JP2002051789A - ｒｐｌＫ遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列 - Google Patents
ｒｐｌＫ遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アミノ酸、特にＬ−リシンの改善された新規
の酵素的製造方法。 【解決手段】 ｒｐｌＫ遺伝子をコードする新規ヌクオ
チド配列を同定し、これが転写減衰された細菌を発酵さ
せることによって、アミノ酸、特にＬ−リシンを製造す
る。
の酵素的製造方法。 【解決手段】 ｒｐｌＫ遺伝子をコードする新規ヌクオ
チド配列を同定し、これが転写減衰された細菌を発酵さ
せることによって、アミノ酸、特にＬ−リシンを製造す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の目的は、ｒｐｌＫ遺
伝子をコードするコリネフォルム（coyneform）細菌か
らのヌクレオチド配列およびアミノ酸、特にＬ−リシン
の酵素的製造方法に関し、またｒｐｌＫ遺伝子のアテニ
ュエーションに関する。
伝子をコードするコリネフォルム（coyneform）細菌か
らのヌクレオチド配列およびアミノ酸、特にＬ−リシン
の酵素的製造方法に関し、またｒｐｌＫ遺伝子のアテニ
ュエーションに関する。
【０００２】本明細書中に記載されたすべての引用文献
は、参考のために用いられる。さらに、以下の開示を通
して、「参考のために記載した」の用語は“Ｉ．Ｂ．
Ｒ．”と表記する。
は、参考のために用いられる。さらに、以下の開示を通
して、「参考のために記載した」の用語は“Ｉ．Ｂ．
Ｒ．”と表記する。
【０００３】
【従来の技術】Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシンは動物飼
料学、ヒト医学および製薬工業において使用される。こ
れらアミノ酸がコリネフォルム細菌、特にコリネバクテ
リウムグルタミクムの菌株の発酵によって製造されるこ
とは公知である。これが極めて重要であるために、製造
方法の改善に関する研究は日々続けられている。突然変
異、選択および突然変異選択の方法は、前記微生物の性
能特性を改善させるために使用される。この方法によっ
て、抗生物質、例えばリシン類似性Ｓ−（２−アミノエ
チル）システインに耐性であるか、あるいは調節のため
に重要な代謝物に関して栄養要求性である菌株が得ら
れ、かつＬ−アミノ酸が製造される。
料学、ヒト医学および製薬工業において使用される。こ
れらアミノ酸がコリネフォルム細菌、特にコリネバクテ
リウムグルタミクムの菌株の発酵によって製造されるこ
とは公知である。これが極めて重要であるために、製造
方法の改善に関する研究は日々続けられている。突然変
異、選択および突然変異選択の方法は、前記微生物の性
能特性を改善させるために使用される。この方法によっ
て、抗生物質、例えばリシン類似性Ｓ−（２−アミノエ
チル）システインに耐性であるか、あるいは調節のため
に重要な代謝物に関して栄養要求性である菌株が得ら
れ、かつＬ−アミノ酸が製造される。
【０００４】数年来、組み換えＤＮＡ技術の方法は、個
々のアミノ酸生合成遺伝子を増幅させ、かつＬ−アミノ
酸の効果を試験することによって、Ｌ−アミノ酸を製造
するコリネバクテリウム菌株の菌株改善のために使用さ
れている。この課題における参考文献は、他の文献中、
キノシタ（Kinoshita）(“Gultamic Acid Bacteria”,
in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain a
nd Solomon (Eds.), Benjamin Cumming, London, UK, 1
985, 115-142)、I.B.R.）ヒュリガー（Hilliger）（Bio
Tec2, 40-44 (1991) I.B.R.）、エッゲリング（Eggelin
g）（Amino Acids 6: 261-272 (1994) I.B.R.）、ジェ
ッテンおよびシンスキー（Jetten and Sinskey）（Crit
ical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995) I.
B.R.）およびシャームら（Sham et al.）（Annuals of
the New York Academy of Sience782, 25-39 (1996) I.
B.R.）で見出されてもよい。
々のアミノ酸生合成遺伝子を増幅させ、かつＬ−アミノ
酸の効果を試験することによって、Ｌ−アミノ酸を製造
するコリネバクテリウム菌株の菌株改善のために使用さ
れている。この課題における参考文献は、他の文献中、
キノシタ（Kinoshita）(“Gultamic Acid Bacteria”,
in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain a
nd Solomon (Eds.), Benjamin Cumming, London, UK, 1
985, 115-142)、I.B.R.）ヒュリガー（Hilliger）（Bio
Tec2, 40-44 (1991) I.B.R.）、エッゲリング（Eggelin
g）（Amino Acids 6: 261-272 (1994) I.B.R.）、ジェ
ッテンおよびシンスキー（Jetten and Sinskey）（Crit
ical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995) I.
B.R.）およびシャームら（Sham et al.）（Annuals of
the New York Academy of Sience782, 25-39 (1996) I.
B.R.）で見出されてもよい。
【０００５】ｒｐｌＫタンパク質（リボソームの大サブ
ユニットのタンパク質Ｋ）はエシェリキア コリ（Esch
erichia coli）に関してタンパク質合成を生じる、細胞
の翻訳装置が最初に示された、細菌性リボソームの成分
である。
ユニットのタンパク質Ｋ）はエシェリキア コリ（Esch
erichia coli）に関してタンパク質合成を生じる、細胞
の翻訳装置が最初に示された、細菌性リボソームの成分
である。
【０００６】リボソームは、３個のリボ核酸（RNA）分
子および特異的な数のタンパク質から成る細胞性粒子で
ある。リボソームは、その多くが細胞濃縮物の超遠心に
よって得られる。残存する細胞成分のさらなる精製は、
通常は、ショ糖密度こう配中での沈降によっておこなわ
れる。この製造技術はリボソームの成分に関して通常の
等級（designation）を導き、この場合、これは直接的
に沈降性質に関連する。したがって、一つの機能的な細
菌性リボソームはしばしば７０Ｓリボソームを示し、こ
の場合、これは小さい３０Ｓサブユニット（小サブユニ
ット）および大きい５０Ｓサブユニット（大サブユニッ
ト）から成る。Ｅ．Ｃｏｌｉの３０Ｓ小サブユニット
は、２１個の異なるポリペプチドおよび１５４２ヌクレ
オチドの長さを有するＲＮＡ分子から成り、この場合、
このＲＮＡ分子は１６Ｓ−ｒＲＮＡとして当業者に公知
であり、さらにｒｐｌＫタンパク質、大きい５０Ｓサブ
ユニットは付加的な３１個の異なるポリペプチド、なら
びにそれぞれ１２０および２９０４ヌクレオチドの長さ
を有する２個のＲＮＡ分子を含み、この場合、このＲＮ
Ａ分子は５Ｓまたは２３Ｓ ｒＲＮＡ分子と呼称され
る。その一方で、二者択一的な用語はリボソームタンパ
ク質として確立されている。したがって、３０Ｓ小サブ
ユニットのポリペプチドは、当業者によってＳ１からＳ
２１と示されており、その一方で５０S大サブユニット
のものはＬ１からＬ３２と示されている。本明細書中
で、ｒｐｌＫタンパク質はリボソームＬ１１タンパク質
に相当する（Noller and Nomura, In: Neidhart et a
l., Escherichia coli and Salmonellatyphimurium: Ce
llular and molecular biology. American Society for
Microbiology, Washington D.C., 167-186, 1996）I.
B.R.。数年来、Ｌ１１様のタンパク質は他の生物、例え
ばボレリア ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）
（Fraser et al., Nature, 390, 580-586, 1997）I.B.
R.、ヘリコバクター ピロリ（Helicobacter pylori）
（Tomb et al., Nature, 388, 539-547, 1997）I.B.
R.、セレイシア マルセッセンス（Serratia marcescen
s）（Sor and Nomura, Molecular and General Genetic
s, 210, 52-59, 1987）I.B.R.、ヘモフィリスインフル
エンゼ（Haemophilys inflenzae）（Fleischmann et a
l., Science, 269, 496-512, 1995）およびグラム陽性
細菌バチルス スブチリス（Bacillus subtilis）（Jeo
ng et al., Molecular Microbiology, 10, 133-142, 19
93）I.B.R.で同定されている。
子および特異的な数のタンパク質から成る細胞性粒子で
ある。リボソームは、その多くが細胞濃縮物の超遠心に
よって得られる。残存する細胞成分のさらなる精製は、
通常は、ショ糖密度こう配中での沈降によっておこなわ
れる。この製造技術はリボソームの成分に関して通常の
等級（designation）を導き、この場合、これは直接的
に沈降性質に関連する。したがって、一つの機能的な細
菌性リボソームはしばしば７０Ｓリボソームを示し、こ
の場合、これは小さい３０Ｓサブユニット（小サブユニ
ット）および大きい５０Ｓサブユニット（大サブユニッ
ト）から成る。Ｅ．Ｃｏｌｉの３０Ｓ小サブユニット
は、２１個の異なるポリペプチドおよび１５４２ヌクレ
オチドの長さを有するＲＮＡ分子から成り、この場合、
このＲＮＡ分子は１６Ｓ−ｒＲＮＡとして当業者に公知
であり、さらにｒｐｌＫタンパク質、大きい５０Ｓサブ
ユニットは付加的な３１個の異なるポリペプチド、なら
びにそれぞれ１２０および２９０４ヌクレオチドの長さ
を有する２個のＲＮＡ分子を含み、この場合、このＲＮ
Ａ分子は５Ｓまたは２３Ｓ ｒＲＮＡ分子と呼称され
る。その一方で、二者択一的な用語はリボソームタンパ
ク質として確立されている。したがって、３０Ｓ小サブ
ユニットのポリペプチドは、当業者によってＳ１からＳ
２１と示されており、その一方で５０S大サブユニット
のものはＬ１からＬ３２と示されている。本明細書中
で、ｒｐｌＫタンパク質はリボソームＬ１１タンパク質
に相当する（Noller and Nomura, In: Neidhart et a
l., Escherichia coli and Salmonellatyphimurium: Ce
llular and molecular biology. American Society for
Microbiology, Washington D.C., 167-186, 1996）I.
B.R.。数年来、Ｌ１１様のタンパク質は他の生物、例え
ばボレリア ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）
（Fraser et al., Nature, 390, 580-586, 1997）I.B.
R.、ヘリコバクター ピロリ（Helicobacter pylori）
（Tomb et al., Nature, 388, 539-547, 1997）I.B.
R.、セレイシア マルセッセンス（Serratia marcescen
s）（Sor and Nomura, Molecular and General Genetic
s, 210, 52-59, 1987）I.B.R.、ヘモフィリスインフル
エンゼ（Haemophilys inflenzae）（Fleischmann et a
l., Science, 269, 496-512, 1995）およびグラム陽性
細菌バチルス スブチリス（Bacillus subtilis）（Jeo
ng et al., Molecular Microbiology, 10, 133-142, 19
93）I.B.R.で同定されている。
【０００７】リボソームで生じる翻訳工程、例えばメッ
センジャーＲＮＡ制御されたポリペプチドの生合成が合
成される。リボソームに加えて、当業者によってタンパ
ク質合成因子と呼称される他のタンパク質（Noller, An
nual Review of Biochemistry, 60, 191-227, 1991）
Ｉ．Ｂ．Ｒ．は、翻訳工程に関して本質的なものであ
る。Ｌ１１タンパク質は、リボソームおよび幾つかのタ
ンパク質合成因子間の相互作用を介在し、例えばここで
伸長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）および終了因子１（ＲＦ−１）
が挙げられてもよい。したがって、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｌ１
１突然変異体中のリボソーム中でのＬ１１タンパク質の
不在は、翻訳速度の低下を導く（Xing and Draper, Bio
chemistry, 35, 1581-1588, 1996）Ｉ．Ｂ．Ｒ．。
センジャーＲＮＡ制御されたポリペプチドの生合成が合
成される。リボソームに加えて、当業者によってタンパ
ク質合成因子と呼称される他のタンパク質（Noller, An
nual Review of Biochemistry, 60, 191-227, 1991）
Ｉ．Ｂ．Ｒ．は、翻訳工程に関して本質的なものであ
る。Ｌ１１タンパク質は、リボソームおよび幾つかのタ
ンパク質合成因子間の相互作用を介在し、例えばここで
伸長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）および終了因子１（ＲＦ−１）
が挙げられてもよい。したがって、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｌ１
１突然変異体中のリボソーム中でのＬ１１タンパク質の
不在は、翻訳速度の低下を導く（Xing and Draper, Bio
chemistry, 35, 1581-1588, 1996）Ｉ．Ｂ．Ｒ．。
【０００８】Ｌ１１タンパク質は同様に、リボソームに
対するＲｅｌＡタンパク質の結合および活性に必要であ
る。アミノ酸の欠失条件下で、ＲｅｌＡは、一つのピロ
フォスフェート基のＡＴＰからＧＤＰへのトランスファ
ーによって、グアノシン３リン酸（ｐｐＧｐｐ）の合成
を触媒する。Ｅ．Ｃｏｌｉにおいて、ｐｐＧｐｐは、否
定的である（negatively）かまたは肯定的（positivel
y）に多くの遺伝子の発現を作用する。一般に、生合成
経路中で効果的な遺伝子生成物の発現は刺激される。異
化作用を有する遺伝子生成物は概して相応して否定的に
調節される。アミノ酸生合成において中心的な規制をお
こなう多くの遺伝子およびオペロンは、Ｅ．Ｃｏｌｉ中
でｐｐＧｐｐによって調節される。現在までに知られて
いるＥ．Ｃｏｌｉ中で肯定的に作用すべき遺伝子は、ａ
ｒｇＦ、ａｒｇＩ、ａｒｇＥＣＢＨ（アルギニン生合
成）、ｇｌｔＢ、ｇｌｎＡ、ｇｄｈ（グルタミン／グル
タメート生合成）、ｉｌｖＢ、ＩｌｖＡ（イソロイシン
生合成）、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＦ、ｍｅｔＫ（メチオニン
生合成）、ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ（スレオニン
生合成）、ｌｙｓＡ、ｌｙｓＣ、ｄａｐＢ、ａｓｄ（リ
シン生合成）（Cashel et al., In: Neidhardt et al.,
Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cell
ular and molecular biology, American Society for M
icrobiology, Washinton D.C., 1458-1496, 1996）I.B.
