molecular cloning：alaboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)，随后使用合适软件进行光学分析以确定浓度(Lohaus and Meyer(1998)Biospektrum[Biospectrum]5：32-39；Lottspeich，Angewandte Chemie[Applied Chemistry]111：2630-2647(1999))。
因此，本发明涉及一种过表达本发明的苹果酸醌氧化还原酶的方法。本发明用于的过表达方法包括使本发明编码苹果酸醌氧化还原酶变体的多核苷酸的拷贝数增加至少一(1)或多个拷贝，所述苹果酸醌氧化还原酶变体中所编码氨基酸序列的第111位或相应位置存在除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸。本发明的另一方法包括将启动子与所述多核苷酸功能性连接。
本发明进一步涉及微生物，其表现为在其细胞内部本发明苹果酸醌氧化还原酶变体的浓度或活性增加。
另外，过表达本发明突变体或重组菌株中相关生物合成途径、糖酵解、添补反应、柠檬酸循环、磷酸戊糖循环、氨基酸输出的一或多种酶及适当情况下过表达调节蛋白，对于改善L-氨基酸的生产也是有益的。通常优选使用内源基因。
“内源基因”或者“内源核苷酸序列”是指在种群中存在的基因或核苷酸序列或等位基因。
因此，为了制备L-赖氨酸，可以过表达选自下组的一或多种基因：
·编码二氢吡啶二羧酸(dihydropicolinate)合酶的dapA基因，例如EP0197335中描述的谷氨酸棒杆菌野生型dapA基因，
·编码葡萄糖六磷酸脱氢酶的zwf基因，例如JP-A-09224661和EP-A-1108790中描述的谷氨酸棒杆菌野生型zwf基因，
·谷氨酸棒杆菌zwf等位基因，其在US-2003-0175911-A1中描述，其编码这样的蛋白质，其中例如氨基酸序列第243位的L-丙氨酸由L-苏氨酸置换或者其中第245位的L-天冬氨酸由L-丝氨酸置换，
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，例如DE-A-19831609和EP1108790中描述的谷氨酸棒杆菌野生型pyc基因，
·谷氨酸棒杆菌pyc等位基因，其在EP1108790中描述，编码其中氨基酸序列第458位的L-脯氨酸由L-丝氨酸置换的蛋白质，
·谷氨酸棒杆菌pyc等位基因，其在WO02/31158中描述，并且编码这样的蛋白质，所述蛋白质如权利要求1所述携带选自下组的一或多个氨基酸取代：第153位L-谷氨酸由L-天冬氨酸置换，第182位L-丙氨酸由L-丝氨酸置换，第206位L-丙氨酸由L-丝氨酸置换，第227位L-组氨酸由L-精氨酸置换，第452位L-精氨酸由甘氨酸置换及第1120位L-天冬氨酸由L-谷氨酸置换(WO02/31158中图2A描述了丙酮酸羧化酶的两个不同起始位置，所述位置的长度差异相当于17个氨基酸。因此，WO02/31158中根据权利要求1的第153位相应于WO02/31158的图2A中的第170位，而根据权利要求1的第182位相应于图2A中的第199位，根据权利要求1的第206位相应于图2A中的第223位，根据权利要求1的第227位相应于图2A中的第244位，根据权利要求1的第452位相应于图2A中的第469位，根据权利要求1的第1120位相应于图2B中的第1137位。WO02/31158中图2A进一步描述了在第472位氨基酸A(丙氨酸)由G(甘氨酸)的置换。具有N末端序列MTA的蛋白质中的第472位相应于具有N末端序列MST的蛋白质中的第455位，如图2A所示。WO02/31158中图2B描述了在具有N末端MTA的蛋白质中的第1133位，氨基酸D(天冬氨酸)由E(谷氨酸)的置换)，
·编码天冬氨酸激酶的lysC基因，例如在EP-A-1108790中以SEQ ID NO：281描述的谷氨酸棒杆菌野生型lysC基因(见登记号AX120085和120365)及在WO01/00843中以SEQ IDNO：25描述的所述基因(见登记号AX063743)，
·lysCFBR等位基因，具体如表1所示，编码反馈抗性天冬氨酸激酶变体，
·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因，例如在DE-A-19548222中描述的谷氨酸棒杆菌野生型lysE基因，
·编码Zwa1蛋白的谷氨酸棒杆菌野生型zwa1基因(US6,632,644)。
除使用本发明mqo基因的等位基因之外，为了生产L-赖氨酸，同时弱化或消除选自下组的一或多种内源基因也是有益的：
·编码葡萄糖六磷酸异构酶的pgi基因，例如US6,586,214和US6,465,238中描述的谷氨酸棒杆菌pgi基因，
·编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因，例如EP-A-0131171中描述的谷氨酸棒杆菌hom基因，
·编码高丝氨酸激酶的thrB基因，例如Peoples et al.(Molecular Microbiology 2(1988)：63-72)所述的谷氨酸棒杆菌thrB基因，
·编码磷酸果糖激酶的pfkB基因，例如WO01/00844中描述的谷氨酸棒杆菌pfkB基因。(序列No.57)
在适当情况中，可以组合列出的弱化措施和额外的过表达措施(dapA基因、zwf基因等的过表达)。
文中术语“弱化”描述了降低或消除微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性，通过例如使用弱启动子或使用编码具有低活性的相应酶的基因或等位基因，或灭活相应基因或酶(蛋白质)，及任选地组合使用这些措施。
通过利用用于实现弱化的措施，相应蛋白质的活性或浓度一般降低至野生型蛋白质或起始微生物中蛋白质活性或浓度的0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或者0-5％。
考虑到可用于产生弱化的突变是转换、颠换、插入和缺失至少一(1)个碱基对或核苷酸。根据突变引起的氨基酸取代对酶活性的影响，称作错义突变或无义突变。错义突变导致蛋白质中给定氨基酸由另一氨基酸置换，具体地，氨基酸置换形成非保守氨基酸取代。这种取代削弱了所述蛋白质的效力或活性，使其降低至0-75％，0-50％，0-25％，0-10％，0-5％。无义突变导致终止密码子位于所述基因编码区中，使得翻译过早中止。在基因中至少一个碱基对的插入或缺失导致移码突变，这样导致不正确的氨基酸掺入或者翻译过早中止。如果终止密码子由于突变的结果而在编码区中形成，则也导致翻译过早中止。缺失至少一个或多个密码子通常也导致酶活性的完全丧失。
产生这种突变的指导属于现有技术领域，可见于已知的遗传和分子生物学教科书，例如Knippers(Molecular Genetics，6thedition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker(Genes and Clones，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或者Hagemann(General Genetics，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)的教科书。其他措施在现有技术领域中描述。
在发酵过程中显示，通过本发明的方法获得的分离的棒状细菌与最初应用的起始菌株或亲代菌株相比更多地分泌或产生合意的氨基酸。
“分离的细菌”是指突变体和重组细菌，具体是棒状细菌，根据本发明其是分离或产生的并包含编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo等位基因，所述酶在氨基酸序列第111位含有所述氨基酸取代并在适当情况中在第201位L-丙氨酸由另一蛋白质氨基酸、优选L-丝氨酸置换。
基于起始菌株或亲代菌株或者使用这些菌株的发酵方法，分离的细菌或者使用这些细菌的发酵方法在选自如下的一或多个参数方面的性能改善至少0.5％、至少1％、至少1.5％或者至少2％：产物浓度(产物/体积)、产物产量(形成的产物/消耗的碳源)及产物形成(形成的产物/体积/时间)，或者其它参数及参数组合。
本发明的分离的棒状细菌可以持续培养，如例如PCT/EP2004/008882中的描述，或者以分批或补料分批或者重复补料分批方法不连续地培养，以生产L-氨基酸。已知的培养方法概述可见于Chmiel(Bioprocess Technology 1.Introduction toBioprocess Technology(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或者Storhas(Bioreactors and Peripheral Equipment(Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))所著教科书的描述。
所用培养基或发酵培养基必须以适当方式符合给定菌株的需求。关于不同微生物培养基的描述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(美国华盛顿D.C.，1981)。术语培养基和发酵培养基可互换使用。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，衍生自糖用甜菜或甘蔗的含有蔗糖的溶液，淀粉，淀粉水解产物和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油，甲醇和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应含钠盐。
培养基另外还必须含有为生长所需的盐，例如金属如钠、钾、镁、钙和铁的氯化物或硫酸盐，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除上述物质之外，可使用生长必需物质，如氨基酸例如高丝氨酸以及维生素例如硫胺素、生物素或泛酸。此外，可将各种氨基酸的适当前体加入培养基中。
上述添加的物质可以单批混合物的形式加入培养物或以适宜方式在培养期间适当补加。
为了控制培养物的pH值，可以适当方式加入碱性化合物如氢氧化钠，氢氧化钾，氨或氨水，或者酸性化合物如磷酸或硫酸。通常将pH调节为6.0-9.0，优选6.5-8之间。为了控制泡沫产生，可以使用抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了保持质粒的稳定性，可将适当的选择性作用物质例如抗生素加入培养基中。氧气或含氧混合气，例如空气，可通入培养物中以保持有氧条件。也可以使用富含过氧化氢的液体。在适当情况下，发酵是在例如0.03-0.2Mpa的正压下进行。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃-40℃。在分批培养方法中，连续培养直至合意的氨基酸的形成达到最大量。此目的通常在10～160小时达到。在持续培养方法中可以进行较长的培养时间。
合适的发酵培养基在US6,221,635，US5,840,551，US5,770,409，US5,605,818，US5,275,940和US4,224,409等中描述。
确定L-氨基酸的方法为本领域所已知。所述分析可以如Spackman等(Analytical Chemistry，30，(1958)，1190)所述通过阴离子交换层析及随后的茚三酮衍生化进行，或者可以如Lindroth等(Analytical Chemistry(1979)51：1167-1174)所述通过反向HPLC进行。
本发明因此涉及一种制备L-氨基酸的方法，其中：
a)将分离的棒状细菌在合适培养基中发酵，所述细菌包含编码具有苹果酸醌氧化还原酶活性的多肽的基因，所述多肽的氨基酸序列第111位或相应位置的L-丝氨酸由另一种蛋白质氨基酸置换，并且在适当情况中，在第201位或相应位置的L-丙氨酸由另一种蛋白质氨基酸、优选L-丝氨酸置换，
b)L-氨基酸在发酵肉汤或分离的棒状细菌细胞中富集。
然后将以这种方式制备的发酵肉汤进行进一步加工成为固体或液体产物。
发酵肉汤是指在其中将微生物在一定温度培养一定时间的发酵培养基。在发酵期间应用的发酵培养基含有保证所述微生物增殖及合意的氨基酸形成所需要的所有物质或成分。
发酵结束时，所得发酵肉汤因此含有：a)作为所述微生物细胞复制的结果而形成的微生物的生物量，b)在发酵期间形成的合意的氨基酸，c)在发酵期间形成的有机副产物，及d)未被发酵消耗的所用发酵培养基的组成成分，或者加入的物质，例如维生素如生物素，氨基酸如高丝氨酸，或者盐如硫酸镁。
所述有机副产物包括由发酵所用微生物产生的除合意氨基酸之外的物质，在适当情况中其被分泌。这些副产物包括比合意的氨基酸少至少30％、20％或10％的L-氨基酸。所述副产物也包括具有1-3个羧基基团的有机酸，如乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸或者延胡索酸。最后，这些副产物还包括糖，如海藻糖。
适于工业化目的的通常的发酵肉汤的氨基酸含量为40g/kg-180g/kg或者50g/kg-150g/kg。通常地，生物量的含量(干生物量)为20-50g/kg。
在L-赖氨酸的情况中，现有技术领域主要公开了四种不同产物形式。
一组含有L-赖氨酸的产物包含经纯化L-赖氨酸的浓缩碱性水溶液(EP-B-0534865)。另一组如US6,340,486和US6,465,025所述，包含含有L-赖氨酸发酵肉汤的含有生物量的酸性含水浓缩物。最常见的固体产物的组包含粉状或晶体形式的经纯化的或纯L-赖氨酸，其通常以盐如L-赖氨酸盐酸盐的形式存在。另一组固体产物形式在例如EP-B-0533039中描述。在本文中描述的产物形式除含L-赖氨酸之外，还含有在发酵生产期间使用的而未被消耗的大部分添加的物质，并且在适当情况中为所用微生物的生物量的＞0％至100％。
根据不同的产物形式，已知有许多方法从发酵肉汤中收集、分离或纯化L-氨基酸，以制备含有L-氨基酸的产物或者纯化的L-氨基酸。
基本上使用的方法是在适当情况下使用活性炭的离子交换层析方法及用于制备固态纯L-氨基酸的结晶化方法。在赖氨酸的情况中，这样产生了相应的碱或相应的盐如一盐酸盐(Lys-HCl)或者赖氨酸硫酸盐(Lys2-H2SO4)。
对于赖氨酸，EP-B-0534865描述了一种从发酵肉汤中制备含有L-赖氨酸的碱性水溶液的方法。在该文中，从发酵肉汤中分离出生物量并弃去。使用碱如氢氧化钠、氢氧化钾或者氢氧化铵将pH调节为9-11。在浓缩和冷却之后，通过结晶化从肉汤中分离出矿物质成分(无机盐)，用作肥料或弃去。
在使用本发明的细菌制备赖氨酸的方法中，优选产生含有发酵肉汤组成成分的产物。这些产物具体可用作动物饲料添加剂。
根据需要，可以通过分离方法如离心、过滤或倾析或这些方法的组合将全部或部分生物量从发酵肉汤中除去，或者可将所有生物量均保留在发酵肉汤中。在适当情况中，在适当的步骤中灭活所述生物量或者含有生物量的发酵肉汤，例如通过热处理(加热)或者加入酸来进行。
所述生物量的化学成分是胞外被膜等，例如肽聚糖和阿拉伯半乳聚糖，蛋白质或多肽，例如苹果酸醌氧化还原酶多肽，脂质和磷脂及核酸(DNA和RNA)，例如含有本发明突变的多核苷酸。作为灭活措施和/或其它程序步骤(例如酸化、喷雾干燥、造粒等)的结果，核酸通常以片段形式存在，所述片段长度为≥40-60bp，＞60-80bp，＞80-100bp，＞100-200bp，＞200-300bp，＞300-400bp，＞400-500bp，＞500-750bp，＞750-1000bp，＞1000-1250bp，＞1250-1500bp，＞1500-1750bp，＞1750-2000bp，＞2000-2500bp，＞2500-3000bp，＞3000-4000bp，＞4000-5000bp等。
在一种方法中，所述生物量被完全或基本完全除去，由此在制备的产物中没有(0％)生物量，或者保存有至多30％、20％、10％、5％、1％或者至多0.1％的生物量。在另一种方法中，所述生物量未被除去，或者仅除去微量，由此所有(100％)或者超过70％、80％、90％、95％、99％或99.9％的生物量保留在制备的产物中。在本发明的一种方法中，所述生物量被除去的比例是≥0％至≤100％。
最后，在发酵后获得的发酵肉汤在完全或部分除去所述生物量之前或之后可以用无机酸如盐酸、硫酸或磷酸或者用有机酸如丙酸调节为酸性(GB1,439,728或者EP1331220)。同样当发酵肉汤含有全部的生物量时也可以对其进行酸化。最后，肉汤也可以通过加入亚硫酸氢钠(NaHSO3，GB1,439,728)或者另一种盐例如铵、碱金属或碱土金属的硫酸盐而稳定化。
当所述生物量被分离出时，发酵肉汤中存在的有机或无机固体被部分或全部除去。溶解于发酵肉汤中的有机副产物中的至少一些(＞0％)，优选至少25％、具体优选至少50％、特别优选至少75％及溶解且未消耗的发酵培养基的组成成分(加入的物质)保留在产物中。在适当情况中，这些副产物和组成成分也完全保留(100％)或者基本上完全保留(即＞95％或＞98％)在产物中。在这个意义上，术语“发酵肉汤主要成分”是指包含至少一部分发酵肉汤组成成分的产物。
随后，使用已知方法从肉汤中排出水分，或者将肉汤增稠或浓缩，例如使用旋转蒸发器、薄膜蒸发器或者降膜蒸发器，或者通过反渗透或纳米过滤方法。然后可以将这种浓缩的发酵肉汤制成易流动的产物，具体是制成细碎的粉末，或者优选制成粗粒，使用冻干方法、喷雾干燥方法或者喷雾造粒或者使用其它方法在例如PCT/EP2004/006655所述的循环流化床中进行。在适当情况中，通过筛选或除尘方法将合意的产物从所得颗粒物中分离出。
另外可以通过喷雾干燥或喷雾造粒方法直接将发酵肉汤干燥，之前不用任何浓缩方法。
“易流动的”是指粉末不受阻碍地从具有不同大小流出孔的一系列玻璃流出管中流出的粉末，即其不受阻碍地从具有5mm(毫米)孔的流量管中流出(Klein：Seifen，le，Fette，Wachse[Soaps，Oils，Fats and Waxes]94，12(1968))。
“细碎的”是指大部分(＞50％)粉末的粒径大小为20-200μm。
“粗粒”是指大部分(＞50％产物)的粒径大小为200-2000μm。
颗粒大小可以使用激光衍射光谱法确定。相应方法在R.H.Müller and R.Schuhmann的教科书Teilchengrβenmessung in derLaborpraxis[Particle Size Measurement in Laboratory Practice]”，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart(1996)或者Introduction to Particle Technology”by M.Rhodes，Wiley&Sons(1998)中描述。
可以通过合适的压型或造粒方法将易流动的细粉末转变为粗粒的、易流动的、耐贮存的且在很大程度上无尘的产物。
术语“无尘”是指所述产物仅含有较小比例(＜5％)的直径小于100μm的颗粒。
在本发明中，“耐贮存的”是指产物在干燥和冷却环境中可以贮存至少一(1)年或更长时间，优选至少1.5年或更长时间，特别优选至少2年或更长时间，而指定的氨基酸不明显丧失(＜5％)。
本发明因此还涉及一种从发酵肉汤中制备含有L-氨基酸、优选L-赖氨酸或L-色氨酸的产物、优选动物饲料添加剂的方法，所述方法的特征在于如下步骤：
a)在发酵培养基中培养和发酵分泌L-氨基酸的棒状细菌，其包含编码一种多肽的至少一个mqo等位基因，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性，包含其中第111位或相应位置存在除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸的氨基酸序列，且在适当情况中在所述氨基酸序列第201位或相应位置存在任何蛋白质氨基酸、优选L-丝氨酸，
b)除去在发酵期间形成的生物量的0-100％重量，
c)干燥根据步骤a)和/或b)中获得的发酵肉汤，以获得合意的粉末形式或颗粒形式的产物，
在适当情况中，在步骤b)或c)之前加入选自硫酸、磷酸或盐酸的酸。
优选在步骤a)或b)之后从含有L-氨基酸的发酵肉汤中除去水分(浓缩)。
使用以下物质对于造粒或压型是有益的：常用的有机或无机辅助物质，或者载体如淀粉、凝胶、纤维素衍生物或者类似物质，如在食品和饲料加工中通常用作粘合剂、稠化剂或者增稠剂的物质，或者其它物质如硅酸、硅酸盐(EP0743016A)或硬脂酸盐。
用油提供所得颗粒的表面也是有益的，如WO 04/054381所述。可以使用的油是矿物质油、植物油或植物油混合物。这些油例如是大豆油、橄榄油和大豆油/卵磷脂混合物。在相同方式中，硅油、聚乙二醇或羟乙基纤维素也是适合的。用所述油处理所述表面增加产物的磨损抗性及降低灰尘含量。产物中油的含量基于饲料添加剂总量为0.02-2.0％重量，优选为0.02-1.0％重量，特别优选为0.2-1.0％重量。
优选粒径为100-1800μm的产物的含量≥97％(重量)，或者粒径为300-1800μm的产物的含量≥95％。灰尘，即直径＜100μm的颗粒，优选为＞0-1％(重量)，具体优选至多0.5％(重量)。
然而，或者所述产物也可以附着于饲料加工中已知及惯用的有机或无机载体物质上，例如硅酸、硅酸盐、谷粉、糠、粗谷粉、淀粉、糖等，和/或与惯用的增稠剂或粘合剂混和及稳定。关于这方面的应用实例和方法在文献(Die Mühle+Mischfuttertechnik[The Grinding Mill+Mixed Feed Technology]132(1995)49，page817)中描述。
最后，如DE-C-4100920所述，所述产物也可以通过包被方法使用成膜剂如金属碳酸盐、硅酸、硅酸盐、藻酸盐、硬脂酸盐、淀粉、橡胶和纤维素醚进行加工，形成对于动物胃、特别是反刍动物的胃的消化稳定的状态。
为了设定产物中合意的氨基酸浓度，根据需要在发酵期间可以加入适当的氨基酸，以浓缩物形式或极纯物质形式或者其液体或固体形式的盐加入。后者可以单独或者作为混和物加入所得发酵肉汤中，或者加入浓缩的发酵肉汤中，或者在干燥或造粒期间加入。
在赖氨酸情况中，在含有赖氨酸的产物制备期间调节离子比率以使根据如下化学式：
2×[SO4 2-]+[Cl-]-[NH4 +]-[Na+]-[K+]-2×[Mg+]-2×[Ca2+]/[L-Lys]的离子比率值为0.68-0.95，优选为0.68-0.90，如Kushiki et al.于US20030152633中的描述。
在赖氨酸的情况中，以这种方式制备的基于发酵肉汤的固体产物的赖氨酸含量(作为赖氨酸碱)基于产物干重为10％-70％重量，或者20％-70％重量，优选30％-70％重量，特别优选40％-70％重量。也可以实现的赖氨酸碱的最大含量为71％重量、72％重量或73％重量。
在电学中性氨基酸如L-色氨酸的情况中，以这种方式制备的基于发酵肉汤的固体产物的氨基酸含量为至少5％重量、10％重量、20％重量或者30％重量，最高为50％重量、60％重量、70％重量、80％重量、90％重量或者直至95％重量。
所述固体产物的水含量为至多5％重量，优选至多4％重量，具体优选少于3％重量。
本发明因此还涉及一种含有L-赖氨酸的基于发酵肉汤的饲料添加剂，其呈现如下特征：
a)赖氨酸含量(作为碱)为至少10％重量至至多73％重量，
b)水含量为至多5％重量，
c)生物量含量相应于发酵肉汤中含有的生物量的至少0.1％，其中所述生物量是从本发明的棒状细菌形成的，其在适当情况下是失活的。
本发明进一步还涉及一种含有L-色氨酸的基于发酵肉汤的饲料添加剂，其呈现如下特征：
a)色氨酸含量为至少5％重量至至多95％重量，
b)水含量为至多5％重量，
c)生物量含量相应于发酵肉汤中含有的生物量的至少0.1％，所述生物量是从本发明的棒状细菌形成的，其在适当情况下是失活的。
称作DM1797且在其天冬氨酸激酶中包含氨基酸取代lysCT311I的谷氨酸棒杆菌于2004年10月28日保藏在德国微生物和细胞保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)，保藏号为DSM16833。
在mqo多肽的氨基酸序列中第111位包含L-苯丙氨酸的本发明的谷氨酸棒杆菌DM1808于2004年11月24日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)，保藏号为DSM16937。
实施例
实施例1：产生L-赖氨酸的菌株DM1797的诱变
将谷氨酸棒杆菌菌株DM1797用作起始菌株，使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)进行诱变。菌株DM1797是谷氨酸棒杆菌ATCC13032的一种氨乙基半胱氨酸抗性突变体，保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)，保藏号为DSM16833。
将菌株DM1797在33℃在100ml Erlenmeyer培养瓶中的10ml的LB肉汤(Merck，Darmstadt，Germany)中以200rpm在Certomat BS-1型旋转式摇瓶(B.Braun Biotech International，Melsungen，Germany)上培养24小时。然后将培养物离心，将沉淀物再悬浮于10ml的0.9％NaCl溶液中；将所得悬浮液再离心一次，将获得的沉淀物置于10ml的0.9％NaCl溶液中。将5ml这种细胞悬浮液用400μg的MNNG/ml在30℃在摇床上以200rpm处理15分钟(见上述)。然后将诱变混合物离心，将沉淀物置于10ml 0.9％NaCl缓冲液(pH＝6.0)中的2％硫代硫酸钠中。然后将细胞悬浮液用0.9％NaCl溶液以1∶1000、1∶10000和1∶100000的比例稀释，将等分试样铺板于脑-心琼脂(Merck，Darmstadt，Germany)上。以此方式分离大约2500个突变体。
实施例2：菌株DM1797突变体的性能测试
将在实施例1中获得的突变体在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，测定培养上清中的赖氨酸含量。
为此，首先将克隆在33℃在脑-心琼脂平板(Merck，Darmstadt，Germany)上增殖24小时。然后用这些琼脂平板培养物接种一份预培养物(10ml培养基，于100ml Erlenmeyer培养瓶中)。用于预培养的培养基是MM培养基。将所述预培养物在33℃在摇床上以240rpm保温24小时。这个预培养物用于接种主培养物，使得主培养物的初始OD(660nm)为0.1 OD。MM培养基也用于主培养物。
MM培养基
CSL                      5g/l
MOPS                     20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)     50g/l
盐：
(NH4)2SO4                25g/l
KH2PO4                   0.1g/l
MgSO4*7H2O               1.0g/l
CaCl2*2H2O               10mg/l
FeSO4*7H2O               10mg/l
MnSO4*H2O                5.0mg/l
生物素(过滤灭菌)         0.3mg/l
硫胺素*HCl(过滤灭菌)     0.2mg/l
CaCO3              25g/l
用氨水将CSL(玉米浸液)，MOPS(吗啉代丙磺酸)和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
培养在具有档板的100ml Erlenmeyer培养瓶中的10ml体积中进行。温度为33℃，转速为250rpm，大气湿度为80％。
48小时后，用Biomek1000(Beckmann仪器有限公司，慕尼黑)在660nm测量波长测定OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)，经离子交换层析和柱后衍生及茚三酮检测来测定形成的赖氨酸的量。特征为赖氨酸形成量增多的突变体被称作DM1808.
表1
    菌株     OD(660)   赖氨酸-HCl(g/l)
    DM1797     12.1     4.9
    DM1808     12.0     5.3
实施例3：突变体DM1808的mqo基因的测序
使用Eikmanns et al.(Microbiology 140：1817-1828(1994))所述方法从DM1808克隆中分离染色体DNA。使用聚合酶链反应扩增携带mqo基因的DNA节段。为该目的使用如下寡核苷酸作为引物：
mqo-A1(SEQ ID NO：13)：
5’ggtgaaacttccgcgatact 3’
mqo-E1(SEQ ID NO：14)：
5’gtgtcgccta aatcacactg 3’
所述引物由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成。它们使得长度为大约2kb并携带mqo基因的DNA节段得以扩增。引物mqo-A1结合相应于SEQ ID NO：3互补链中第22-41位的区域。引物mqo-E1结合相应于SEQ ID NO：3所示链中第2002-1983位的区域。
使用Phusion High Fidelity DNA聚合酶(New EnglandBiolabs，Frankfurt，Germany)进行PCR反应。所述反应混合物根据厂商指导制备，含有10μl的5×Phusion HF缓冲液，以及在每种情况中200μM浓度的三磷酸脱氧核苷，0.5μM浓度的引物，大约50ng的模板DNA及2单位的Phusion聚合酶，总体积为50μl。通过加入水将体积调节为50μl。
首先将PCR混合物在98℃30秒进行初步变性。然后将如下步骤重复35次：在98℃20秒的变性步骤，在60℃20秒使所述引物与导入的DNA结合的步骤，及在72℃60秒使引物延伸的延伸步骤。最后在72℃5分钟的延伸步骤之后，对PCR混合物进行琼脂糖凝胶电泳(0.8％琼脂糖)。鉴定长度为大约2kb的DNA片段，使用Qiagen的QIAquick凝胶提取试剂盒(Hilden，Germany)从凝胶中分离并纯化。
扩增的DNA片段或PCR产物的核苷酸序列通过Agowa(Berlin，Germany)确定。所得mqo等位基因的编码区序列示于SEQ ID NO：5。使用Patentin程序获得的蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO：6。
突变体DM1808中mqo等位基因的编码区的核苷酸序列在第332位含有核碱基胸腺嘧啶332(见SEQ ID NO：5)。野生型基因(见SEQ ID NO：1)在这个位置含有核碱基胞嘧啶。这种胞嘧啶-胸腺嘧啶转换导致在所得氨基酸序列第111位的丝氨酸由苯丙氨酸置换。下文将这个突变称作mqoS111F。
实施例4：置换型载体pK1 8omobsacB_mqoS111F的构建
使用聚合酶链反应扩增携带mqoS111F突变的mqo等位基因的一部分编码区，即内部片段或内部区域。将在实施例3中分离的染色体DNA用作模板。选择如下寡核苷酸作为PCR引物：
mqo-int1-bam(SEQ ID NO：27)：
5’ctag- ggatcc-ccgaagaacgcaccgaggat 3’
mqo-int2-bam(SEQ ID NO：28)：
5’ctag- ggatcc-ggcggatggacttgaacagg 3’
它们由MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成，使得扩增长度为大约1.05kb的编码区的DNA节段成为可能。mqo-int1-bam引物的第11-30位核苷酸结合SEQ ID NO：3互补链中第362-381位的区域。SEQ ID NO：3的第362和381位相应于SEQ ID NO：1的第13和32位。mqo-int2-bam引物的第11-30位核苷酸结合相应于SEQ ID NO：3所示链中第1385-1366位的区域。SEQ ID NO：3中第1385位和1366位相应于SEQ ID NO：1中第1036和1017位。另外，所述引物含有针对限制性核酸内切酶BamHI的切割位点的序列，该位点在上述核苷酸序列中以下划线示出。
使用Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(New EnglandBiolabs，Frankfurt，Germany)进行PCR反应。所述反应混合物具有如上述组成。基本如上述进行PCR，一处差别外是：重复35次的循环中的72℃延伸步骤在每种情况中均只进行30秒。
将长度为大约1.05kb的扩增物用限制性核酸内切酶BamHI处理，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳鉴别。然后使用Qiagen的QIAquick提取试剂盒从凝胶中分离并纯化。
以此方式纯化的DNA片段含有所述mqoS111F突变，并具有BamHI相容性末端(mqoS111F片段或图1中的‘mqo’)。然后将其掺入Schfer et al.(Gene，145，69-73(1994))所述的可移动载体pK18mobsacB中，以使实现等位基因或突变置换成为可能。为此，将pK18mobsacB用限制酶BamHI消化，将末端用碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim，Germany)去磷酸化。将以此方式制备的载体与mqoS111F片段混和，将该混合物用Ready-To-Go T4 DNA连接酶试剂盒(Amersham-Pharmacia，Freiburg，Germany)处理。
然后将大肠杆菌菌株S17-1(Simon et al.，Bio/Technologie 1：784-791，1993)用该连接混合物转化(Hanahan，In.DNA cloning.A practical approach.Vol.1.ILR-Press，Cold Spring Harbor，NewYork，1989)。通过将该转化混合物铺板于添加了25mg/l卡那霉素/lLB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook et al.，MolecularCloning：a laboratory manual.2ndEd.Cold Spring Harbor，NewYork，1989)。
使用Qiagen QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，通过用酶BamHI限制切割一次及用酶EcoRI限制切割一次进行检测，然后进行琼脂糖凝胶电泳。将该质粒称作
pK18mobsacB_mqoS111F，并在图1中描绘。
实施例5：将突变mqoS111F掺入菌株DM1797中
将如实施例4所述的载体pK18mobsacB_mqoS111F通过接合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DM1797中，使用Schfer et al.(Journalof Microbiology 172：1663-1666(1990))所述方案进行。所述载体在DM1797中不能独立复制，当其通过重组事件而整合进染色体中时才在细胞中保持。转接合子，即含有整合的pK18mobsacB_mqoS111F的克隆，通过将接合混合物铺板于添加了25mg卡那霉素/l和50mg萘啶酸/l的LB琼脂上进行选择。然后将卡那霉素抗性转接合子在添加了卡那霉素(25mg/l)的LB琼脂上划线，将平板在33℃保温24小时。为了选择其中通过二次重组事件切除所述质粒的突变体，将克隆在LB液体培养基中非选择性培养30小时，然后在添加了10％蔗糖的LB琼脂上划线，之后将该平板在33℃保温24小时。
除卡那霉素抗性基因之外，与起始质粒pK18mobsacB一样，质粒pK18mobsacB_mqoS111F也含有sacB基因的拷贝，其编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶。sacB基因的蔗糖诱导型表达导致果聚糖蔗糖酶形成，该酶催化对于谷氨酸棒杆菌有毒性的果聚糖的合成。因此在添加了蔗糖的LB琼脂上生长的克隆才是其中通过二次重组事件切除了整合的pK18mobsacB_mqoS111F的那些克隆。当发生切除时，根据二次重组事件相对于突变位点的位置，发生等位基因的置换或者突变的掺入，或者原始拷贝保留在宿主的染色体中。
然后寻找其中发生合意的置换、即已经掺入了突变mqoS111的克隆。为此，在呈现“在存在蔗糖的条件下生长”及“在存在卡那霉素条件下不生长”表型的10个克隆中确定mqo基因的序列。这样可以鉴别携带突变mqoS111F的克隆。将这个菌株称作谷氨酸棒杆菌DM1797_mqoS111F。
实施例6：菌株DM1797_mqoS111F与起始菌株DM1797的性能对比
如实施例2所述进行性能测试。与DM1808一样，菌株DM1797_mqoS111F显示的赖氨酸分泌显著高于DM1797(见表1)。
附图简述：
图1：质粒pK18mobsacB_mqoS111F的图谱。
文中所用缩写和名称具有如下含义。给出的碱基对数目是在测量再现性的限度内获得的近似值。
Kan：     卡那霉素抗性基因
BamHI：   限制酶BamHI的切割位点
EcoRI：   限制酶EcoRI的切割位点
mqo：     含有mqoS111F等位基因内部区域的克隆的DNA片段
sacB：    sacB基因
RP4-mob： 含有复制转移起点(oriT)的mob区域
oriV：    复制起点V
序列表
<110>德古萨股份公司(Degussa AG)
<120>棒状细菌mqo基因的等位基因
<130>040041 BT
<160>26
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1503
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1500)
<223>mqo wild-type gene
<400>1
atg tca gat tcc ccg aag aac gca ccg agg att acc gat gag gca gat       48
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1               5                   10                  15
gta gtt ctc att ggt gcc ggt atc atg agc tcc acg ctg ggt gca atg       96
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
            20                  25                  30
ctg cgt cag ctg gag cca agc tgg act cag atc gtc ttc gag cgt ttg      144
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
        35                  40                  45
gat gga ccg gca caa gag tcg tcc tcc ccg tgg aac aat gca gga acc      192
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
    50                  55                  60
ggc cac tct gct cta tgc gag ctg aac tac acc cca gag gtt aag ggc      240
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
65                  70                  75                  80
aag gtt gaa att gcc aag gct gta gga atc aac gag aag ttc cag gtt      288
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
                85                  90                  95
tcc cgt cag ttc tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg tct gat      336
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ser Asp
            100                 105                 110
cct aag gaa ttc atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc cag ggc      384
Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
        115                 120                 125
gca gat cag gtt gca tac atc aag gct cgc tac gaa gct ttg aag gat      432
Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
    130                 135                 140
cac cca ctc ttc cag ggc atg acc tac gct gac gat gaa gct acc ttc      480
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145                 150                 155                 160
acc gag aag ctg cct ttg atg gca aag ggc cgt gac ttc tct gat cca      528
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
                165                 170                 175
gta gca atc tct tgg atc gat gaa ggc acc gac atc aac tac ggt gct      576
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
            180                 185                 190
cag acc aag cag tac ctg gat gca gct gaa gtt gaa ggc act gaa atc      624
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ala Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
        195                 200                 205
cgc tat ggc cac gaa gtc aag agc atc aag gct gat ggc gca aag tgg      672
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
    210                 215                 220
atc gtg acc gtc aag aac gta cac act ggc gac acc aag acc atc aag      720
Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys
225                 230                 235                 240
gca aac ttc gtg ttc gtc ggc gca ggc gga tac gca ctg gat ctg ctt      768
Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu
                245                 250                 255
cgc agc gca ggc atc cca cag gtc aag ggc ttc gct gga ttc cca gta      816
Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
            260                 265                 270
tcc ggc ctg tgg ctt cgt tgc acc aac gag gaa ctg atc gag cag cac      864
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
        275                 280                 285
gca gcc aag gta tat ggc aag gca tct gtt ggc gct cct cca atg tct      912
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
    290                 295                 300
gtt cct cac ctt gac acc cgc gtt atc gag ggt gaa aag ggt ctg ctc      960
Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
305                 310                 315                 320
ttt gga cct tac ggt ggc tgg acc cct aag ttc ttg aag gaa ggc tcc     1008
Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser
                325                 330                 335
tac ctg gac ctg ttc aag tcc atc cgc cca gac aac att cct tcc tac     1056
Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr
            340                 345                 350
ctt ggc gtt gct gct cag gaa ttt gat ctg acc aag tac ctt gtc act     1104
Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
        355                 360                 365
gaa gtt ctc aag gac cag gac aag cgt atg gat gct ctt cgc gag tac     1152
Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr
    370                 375                 380
atg cca gag gca caa aac ggc gat tgg gag acc atc gtt gcc gga cag     1200
Met Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln
385                 390                 395                 400
cgt gtt cag gtt att aag cct gca gga ttc cct aag ttc ggt tcc ctg     1248
Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu
                405                 410                 415
gaa ttc ggc acc acc ttg atc aac aac tcc gaa ggc acc atc gcc gga     1296
Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly
            420                 425                 430
ttg ctc ggt gct tcc cct gga gca tcc atc gca cct tcc gca atg atc     1344
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
        435                 440                 445
gag ctg ctt gag cgt tgc ttc ggt gac cgc atg atc gag tgg ggc gac     1392
Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
    450                 455                 460
aag ctg aag gac atg atc cct tcc tac ggc aag aag ctt gct tcc gag     1440
Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu
465                 470                 475                 480
cca gca ctg ttt gag cag cag tgg gca cgc acc cag aag acc ctg aag     1488
Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
                485                 490                 495
ctt gag gaa gcc taa                                                 1503
Leu Glu Glu Ala
            500
<210>2
<211>500
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>2
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1               5                   10                  15
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
        35                  40                  45
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
    50                  55                  60
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
65                  70                  75                  80
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
                85                  90                  95
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ser Asp
            100                 105                 110
Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
    130                 135                 140
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145                 150                 155                 160
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
                165                 170                 175
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
            180                 185                 190
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ala Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
        195                 200                 205
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
    210                 215                 220
Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys
225                 230                 235                 240
Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu
                245                 250                 255
Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
            260                 265                 270
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
        275                 280                 285
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
    290                 295                 300
Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
305                 310                 315                 320
Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser
                325                 330                 335
Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr
            340                 345                 350
Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
        355                 360                 365
Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr
    370                 375                 380
Met Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln
385                 390                 395                 400
Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu
                405                 410                 415
Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly
            420                 425                 430
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
        435                 440                 445
Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
    450                 455                 460
Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu
465                 470                 475                 480
Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
                485                 490                 495
Leu Glu Glu Ala
            500
<210>3
<211>2002
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(350).. (1849)
<223>mqo wild-type gene
<400>3
agtcgactga aatgttcacg tggtgaaact tccgcgatac tactcatgtt tgcgaattgc     60
acatttacta actttgcaaa ttgggggagg gggtagcgcg ggggaggaat tcgcatgaga    120
aaggggaata tcccgtgctt gtttattcag ctcgaggtgg caggcgtaca ctctatattc    180
acggacaatg tgtacccacg ctttcttgta agaaacaaga agggtaacgc cccacgcgtc    240
agtcaaaaat atggccaaca cttgcattcg ggtgctggcg atcatttatg agatgacgcc    300
ttgtgttggt gttcggcaga gaactcgcgg agataaaagg aagttgaac atg tca gat    358
                                                      Met Ser Asp
                                                      1
tcc ccg aag aac gca ccg agg att acc gat gag gca gat gta gtt ctc      406
Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp Val Val Leu
    5                   10                  15
att ggt gcc ggt atc atg agc tcc acg ctg ggt gca atg ctg cgt cag      454
Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met Leu Arg Gln
20                  25                  30                  35
ctg gag cca agc tgg act cag atc gtc ttc gag cgt ttg gat gga ccg      502
Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu Asp Gly Pro
                40                  45                  50