R.である。その一方で、さらに、アミノ酸生合成の肯定
的な調節因子としてのｐｐＧｐｐの機能は他の細菌、例
えばサルモネラ チフィムリウム（Salmonella typhimu
rium）（Rudd et al., Journal ofBacteriology, 163,
534-542, 1985）I.B.R.、ビブリオ ｓｐ．（Vibrio s
p.）（Flaerdh et al., Journal of Bacteriology, 17
6, 5949-5957, 1994）I.B.R.およびＢ．スブチリス（B.
subtilis）（Wendrich and Marahiel, Molecular Micro
biology, 26, 65-79, 1997）I.B.R.で明かにされた。
対するＲｅｌＡタンパク質の結合および活性に必要であ
る。アミノ酸の欠失条件下で、ＲｅｌＡは、一つのピロ
フォスフェート基のＡＴＰからＧＤＰへのトランスファ
ーによって、グアノシン３リン酸（ｐｐＧｐｐ）の合成
を触媒する。Ｅ．Ｃｏｌｉにおいて、ｐｐＧｐｐは、否
定的である（negatively）かまたは肯定的（positivel
y）に多くの遺伝子の発現を作用する。一般に、生合成
経路中で効果的な遺伝子生成物の発現は刺激される。異
化作用を有する遺伝子生成物は概して相応して否定的に
調節される。アミノ酸生合成において中心的な規制をお
こなう多くの遺伝子およびオペロンは、Ｅ．Ｃｏｌｉ中
でｐｐＧｐｐによって調節される。現在までに知られて
いるＥ．Ｃｏｌｉ中で肯定的に作用すべき遺伝子は、ａ
ｒｇＦ、ａｒｇＩ、ａｒｇＥＣＢＨ（アルギニン生合
成）、ｇｌｔＢ、ｇｌｎＡ、ｇｄｈ（グルタミン／グル
タメート生合成）、ｉｌｖＢ、ＩｌｖＡ（イソロイシン
生合成）、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＦ、ｍｅｔＫ（メチオニン
生合成）、ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ（スレオニン
生合成）、ｌｙｓＡ、ｌｙｓＣ、ｄａｐＢ、ａｓｄ（リ
シン生合成）（Cashel et al., In: Neidhardt et al.,
Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cell
ular and molecular biology, American Society for M
icrobiology, Washinton D.C., 1458-1496, 1996）I.B.
R.である。その一方で、さらに、アミノ酸生合成の肯定
的な調節因子としてのｐｐＧｐｐの機能は他の細菌、例
えばサルモネラ チフィムリウム（Salmonella typhimu
rium）（Rudd et al., Journal ofBacteriology, 163,
534-542, 1985）I.B.R.、ビブリオ ｓｐ．（Vibrio s
p.）（Flaerdh et al., Journal of Bacteriology, 17
6, 5949-5957, 1994）I.B.R.およびＢ．スブチリス（B.
subtilis）（Wendrich and Marahiel, Molecular Micro
biology, 26, 65-79, 1997）I.B.R.で明かにされた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】従来技術から、コリネ
フォルム細菌のｒｐｌＫ遺伝子のヌクレオチド配列の情
報が前記細菌のアミノ酸製造の改善に寄与するであろう
場合において、見出される重要性が明かになっている。
したがって、本発明の目的はアミノ酸、特にＬ−リシン
の改善された新規の酵素的製造を可能にすることであ
る。
フォルム細菌のｒｐｌＫ遺伝子のヌクレオチド配列の情
報が前記細菌のアミノ酸製造の改善に寄与するであろう
場合において、見出される重要性が明かになっている。
したがって、本発明の目的はアミノ酸、特にＬ−リシン
の改善された新規の酵素的製造を可能にすることであ
る。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は次のよう
にして達成された。
にして達成された。
【００１１】
【発明の実施の形態】Ｌ−アミノ酸、特にリシンはヒト
医学および製薬工業、食品工業および特に動物飼料にお
いて使用される。この理由から、アミノ酸、特にＬ−リ
シンを製造するための改善された方法に関する新規アプ
ローチは概して重要である。
医学および製薬工業、食品工業および特に動物飼料にお
いて使用される。この理由から、アミノ酸、特にＬ−リ
シンを製造するための改善された方法に関する新規アプ
ローチは概して重要である。
【００１２】本発明の特徴は、 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一であ
るポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一
であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）に対して相補
的なポリヌクレオチド、かつ、 ｄ）ポリヌクレオチド配列（ａ）、（ｂ）または（ｃ）
の連続する塩基を少なくとも１５個含むポリヌクレオチ
ドの群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離
されたポリヌクレオチドである。
ードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一であ
るポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一
であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）に対して相補
的なポリヌクレオチド、かつ、 ｄ）ポリヌクレオチド配列（ａ）、（ｂ）または（ｃ）
の連続する塩基を少なくとも１５個含むポリヌクレオチ
ドの群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離
されたポリヌクレオチドである。
【００１３】この配列同一性に関する百分率を定めるた
めのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列中の置換
または突然変異の相対的な度合いは、配列分析の公知の
方法によって証明されるかまたは測定されてもよい。前
記方法は、ビショップら（Bishop et al.）“DNA & Pro
tein Sequence Analysis (A Practical Approach”)、
Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９
９７）Ｉ．Ｂ．Ｒ．およびシュテインベルグ、ミハエル
（Steinberg, Michael）“Protein StructurePredictio
n”(A Practical Approach), Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉ
ｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で
開示および明らかにされている。
めのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列中の置換
または突然変異の相対的な度合いは、配列分析の公知の
方法によって証明されるかまたは測定されてもよい。前
記方法は、ビショップら（Bishop et al.）“DNA & Pro
tein Sequence Analysis (A Practical Approach”)、
Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９
９７）Ｉ．Ｂ．Ｒ．およびシュテインベルグ、ミハエル
（Steinberg, Michael）“Protein StructurePredictio
n”(A Practical Approach), Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉ
ｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で
開示および明らかにされている。
【００１４】本発明の他の特徴は、前記（ａ〜ｄ）によ
るポリヌクレオチドであり、この場合、これは好ましく
は、（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、また
は（ｉｉ）遺伝子コード縮退の範囲内で配列（ｉ）と一
致する少なくとも一つの配列、または（ｉｉｉ）配列
（ｉ）または（ｉｉ）に対して相補的な配列とハイブリ
ダイズする少なくとも一つの配列、および場合によって
は、（ｉｖ）（ｉ）の機能中立センス突然変異を含む複
製可能なＤＮＡである。ハイブリダイゼーションに要求
されるストリンジェンシーの度合いはサンブルックら
（Sambrook et al.）および本明細書中に参考のために
記載された他の文献中で記載されているように、高いも
のから低いものまで多様であってもよい。
るポリヌクレオチドであり、この場合、これは好ましく
は、（ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列、また
は（ｉｉ）遺伝子コード縮退の範囲内で配列（ｉ）と一
致する少なくとも一つの配列、または（ｉｉｉ）配列
（ｉ）または（ｉｉ）に対して相補的な配列とハイブリ
ダイズする少なくとも一つの配列、および場合によって
は、（ｉｖ）（ｉ）の機能中立センス突然変異を含む複
製可能なＤＮＡである。ハイブリダイゼーションに要求
されるストリンジェンシーの度合いはサンブルックら
（Sambrook et al.）および本明細書中に参考のために
記載された他の文献中で記載されているように、高いも
のから低いものまで多様であってもよい。
【００１５】本発明の他の特徴は：配列番号１に記載の
ヌクレオチド配列を含む、複製可能な、好ましくは組み
換えＤＮＡであるポリヌクレオチド、配列番号２に記載
のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、複製
可能な、好ましくは組み換えＤＮＡのポリヌクレオチ
ド、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む、前記
（ａ〜ｄ）、特に項目（ｄ）に記載のポリヌクレオチ
ド、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドをコードする、前記（ａ〜ｄ）、特に項目（ｄ）に記
載のポリヌクレオチド、配列番号３および図１（Δ＝ｄ
ｅＨａ）に記載されており、かつ、ブタペスト条約に従
ってＤＳＭ１３１５８でＥ．ＣｏｌｉＤＨ５α／ｐΔｒ
ｐｌＫに寄託された、前記（ａ〜ｄ）、特に項目（ｄ）
に記載の突然変異されたポリヌクレオチドを含むベクタ
ーであり、この場合、これは、１９９９年、１１月２６
日にＤＳＭＺ−カッツエ ザンムルグ ホン ミクロオ
ルガニズム ウント ツエルカルツイーレン Ｇｍｂ
Ｈ、マスクローダー Ｗｅｇ１ｂ、Ｄ−３８１２４ブラ
ウンシュウイッグ、ドイツ（DSMZ-Qeutsche Sammlung v
on Microorganism Und Zell Kulturen GmbH, Maschrode
r Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany）の国際寄
託機関で寄託され、かつ、ｒｐｌＫ遺伝子中の挿入体ま
たは欠失体を含む、ホスト細胞として役立つコリネフォ
ルム細菌を含む。
ヌクレオチド配列を含む、複製可能な、好ましくは組み
換えＤＮＡであるポリヌクレオチド、配列番号２に記載
のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、複製
可能な、好ましくは組み換えＤＮＡのポリヌクレオチ
ド、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む、前記
（ａ〜ｄ）、特に項目（ｄ）に記載のポリヌクレオチ
ド、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドをコードする、前記（ａ〜ｄ）、特に項目（ｄ）に記
載のポリヌクレオチド、配列番号３および図１（Δ＝ｄ
ｅＨａ）に記載されており、かつ、ブタペスト条約に従
ってＤＳＭ１３１５８でＥ．ＣｏｌｉＤＨ５α／ｐΔｒ
ｐｌＫに寄託された、前記（ａ〜ｄ）、特に項目（ｄ）
に記載の突然変異されたポリヌクレオチドを含むベクタ
ーであり、この場合、これは、１９９９年、１１月２６
日にＤＳＭＺ−カッツエ ザンムルグ ホン ミクロオ
ルガニズム ウント ツエルカルツイーレン Ｇｍｂ
Ｈ、マスクローダー Ｗｅｇ１ｂ、Ｄ−３８１２４ブラ
ウンシュウイッグ、ドイツ（DSMZ-Qeutsche Sammlung v
on Microorganism Und Zell Kulturen GmbH, Maschrode
r Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany）の国際寄
託機関で寄託され、かつ、ｒｐｌＫ遺伝子中の挿入体ま
たは欠失体を含む、ホスト細胞として役立つコリネフォ
ルム細菌を含む。
【００１６】さらに、本発明の他の特徴は、ハイブリダ
イゼーションによるスクリーニングによって得られても
よいポリヌクレオチド配列、この場合、これはサンブル
ックおよび本明細書中に参考のために記載された文献で
証明されているように、多様のストリンジェンシーの度
合いを有し、ならびに配列番号１に相当するポリヌクレ
オチド配列を含む完全な遺伝子、ならびに配列番号１に
記載の前記ポリヌクレオチド配列を含むプローブ、また
はこれらのフラグメントを含む適切な遺伝子バンクから
本質的に成るポリヌクレオチドであり、かつ、前記ＤＮ
Ａ配列の単離を含む。
イゼーションによるスクリーニングによって得られても
よいポリヌクレオチド配列、この場合、これはサンブル
ックおよび本明細書中に参考のために記載された文献で
証明されているように、多様のストリンジェンシーの度
合いを有し、ならびに配列番号１に相当するポリヌクレ
オチド配列を含む完全な遺伝子、ならびに配列番号１に
記載の前記ポリヌクレオチド配列を含むプローブ、また
はこれらのフラグメントを含む適切な遺伝子バンクから
本質的に成るポリヌクレオチドであり、かつ、前記ＤＮ
Ａ配列の単離を含む。
【００１７】本発明によるポリヌクレオチド配列はＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡのためのハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして、ｃＤＮＡをその完全長で単離する
ために適しており、この場合、これはリボソームタンパ
ク質Ｌ１１をコードし、かつｒｐｌＫ遺伝子を含む配列
と高い類似性を有する前記ｃＤＮＡまたは遺伝子を単離
する。
Ａ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡのためのハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして、ｃＤＮＡをその完全長で単離する
ために適しており、この場合、これはリボソームタンパ
ク質Ｌ１１をコードし、かつｒｐｌＫ遺伝子を含む配列
と高い類似性を有する前記ｃＤＮＡまたは遺伝子を単離
する。
【００１８】また、本発明によるポリヌクレオチド配列
はプライマーとして適しており、この場合、これによっ
て、ｒｐｌＫ遺伝子生成物またはリボソームタンパク質
Ｌ１１をコードする遺伝子のＤＮＡのポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を実施することができる。
はプライマーとして適しており、この場合、これによっ
て、ｒｐｌＫ遺伝子生成物またはリボソームタンパク質
Ｌ１１をコードする遺伝子のＤＮＡのポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を実施することができる。
【００１９】プローブまたはプライマーとして役立つオ
リゴヌクレオチドは少なくとも３０個、好ましくは少な
くとも２０個、特に好ましくは少なくとも１５個の連続
するヌクレオチドを含む。同様に適しているのは、少な
くとも４０個または５０個の塩基対の長さを有するオリ
ゴヌクレオチドである。
リゴヌクレオチドは少なくとも３０個、好ましくは少な