gca caa gag tcg tcc tcc ccg tgg aac aat gca gga acc ggc cac tct      550
Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr Gly His Ser
            55                  60                  65
gct cta tgc gag ctg aac tac acc cca gag gtt aag ggc aag gtt gaa      598
Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly Lys Val Glu
        70                  75                  80
att gcc aag gct gta gga atc aac gag aag ttc cag gtt tcc cgt cag      646
Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val Ser Arg Gln
    85                  90                  95
ttc tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg tct gat cct aag gaa      694
Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ser Asp Pro Lys Glu
100                 105                 110                 l15
ttc atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc cag ggc gca gat cag      742
Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly Ala Asp Gln
                120                 125                 130
gtt gca tac atc aag gct cgc tac gaa gct ttg aag gat cac cca ctc      790
Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp His Pro Leu
            135                 140                 145
ttc cag ggc atg acc tac gct gac gat gaa gct acc ttc acc gag aag      838
Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe Thr Glu Lys
        150                 155                 160
ctg cct ttg atg gca aag ggc cgt gac ttc tct gat cca gta gca atc      886
Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro Val Ala Ile
    165                 170                 175
tct tgg atc gat gaa ggc acc gac atc aac tac ggt gct cag acc aag      934
Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala Gln Thr Lys
180                 185                 190                 195
cag tac ctg gat gca gct gaa gtt gaa ggc act gaa atc cgc tat ggc      982
Gln Tyr Leu Asp Ala Ala Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile Arg Tyr Gly
                200                 205                 210
cac gaa gtc aag agc atc aag gct gat ggc gca aag tgg atc gtg acc     1030
His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp Ile Val Thr
            215                 220                 225
gtc aag aac gta cac act ggc gac acc aag acc atc aag gca aac ttc     1078
Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys Ala Asn Phe
        230                 235                 240
gtg ttc gtc ggc gca ggc gga tac gca ctg gat ctg ctt cgc agc gca     1126
Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu Arg Ser Ala
    245                 250                 255
ggc atc cca cag gtc aag ggc ttc gct gga ttc cca gta tcc ggc ctg     1174
Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val Ser Gly Leu
260                 265                 270                 275
tgg ctt cgt tgc acc aac gag gaa ctg atc gag cag cac gca gcc aag     1222
Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His Ala Ala Lys
                280                 285                 290
gta tat ggc aag gca tct gtt ggc gct cct cca atg tct gtt cct cac     1270
Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser Val Pro His
            295                 300                 305
ctt gac acc cgc gtt atc gag ggt gaa aag ggt ctg ctc ttt gga cct     1318
Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu Phe Gly Pro
        310                 315                 320
tac ggt ggc tgg acc cct aag ttc ttg aag gaa ggc tcc tac ctg gac     1366
Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser Tyr Leu Asp
    325                 330                 335
ctg ttc aag tcc atc cgc cca gac aac att cct tcc tac ctt ggc gtt     1414
Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr Leu Gly Val
340                 345                 350                 355
gct gct cag gaa ttt gat ctg acc aag tac ctt gtc act gaa gtt ctc     1462
Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr Glu Val Leu
                360                 365                 370
aag gac cag gac aag cgt atg gat gct ctt cgc gag tac atg cca gag     1510
Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr Met Pro Glu
            375                 380                 385
gca caa aac ggc gat tgg gag acc atc gtt gcc gga cag cgt gtt cag     1558
Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln Arg Val Gln
        390                 395                 400
gtt att aag cct gca gga ttc cct aag ttc ggt tcc ctg gaa ttc ggc     1606
Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu Glu Phe Gly
    405                 410                 415
acc acc ttg atc aac aac tcc gaa ggc acc atc gcc gga ttg ctc ggt     1654
Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly Leu Leu Gly
420                 425                 430                 435
gct tcc cct gga gca tcc atc gca cct tcc gca atg atc gag ctg ctt     1702
Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile Glu Leu Leu
                440                 445                 450
gag cgt tgc ttc ggt gac cgc atg atc gag tgg ggc gac aag ctg aag     1750
Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp Lys Leu Lys
            455                 460                 465
gac atg atc cct tcc tac ggc aag aag ctt gct tcc gag cca gca ctg     1798
Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu Pro Ala Leu
        470                 475                 480
ttt gag cag cag tgg gca cgc acc cag aag acc ctg aag ctt gag gaa     1846
Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys Leu Glu Glu
    485                 490                 495
gcc taaatcttct aactgctttc tttaaagcac ccgcacatgt ctgttgaggt          1899
Ala
500
ttcacctgcg gagacaatct ccgccttcat gggttggaac tgacacagtt gaaggcatgt   1959
cgggtgcttt gcgtattctt tgccagtgtg atttaggcga cac                     2002
<210>4
<211>500
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>4
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1               5                   10                  15
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
        35                  40                  45
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
    50                  55                  60
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
65                  70                  75                  80
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
                85                  90                  95
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ser Asp
            100                 105                 110
Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
    130                 135                 140
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145                 150                 155                 160
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
                165                 170                 175
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
            180                 185                 190
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ala Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
        195                 200                 205
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
    210                 215                 220
Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys
225                 230                 235                 240
Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu
                245                 250                 255
Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
            260                 265                 270
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
        275                 280                 285
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
    290                 295                 300
Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
305                 310                 315                 320
Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser
                325                 330                 335
Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr
            340                 345                 350
Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
        355                 360                 365
Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr
    370                 375                 380
Met Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln
385                 390                 395                 400
Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu
                405                 410                 415
Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly
            420                 425                 430
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
        435                 440                 445
Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
    450                455                  460
Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu
465                 470                 475                 480
Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
                485                 490                 495
Leu Glu Glu Ala
            500
<210>5
<211>1503
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1).. (1500)
<223>mqo allele
<220>
<221>mutation
<222>(332).. (332)
<223>Transition：replacement of cytosine with thymine
<400>5
atg tca gat tcc ccg aag aac gca ccg agg att acc gat gag gca gat       48
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1               5                   10                  15
gta gtt ctc att ggt gcc ggt atc atg agc tcc acg ctg ggt gca atg       96
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
            20                  25                  30
ctg cgt cag ctg gag cca agc tgg act cag atc gtc ttc gag cgt ttg      144
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
        35                  40                  45
gat gga ccg gca caa gag tcg tcc tcc ccg tgg aac aat gca gga acc      192
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
    50                  55                  60
ggc cac tct gct cta tgc gag ctg aac tac acc cca gag gtt aag ggc      240
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
65                  70                  75                  80
aag gtt gaa att gcc aag gct gta gga atc aac gag aag ttc cag gtt      288
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
                85                  90                  95
tcc cgt cag ttc tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg ttt gat      336
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Phe Asp
            100                 105                 110
cct aag gaa ttc atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc cag ggc      384
Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
        115                 120                 125
gca gat cag gtt gca tac atc aag gct cgc tac gaa gct ttg aag gat      432
Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
    130                 135                 140
cac cca ctc ttc cag ggc atg acc tac gct gac gat gaa gct acc ttc      480
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145                 150                 155                 160
acc gag aag ctg cct ttg atg gca aag ggc cgt gac ttc tct gat cca      528
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
                165                 170                 175
gta gca atc tct tgg atc gat gaa ggc acc gac atc aac tac ggt gct      576
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
            180                 185                 190
cag acc aag cag tac ctg gat gca gct gaa gtt gaa ggc act gaa atc      624
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ala Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
        195                 200                 205
cgc tat ggc cac gaa gtc aag agc atc aag gct gat ggc gca aag tgg      672
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
    210                 215                 220
atc gtg acc gtc aag aac gta cac act ggc gac acc aag acc atc aag      720
Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys
225                 230                 235                 240
gca aac ttc gtg ttc gtc ggc gca ggc gga tac gca ctg gat ctg ctt      768
Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu
                245                 250                 255
cgc agc gca ggc atc cca cag gtc aag ggc ttc gct gga ttc cca gta      816
Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
            260                 265                 270
tcc ggc ctg tgg ctt cgt tgc acc aac gag gaa ctg atc gag cag cac      864
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
        275                 280                 285
gca gcc aag gta tat ggc aag gca tct gtt ggc gct cct cca atg tct      912
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
    290                 295                 300
gtt cct cac ctt gac acc cgc gtt atc gag ggt gaa aag ggt ctg ctc      960
Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
305                 310                 315                 320
ttt gga cct tac ggt ggc tgg acc cct aag ttc ttg aag gaa ggc tcc     1008
Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser
                325                 330                 335
tac ctg gac ctg ttc aag tcc atc cgc cca gac aac att cct tcc tac     1056
Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr
            340                 345                 350
ctt ggc gtt gct gct cag gaa ttt gat ctg acc aag tac ctt gtc act     1104
Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