くとも２０個、特に好ましくは少なくとも１５個の連続
するヌクレオチドを含む。同様に適しているのは、少な
くとも４０個または５０個の塩基対の長さを有するオリ
ゴヌクレオチドである。
【００２０】“単離された”はその本来の環境から分離
されたことを意味する。
されたことを意味する。
【００２１】“ポリヌクレオチド”は一般にポリリボヌ
クレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドに関
し、この場合、これらは未修飾のＲＮＡまたはＤＮＡで
あってもよいし、あるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮ
Ａであってもよい。
クレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドに関
し、この場合、これらは未修飾のＲＮＡまたはＤＮＡで
あってもよいし、あるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮ
Ａであってもよい。
【００２２】“ポリペプチド”はペプチド結合を介して
結合された二つまたはそれ以上のアミノ酸を含むペプチ
ドまたはタンパク質を意味するものとされる。
結合された二つまたはそれ以上のアミノ酸を含むペプチ
ドまたはタンパク質を意味するものとされる。
【００２３】本発明によるポリペプチドは、配列番号２
に記載のポリペプチド、特にｒｐｌＫ遺伝子生成物の生
物学的活性を有するものおよびさらには配列番号２に記
載のポリペプチドと少なくとも７０％同一であり、好ま
しくは少なくとも８０％および特には少なくとも９０％
〜９５％同一であり、かつ同様の活性を有するものを含
む。同一の度合いを定めるために、ポリヌクレオチドま
たはアミノ酸配列中の置換または突然変異の度合いは、
配列分析の公知の方法によって測定されてもよい。前記
方法は開示されており、かつビショップら（Bishop et
al.）“DNA & Protein Sequence Analysis (A Practica
l Approach”)、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）Ｉ．Ｂ．Ｒ．およびシュテイ
ンベルグ、ミハエル（Steinberg, Michael）“Protein
structure Prediction”（A practical Approach）、Ｏ
ｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９
７）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で明かにされている。
に記載のポリペプチド、特にｒｐｌＫ遺伝子生成物の生
物学的活性を有するものおよびさらには配列番号２に記
載のポリペプチドと少なくとも７０％同一であり、好ま
しくは少なくとも８０％および特には少なくとも９０％
〜９５％同一であり、かつ同様の活性を有するものを含
む。同一の度合いを定めるために、ポリヌクレオチドま
たはアミノ酸配列中の置換または突然変異の度合いは、
配列分析の公知の方法によって測定されてもよい。前記
方法は開示されており、かつビショップら（Bishop et
al.）“DNA & Protein Sequence Analysis (A Practica
l Approach”)、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）Ｉ．Ｂ．Ｒ．およびシュテイ
ンベルグ、ミハエル（Steinberg, Michael）“Protein
structure Prediction”（A practical Approach）、Ｏ
ｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９
７）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で明かにされている。
【００２４】さらに本発明は、すでにアミノ酸を製造す
るコリネフォルム細菌を用いてのアミノ酸、特にリシン
の酵素的製造方法に関し、かつこの場合、ｒｐｌＫ遺伝
子をコードするそのヌクレオチド配列は転写減衰されて
いる。
るコリネフォルム細菌を用いてのアミノ酸、特にリシン
の酵素的製造方法に関し、かつこの場合、ｒｐｌＫ遺伝
子をコードするそのヌクレオチド配列は転写減衰されて
いる。
【００２５】これに関連して“アテニュエーション”の
用語は、微生物中で相当するDNAによってコードされて
いる一つまたはそれ以上の酵素またはタンパク質の細胞
内活性または機能を、例えば弱いプロモーターまたは低
い活性を有する相当する酵素またはタンパク質をコード
するか、あるいは相当する遺伝子または酵素またはタン
パク質を不活性化させる遺伝子または対立遺伝子を用い
るか、あるいはこれらの方法を組み合わせることによっ
て、減少させるか、あるいはスイッチオフ（switch of
f）することを示す。
用語は、微生物中で相当するDNAによってコードされて
いる一つまたはそれ以上の酵素またはタンパク質の細胞
内活性または機能を、例えば弱いプロモーターまたは低
い活性を有する相当する酵素またはタンパク質をコード
するか、あるいは相当する遺伝子または酵素またはタン
パク質を不活性化させる遺伝子または対立遺伝子を用い
るか、あるいはこれらの方法を組み合わせることによっ
て、減少させるか、あるいはスイッチオフ（switch of
f）することを示す。
【００２６】本発明の目的の微生物はアミノ酸、特にリ
シンを、グルコース、ショ糖、ラクトース、フルクトー
ス、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースまたはグ
リセロールおよびエタノールから製造することができ
る。これはコリネフォルム細菌の典型的なもの、特にコ
リネバクテリウム属であってもよい。コリネバクテリウ
ム属において、コリネバクテリム種コリネバクテリム
グルタミクム種が特に挙げられるべきであり、この場
合、これはＬ−アミノ酸を製造するその能力に関して当
業者に公知である。
シンを、グルコース、ショ糖、ラクトース、フルクトー
ス、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースまたはグ
リセロールおよびエタノールから製造することができ
る。これはコリネフォルム細菌の典型的なもの、特にコ
リネバクテリウム属であってもよい。コリネバクテリウ
ム属において、コリネバクテリム種コリネバクテリム
グルタミクム種が特に挙げられるべきであり、この場
合、これはＬ−アミノ酸を製造するその能力に関して当
業者に公知である。
【００２７】さらに、本発明は、例証のためにのみであ
って、本発明を制限することのない、明細書中に提供さ
れた図表を参考にして理解されるであろう。
って、本発明を制限することのない、明細書中に提供さ
れた図表を参考にして理解されるであろう。
【００２８】配列表は次の意味、 配列番号１： ｒｐｌＫ遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列、 配列番号２： ｒｐｌＫ遺伝子生成物（Ｌ−１１遺伝子）のアミノ酸配列、 配列番号３： ｒｐｌＫ遺伝子の対立遺伝子、 配列番号４： ΔｒｐｌＫ対立遺伝子によってコードされたタンパク質Ｌ−１ １の変型（variation）、 配列番号５： 配列番号１に基づいて誘導されたＰ１ｕｐプライマー、 配列番号６： 配列番号１に基づいて誘導されたＰ２ｄｏｗｎプライマー、 配列番号７： 配列番号１に基づいて誘導されたＰ１ｄｏｗｎプライマー、 配列番号８： 配列番号１に基づいて誘導されたＰ２ｕｐプライマー を有する。
【００２９】コリネバクテリウム属、特にコリバクテリ
ム グルタミクム種の適した菌株は特に公知の野生型菌
株 コリネバクテリウム グルタミクム（Corynebacterium
glutamicum） ＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム アセトグルタミクム（Corynebact
erium acetogkutamicum） ＡＴＣＣ１５８６０ コリネバクテリウム アセトアシドフィルム（Coryneba
cteruim acetoacidphilum） ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム メラッセコラ（Corynebacterium
melassecola） ＡＴＣＣ１７９６５ コリネバクテリウム セルモアミノジェネス（Coryneba
cteruim thermoaminogenes）ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９ ブレビバクテリウム フラブム（Brevibacterium flavu
m）ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツム（Brevibac
terium lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９および ブレビバクテリウム ジバリカツム（Brevibacterium d
ivaricatum）ＡＴＣＣ１４０２００、 ならびにＬ−アミノ酸を製造する突然変異体または菌株
であり、かつこれから製造されたもの、例えば、Ｌ−リ
シン製造菌株 コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ１７
０９ ブレビバクテリウム フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ１７０８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツム ＦＥＲＭ
−Ｐ１７１２ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ６４
６３ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ６４
６４ コリネバクテリウム グルタミクム ＤＳＭ５７１５ コリネバクテリウム グルタミクム ＤＳＭ１２８６６
および コリネバクテリウム グルタミクム ＤＭ５８−１であ
る。
ム グルタミクム種の適した菌株は特に公知の野生型菌
株 コリネバクテリウム グルタミクム（Corynebacterium
glutamicum） ＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム アセトグルタミクム（Corynebact
erium acetogkutamicum） ＡＴＣＣ１５８６０ コリネバクテリウム アセトアシドフィルム（Coryneba
cteruim acetoacidphilum） ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム メラッセコラ（Corynebacterium
melassecola） ＡＴＣＣ１７９６５ コリネバクテリウム セルモアミノジェネス（Coryneba
cteruim thermoaminogenes）ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９ ブレビバクテリウム フラブム（Brevibacterium flavu
m）ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツム（Brevibac
terium lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９および ブレビバクテリウム ジバリカツム（Brevibacterium d
ivaricatum）ＡＴＣＣ１４０２００、 ならびにＬ−アミノ酸を製造する突然変異体または菌株
であり、かつこれから製造されたもの、例えば、Ｌ−リ
シン製造菌株 コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ１７
０９ ブレビバクテリウム フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ１７０８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツム ＦＥＲＭ
−Ｐ１７１２ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ６４
６３ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ６４
６４ コリネバクテリウム グルタミクム ＤＳＭ５７１５ コリネバクテリウム グルタミクム ＤＳＭ１２８６６
および コリネバクテリウム グルタミクム ＤＭ５８−１であ
る。
【００３０】本発明はコリネバクテリウム グルタミク
ムから新規ｒｐｌＫ遺伝子を単離することに成功した。
ムから新規ｒｐｌＫ遺伝子を単離することに成功した。
【００３１】Ｃ．グルタミクムのｒｐｌＫ遺伝子を単離
するために、コリネバクテリウムグルタミクムの遺伝子
バンクを最初に構築する。遺伝子バンクの形成は一般的
に公知の教科書および指示書に記載されている。挙げら
れてもよい例は、ウィナッカー（Winnacker）による教
科書：Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｃｌｏｎｅｓ：ａｎ Ｉｎｔ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ（Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990 ）
Ｉ．Ｂ．Ｒ．またはサンブルックらによる指示書：Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, 1989）Ｉ．Ｂ．Ｒ．である。よく知られた
遺伝子バンクは、Ｅ．ＣｏｌｉＫ−１２菌株Ｗ３１１０
であり、この場合、これはコハラら（Kohara et al.）
によってλ−ベクター中にデザインされた（Cell 50, 4
95-508 (1987)I.B.R.）。ベイズら（Bathe et al.）(Mo
lecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996)
Ｉ．Ｂ．Ｒ．はＣ．グルタミクム ＡＴＣＣ１３０２２
の遺伝子バンクを記載しており、この場合、これはコス
ミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（Wahl et al., 1987,
Proceedings ofthe National Academy of Sicences US
A, 84:2160-2164）Ｉ．Ｂ．Ｒ．を用いて、Ｅ．Ｃｏｌ
ｉＫ−１２菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al., 1988, Nu
cleic Acids Research 16: 1563-1575）Ｉ．Ｂ．Ｒ．中
に構築された。ボールマンら（Boermann et al.）（Mol
ecular Microbiology 6(3), 317-326）Ｉ．Ｂ．Ｒ．は
再度、コスミドｐＨＣ７９（Hohn and Collins, Gene 1
1, 291-298 (1980)I.B.R.）を用いてのＣ．グルタミク
ム ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子バンクを記載してい
る。
するために、コリネバクテリウムグルタミクムの遺伝子
バンクを最初に構築する。遺伝子バンクの形成は一般的
に公知の教科書および指示書に記載されている。挙げら
れてもよい例は、ウィナッカー（Winnacker）による教
科書：Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｃｌｏｎｅｓ：ａｎ Ｉｎｔ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ（Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990 ）
Ｉ．Ｂ．Ｒ．またはサンブルックらによる指示書：Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, 1989）Ｉ．Ｂ．Ｒ．である。よく知られた
遺伝子バンクは、Ｅ．ＣｏｌｉＫ−１２菌株Ｗ３１１０
であり、この場合、これはコハラら（Kohara et al.）
によってλ−ベクター中にデザインされた（Cell 50, 4
95-508 (1987)I.B.R.）。ベイズら（Bathe et al.）(Mo
lecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996)
Ｉ．Ｂ．Ｒ．はＣ．グルタミクム ＡＴＣＣ１３０２２
の遺伝子バンクを記載しており、この場合、これはコス
ミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（Wahl et al., 1987,
Proceedings ofthe National Academy of Sicences US
A, 84:2160-2164）Ｉ．Ｂ．Ｒ．を用いて、Ｅ．Ｃｏｌ
ｉＫ−１２菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al., 1988, Nu
cleic Acids Research 16: 1563-1575）Ｉ．Ｂ．Ｒ．中
に構築された。ボールマンら（Boermann et al.）（Mol
ecular Microbiology 6(3), 317-326）Ｉ．Ｂ．Ｒ．は
再度、コスミドｐＨＣ７９（Hohn and Collins, Gene 1
1, 291-298 (1980)I.B.R.）を用いてのＣ．グルタミク
ム ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子バンクを記載してい
る。
【００３２】ｐＢＲ３２２（Bolivar, Life Sciences,
25, 807-818 (1979) I.B.R.）またはｐＵＣ９（Vieria
et al., 1982, Gene, 19: 259-268）Ｉ．Ｂ．Ｒ．のよ
うなプラスミドは、さらにＥ．Ｃｏｌｉ中にＣ．グルタ
ミクムの遺伝子バンクを製造するのに使用されてもよ
い。制限および組み換えの欠失体であるＥ．Ｃｏｌｉの
菌株は特にホストとして適している。この例は菌株ＤＨ
５αｍｃｒであり、この場合、これはグラントら（Gran
t et al.）によって記載されている（Proceedings of N
ational Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-46
49）Ｉ．Ｂ．Ｒ．。
25, 807-818 (1979) I.B.R.）またはｐＵＣ９（Vieria
et al., 1982, Gene, 19: 259-268）Ｉ．Ｂ．Ｒ．のよ
うなプラスミドは、さらにＥ．Ｃｏｌｉ中にＣ．グルタ
ミクムの遺伝子バンクを製造するのに使用されてもよ
い。制限および組み換えの欠失体であるＥ．Ｃｏｌｉの
菌株は特にホストとして適している。この例は菌株ＤＨ
５αｍｃｒであり、この場合、これはグラントら（Gran
t et al.）によって記載されている（Proceedings of N
ational Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-46
49）Ｉ．Ｂ．Ｒ．。
【００３３】コスミドを用いてクローン化された長いＤ
ＮＡフラグメントは最終的には再度、シークエンシング
に適した通常のベクター中にサブクローニングされても
よい。
ＮＡフラグメントは最終的には再度、シークエンシング
に適した通常のベクター中にサブクローニングされても
よい。
【００３４】ＤＮＡシークエンシングの方法は、他の文
献、サンガーら（Sanger et al.）（Proceedings of Na
tional Academy of Scirences of the United States o
f America USA, 74: 5463-5467,1977）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で
記載されている。
献、サンガーら（Sanger et al.）（Proceedings of Na
tional Academy of Scirences of the United States o
f America USA, 74: 5463-5467,1977）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で
記載されている。
【００３５】本発明の目的である、配列番号１としてｒ
ｐｌＫ遺伝子をコードするＣ．グルタミクムの新規ＤＮ
Ａ配列は、この方法で得られる。さらに、相当するタン
パク質のアミノ酸配列は、前記の方法によるＤＮＡ配列
から誘導された。得られるｒｐｌＫ遺伝子生成物または
Ｌ−１１遺伝子のアミノ酸配列は、配列番号２に示され
ている。
ｐｌＫ遺伝子をコードするＣ．グルタミクムの新規ＤＮ
Ａ配列は、この方法で得られる。さらに、相当するタン
パク質のアミノ酸配列は、前記の方法によるＤＮＡ配列
から誘導された。得られるｒｐｌＫ遺伝子生成物または
Ｌ−１１遺伝子のアミノ酸配列は、配列番号２に示され
ている。
【００３６】遺伝子コードの縮退によって配列番号１か
ら得られるコーディングＤＮＡ配列は、同様に本発明の
目的である。同様に、配列番号１または配列番号１の一
部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列は本発明の目的で
ある。ハイブリダイゼーションは異なる度合いのストリ
ンジェンシーで生じてもよい。配列番号１から相当する
方法で得られたアミノ酸配列は、同様に本発明の目的で
ある。
ら得られるコーディングＤＮＡ配列は、同様に本発明の
目的である。同様に、配列番号１または配列番号１の一
部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列は本発明の目的で
ある。ハイブリダイゼーションは異なる度合いのストリ
ンジェンシーで生じてもよい。配列番号１から相当する
方法で得られたアミノ酸配列は、同様に本発明の目的で
ある。
【００３７】本発明は、ｒｐｌＫ遺伝子のアテニュエー
ション後に、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシンを、改善さ
れた方法で製造するコリネフォルム細菌を見出した。
ション後に、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシンを、改善さ
れた方法で製造するコリネフォルム細菌を見出した。
【００３８】アテニュエーションを達成するために、ｒ
ｐｌＫ遺伝子または好ましくはタンパク質の機能的性質
の双方の発現が減少されてもよい。場合によっては２つ
の方法が組み合わされてもよい。
ｐｌＫ遺伝子または好ましくはタンパク質の機能的性質
の双方の発現が減少されてもよい。場合によっては２つ
の方法が組み合わされてもよい。
【００３９】遺伝子発現の減少は、適した培養である
か、あるいは遺伝子発現のシグナル構造の遺伝子的な改
変（突然変異）によって生じさせてもよい。遺伝子発現
のシグナル構造は、例えばリプレッサー遺伝子、アクチ
ベーター遺伝子、オペレーター、プロモーター、アテニ
ュエーター、リボソーム結合部位、開始コドンおよびタ
ーミネーターである。当業者はこれに関する情報を、特
許出願ＷＯ９６／１５２４６Ｉ．Ｂ．Ｒ．、ボイドおよ
びマーフィー（Boyd and Murphy）（Journal ofBacteri
ology 170:5949 (1988) I.B.R.）、ボスキュルおよびチ
ャンブリス（Voskuil and Chambliss）（Nucleic Acid
Research 26: 3548 (1998) I.B.R.）、ジェンセンおよ
びハマー（Jensen and Hammer）（Biotechnology and B
ioengineering 58: 191 (1998) I.B.R.）、パテックら
（Patek et al.）（Microbiology 142: 1297 (1996) I.
B.R.）および遺伝子学ならびに分子生物学の公知の教科
書、例えばニッパーズ（Knippers）による教科書（Mole
cular Genetics, 6th edition, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Germany, 1995）Ｉ．Ｂ．Ｒ．またはウィナ
ッカー（Winnacker）による教科書（Genes and Clones,
VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 199
0）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で見出すことができるだろう。
か、あるいは遺伝子発現のシグナル構造の遺伝子的な改
変（突然変異）によって生じさせてもよい。遺伝子発現
のシグナル構造は、例えばリプレッサー遺伝子、アクチ
ベーター遺伝子、オペレーター、プロモーター、アテニ
ュエーター、リボソーム結合部位、開始コドンおよびタ
ーミネーターである。当業者はこれに関する情報を、特
許出願ＷＯ９６／１５２４６Ｉ．Ｂ．Ｒ．、ボイドおよ
びマーフィー（Boyd and Murphy）（Journal ofBacteri
ology 170:5949 (1988) I.B.R.）、ボスキュルおよびチ
ャンブリス（Voskuil and Chambliss）（Nucleic Acid
Research 26: 3548 (1998) I.B.R.）、ジェンセンおよ
びハマー（Jensen and Hammer）（Biotechnology and B
ioengineering 58: 191 (1998) I.B.R.）、パテックら
（Patek et al.）（Microbiology 142: 1297 (1996) I.
B.R.）および遺伝子学ならびに分子生物学の公知の教科
書、例えばニッパーズ（Knippers）による教科書（Mole
cular Genetics, 6th edition, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Germany, 1995）Ｉ．Ｂ．Ｒ．またはウィナ
ッカー（Winnacker）による教科書（Genes and Clones,
VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 199
0）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で見出すことができるだろう。
【００４０】タンパク質の機能的性質の改変または減少
を導く突然変異体は、従来技術から公知である。これ
は、例えばキューおよびグッドマン（Qiu and Goodma
n）（Journal of Biological Chemistry 272: 8611-861
7 (1997) I.B.R.）、スギモトら（Sugimoto et al.）
（Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 17
60-1762 (1997) I.B.R.）およびメッケル（Moeckel）
（“Threonine dehudratase from Corynebacterium glu
tamicum: elimination of allosteric regulation andt
he structure of the enzyme”Reports of Juelich Res
earch Center, Juel-2906, ISNN9442952, Juelich, Ger
many, 1994）Ｉ．Ｂ．Ｒ．の研究が挙げられてもよい。
抄録は遺伝子学および分子生物学の公知の教科書、例え
ばハージェマン（Hagemann）（General Genetics, Gust
av Fischer verlag, Stuttgart, 1986）Ｉ．Ｂ．Ｒ．に
よる教科書から得られてもよい。
を導く突然変異体は、従来技術から公知である。これ
は、例えばキューおよびグッドマン（Qiu and Goodma
n）（Journal of Biological Chemistry 272: 8611-861
7 (1997) I.B.R.）、スギモトら（Sugimoto et al.）
（Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 17
60-1762 (1997) I.B.R.）およびメッケル（Moeckel）
（“Threonine dehudratase from Corynebacterium glu
tamicum: elimination of allosteric regulation andt
he structure of the enzyme”Reports of Juelich Res
earch Center, Juel-2906, ISNN9442952, Juelich, Ger
many, 1994）Ｉ．Ｂ．Ｒ．の研究が挙げられてもよい。
抄録は遺伝子学および分子生物学の公知の教科書、例え
ばハージェマン（Hagemann）（General Genetics, Gust
av Fischer verlag, Stuttgart, 1986）Ｉ．Ｂ．Ｒ．に
よる教科書から得られてもよい。
【００４１】変換、転換、挿入および欠失は突然変異と
して起こりうる。これはミスセンス突然変異またはナン
センス突然変異が、活性上でのアミノ酸交換の影響によ
るものであることを物語っている。遺伝子中の少なくと
も一つの塩基対の挿入または欠失は、誤ったアミノ酸が
組み込まれるか、あるいは翻訳が早期に短く切断される
結果として、フレームシフト突然変異を導く。このよう
な突然変異の製造の教示は従来技術に属し、かつ遺伝子
学および分子生物学の公知の教科書、例えばニッパース
（Knippers）による教科書（Nolecular Genetics, 6th
edition, GeorgThieme Verlag, Stuutgart, Germany, 1
995）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、ウィナッカーによる教科書（Genes
and Clones, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Ge
rmany,1990）Ｉ．Ｂ．Ｒ．またはハージェマンによる教
科書（Genaral Genetics, Ｇustav Fischer Verlag, St
uttgart, 1986）Ｉ．Ｂ．Ｒ．から得ることができる。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による突然変異体の製
造方法は、Ｃ．Ｒ．ニュートンおよびＡ．グラハム、Ｐ
ＣＲ、第２版、スペクトラム アカデミッシャーフェア
ラグ、ヘイデルベルグ、１９９７ (C.R. Newton and A.
Graham, PCR,2nd edution, Specltrum Akademischer v
erlag, Heidelberg, 1997.)、Ｉ．Ｂ．Ｒ．に記載され
ている。
して起こりうる。これはミスセンス突然変異またはナン
センス突然変異が、活性上でのアミノ酸交換の影響によ
るものであることを物語っている。遺伝子中の少なくと
も一つの塩基対の挿入または欠失は、誤ったアミノ酸が
組み込まれるか、あるいは翻訳が早期に短く切断される
結果として、フレームシフト突然変異を導く。このよう
な突然変異の製造の教示は従来技術に属し、かつ遺伝子
学および分子生物学の公知の教科書、例えばニッパース
（Knippers）による教科書（Nolecular Genetics, 6th
edition, GeorgThieme Verlag, Stuutgart, Germany, 1
995）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、ウィナッカーによる教科書（Genes
and Clones, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Ge
rmany,1990）Ｉ．Ｂ．Ｒ．またはハージェマンによる教
科書（Genaral Genetics, Ｇustav Fischer Verlag, St
uttgart, 1986）Ｉ．Ｂ．Ｒ．から得ることができる。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による突然変異体の製
造方法は、Ｃ．Ｒ．ニュートンおよびＡ．グラハム、Ｐ
ＣＲ、第２版、スペクトラム アカデミッシャーフェア
ラグ、ヘイデルベルグ、１９９７ (C.R. Newton and A.