        355                 360                 365
gaa gtt ctc aag gac cag gac aag cgt atg gat gct ctt cgc gag tac     1152
Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr
    370                 375                 380
atg cca gag gca caa aac ggc gat tgg gag acc atc gtt gcc gga cag     1200
Met Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln
385                 390                 395                 400
cgt gtt cag gtt att aag cct gca gga ttc cct aag ttc ggt tcc ctg     1248
Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu
                405                 410                 415
gaa ttc ggc acc acc ttg atc aac aac tcc gaa ggc acc atc gcc gga     1296
Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly
            420                 425                 430
ttg ctc ggt gct tcc cct gga gca tcc atc gca cct tcc gca atg atc     1344
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
        435                 440                 445
gag ctg ctt gag cgt tgc ttc ggt gac cgc atg atc gag tgg ggc gac     1392
Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
    450                 455                 460
aag ctg aag gac atg atc cct tcc tac ggc aag aag ctt gct tcc gag     1440
Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu
465                 470                 475                 480
cca gca ctg ttt gag cag cag tgg gca cgc acc cag aag acc ctg aag     1488
Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
                485                 490                 495
ctt gag gaa gcc taa                                                 1503
Leu Glu Glu Ala
            500
<210>6
<211>500
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>6
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1               5                   10                  15
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
        35                  40                  45
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
    50                  55                  60
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
65                  70                  75                  80
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
                85                  90                  95
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Phe Asp
            100                 105                 110
Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
    130                 135                 140
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145                 150                 155                 160
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
                165                 170                 175
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
            180                 185                 190
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ala Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
        195                 200                 205
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
    210                 215                 220
Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys
225                 230                 235                 240
Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu
                245                 250                 255
Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
            260                 265                 270
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
        275                 280                 285
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
    290                 295                 300
Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
305                 310                 315                 320
Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser
                325                 330                 335
Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr
            340                 345                 350
Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
        355                 360                 365
Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr
    370                 375                 380
Met Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln
385                 390                 395                 400
Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu
                405                 410                 415
Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly
            420                 425                 430
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
        435                 440                 445
Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
    450                 455                 460
Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu
465                 470                 475                 480
Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
                485                 490                 495
Leu Glu Glu Ala
            500
<210>7
<211>1503
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1).. (1500)
<223>mqo allele
<220>
<221>mutation
<222>(331).. (331)
<223>Transversion： replacement of thymine with guanine
<400>7
atg tca gat tcc ccg aag aac gca ccg agg att acc gat gag gca gat       48
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1               5                   10                  15
gta gtt ctc att ggt gcc ggt atc atg agc tcc acg ctg ggt gca atg       96
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
            20                  25                  30
ctg cgt cag ctg gag cca agc tgg act cag atc gtc ttc gag cgt ttg      144
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
        35                  40                  45
gat gga ccg gca caa gag tcg tcc tcc ccg tgg aac aat gca gga acc      192
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
    50                  55                  60
ggc cac tct gct cta tgc gag ctg aac tac acc cca gag gtt aag ggc      240
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
65                  70                  75                  80
aag gtt gaa att gcc aag gct gta gga atc aac gag aag ttc cag gtt      288
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
                85                  90                  95
tcc cgt cag ttc tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg gct gat      336
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ala Asp
            100                 105                 110
cct aag gaa ttc atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc cag ggc      384
Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
        115                 120                 125
gca gat cag gtt gca tac atc aag gct cgc tac gaa gct ttg aag gat      432
Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
    130                 135                 140
cac cca ctc ttc cag ggc atg acc tac gct gac gat gaa gct acc ttc      480
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145                 150                 155                 160
acc gag aag ctg cct ttg atg gca aag ggc cgt gac ttc tct gat cca      528
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
                165                 170                 175
gta gca atc tct tgg atc gat gaa ggc acc gac atc aac tac ggt gct      576
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
            180                 185                 190
cag acc aag cag tac ctg gat gca gct gaa gtt gaa ggc act gaa atc      624
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ala Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
        195                 200                 205
cgc tat ggc cac gaa gtc aag agc atc aag gct gat ggc gca aag tgg      672
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
    210                 215                 220
atc gtg acc gtc aag aac gta cac act ggc gac acc aag acc atc aag      720
Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys
225                 230                 235                 240
gca aac ttc gtg ttc gtc ggc gca ggc gga tac gca ctg gat ctg ctt      768
Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu
                245                 250                 255
cgc agc gca ggc atc cca cag gtc aag ggc ttc gct gga ttc cca gta      816
Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
            260                 265                 270
tcc ggc ctg tgg ctt cgt tgc acc aac gag gaa ctg atc gag cag cac      864
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
        275                 280                 285
gca gcc aag gta tat ggc aag gca tct gtt ggc gct cct cca atg tct      912
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
    290                 295                 300
gtt cct cac ctt gac acc cgc gtt atc gag ggt gaa aag ggt ctg ctc      960
Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
305                 310                 315                 320
ttt gga cct tac ggt ggc tgg acc cct aag ttc ttg aag gaa ggc tcc     1008
Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser
                325                 330                 335
tac ctg gac ctg ttc aag tcc atc cgc cca gac aac att cct tcc tac     1056
Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr
            340                 345                 350
ctt ggc gtt gct gct cag gaa ttt gat ctg acc aag tac ctt gtc act     1104
Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
        355                 360                 365
gaa gtt ctc aag gac cag gac aag cgt atg gat gct ctt cgc gag tac     1152
Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr
    370                 375                 380
atg cca gag gca caa aac ggc gat tgg gag acc atc gtt gcc gga cag     1200
Met Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln
385                 390                 395                 400
cgt gtt cag gtt att aag cct gca gga ttc cct aag ttc ggt tcc ctg     1248
Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu
                405                 410                 415
gaa ttc ggc acc acc ttg atc aac aac tcc gaa ggc acc atc gcc gga     1296
Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly
            420                 425                 430
ttg ctc ggt gct tcc cct gga gca tcc atc gca cct tcc gca atg atc     1344
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
        435                 440                 445
gag ctg ctt gag cgt tgc ttc ggt gac cgc atg atc gag tgg ggc gac     1392
Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
    450                 455                 460
aag ctg aag gac atg atc cct tcc tac ggc aag aag ctt gct tcc gag     1440
Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu
465                 470                 475                 480
cca gca ctg ttt gag cag cag tgg gca cgc acc cag aag acc ctg aag     1488
Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
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ctt gag gaa gcc taa                                                 1503
Leu Glu Glu Ala
            500
<210>8
<211>500
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>8
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1               5                   10                  15
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
        35                  40                  45
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
    50                  55                  60
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
65                  70                  75                  80
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala ValGly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
                85                 90                  95
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ala Asp
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Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
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Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
    130                 135                 140
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145                 150                 155                 160
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
                165                 170                 175
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
            180                 185                 190
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ala Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
        195                 200                 205
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
    210                 215                 220
Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys
225                 230                 235                 240
Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu
                245                 250                 255
Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
            260                 265                 270
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
        275                 280                 285
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
    290                 295                 300
Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
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Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
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            420                 425                 430
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
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Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
    450                 455                 460
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Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
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Leu Glu Glu Ala
            500
<210>9
<211>1503
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1).. (1500)
<223>mqo allele
<220>
<221>mutation
<222>(331).. (331)
<223>Transversion： replacement of thymine with guanine
<220>
<221>mutation
<222>601).. (601)
<223>Transversion：replacement of guanine with thymine
<400>9
atg tca gat tcc ccg aag aac gca ccg agg att acc gat gag gca gat       48
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1               5                   10                  15
gta gtt ctc att ggt gcc ggt atc atg agc tcc acg ctg ggt gca atg       96
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
            20                  25                  30
ctg cgt cag ctg gag cca agc tgg act cag atc gtc ttc gag cgt ttg      144
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
        35                  40                  45
gat gga ccg gca caa gag tcg tcc tcc ccg tgg aac aat gca gga acc      192
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
    50                  55                  60
ggc cac tct gct cta tgc gag ctg aac tac acc cca gag gtt aag ggc      240
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
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aag gtt gaa att gcc aag gct gta gga atc aac gag aag ttc cag gtt      288
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
                85                  90                  95
tcc cgt cag ttc tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg gct gat      336
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ala Asp
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cct aag gaa ttc atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc cag ggc      384
Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
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gca gat cag gtt gca tac atc aag gct cgc tac gaa gct ttg aag gat      432
Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
    130                 135                 140
cac cca ctc ttc cag ggc atg acc tac gct gac gat gaa gct acc ttc      480
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145                 150                 155                 160
acc gag aag ctg cct ttg atg gca aag ggc cgt gac ttc tct gat cca      528
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
                165                 170                 175
gta gca atc tct tgg atc gat gaa ggc acc gac atc aac tac ggt gct      576
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
            180                 185                 190
cag acc aag cag tac ctg gat gca tct gaa gtt gaa ggc act gaa atc      624
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ser Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
        195                 200                 205
cgc tat ggc cac gaa gtc aag agc atc aag gct gat ggc gca aag tgg      672
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
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Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
            260                 265                 270
tcc ggc ctg tgg ctt cgt tgc acc aac gag gaa ctg atc gag cag cac      864
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
        275                 280                 285
gca gcc aag gta tat ggc aag gca tct gtt ggc gct cct cca atg tct      912
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
    290                 295                 300
gtt cct cac ctt gac acc cgc gtt atc gag ggt gaa aag ggt ctg ctc      960
Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
305                 310                 315                 320
ttt gga cct tac ggt ggc tgg acc cct aag ttc ttg aag gaa ggc tcc     1008
Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser
                325                 330                 335
tac ctg gac ctg ttc aag tcc atc cgc cca gac aac att cct tcc tac     1056
Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr
            340                 345                 350
ctt ggc gtt gct gct cag gaa ttt gat ctg acc aag tac ctt gtc act     1104
Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
        355                 360                 365
gaa gtt ctc aag gac cag gac aag cgt atg gat gct ctt cgc gag tac     1152
Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr
    370                 375                 380
atg cca gag gca caa aac ggc gat tgg gag acc atc gtt gcc gga cag     1200
Met Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln
385                 390                 395                 400
cgt gtt cag gtt att aag cct gca gga ttc cct aag ttc ggt tcc ctg     1248
Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu
                405                 410                 415
gaa ttc ggc acc acc ttg atc aac aac tcc gaa ggc acc atc gcc gga     1296
Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly
            420                 425                 430
ttg ctc ggt gct tcc cct gga gca tcc atc gca cct tcc gca atg atc     1344
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
        435                 440                 445
gag ctg ctt gag cgt tgc ttc ggt gac cgc atg atc gag tgg ggc gac     1392
Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
    450                 455                 460
aag ctg aag gac atg atc cct tcc tac ggc aag aag ctt gct tcc gag     1440
Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu
465                 470                 475                 480
cca gca ctg ttt gag cag cag tgg gca cgc acc cag aag acc ctg aag     1488
Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
                485                 490                 495
ctt gag gaa gcc taa                                                    1503
Leu Glu Glu Ala
            500
<210>10
<211>500
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>10
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1               5                   10                  15
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
        35                  40                  45
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
    50                  55                  60
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
65                  70                  75              80
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
                85                  90              95
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ala Asp
            100                 105             110
 Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
         115                 120             125
Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
    130                 135                 140
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145                 150                 155                 160
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
                165                 170                 175
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
            180                 185                 190
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ser Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
        195                 200                 205
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
    210                 215                 220
Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys
225                 230                 235                 240
Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu
                245                 250                 255
Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
            260                 265                 270
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
        275                 280                 285
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
    290                 295                 300
Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
305                 310                 315                 320
Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser
                325                 330                 335
Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr
            340                 345                 350
Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
        355                 360                 365
Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr
    370                 375                 380
Met Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln
385                 390                 395                 400
Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu
                405                 410                 415
Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly
            420                 425                 430
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
        435                 440                 445
Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
    450                 455                 460
Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu
465                 470                 475                 480
Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
                485                 490                 495
Leu Glu Glu Ala
            500
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer mqo-start
<400>11
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<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer mqo-stop
<400>12
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<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer mqo-A1
<400>13
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<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>artificial  sequence
<220>
<223>primer mqo-E1
<400>14
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<210>15
<211>99
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(99)
<223>reading frame
<220>
<221>mutation
<222>(49)..(51)
<223>position 49 to 51 corresponds to position 331 to 333 in SEQ ID
NO：1，SEQ ID NO：5，SEQID NO：7 or SEQ ID NO：9
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(51)
<223>n is a，c，g，or t
<400>15
cag gtt tcc cgt cag ttc tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg    48
Gln Val Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu
1               5                   10                  15
nnn gat cct aag gaa ttc atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc    96
Xaa Asp Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly
            20                  25                  30
cag                                                               99
Gln
<210>16
<211>33
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>The’Xaa’at location 17 stands for Lys，Asn，Arg，Thr，Ile，
Met，Glu，Asp，Gly，Ala，Val，Gln，His，Pro，Leu，Tyr，Trp，Cys，
or Phe.
<400>16
Gln Val Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu
1               5                   10                  15
Xaa Asp Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly
            20                  25                  30
Gln
<210>17
<211>99
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
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<223>reading frame
<220>
<221>mutation
<222>(49)..(51)
<223>position 49 to 51 corresponds to position 331 to 333 in SEQ ID
NO：5
<400>17
cag gtt tcc cgt cag ttc tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg    48
Gln Val Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu
1               5                   10                  15
ttt gat cct aag gaa ttc atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc    96
Phe Asp Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly
            20                  25                  30
cag                                                         99
Gln
<210>18
<211>33
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>18
Gln Val Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu
1               5                   10                  15
Phe Asp Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly
            20                  25                  30
Gln
<210>19
<211>99
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(99)
<223>reading frame
<220>
<221>mutation
<222>(49)..(51)
<223>posi tion 49 to 51 corresponds to position 331 to 333 von SEQ ID
NO：7 or SEQ ID NO：9
<400>19
cag gtt tcc cgt cag ttc tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg    48
Gln Val Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu
1               5                   10                  15
gct gat cct aag gaa ttc atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc    96
Ala Asp Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly
            20                  25                  30
cag                                                                99
Gln
<210>20
<211>33
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>20
Gln Val Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu
1               5                   10                  15
Ala Asp Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly
            20                  25                  30
Gln
<210>21
<211>1263
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1).. (1263)
<223>lysC wild-type gene
<400>21
gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg       48