Graham, PCR,2nd edution, Specltrum Akademischer v
erlag, Heidelberg, 1997.)、Ｉ．Ｂ．Ｒ．に記載され
ている。
【００４２】実施されてもよいｒｐｌＫ遺伝子の欠失突
然変異体を有するプラスミドの例は、図１に記載されて
いるプラスミドｐΔｒｐｌＫである。
然変異体を有するプラスミドの例は、図１に記載されて
いるプラスミドｐΔｒｐｌＫである。
【００４３】プラスミドｐΔｒｐｌＫは、ジェイガーら
（Jaegaer et al.）（Journal of Bacteriology, 1992,
174: 5462-65）Ｉ．Ｂ．Ｒ．によって記載されている
プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢから成り、この場
合、これは、配列番号３に記載されているｒｐｌＫ遺伝
子の対立遺伝子が挿入された。ΔｒｐｌＫと示された対
立遺伝子は、遺伝子の５’末端で１２ｂｐの長さの欠失
を有する。ΔｒｐｌＫ対立遺伝子によってコードされた
タンパク質Ｌ１１の変型は、配列番号４に記載されてい
る。記載されたタンパク質Ｌ−１１の変型は、配列番号
２の第３０〜３３番目のアミノ酸に相当するテトラペプ
チド、プロリン−アラニン−ロイシン−グリシン中での
エラーによるタンパク質Ｌ１１の野生型とは異なる。
（Jaegaer et al.）（Journal of Bacteriology, 1992,
174: 5462-65）Ｉ．Ｂ．Ｒ．によって記載されている
プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢから成り、この場
合、これは、配列番号３に記載されているｒｐｌＫ遺伝
子の対立遺伝子が挿入された。ΔｒｐｌＫと示された対
立遺伝子は、遺伝子の５’末端で１２ｂｐの長さの欠失
を有する。ΔｒｐｌＫ対立遺伝子によってコードされた
タンパク質Ｌ１１の変型は、配列番号４に記載されてい
る。記載されたタンパク質Ｌ−１１の変型は、配列番号
２の第３０〜３３番目のアミノ酸に相当するテトラペプ
チド、プロリン−アラニン−ロイシン−グリシン中での
エラーによるタンパク質Ｌ１１の野生型とは異なる。
【００４４】プラスミドｐΔｒｐｌＫは、相同組み換え
の後に、染色体ΔｒｐｌＫとΔｒｐｌＫ対立遺伝子との
交換を導く。挿入突然変異のための教示および例証は、
例えばシュバルツアーおよびピューラー（Schwarzer an
d Puehler）（Bio/Technology 9, 84-87 (1991) I.B.
R.）またフィッツパトリックら（Fitzpatrick et al.）
（Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-5
80 (1994) I.B.R.）で見出されてもよい。
の後に、染色体ΔｒｐｌＫとΔｒｐｌＫ対立遺伝子との
交換を導く。挿入突然変異のための教示および例証は、
例えばシュバルツアーおよびピューラー（Schwarzer an
d Puehler）（Bio/Technology 9, 84-87 (1991) I.B.
R.）またフィッツパトリックら（Fitzpatrick et al.）
（Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-5
80 (1994) I.B.R.）で見出されてもよい。
【００４５】さらに、適切な生合成経路の一つまたはそ
れ以上の酵素を増強させ、特にｒｐｌＫ遺伝子のアテニ
ュエーションの他にこれらを過剰発現させることで、Ｌ
−アミノ酸、特にＬ−リシンを製造することは有利であ
ってもよい。
れ以上の酵素を増強させ、特にｒｐｌＫ遺伝子のアテニ
ュエーションの他にこれらを過剰発現させることで、Ｌ
−アミノ酸、特にＬ−リシンを製造することは有利であ
ってもよい。
【００４６】例えば、特にＬ−リシンの製造に関して、 ●ジヒドロジピコリネート シンターゼ（EP-B019733
5）Ｉ．Ｂ．Ｒ．をコードするｄａｐＡ遺伝子、 ●フィードバック耐性アスパルテート キナーゼをコー
ドするｌｙｓＣ遺伝子（Kalinowski et al. (1990) I.
B.R., Molecular and Genaral Genatics 224: 317-32
4）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、 ●ピルベートカルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝
子（Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:
6076-6086）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、 ●マレート キノリン オキシドレダクターゼをコード
するｍｑｏ遺伝子（Molenaar et al., European Journa
l of Biochemistry 254, 395-403 (1998) I.B.R.）、 ●リシン排出をコードするｌｙｓＥ遺伝子（DE-A-19548
222）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、 ●ｚｗａｌ遺伝子（DE 19959328.0; DSM 13115）Ｉ．
Ｂ．Ｒ．の群から選択された一つまたはそれ以上の遺伝
子は、例えば同時に増強され、特に過剰に発現されても
よい。
5）Ｉ．Ｂ．Ｒ．をコードするｄａｐＡ遺伝子、 ●フィードバック耐性アスパルテート キナーゼをコー
ドするｌｙｓＣ遺伝子（Kalinowski et al. (1990) I.
B.R., Molecular and Genaral Genatics 224: 317-32
4）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、 ●ピルベートカルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝
子（Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:
6076-6086）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、 ●マレート キノリン オキシドレダクターゼをコード
するｍｑｏ遺伝子（Molenaar et al., European Journa
l of Biochemistry 254, 395-403 (1998) I.B.R.）、 ●リシン排出をコードするｌｙｓＥ遺伝子（DE-A-19548
222）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、 ●ｚｗａｌ遺伝子（DE 19959328.0; DSM 13115）Ｉ．
Ｂ．Ｒ．の群から選択された一つまたはそれ以上の遺伝
子は、例えば同時に増強され、特に過剰に発現されても
よい。
【００４７】さらに、Ｌ−アミノ酸製造のために、ｒｐ
ｌＫ遺伝子のアテニュエーションに加えて、 ●ホスホエノールカルボキシキナーゼをコードするｐｃ
ｋ遺伝子（DE19950409.1; DSM 13047）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、 ●グルコース６−リン酸イソメラーゼをコードするｐｇ
ｉ遺伝子（US09/96,478,DSM 12969）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、 ●ピルベートオキシダーゼをコードするｐｏｘＢ遺伝子
（DE19951975.7;DSM 13114）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、 ●ｚｗａ２遺伝子（DE: 19959327.2; DSM 13113）Ｉ．
Ｂ．Ｒ．または ●ＰＰＧＰＰシンターゼＩをコードするｒｅｌＡ遺伝子
（EC 2.7.6.5）Ｉ．Ｂ．Ｒ． の群から一つまたはそれ以上の遺伝子を選択し、同時に
転写減衰することは有利であってもよい。
ｌＫ遺伝子のアテニュエーションに加えて、 ●ホスホエノールカルボキシキナーゼをコードするｐｃ
ｋ遺伝子（DE19950409.1; DSM 13047）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、 ●グルコース６−リン酸イソメラーゼをコードするｐｇ
ｉ遺伝子（US09/96,478,DSM 12969）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、 ●ピルベートオキシダーゼをコードするｐｏｘＢ遺伝子
（DE19951975.7;DSM 13114）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、 ●ｚｗａ２遺伝子（DE: 19959327.2; DSM 13113）Ｉ．
Ｂ．Ｒ．または ●ＰＰＧＰＰシンターゼＩをコードするｒｅｌＡ遺伝子
（EC 2.7.6.5）Ｉ．Ｂ．Ｒ． の群から一つまたはそれ以上の遺伝子を選択し、同時に
転写減衰することは有利であってもよい。
【００４８】さらに、Ｌ−アミノ酸製造に関して、６−
ホスホグルコネート デヒドロゲナーゼの過剰発現に加
えて、望ましくない副反応をスイッチ オフ（Switch o
ff）する方法は有利であってもよい（Nakayama: “Bree
ding of Amino Acid Producing Micro-organisms,”in:
Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl,
Sikyta, Vanek(eds.), Academic Press, London, UK,
1982）Ｉ．Ｂ．Ｒ．。
ホスホグルコネート デヒドロゲナーゼの過剰発現に加
えて、望ましくない副反応をスイッチ オフ（Switch o
ff）する方法は有利であってもよい（Nakayama: “Bree
ding of Amino Acid Producing Micro-organisms,”in:
Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl,
Sikyta, Vanek(eds.), Academic Press, London, UK,
1982）Ｉ．Ｂ．Ｒ．。
【００４９】前記（ａ−ｄ）、特に項目（ｄ）にしたが
って、突然変異されたポリヌクレオチドを含有する微生
物は同様に本発明の目的であり、かつ、Ｌ−アミノ酸、
特にＬ−リシンを製造する目的のために、回分方法また
は半回分方法または反復回分方法（repeated fed batch
process）で、連続的にかまたは回分的に培養されても
よい。公知培養方法の概要はクミール（Chmiel）による
教科書（Bioprocess Engineering. 1. Production to B
ioprocess Techniques）（Gustav Fischer Verlag, Stu
ttgart, 1991）I.B.R.）またはストーハス（Storhas）
による教科書（Bioreactors and Peripheral Equipment
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)I.B.
R.）に記載されている。
って、突然変異されたポリヌクレオチドを含有する微生
物は同様に本発明の目的であり、かつ、Ｌ−アミノ酸、
特にＬ−リシンを製造する目的のために、回分方法また
は半回分方法または反復回分方法（repeated fed batch
process）で、連続的にかまたは回分的に培養されても
よい。公知培養方法の概要はクミール（Chmiel）による
教科書（Bioprocess Engineering. 1. Production to B
ioprocess Techniques）（Gustav Fischer Verlag, Stu
ttgart, 1991）I.B.R.）またはストーハス（Storhas）
による教科書（Bioreactors and Peripheral Equipment
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)I.B.
R.）に記載されている。
【００５０】使用されるべき培地は、適した方法で適切
な菌株の要求を満たすものでなければならない。種々の
微生物のための培地の詳細は、アメリカン ソサエティ
ーフォー バクテリオロジー（American Society for B
acteriology）（Washinton, D.C., USA, 1981）Ｉ．
Ｂ．Ｒ．の指示書“Manual of Methods for General Ba
cteriology”で見出されてもよい。糖および炭水化物、
例えばグルコース、ショ糖、ラクトース、フルクトー
ス、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油
および脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ種子油、ピーナッ
ツ油およびココナッツ油、脂肪酸、例えばパルミチン
酸、ステアリン酸およびリノレイン酸、アルコール、例
えばグリセロールおよびエタノール、ならびに有機酸、
例えば酢酸は炭素源として使用されてもよい。前記物質
は別個にかまたは混合物として使用されてもよい。化合
物、例えばペプトン、イーストエクストラクト、肉エキ
ス、麦芽エキス、コーン浸漬液、大豆粉および尿素また
は無機酸、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸
アンモニウムは窒素源として使用されてもよい。窒素源
は別個にかまたは混合物として使用することができる。
リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリ
ウムまたは相当するナトリウム含有塩はリン源として使
用されてもよい。培地は付加的に金属の塩、例えば硫酸
マグネシウム、硫酸鉄を含んでいなければならず、この
場合、これは成長に必要不可欠なものである。最終的
に、本質的な成長促進物質、例えばアミノ酸およびビタ
ミンは前記に示された物質の他に使用されてもよい。さ
らに、適した前駆物質は培地に添加されてもよい。前記
物質は、適した方法で培養中に、分配されていてもよい
一回分の形で、培養物に添加されてもよい。
な菌株の要求を満たすものでなければならない。種々の
微生物のための培地の詳細は、アメリカン ソサエティ
ーフォー バクテリオロジー（American Society for B
acteriology）（Washinton, D.C., USA, 1981）Ｉ．
Ｂ．Ｒ．の指示書“Manual of Methods for General Ba
cteriology”で見出されてもよい。糖および炭水化物、
例えばグルコース、ショ糖、ラクトース、フルクトー
ス、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油
および脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ種子油、ピーナッ
ツ油およびココナッツ油、脂肪酸、例えばパルミチン
酸、ステアリン酸およびリノレイン酸、アルコール、例
えばグリセロールおよびエタノール、ならびに有機酸、
例えば酢酸は炭素源として使用されてもよい。前記物質
は別個にかまたは混合物として使用されてもよい。化合
物、例えばペプトン、イーストエクストラクト、肉エキ
ス、麦芽エキス、コーン浸漬液、大豆粉および尿素また
は無機酸、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸
アンモニウムは窒素源として使用されてもよい。窒素源
は別個にかまたは混合物として使用することができる。
リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリ
ウムまたは相当するナトリウム含有塩はリン源として使
用されてもよい。培地は付加的に金属の塩、例えば硫酸
マグネシウム、硫酸鉄を含んでいなければならず、この
場合、これは成長に必要不可欠なものである。最終的
に、本質的な成長促進物質、例えばアミノ酸およびビタ
ミンは前記に示された物質の他に使用されてもよい。さ
らに、適した前駆物質は培地に添加されてもよい。前記
物質は、適した方法で培養中に、分配されていてもよい
一回分の形で、培養物に添加されてもよい。
【００５１】塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水、ある
いは酸性化合物、例えばリン酸または硫酸は、培養物の
ｐＨを調整するために適切に使用される。消泡剤、例え
ば脂肪酸ポリグリコールエステルは泡形成を調整するた
めに使用されてもよい。プラスミドの安定性を維持する
ために、適した選択的活性物質、例えば抗生物質は培地
に添加されてもよい。好気条件を維持するために、酸素
または酸素含有ガス混合物、例えば空気は培養物中に装
入されてもよい。培養物の温度は、通常は２０℃〜４５
℃であり、かつ好ましくは２５℃〜４０℃である。培養
物は、望ましい生成物の形成が最大になるまで続けられ
る。これは、通常は１０時間〜１６０時間の間に達成さ
れる。
水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水、ある
いは酸性化合物、例えばリン酸または硫酸は、培養物の
ｐＨを調整するために適切に使用される。消泡剤、例え
ば脂肪酸ポリグリコールエステルは泡形成を調整するた
めに使用されてもよい。プラスミドの安定性を維持する
ために、適した選択的活性物質、例えば抗生物質は培地
に添加されてもよい。好気条件を維持するために、酸素
または酸素含有ガス混合物、例えば空気は培養物中に装
入されてもよい。培養物の温度は、通常は２０℃〜４５
℃であり、かつ好ましくは２５℃〜４０℃である。培養
物は、望ましい生成物の形成が最大になるまで続けられ
る。これは、通常は１０時間〜１６０時間の間に達成さ
れる。
【００５２】Ｌ−アミノ酸を測定するための方法は従来
技術から公知である。分析はスパックマンら（Spackman
et al.）（Analytical Chemistry, 30, (1958), 119
0）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で、アニオン交換クロマトグラフィー
に引き続いてのニンヒドリン誘導によってかまたはリン
ドロースら（Lindroth et al.）（Analytical Chemistr
y (1979) 51: 1167-1174）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で記載されたよ
うに逆相ＨＰＬＣによって実施されてもよい。
技術から公知である。分析はスパックマンら（Spackman
et al.）（Analytical Chemistry, 30, (1958), 119
0）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で、アニオン交換クロマトグラフィー
に引き続いてのニンヒドリン誘導によってかまたはリン
ドロースら（Lindroth et al.）（Analytical Chemistr
y (1979) 51: 1167-1174）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で記載されたよ
うに逆相ＨＰＬＣによって実施されてもよい。
【００５３】次の微生物は、ブタペスト条約にしたがっ
て、ジャーマンコレクション オブミクロオルガニズム
ズ アンド セルカルチャー（German Collection of M
icroorganisms and Cell Cultures）（DSMZ, Braunschw
eig, Germany）に加えられた。
て、ジャーマンコレクション オブミクロオルガニズム
ズ アンド セルカルチャー（German Collection of M
icroorganisms and Cell Cultures）（DSMZ, Braunschw
eig, Germany）に加えられた。
【００５４】●ＤＳＭ１３１５８としての、エシェリキ
ア コリ（Escherichia coli）菌株ＤＨ５α/ｐΔｒｐ
ｌＫ
ア コリ（Escherichia coli）菌株ＤＨ５α/ｐΔｒｐ
ｌＫ
【００５５】
【実施例】例１ コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０２
２からのゲノミックコスミド遺伝子バンクの製造 染色体ＤＮＡをコリネバクテリウム グルタミクム Ａ
ＴＣＣ１３０３２から、タウチら（tauch et al.）（19
95、プラスミド33：168-179）に記載されたように単離
し、かつ部分的に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pha
rmacia, Freiburg, Germany, 製品名Sau3AI, コード番
号27-0913-02）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で切断した。ＤＮＡフラグ
メントをエビアルカリホスファターゼ（Roche Molecula
r Biochemicals, Mannheim, Germany, 製品名ＳＡＰ,
コード番号１７５８２５０）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で脱リン酸化
した。ストラタジーン社（Stratagene Company）（La J
olla, USA, 製品名SuperCos1 コスミドベクターキット,
コード番号２５１３０１）Ｉ．Ｂ．Ｒ．から購入した
コスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ１（Wahl et al. (1
987) I.B.R.）のＤＮＡを、制限酵素ＸｂａＩ（Amersha
m Pharmacia, Freiburg, Germany, 製品名ＸｂａＩ、コ
ード番号27-0948-02）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で切断し、かつ同様
にエビアルカリフォスファターゼで脱リン酸化した。そ
の後に、コスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersh
am Pharmacia, Freiburg, Germany,製品名BamHI, コー
ド番号27-0868-04）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で切断した。この方法
で処理したコスミドＤＮＡを、処理したＡＴＣＣ１３０
３２ＤＮＡと混合させ、かつ回分をＴ４−ＤＮＡリガー
ゼ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, 製品名
Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼ、コード番号27-0870-04）Ｉ．
Ｂ．Ｒ．で処理した。その後に、リガーゼ混合物を、ギ
ガパックＩＩ ＸＬパッキングエクストラクト（Strata
gene, La Jolla, USA, 製品名Gigapack II XL Packing
Extracts, コード番号２００２１７）Ｉ．Ｂ．Ｒ．を用
いてパッケージングした。Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株ＮＭ５５４
（Raleigh et al., 1988, Nucleic acid Research 16:
1563-1575）Ｉ．Ｂ．Ｒ．を感染させるために、細胞を
１０ｍＭ ＭｇＳＯ４中に入れ、かつファージ懸濁液の
アリコート部分と混合させた。コスミドバンクの感染お
よびタイトレーション（titration）はサンブルックら
（Sambrook et al.）で記載されたように（1989, Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Har
bor）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを
含むＬＢアガー（Lennox, 1955, Virology, 1:190）
Ｉ．Ｂ．Ｒ．上にプレートされている細胞を用いて実施
した。３７℃で一晩に亘るインキュベーションの後に、
単一組み換えクローンを選択した。
２からのゲノミックコスミド遺伝子バンクの製造 染色体ＤＮＡをコリネバクテリウム グルタミクム Ａ
ＴＣＣ１３０３２から、タウチら（tauch et al.）（19
95、プラスミド33：168-179）に記載されたように単離
し、かつ部分的に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pha
rmacia, Freiburg, Germany, 製品名Sau3AI, コード番
号27-0913-02）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で切断した。ＤＮＡフラグ
メントをエビアルカリホスファターゼ（Roche Molecula
r Biochemicals, Mannheim, Germany, 製品名ＳＡＰ,
コード番号１７５８２５０）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で脱リン酸化
した。ストラタジーン社（Stratagene Company）（La J
olla, USA, 製品名SuperCos1 コスミドベクターキット,
コード番号２５１３０１）Ｉ．Ｂ．Ｒ．から購入した
コスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ１（Wahl et al. (1
987) I.B.R.）のＤＮＡを、制限酵素ＸｂａＩ（Amersha
m Pharmacia, Freiburg, Germany, 製品名ＸｂａＩ、コ
ード番号27-0948-02）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で切断し、かつ同様
にエビアルカリフォスファターゼで脱リン酸化した。そ
の後に、コスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersh
am Pharmacia, Freiburg, Germany,製品名BamHI, コー
ド番号27-0868-04）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で切断した。この方法
で処理したコスミドＤＮＡを、処理したＡＴＣＣ１３０
３２ＤＮＡと混合させ、かつ回分をＴ４−ＤＮＡリガー
ゼ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, 製品名
Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼ、コード番号27-0870-04）Ｉ．
Ｂ．Ｒ．で処理した。その後に、リガーゼ混合物を、ギ
ガパックＩＩ ＸＬパッキングエクストラクト（Strata
gene, La Jolla, USA, 製品名Gigapack II XL Packing
Extracts, コード番号２００２１７）Ｉ．Ｂ．Ｒ．を用
いてパッケージングした。Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株ＮＭ５５４
（Raleigh et al., 1988, Nucleic acid Research 16:
1563-1575）Ｉ．Ｂ．Ｒ．を感染させるために、細胞を
１０ｍＭ ＭｇＳＯ４中に入れ、かつファージ懸濁液の
アリコート部分と混合させた。コスミドバンクの感染お
よびタイトレーション（titration）はサンブルックら
（Sambrook et al.）で記載されたように（1989, Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Har
bor）Ｉ．Ｂ．Ｒ．、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを
含むＬＢアガー（Lennox, 1955, Virology, 1:190）
Ｉ．Ｂ．Ｒ．上にプレートされている細胞を用いて実施
した。３７℃で一晩に亘るインキュベーションの後に、
単一組み換えクローンを選択した。
【００５６】例２ ｒｐｌＫ遺伝子の単離およびシークエンシング 単一コロニーのコスミドＤＮＡをキアプレップ スピン
ミニプレップ キット（Quiprep Spin Miniprep Ki
t）（製品番号２７１０６、Quagen, Hileden, German
y）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で、製品使用説明書にしたがって単離
し、かつ部分的に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amershaｍ, P
harmacia, Freiburg, Germany,製品名Ｓａｕ３ＡＩ，製
品番号２７−０９１３−０２）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で切断し
た。ＤＮＡフラグメントをエビアルカリホスファターゼ
（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany,
製品番号ＳＡＰ、製品番号１７５８２５０）Ｉ．Ｂ．
Ｒ．で脱リン酸化した。ゲル電気泳動分離の後に、１５
００〜２０００ｂｐの範囲の大きさのコスミドフラグメ
ントをＱｉａＥｘＩＩゲル抽出キット（QiaExII extrac
tion kit）（製品番号20021、Qiagen, Hilden, German
y）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で単離した。インビトロジェン社（Inv
itrogen Coｍpany）からのシークエンシングベクターｐ
Ｚｅｒｏ−１のＤＮＡ（Groningen, netherland, 製品