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1               5                   10                  15
gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct       96
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
            20                  25                  30
gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat      144
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
        35                  40                  45
gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt      192
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
    50                  55                  60
gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc      240
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65                  70                  75                  80
gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg      288
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
                85                  90                  95
ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc      336
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
            100                 105                 110
att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc      384
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
        115                 120                 125
aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc      432
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
    130                 135                 140
gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg      480
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                 155                 160
ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt      528
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
                165                 170                 175
gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag      576
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
            180                 185                 190
ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc      624
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
        195                 200                 205
tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat      672
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
    210                 215                 220
gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg      720
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc      768
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
                245                 250                 255
ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att      816
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
            260                 265                 270
tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat      864
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
        275                 280                 285
gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa      912
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
    290                 295                 300
gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc      960
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305                 310                 315                 320
cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc     1008
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
                325                 330                 335
aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct     1056
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
            340                 345                 350
ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg     1104
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
        355                 360                 365
cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt     1152
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
    370                 375                 380
att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca     1200
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                 390                 395                 400
ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat     1248
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
                405                 410                 415
gca ggc acc gga cgc                                                 1263
Ala Gly Thr Gly Arg
            420
<210>22
<211>421
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>22
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1               5                   10                  15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
            20                  25                  30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
        35                  40                  45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
    50                  55                  60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65                  70                  75                  80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
                85                  90                  95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
            100                 105                 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
        115                 120                 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
    130                 135                 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                 155                 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
                165                 170                 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
            180                 185                 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
        195                 200                 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
    210                 215                 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
                245                 250                 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
            260                 265                 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
       275                  280                 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
    290                 295                 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305                 310                 315                 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln ValGln Gly Asn Trp Thr
                325                 330                 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
            340                 345                 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
        355                 360                 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
    370                 375                 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                 390                 395                 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
                405                 410                 415
Ala Gly Thr Gly Arg
            420
<210>23
<211>1503
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1).. (1500)
<223>mqo allele
<220>
<221>mutation
<222>(1168).. (1170)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1168).. (1170)
<223>n is a，c，g，or t
<400>23
atg tca gat tcc ccg aag aac gca ccg agg att acc gat gag gca gat       48
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1               5                   10                  15
gta gtt ctc att ggt gcc ggt atc atg agc tcc acg ctg ggt gca atg       96
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
            20                  25                  30
ctg cgt cag ctg gag cca agc tgg act cag atc gtc ttc gag cgt ttg      144
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
        35                  40                  45
gat gga ccg gca caa gag tcg tcc tcc ccg tgg aac aat gca gga acc      192
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
    50                  55                  60
ggc cac tct gct cta tgc gag ctg aac tac acc cca gag gtt aag ggc     240
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
65                  70                  75                  80
aag gtt gaa att gcc aag gct gta gga atc aac gag aag ttc cag gtt      288
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
                85                  90                  95
tcc cgt cag ttc tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg tct gat      336
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ser Asp
            100                 105                 110
cct aag gaa ttc atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc cag ggc      384
Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
        115                 120                 125
gca gat cag gtt gca tac atc aag gct cgc tac gaa gct ttg aag gat     432
Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
    130                 135                 140
cac cca ctc ttc cag ggc atg acc tac gct gac gat gaa gct acc ttc      480
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145                 150                 155                 160
acc gag aag ctg cct ttg atg gca aag ggc cgt gac ttc tct gat cca      528
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
                165                 170                 175
gta gca atc tct tgg atc gat gaa ggc acc gac atc aac tac ggt gct      576
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
            180                 185                 190
cag acc aag cag tac ctg gat gca gct gaa gtt gaa ggc act gaa atc      624
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ala Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
        195                 200                 205
cgc tat ggc cac gaa gtc aag agc atc aag gct gat ggc gca aag tgg      672
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
    210                 215                 220
atc gtg acc gtc aag aac gta cac act ggc gac acc aag acc atc aag      720
Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys
225                 230                 235                 240
gca aac ttc gtg ttc gtc ggc gca ggc gga tac gca ctg gat ctg ctt      768
Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu
                245                 250                 255
cgc agc gca ggc atc cca cag gtc aag ggc ttc gct gga ttc cca gta      816
Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
            260                 265                 270
tcc ggc ctg tgg ctt cgt tgc acc aac gag gaa ctg atc gag cag cac      864
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
        275                 280                 285
gca gcc aag gta tat ggc aag gca tct gtt ggc gct cct cca atg tct      912
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
    290                 295                 300
gtt cct cac ctt gac acc cgc gtt atc gag ggt gaa aag ggt ctg ctc      960
Val Pro His Leu Asp Thr Arg ValIle Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
305                 310                315                 320
ttt gga cct tac ggt ggc tgg acc cct aag ttc ttg aag gaa ggc tcc     1008
Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser
                325                 330                 335
tac ctg gac ctg ttc aag tcc atc cgc cca gac aac att cct tcc tac     1056
Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr
            340                 345                 350
ctt ggc gtt gct gct cag gaa ttt gat ctg acc aag tac ctt gtc act     1104
Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
        355                 360                 365
gaa gtt ctc aag gac cag gac aag cgt atg gat gct ctt cgc gag tac     1152
Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr
    370                 375                 380
atg cca gag gca caa nnn ggc gat tgg gag acc atc gtt gcc gga cag     1200
Met Pro Glu Ala Gln Xaa Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln
385                 390                 395                 400
cgt gtt cag gtt att aag cct gca gga ttc cct aag ttc ggt tcc ctg     1248
Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu
                405                 410                 415
gaa ttc ggc acc acc ttg atc aac aac tcc gaa ggc acc atc gcc gga     1296
Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly
                420             425                 430
ttg ctc ggt gct tcc cct gga gca tcc atc gca cct tcc gca atg atc     1344
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
        435                 440                 445
gag ctg ctt gag cgt tgc ttc ggt gac cgc atg atc gag tgg ggc gac     1392
Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
    450                 455                 460
aag ctg aag gac atg atc cct tcc tac ggc aag aag ctt gct tcc gag     1440
Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu
465                 470                 475                 480
cca gca ctg ttt gag cag cag tgg gca cgc acc cag aag acc ctg aag     1488
Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
                    485             490                 495
ctt gag gaa gcc taa                                                 1503
Leu Glu Glu Ala
            500
<210>24
<211>500
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(390).. (390)
<223>The’Xaa’at location 390 stands for Lys， Arg，Ser，Thr，
     Ile，Met，Glu，Asp，Gly，Ala，Val，Gln，His，Pro，Leu，Tyr，Trp，
     Cys，or Phe.
<400>24
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1               5                   10                  15
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
        35                  40                  45
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
    50                  55                  60
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
65                  70                  75                  80
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
    85                              90                  95
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ser Asp
            100                 105                 110
Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
    130                 135                 140
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145                 150                 155                 160
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
                165                 170                 175
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
            180                 185                 190
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ala Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
        195                 200                 205
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
    210                 215                 220
Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys
225                 230                 235                 240
Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu
                245                 250                 255
Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
            260                 265                 270
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
        275                 280                 285
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
    290                 295                 300
Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
305                 310                 315                 320
Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser
                325                 330                 335
Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr
            340                 345                 350
Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
        355                 360                 365
Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr
    370                 375                 380
Met Pro Glu Ala Gln Xaa Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln
385                 390                 395                 400
Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu
                405                 410                 415
Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly
            420                 425                 430
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
        435                 440                 445
Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
    450                 455                 460
Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu
465                 470                 475                 480
Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
                485                 490                 495
Leu Glu Glu Ala
            500
<210>25
<211>1503
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1).. (1500)
<223>mqo allele
<220>
<221>mutation
<222>(1168).. (1170)
<400>25
atg tca gat tcc ccg aag aac gca ccg agg att acc gat gag gca gat       48
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1               5                   10                  15
gta gtt ctc att ggt gcc ggt atc atg agc tcc acg ctg ggt gca atg       96
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
            20                  25                  30
ctg cgt cag ctg gag cca agc tgg act cag atc gtc ttc gag cgt ttg      144
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
        35                  40                  45
gat gga ccg gca caa gag tcg tcc tcc ccg tgg aac aat gca gga acc      192
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
    50                  55                  60
ggc cac tct gct cta tgc gag ctg aac tac acc cca gag gtt aag ggc      240
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
65                  70                  75                  80
aag gtt gaa att gcc aag gct gta gga atc aac gag aag ttc cag gtt      288
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
                85                  90                  95
tcc cgt cag ttc tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg tct gat      336
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ser Asp
            100                 105                 110
cct aag gaa ttc atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc cag ggc      384
Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
        115                 120                 125
gca gat cag gtt gca tac atc aag gct cgc tac gaa gct ttg aag gat      432
Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
    130                 135                 140
cac ccc ctc ttc cag ggc atg acc tac gct gac gat gaa gct acc ttc      480
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145                 150                 155                 160
acc gag aag ctg cct ttg atg gca aag ggc cgt gac ttc tct gat cca      528
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
                165                 170                 175
gta gca atc tct tgg atc gat gaa ggc acc gac atc aac tac ggt gct      576
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
            180                 185                 190
cag acc aag cag tac ctg gat gca gct gaa gtt gaa ggc act gaa atc      624
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ala Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
        195                 200                 205
cgc tat ggc cac gaa gtc aag agc atc aag gct gat ggc gca aag tgg      672
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
    210                 215                 220
atc gtg acc gtc aag aac gta cac act ggc gac acc aag acc atc aag      720
Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys
225                 230                 235                 240
gca aac ttc gtg ttc gtc ggc gca ggc gga tac gca ctg gat ctg ctt      768
Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu
                245                 250                 255
cgc agc gca ggc atc cca cag gtc aag ggc ttc gct gga ttc cca gta      816
Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
            260                 265                 270
tcc ggc ctg tgg ctt cgt tgc acc aac gag gaa ctg atc gag cag cac      864
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
        275                 280                 285
gca gcc aag gta tat ggc aag gca tct gtt ggc gct cct cca atg tct      912
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
          290                 295                  300
gtt cct cac ctt gac acc cgc gtt atc gag ggt gaa aag ggt ctg ctc      960
Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
305                 310                 315                 320
ttt gga cct tac ggt ggc tgg acc cct aag ttc ttg aag gaa ggc tcc     1008
Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser
                325                 330                 335
tac ctg gac ctg ttc aag tcc atc cgc cca gac aac att cct tcc tac     1056
Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr
            340                 345                 350
ctt ggc gtt gct gct cag gaa ttt gat ctg acc aag tac ctt gtc act     1104
Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
        355                 360                 365
gaa gtt ctc aag gac cag gac aag cgt atg gat gct ctt cgc gag tac     1152
Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr
    370                 375                 380
atg cca gag gca caa tac ggc gat tgg gag acc atc gtt gcc gga cag     1200
Met Pro Glu Ala Gln Tyr Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln
385                 390                 395                 400
cgt gtt cag gtt att aag cct gca gga ttc cct aag ttc ggt tcc ctg     1248
Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu
                405                 410                 415
gaa ttc ggc acc acc ttg atc aac aac tcc gaa ggc acc atc gcc gga     1296
Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly
            420                 425                 430
ttg ctc ggt gct tcc cct gga gca tcc atc gca cct tcc gca atg atc     1344
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
        435                 440                 445
gag ctg ctt gag cgt tgc ttc ggt gac cgc atg atc gag tgg ggc gac     1392
Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
    450                 455                 460
aag ctg aag gac atg atc cct tcc tac ggc aag aag ctt gct tcc gag     1440
Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu
465                 470                 475                 480
cca gca ctg ttt gag cag cag tgg gca cgc acc cag aag acc ctg aag     1488
Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
                485                 490                 495
ctt gag gaa gcc taa                                                 1503
Leu Glu Glu Ala
            500
<210>26
<211>500
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>26
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1               5                   10                  15
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
        35                  40                  45
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
    50                  55                  60
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
65                  70                  75                  80
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
                85                  90                  95
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ser Asp