名Zero Background Cloning Kit, 製品番号Ｋ2500-01）
Ｉ．Ｂ．Ｒ．を制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmac
ia, Freiburg, Germany, 製品名ＢａｍＨＩ、製品番号2
7-0868-04）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で切断した。シークエンシン
グベクターｐＺｅｒｏ−１中のコスミドフラグメントの
ライゲーションをサンブルックら（Sambrook et al.）
によって記載されたように（1989, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor）Ｉ．Ｂ．
Ｒ．、Ｔ４リガーゼ（Pharmacia, Biotech, Freiburg,
Germany）で一晩に亘ってインキュベーションされたＤ
ＮＡ混合物を用いて実施した。その後に、このライゲー
ション混合物をＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Gran
t, 1990, Proceedings of National Academy of Scienc
es U.S.A., 87: 4645-4649）Ｉ．Ｂ．Ｒ．中にエレクト
ロポレーションし（Tauch et al., 1994, FEMS Microbi
ol Letters, 123: 343-7）、かつ５０ｍｇ／Ｌゼオシン
を含有するＬＢアガー（Lennox, 1955, Virology, 1:19
0）上にプレートした。組み換えクローンのプラスミド
製造を、バイオロボット９６００（Biorobot 9600）
（製品番号９００２００、Qiagen, Hilden, Germany）
Ｉ．Ｂ．Ｒ．を用いて実施した。シークエンシングは、
ツイマールマンら（Zimmermann et al.）（1990, Nucle
icAcids Research, 18: 1067）Ｉ．Ｂ．Ｒ．によって改
変されたサンガーら（Sanger et al.）によるジデオキ
シ連鎖停止法（1977, Proceedings of National Academ
ies of Sciences U.S.A., 74: 5463-5467）Ｉ．Ｂ．
Ｒ．で続けた。ＰＥアプライド バイオシステムズ（PE
Applied Biosystems）の“ＲＲｄローダミンターミネ
ーター サイクル シークイエンシング キット（RR d
Rhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit）”（製品
番号４０３０４４、Weiterstadt, Germany）Ｉ．Ｂ．
Ｒ．を使用した。ゲル電気泳動分離およびシークエンシ
ング反応の分析は、ロチホレースＮＦアクリルミド／ビ
スアクリルアミドゲル（Rotiphorese NF acrylamide/bi
sacrylamide gel）（２９：１）（製品番号Ａ１２４．
１、Roth, Karlsruhe, Germany）Ｉ．Ｂ．Ｒ．中で、Ｐ
Ｅアプライドバイオシステムズ（Weiterstsdt, German
y）のＡＢＩプリズム３７７シークエンシング装置（ABI
Prism 377 sequencing device）を用いて行った。
ミニプレップ キット（Quiprep Spin Miniprep Ki
t）（製品番号２７１０６、Quagen, Hileden, German
y）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で、製品使用説明書にしたがって単離
し、かつ部分的に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amershaｍ, P
harmacia, Freiburg, Germany,製品名Ｓａｕ３ＡＩ，製
品番号２７−０９１３−０２）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で切断し
た。ＤＮＡフラグメントをエビアルカリホスファターゼ
（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany,
製品番号ＳＡＰ、製品番号１７５８２５０）Ｉ．Ｂ．
Ｒ．で脱リン酸化した。ゲル電気泳動分離の後に、１５
００〜２０００ｂｐの範囲の大きさのコスミドフラグメ
ントをＱｉａＥｘＩＩゲル抽出キット（QiaExII extrac
tion kit）（製品番号20021、Qiagen, Hilden, German
y）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で単離した。インビトロジェン社（Inv
itrogen Coｍpany）からのシークエンシングベクターｐ
Ｚｅｒｏ−１のＤＮＡ（Groningen, netherland, 製品
名Zero Background Cloning Kit, 製品番号Ｋ2500-01）
Ｉ．Ｂ．Ｒ．を制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmac
ia, Freiburg, Germany, 製品名ＢａｍＨＩ、製品番号2
7-0868-04）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で切断した。シークエンシン
グベクターｐＺｅｒｏ−１中のコスミドフラグメントの
ライゲーションをサンブルックら（Sambrook et al.）
によって記載されたように（1989, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor）Ｉ．Ｂ．
Ｒ．、Ｔ４リガーゼ（Pharmacia, Biotech, Freiburg,
Germany）で一晩に亘ってインキュベーションされたＤ
ＮＡ混合物を用いて実施した。その後に、このライゲー
ション混合物をＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Gran
t, 1990, Proceedings of National Academy of Scienc
es U.S.A., 87: 4645-4649）Ｉ．Ｂ．Ｒ．中にエレクト
ロポレーションし（Tauch et al., 1994, FEMS Microbi
ol Letters, 123: 343-7）、かつ５０ｍｇ／Ｌゼオシン
を含有するＬＢアガー（Lennox, 1955, Virology, 1:19
0）上にプレートした。組み換えクローンのプラスミド
製造を、バイオロボット９６００（Biorobot 9600）
（製品番号９００２００、Qiagen, Hilden, Germany）
Ｉ．Ｂ．Ｒ．を用いて実施した。シークエンシングは、
ツイマールマンら（Zimmermann et al.）（1990, Nucle
icAcids Research, 18: 1067）Ｉ．Ｂ．Ｒ．によって改
変されたサンガーら（Sanger et al.）によるジデオキ
シ連鎖停止法（1977, Proceedings of National Academ
ies of Sciences U.S.A., 74: 5463-5467）Ｉ．Ｂ．
Ｒ．で続けた。ＰＥアプライド バイオシステムズ（PE
Applied Biosystems）の“ＲＲｄローダミンターミネ
ーター サイクル シークイエンシング キット（RR d
Rhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit）”（製品
番号４０３０４４、Weiterstadt, Germany）Ｉ．Ｂ．
Ｒ．を使用した。ゲル電気泳動分離およびシークエンシ
ング反応の分析は、ロチホレースＮＦアクリルミド／ビ
スアクリルアミドゲル（Rotiphorese NF acrylamide/bi
sacrylamide gel）（２９：１）（製品番号Ａ１２４．
１、Roth, Karlsruhe, Germany）Ｉ．Ｂ．Ｒ．中で、Ｐ
Ｅアプライドバイオシステムズ（Weiterstsdt, German
y）のＡＢＩプリズム３７７シークエンシング装置（ABI
Prism 377 sequencing device）を用いて行った。
【００５７】得られた粗シークエンシングデータをその
後にスターデン プログラム パッケージ（Staden pro
gram package）（1986、Nucleic Acids Research, 14:2
17-231）Ｉ．Ｂ．Ｒ．バージョン９７−０を用いて続け
た。ｐＺｅｒｏ１誘導体の単一配列を連接するコンティ
グと結合した。コンピューターによるコーディング領域
の分析は、プログラムＸＮＩＰ（Staden, 1986, Nuclei
c Acids Research, 14: 217-231）Ｉ．Ｂ．Ｒ．を用い
て行われた。さらなる分析は、ＢＬＡＳＴ検索プログラ
ム（BLAST search programs）（Altschul et al., 199
7, Nucleic acids Research, 25:3389-3402）Ｉ．Ｂ．
Ｒ．を用いて、ナショナルセンター フォー バイオテ
クノロジー インフォメーション（National Center fo
r Biotechnplogy Information）（NCBI, Betheda, MD,
USA）Ｉ．Ｂ．Ｒ．の２０００年、５月５日の時点で完
全なものである、非冗長データバンクに対して実施され
た（ウェブサイト上の、その日時でシークエンス分析の
ために利用可能なすべての分析ツールを含む）。
後にスターデン プログラム パッケージ（Staden pro
gram package）（1986、Nucleic Acids Research, 14:2
17-231）Ｉ．Ｂ．Ｒ．バージョン９７−０を用いて続け
た。ｐＺｅｒｏ１誘導体の単一配列を連接するコンティ
グと結合した。コンピューターによるコーディング領域
の分析は、プログラムＸＮＩＰ（Staden, 1986, Nuclei
c Acids Research, 14: 217-231）Ｉ．Ｂ．Ｒ．を用い
て行われた。さらなる分析は、ＢＬＡＳＴ検索プログラ
ム（BLAST search programs）（Altschul et al., 199
7, Nucleic acids Research, 25:3389-3402）Ｉ．Ｂ．
Ｒ．を用いて、ナショナルセンター フォー バイオテ
クノロジー インフォメーション（National Center fo
r Biotechnplogy Information）（NCBI, Betheda, MD,
USA）Ｉ．Ｂ．Ｒ．の２０００年、５月５日の時点で完
全なものである、非冗長データバンクに対して実施され
た（ウェブサイト上の、その日時でシークエンス分析の
ために利用可能なすべての分析ツールを含む）。
【００５８】得られたヌクレオチド配列は、配列番号１
に記載されている。ヌクレオチド配列の分析は、４３８
ｂｐの転写解読枠を示し、この場合、これは、ｒｐｌＫ
遺伝子を特徴づけた。ｒｐｌＫ遺伝子は１４５アミノ酸
のポリペプチドをコードし、この場合、これは配列番号
２に記載されている。
に記載されている。ヌクレオチド配列の分析は、４３８
ｂｐの転写解読枠を示し、この場合、これは、ｒｐｌＫ
遺伝子を特徴づけた。ｒｐｌＫ遺伝子は１４５アミノ酸
のポリペプチドをコードし、この場合、これは配列番号
２に記載されている。
【００５９】例３ ｒｐｌＫ遺伝子の一つのコピーを含むベクターの製造 Ｃ．グルタミクムからのｒｐｌＫ遺伝子を含む１２００
ｂｐの染色体ＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲによってク
ローン化された。
ｂｐの染色体ＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲによってク
ローン化された。
【００６０】このために、染色体ＤＮＡを、コリネバク
テリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２から、タウ
チら（Tauch et al.）で記載されように（1955、プラス
ミド33: 168-179）Ｉ．Ｂ．Ｒ．単離した。ｒｐｌＫ遺
伝子を含む１２００ｂｐのＤＮＡフラグメントをポリメ
ラーゼ連鎖反応によって増幅した。さらに、次のプライ
マーを配列番号１に基づいて誘導した。
テリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２から、タウ
チら（Tauch et al.）で記載されように（1955、プラス
ミド33: 168-179）Ｉ．Ｂ．Ｒ．単離した。ｒｐｌＫ遺
伝子を含む１２００ｂｐのＤＮＡフラグメントをポリメ
ラーゼ連鎖反応によって増幅した。さらに、次のプライ
マーを配列番号１に基づいて誘導した。
【００６１】
【外１】
【００６２】記載されたオリゴヌクレオチドをＡＲＫサ
イエンテフィック社（ARK Scientific Company）（ARK
Scientific GmbH Biosystems, Darmstadt, Germany）に
よって合成させ、かつＰＣＲ反応をＰｆｕ−ＤＮＡポリ
メラーゼ（Stratagene, La Jolla, USA）およびＰＴＣ
１００サーモサイクラー（PTC 100 thermocycler）（MJ
Research Inc., Waltham, USA）を用いて実施した。
イエンテフィック社（ARK Scientific Company）（ARK
Scientific GmbH Biosystems, Darmstadt, Germany）に
よって合成させ、かつＰＣＲ反応をＰｆｕ−ＤＮＡポリ
メラーゼ（Stratagene, La Jolla, USA）およびＰＴＣ
１００サーモサイクラー（PTC 100 thermocycler）（MJ
Research Inc., Waltham, USA）を用いて実施した。
【００６３】熱変性（９４℃、９０秒）、アニーリング
（５８℃、９０秒）およびポリメラーゼ反応（７２℃、
９０秒）から成るサイクルをＰＣＲ中で３５回に亘って
実施した。得られた１２００ｂｐのＤＮＡフラグメント
をその後にキアジェン ＰＣＲ 精製スピンキット（Qi
agen Hilden, Germany）を用いて精製した。
（５８℃、９０秒）およびポリメラーゼ反応（７２℃、
９０秒）から成るサイクルをＰＣＲ中で３５回に亘って
実施した。得られた１２００ｂｐのＤＮＡフラグメント
をその後にキアジェン ＰＣＲ 精製スピンキット（Qi
agen Hilden, Germany）を用いて精製した。
【００６４】Ｃ．グルタミクム中で複製されてもよいプ
ラスミドに関して、ｒｐｌＫ遺伝子を含有するＤＮＡ増
幅物のクローニングのために、タウチら（FEMS Microbi
ological Letters, 123, 343-437 (1994) I.B.R.）で記
載されたプラスミドｐＥＣＭ３、すなわち、プラスミド
ｐＥＣＭ２の欠失誘導体を調製した。このために、プラ
スミドｐＥＣＭ２を制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersham-Pha
rmacia, Freiburg, Germany）およびＢｇＩＩＩ（Amers
ham-Pharmacia, Freiburg, Germany）で切断し、かつＴ
４リガーゼ（Amersham-Pharmacia, Freiburg, German
y）で、サンブルックら（Molecular Cloning: A Labora
tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)
I.B.R.）で記載されたように処理し、このようにしてプ
ラスミドｐＥＣＭ３を製造した。グラントら（Grant et
al.）（Proceedings of National Academy of Science
USA, 87, 4645-4649 (1990) I.B.R.）で記載された、
プラスミドｐＥＣＭ３を用いてのＥ．ＣｏｌｉＤＨ５α
ＭＣＲ菌株の形質転換は、タウチらＩ．Ｂ．Ｒ．（FEMS
Microbiological Letters, 123, 343-347 (1994)I.B.
R.）で記載されたようにして行われた。形質転換体は、
クロラムフェニコール（Merck, Darmstadt, Germany）
（５０ｍｇ／Ｌ）を含む、ＬＢＧアガー（１Ｌ当たり、
トリプトン１０ｇ、イーストエクストラクト５ｇ、Ｎａ
ｃｌ５ｇ、グルコース２ｇ、アガー１５ｇ）上で選択し
た。
ラスミドに関して、ｒｐｌＫ遺伝子を含有するＤＮＡ増
幅物のクローニングのために、タウチら（FEMS Microbi
ological Letters, 123, 343-437 (1994) I.B.R.）で記
載されたプラスミドｐＥＣＭ３、すなわち、プラスミド
ｐＥＣＭ２の欠失誘導体を調製した。このために、プラ
スミドｐＥＣＭ２を制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersham-Pha
rmacia, Freiburg, Germany）およびＢｇＩＩＩ（Amers
ham-Pharmacia, Freiburg, Germany）で切断し、かつＴ
４リガーゼ（Amersham-Pharmacia, Freiburg, German
y）で、サンブルックら（Molecular Cloning: A Labora
tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)
I.B.R.）で記載されたように処理し、このようにしてプ
ラスミドｐＥＣＭ３を製造した。グラントら（Grant et
al.）（Proceedings of National Academy of Science
USA, 87, 4645-4649 (1990) I.B.R.）で記載された、
プラスミドｐＥＣＭ３を用いてのＥ．ＣｏｌｉＤＨ５α
ＭＣＲ菌株の形質転換は、タウチらＩ．Ｂ．Ｒ．（FEMS
Microbiological Letters, 123, 343-347 (1994)I.B.