            100                 105                 110
Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
    130                 135                 140
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145                 150                 155                 160
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
                165                 170                 175
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
            180                 185                 190
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ala Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
        195                 200                 205
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
210                     215                 220
Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys
225                 230                 235                 240
Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu
                245                 250                 255
Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
            260                 265                 270
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
        275                 280                 285
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
    290                 295                 300
Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
305                 310                 315                 320
Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser
                325                 330                 335
Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr
            340                 345                 350
Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
        355                 360                 365
Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr
    370                 375                 380
Met Pro Glu Ala Gln Tyr Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln
385                 390                 395                 400
Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu
                405                 410                 415
Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly
            420                 425                 430
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
        435                 440                 445
Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
    450                 455                 460
Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu
465                 470                 475                 480
Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
                485                 490                 495
Leu Glu Glu Ala
<210>27
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer mqo-int1-bam
<400>27
ctagggatcc ccgaagaacg caccgaggat
<210>27
ctagggatcc ccgaagaacg caccgaggat
<210>28
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Primer mqo-int2-bam
<400>28
ctagggatcc ggcggatgga cttgaacagg
 0-10-1-1 PCT/RO/134表(SAFE)被保藏的微生物和/或其他被保藏的生物材料的说明
 0-2 国际申请号 PCT/EP2005/057216
 0-3 申请人或代理人代码 2004P10017WO
 11-11-2 关于被保藏的微生物和/或其他被保藏的生物材料的以下说明记载于说明书页行 487-13
 1-31-3-11-3-21-3-31-3-4 关于保藏的说明保藏单位名称保藏单位地址保藏日保藏号 DSMZ德国微生物和细胞培养物保藏中心德国不伦瑞克2004年10月28号DSMZ 16833
 1-5 特别说明的指定国 所有指定国
 22-12-2 关于被保藏的微生物和/或其他被保藏的生物材料的以下说明记载于说明书页行 487-13
 2-32-3-12-3-22-3-32-3-4 关于保藏的说明保藏单位名称保藏单位地址保藏日保藏号 DSMZ德国微生物和细胞培养物保藏中心德国不伦瑞克2004年11月24号DSMZ 16937
 2-5 特别说明的指定国 所有指定国
由申请局填写
0-4 本表格随国际申请到达(是或否)
0-4-1 全权公务员
由国际局填写
  0-5   本表格于以下日期到达国际局
  0-5-1   全权公务员

Claims (65)

1.一种分离的棒状细菌突变体，其包含编码具有苹果酸醌氧化还原酶活性的多肽的基因，其特征在于所述多肽包含这样的氨基酸序列，其中在第111位或相应位置存在除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸。
2.权利要求1的棒状细菌突变体，其特征在于所述棒状细菌是选自Corynebacterium efficiens、谷氨酸棒杆菌、热产氨棒状杆菌和产氨棒状杆菌组成的组的细菌。
3.权利要求2的棒状细菌突变体，其特征在于所述细菌是谷氨酸棒杆菌。
4.权利要求1、2或3的棒状细菌突变体，其特征在于所述细菌是分泌L-氨基酸的细菌。
5.权利要求4的棒状细菌突变体，其特征在于所述细菌是分泌L-赖氨酸的细菌，分泌L-色氨酸的细菌或者分泌L-脯氨酸的细菌。
6.权利要求1-5之一的棒状细菌突变体，其特征在于所编码的多肽在第111位或相应位置含有L-苯丙氨酸或L-丙氨酸。
7.权利要求1-5之一的棒状细菌突变体，其特征在于所编码的多肽包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，其中在第111位存在除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸。
8.权利要求7的棒状细菌突变体，其特征在于在第201位的L-丙氨酸由另一蛋白质氨基酸置换。
9.权利要求1-5之一的棒状细菌突变体，其特征在于所述基因包含这样的核苷酸序列，其相同于可通过使用得自棒状细菌的DNA及使用引物对通过聚合酶链反应(PCR)获得的多核苷酸的核苷酸序列，所述引物对由第一个引物和第二个引物组成，其中第一个引物包含选自SEQ ID NO：3第1-349位的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，第二个引物包含选自SEQ ID NO：3第2002-1850位的互补核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
10.权利要求1-5之一的棒状细菌突变体，其特征在于所编码的多肽包含长度相应于500个L-氨基酸的氨基酸序列。
11.权利要求1-5之一的棒状细菌突变体，其特征在于所编码的多肽在其氨基酸序列的第106-1164位含有相应于SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10中第106-1164位的氨基酸序列。
12.权利要求1-5之一的棒状细菌突变体，其特征在于所编码的多肽包含与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
13.权利要求1-5之一的棒状细菌突变体，其特征在于所述基因包含与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。
14.权利要求6的棒状细菌突变体，其特征在于所编码的蛋白质包含选自如下序列组成的组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列，
b)包含一或多个保守氨基酸取代的SEQ ID NO：6、SEQID NO：8或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列，
c)包含一或多个氨基酸插入或缺失的SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列。
15.权利要求7或8的棒状细菌突变体，其特征在于SEQ IDNO：2所示氨基酸序列在第111位含有L-苯丙氨酸或L-丙氨酸。
16.权利要求15的棒状细菌突变体，其特征在于所述基因包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示核苷酸序列。
17.一种分离的多核苷酸，其编码这样的多肽，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性并在氨基酸序列第111位含有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸。
18.权利要求17的分离的多核苷酸，其特征在于所述蛋白质氨基酸是L-苯丙氨酸或L-丙氨酸。
19.权利要求17的分离的多核苷酸，其特征在于所编码的多肽包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，在该氨基酸序列第111位存在除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸。
20.权利要求19的分离的多核苷酸，其特征在于所编码的多肽在第201位含有除L-丙氨酸之外的任何蛋白质氨基酸。
21.权利要求17的分离的多核苷酸，其特征在于所编码的多肽包含长度为500个氨基酸的氨基酸序列。
22.权利要求18的分离的多核苷酸，其特征在于所编码的多肽在其氨基酸序列中的第324-334位含有相应于SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10中第324-334位的氨基酸序列。
23.权利要求18的分离的多核苷酸，其特征在于其相同于可通过使用得自棒状细菌的DNA并使用引物对通过聚合酶链反应(PCR)获得的多核苷酸的核苷酸序列，所述引物对由第一个和第二个引物组成，其中第一个引物包含选自SEQ ID NO：3中第1-349位的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，第二个引物包含选自SEQ ID NO：3中第2002-1850位的互补核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
24.权利要求18的分离的多核苷酸，其特征在于其在严格条件下与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的互补核苷酸序列杂交。
25.权利要求18的分离的多核苷酸，其特征在于所编码的多肽包含与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
26.权利要求18的分离的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。
27.权利要求19或20的分离的多核苷酸，其特征在于所编码的蛋白质包含选自以下序列组成的组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列，
b)包含一或多个保守氨基酸取代的SEQ ID NO：6、SEQID NO：8或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列，
c)包含一或多个氨基酸插入或缺失的SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列。
28.权利要求27的分离的多核苷酸，其特征在于所编码的多肽包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示氨基酸序列。
29.权利要求28的分离的多核苷酸，其特征在于所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9。
30.一种分离的多核苷酸，其包含这样的核酸分子，其至少编码具有相应于SEQ ID NO：2第95-127位的氨基酸序列的读框，所述氨基酸序列中在相应于SEQ ID NO：2第111位的位置具有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸。
31.权利要求30的分离的多核苷酸，其特征在于其至少编码下述的读框，所述读框具有相应于SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：10的第95-127位的氨基酸序列。
32.权利要求30的分离的多核苷酸，其特征在于所述氨基酸序列含有一或多个保守氨基酸取代，所述保守氨基酸取代不影响第111位。
33.权利要求30的分离的多核苷酸，其特征在于其含有一或多个沉默突变。
34.权利要求31的分离的多核苷酸，其特征在于其至少包含相应于SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9中第283-381位的核苷酸序列。
35.一种制备重组棒状细菌的方法，其特征在于：
a)将权利要求17-29或者权利要求30-34的分离的多核苷酸转移进棒状细菌中，
b)用得自a)的多核苷酸置换下述苹果酸醌氧化还原酶基因，所述基因存在于所述棒状细菌的染色体中并编码在氨基酸序列第111位或相应位置具有L-丝氨酸及在第201位或相应位置具有L-丙氨酸的氨基酸序列，其中所述得自a)的多核苷酸编码在第111位且在适当时在第201位具有不同L-氨基酸的氨基酸序列，
c)使根据a)和b)步骤获得的棒状细菌增殖。
36.权利要求35的方法，其特征在于使用权利要求17-29之一所述分离的多核苷酸。
37.权利要求35的方法，其特征在于使用权利要求30-34之一所述的分离的多核苷酸。
38.权利要求35的方法，其特征在于所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸或L-丙氨酸。
39.一种制备重组微生物的方法，其特征在于：
a)将权利要求17-20之一所述的分离的多核苷酸转移到微生物中，
b)使所述分离的多核苷酸在所述微生物中复制，
c)使根据步骤a)和b)获得的微生物增殖。
40.一种重组微生物，其包含权利要求17-29或者30-34之一的分离的多核苷酸。
41.权利要求40的重组微生物，其特征在于所述微生物是棒状细菌或者埃希氏菌属的细菌。
42.权利要求41的重组微生物，其特征在于所述棒状细菌是棒杆菌属的细菌。
43.权利要求42的重组微生物，其特征在于所述棒杆菌属细菌是谷氨酸棒杆菌。
44.载体，其含有权利要求17-29或者30-34之一的分离的多核苷酸。
45.包含权利要求44的载体的重组微生物。
46.权利要求45的重组微生物，其特征在于所述微生物是棒状细菌或者埃希氏菌属的细菌。
47.权利要求46的重组微生物，其特征在于所述棒状细菌是棒杆菌属的细菌。
48.权利要求47的重组微生物，其特征在于所述棒杆菌属的细菌是谷氨酸棒杆菌。
49.一种在微生物中过表达苹果酸醌氧化还原酶的方法，其特征在于：
a)使微生物中权利要求17-29之一的多核苷酸的拷贝数增加至少1个拷贝，或者将启动子与编码下述多肽的多核苷酸功能性连接，所述多肽具有苹果酸醌氧化还原酶活性并且其氨基酸序列第111位或相应位置存在除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸，
b)使所得微生物增殖。
50.一种制备L-氨基酸的方法，其特征在于：
a)将分离的棒状细菌在合适培养基中发酵，所述细菌包含编码具有苹果酸醌氧化还原酶活性的多肽的基因，其中所述多肽氨基酸序列中第111位或相应位置的L-丝氨酸及适当时第201位或相应位置的L-丙氨酸由另一种蛋白质氨基酸置换，
b)L-氨基酸在发酵肉汤或细菌细胞中富集。
51.权利要求50的方法，其特征在于分离的棒状细菌是权利要求1-16之一的突变体。
52.权利要求50的方法，其特征在于所述分离的棒状细菌是下述的重组棒状细菌，其包含权利要求17-34之一的分离的多核苷酸或者使用这种多核苷酸制备得来。
53.权利要求50的方法，其特征在于所述氨基酸是分离的或收集的。
54.权利要求53的方法，其特征在于所述L-氨基酸是纯化的。
55.权利要求50的方法，其特征在于所述L-氨基酸是与发酵肉汤的组分和/或生物量(＞0至100％)一起分离或收集的。
56.权利要求50的方法，其特征在于：
a)从权利要求50的b)步骤中获得的发酵肉汤中除去已经形成的生物量的0-100％，
b)通过选自如下方法组成的组的方法从步骤a)中获得的肉汤中制备基本干燥的和成形的产物：造粒、压制、喷雾干燥和挤出。
57.权利要求56的方法，其特征在于在步骤a)之前或之后向发酵肉汤中加入选自硫酸、盐酸或磷酸的酸。
58.权利要求56的方法，其特征在于在步骤a)之前或之后从获得的肉汤中除去水分。
59.权利要求56的方法，其特征在于用油对在步骤b)中或其间获得的成形产物进行喷雾。
60.一种棒状细菌突变体，其特征在于其可以通过如下步骤获得：
a)用诱变剂处理具有分泌氨基酸的能力的棒状细菌，
b)分离在步骤a)中产生的突变体并使其增殖，
c)从步骤b)获得的突变体中制备核酸，
d)通过聚合酶链反应使用得自步骤c)的核酸及引物对制备核酸分子，所述引物对由第一个引物和第二个引物组成，其中第一个引物包含选自SEQ ID NO：3中第1-349位的核苷酸序列的至少1 5个连续核苷酸，第二个引物包含选自SEQ ID NO：3中第2002-1850位的互补核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，
e)测定在步骤d)中获得的核酸分子的核苷酸序列及测定编码的氨基酸序列，
f)在适当情况下，将步骤e)中测定的氨基酸序列与SEQ ID NO：6、8或10或者SEQ ID NO：15、17或19进行对比，
g)鉴别含有编码下述多肽的多核苷酸的突变体，所述多肽在第111位或相应位置具有除L-丝氨酸之外的任何蛋白质氨基酸，并且在适当时在第201位或相应位置具有除L-丙氨酸之外的任何蛋白质氨基酸。
61.权利要求60的突变体，其特征在于在步骤b)之后，选择与步骤a)中应用的棒状细菌相比，能在培养基中分泌或者在细胞内部浓缩至少多0.5％的氨基酸的突变体。
62.权利要求60的步骤g)中的突变体，其特征在于在第111位的蛋白质氨基酸是L-苯丙氨酸或L-丙氨酸。
63.权利要求60的步骤g)中的突变体，其特征在于在第201位的蛋白质氨基酸是L-丝氨酸。
64.一种含有L-赖氨酸的基于发酵肉汤的饲料添加剂，其具有如下特点：
a)赖氨酸含量(作为碱)为至少10％-至多73％重量，
b)水含量为至多5％重量，
c)生物量含量相应于发酵肉汤中包含的生物量的至少0.1％，其中所述生物量在适当情况中是失活的，其是从权利要求1-16或者40-43或者45-48或者60-63中的一或多项的细菌形成的。
65.一种含有L-色氨酸的基于发酵肉汤的饲料添加剂，其具有如下特点：
a)色氨酸含量为至少5％-至多95％重量，
b)水含量为至多5％重量，
c)生物量含量相应于发酵肉汤中包含的生物量的至少0.1％，所述生物量在适当情况中是失活的，其是从权利要求1-16或者40-43或者45-48或者60-63的一或多项的细菌形成的。
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WO2022143646A1 (zh) * 2020-12-30 2022-07-07 内蒙古伊品生物科技有限公司 一种改造基因bbd29_09525产l-谷氨酸的重组菌株及其构建方法与应用

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