R.）で記載されたようにして行われた。形質転換体は、
クロラムフェニコール（Merck, Darmstadt, Germany）
（５０ｍｇ／Ｌ）を含む、ＬＢＧアガー（１Ｌ当たり、
トリプトン１０ｇ、イーストエクストラクト５ｇ、Ｎａ
ｃｌ５ｇ、グルコース２ｇ、アガー１５ｇ）上で選択し
た。
【００６５】その後に、ｒｐｌＫ遺伝子を含有する１２
００ｂｐのＤＮＡ増幅物をプラスミドｐＥＣＭ３と混合
させ、この場合、このプラスミドは予め制限酵素Ｓｍａ
Ｉ（Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany）を用い
て線状化されており、かつＴ４DNAリガーゼ（Amersham-
Pharmacia, Freiburg, Germany）で処理され、プラスミ
ドｐｒｐｌＫを製造した。プラスミドｐｒｐｌＫを用い
てのＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲの形質転換は、タ
ウチら（FEMS Microbiological Letters, 123,343-347
(1994) I.B.R.）で記載されたように行われ、かつ形質
転換体は、クロラムフェニコール (Merck, Darmstadt,
Germany)（５０ｍｇ／Ｌ）が添加されているＬＢＧアガ
ー上で選択した。したがって、プラスミドｐｒｐｌＫは
Ｃ．グルタミクムの完全なｒｐｌＫ遺伝子を有し、かつ
Ｅ．ＣｏｌｉおよびＣ．グルタミクム中で、自律的に複
製することができる。
００ｂｐのＤＮＡ増幅物をプラスミドｐＥＣＭ３と混合
させ、この場合、このプラスミドは予め制限酵素Ｓｍａ
Ｉ（Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany）を用い
て線状化されており、かつＴ４DNAリガーゼ（Amersham-
Pharmacia, Freiburg, Germany）で処理され、プラスミ
ドｐｒｐｌＫを製造した。プラスミドｐｒｐｌＫを用い
てのＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲの形質転換は、タ
ウチら（FEMS Microbiological Letters, 123,343-347
(1994) I.B.R.）で記載されたように行われ、かつ形質
転換体は、クロラムフェニコール (Merck, Darmstadt,
Germany)（５０ｍｇ／Ｌ）が添加されているＬＢＧアガ
ー上で選択した。したがって、プラスミドｐｒｐｌＫは
Ｃ．グルタミクムの完全なｒｐｌＫ遺伝子を有し、かつ
Ｅ．ＣｏｌｉおよびＣ．グルタミクム中で、自律的に複
製することができる。
【００６６】例４ ｒｐｌＫ遺伝子への欠失体の挿入 １２ｂｐの長さの欠失を有し、かつΔｒｐｌＫとして示
されるｒｐｌＫ遺伝子の対立遺伝子を、ＰＣＲによって
製造した。得られるｒｐｌＫ遺伝子中の１２ｂｐの欠失
体は、Ｃ．グルタミクムのＬ１１タンパク質のＮ−末端
領域で、テトラポリペプチド、プロリン−アラニン−ロ
イシン−グリシンの損失を導く。
されるｒｐｌＫ遺伝子の対立遺伝子を、ＰＣＲによって
製造した。得られるｒｐｌＫ遺伝子中の１２ｂｐの欠失
体は、Ｃ．グルタミクムのＬ１１タンパク質のＮ−末端
領域で、テトラポリペプチド、プロリン−アラニン−ロ
イシン−グリシンの損失を導く。
【００６７】ｒｐｌＫ欠失対立遺伝子を製造するプライ
マーとして、ＡＲＫサイエンティフィック（ARK Scient
ific GmbH Biosystems, Darmstadt, Germany）によって
製造された次のオリゴヌクレオチドを、例３で記載され
たプライマーＰ１ｕｐおよびＰ２ｄｏｗｎの他に使用し
た。
マーとして、ＡＲＫサイエンティフィック（ARK Scient
ific GmbH Biosystems, Darmstadt, Germany）によって
製造された次のオリゴヌクレオチドを、例３で記載され
たプライマーＰ１ｕｐおよびＰ２ｄｏｗｎの他に使用し
た。
【００６８】
【外２】
【００６９】ＰＣＲのために使用されるプライマーは、
公知のＤＮＡ配列から誘導された。これはそれぞれ１０
ｂｐの５’伸長（extension）を有し、この場合、これ
は正確に５’側のプライマーＰ１ｕｐおよびＰ２ｄｏｗ
ｎに相補的である。染色体ＤＮＡをＣ．グルタミクムＡ
ＴＣＣ１３０３２から抽出し、かつ２個の６００ｂｐの
ＤＮＡフラグメントを最初に、基質としてこれを含有す
る別個のＰＣＲ反応物中で、オリゴヌクレオチドＰ１ｕ
ｐ、Ｐ１ｄｏｗｎ、Ｐ２ｕｐおよびＰ２ｄｏｗｎ、Ｐｆ
ｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, USA）
およびＰＴＣ１００サーモサイクラー（MJ Research In
c., Waltham, USA）を用いて製造する。熱変性（９４
℃、９０秒）、アニーリング（５８℃、９０秒）および
ポリメラーゼ反応（７２℃、９０秒）から成るサイクル
を、前記ＰＣＲ反応物それぞれにおいて３５回に亘って
実施した。
公知のＤＮＡ配列から誘導された。これはそれぞれ１０
ｂｐの５’伸長（extension）を有し、この場合、これ
は正確に５’側のプライマーＰ１ｕｐおよびＰ２ｄｏｗ
ｎに相補的である。染色体ＤＮＡをＣ．グルタミクムＡ
ＴＣＣ１３０３２から抽出し、かつ２個の６００ｂｐの
ＤＮＡフラグメントを最初に、基質としてこれを含有す
る別個のＰＣＲ反応物中で、オリゴヌクレオチドＰ１ｕ
ｐ、Ｐ１ｄｏｗｎ、Ｐ２ｕｐおよびＰ２ｄｏｗｎ、Ｐｆ
ｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, USA）
およびＰＴＣ１００サーモサイクラー（MJ Research In
c., Waltham, USA）を用いて製造する。熱変性（９４
℃、９０秒）、アニーリング（５８℃、９０秒）および
ポリメラーゼ反応（７２℃、９０秒）から成るサイクル
を、前記ＰＣＲ反応物それぞれにおいて３５回に亘って
実施した。
【００７０】ｒｐｌＫ部分１として示された、最初の６
００ｂｐＤＮＡ増幅物を、オリゴヌクレオチドＰ１ｕｐ
およびＰ１ｄｏｗｎを用いて得た。これは、ｒｐｌＫ遺
伝子の５’領域（ヌクレオチド１ー８７）および付加的
にオリゴヌクレオチドＰ１ｄｏｗｎから誘導された１０
ｂｐの伸長を含み、この場合、これは、ｒｐｌＫ遺伝子
（配列番号１）のヌクレオチド１００〜１０９に相当す
る。したがって、この増幅されたｒｐｌＫ遺伝子領域
は、使用された染色体ＤＮＡテンプレートと比較して１
２ｂｐのギャップを有する。もう一つの６００ｂｐＤＮ
Ａフラグメント、ｒｐｌＫ部分２は、オリゴヌクレオチ
ドＰ２ｄｏｗｎおよびＰ２ｕｐを用いて得られ、かつｒ
ｐｌＫ遺伝子の３’領域（ヌクレオチド７８〜４３５）
を含み、かつ増幅されたｒｐｌＫ遺伝子領域の範囲内で
同一のギャップ（ヌクレオチド８８〜９９）を有する。
したがって、前記２個の６００ｂｐのＤＮＡ増幅物は、
２０ｂｐのオーバーラップＤＮＡ領域を有する。２個の
６００ｂｐのＰＣＲ生成物、ｒｐｌＫ部分１およびｒｐ
ｌＫ部分２は、ここでＤＮＡテンプレートとして一緒に
付加的なＰＣＲ反応中で使用し、その際、ｒｐｌＫ部分
１のリーディング鎖はｒｐｌＫ部分２のラギング鎖と結
合していてもよく、それというのも、オーバーラップＤ
ＮＡ領域であるからである。このオーバーラップＤＮＡ
領域の伸長またはオリゴヌクレオチドＰ１ｕｐおよびＰ
２ｄｏｗｎのオリゴヌクレオチドの添加は、１２００ｂ
ｐのＰＣＲ増幅物の形成を導き、この場合、これはＣ．
グルタミクムｒｐｌＫ遺伝子の１２ｂｐの欠失誘導体を
含む。熱変性（９４℃、９０秒）、アニーリング（５８
℃、９０秒）およびポリメラーゼ反応（７２℃、９０
秒）を前記ＰＣＲ反応物のそれぞれの場合において３５
回に亘って実施した。
００ｂｐＤＮＡ増幅物を、オリゴヌクレオチドＰ１ｕｐ
およびＰ１ｄｏｗｎを用いて得た。これは、ｒｐｌＫ遺
伝子の５’領域（ヌクレオチド１ー８７）および付加的
にオリゴヌクレオチドＰ１ｄｏｗｎから誘導された１０
ｂｐの伸長を含み、この場合、これは、ｒｐｌＫ遺伝子
（配列番号１）のヌクレオチド１００〜１０９に相当す
る。したがって、この増幅されたｒｐｌＫ遺伝子領域
は、使用された染色体ＤＮＡテンプレートと比較して１
２ｂｐのギャップを有する。もう一つの６００ｂｐＤＮ
Ａフラグメント、ｒｐｌＫ部分２は、オリゴヌクレオチ
ドＰ２ｄｏｗｎおよびＰ２ｕｐを用いて得られ、かつｒ
ｐｌＫ遺伝子の３’領域（ヌクレオチド７８〜４３５）
を含み、かつ増幅されたｒｐｌＫ遺伝子領域の範囲内で
同一のギャップ（ヌクレオチド８８〜９９）を有する。
したがって、前記２個の６００ｂｐのＤＮＡ増幅物は、
２０ｂｐのオーバーラップＤＮＡ領域を有する。２個の
６００ｂｐのＰＣＲ生成物、ｒｐｌＫ部分１およびｒｐ
ｌＫ部分２は、ここでＤＮＡテンプレートとして一緒に
付加的なＰＣＲ反応中で使用し、その際、ｒｐｌＫ部分
１のリーディング鎖はｒｐｌＫ部分２のラギング鎖と結
合していてもよく、それというのも、オーバーラップＤ
ＮＡ領域であるからである。このオーバーラップＤＮＡ
領域の伸長またはオリゴヌクレオチドＰ１ｕｐおよびＰ
２ｄｏｗｎのオリゴヌクレオチドの添加は、１２００ｂ
ｐのＰＣＲ増幅物の形成を導き、この場合、これはＣ．
グルタミクムｒｐｌＫ遺伝子の１２ｂｐの欠失誘導体を
含む。熱変性（９４℃、９０秒）、アニーリング（５８
℃、９０秒）およびポリメラーゼ反応（７２℃、９０
秒）を前記ＰＣＲ反応物のそれぞれの場合において３５
回に亘って実施した。
【００７１】ΔｒｐｌＫ対立遺伝子のヌクレオチド配列
は、配列番号３として記載されており、かつこの対立遺
伝子によってコードされるＬ１１タンパク質の変型は、
配列番号４で記載されている。このＬ１１タンパク質の
変型は、配列番号２に記載のＬ１１タンパク質からの野
生型のアミノ酸第３０〜３３番目に相当するテトラペプ
チド、プロリン−アラニン−ロイシン−グリシンを欠い
ている。
は、配列番号３として記載されており、かつこの対立遺
伝子によってコードされるＬ１１タンパク質の変型は、
配列番号４で記載されている。このＬ１１タンパク質の
変型は、配列番号２に記載のＬ１１タンパク質からの野
生型のアミノ酸第３０〜３３番目に相当するテトラペプ
チド、プロリン−アラニン−ロイシン−グリシンを欠い
ている。
【００７２】例５ 染色体中へのΔｒｐｌＫ対立遺伝子の挿入 ｒｐｌＫ遺伝子中で１２ｂｐの欠失を有するΔｒｐｌＫ
対立遺伝子を、シェーファーら（Shaefer et al.）,Ｇ
ｅｎｅ、１４、第６９頁〜７３頁（１９９４）Ｉ．Ｂ．
Ｒ．で記載されたｓａｃＢ系によって組み込み突然変異
によって、Ｃ．グルタミクム染色体中に挿入した。この
系は、当業者が、相同組み換えによって達成される対立
遺伝子交換を同定または選択するのを可能にする。
対立遺伝子を、シェーファーら（Shaefer et al.）,Ｇ
ｅｎｅ、１４、第６９頁〜７３頁（１９９４）Ｉ．Ｂ．
Ｒ．で記載されたｓａｃＢ系によって組み込み突然変異
によって、Ｃ．グルタミクム染色体中に挿入した。この
系は、当業者が、相同組み換えによって達成される対立
遺伝子交換を同定または選択するのを可能にする。
【００７３】１．交換ベクターｐΔｒｐｌＫの構築 例４で得られた、１２００ｂｐのｒｐｌＫ欠失対立遺伝
子ΔｒｐｌＫを、キアジェン精製スピンキット（Qiage
n, Hilden, Germany）によって精製し、かつシェーファ
ーら（Shaefer et al.）、Ｇｅｎｅ、１４、第６９頁〜
７３頁（１９９４）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で記載された可動性ク
ローニングベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢを用いての
ライゲーションに使用した。このベクターは制限酵素Ｓ
ｍａＩ（Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany）で
予め線状化され、ｒｐｌＫ欠失対立遺伝子と混合させ、
かつＴ４リガーゼで処理した（Amersham-Pharmacia, Fr
eiburg, Germany）。
子ΔｒｐｌＫを、キアジェン精製スピンキット（Qiage
n, Hilden, Germany）によって精製し、かつシェーファ
ーら（Shaefer et al.）、Ｇｅｎｅ、１４、第６９頁〜
７３頁（１９９４）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で記載された可動性ク
ローニングベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢを用いての
ライゲーションに使用した。このベクターは制限酵素Ｓ
ｍａＩ（Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany）で
予め線状化され、ｒｐｌＫ欠失対立遺伝子と混合させ、
かつＴ４リガーゼで処理した（Amersham-Pharmacia, Fr
eiburg, Germany）。
【００７４】結果はプラスミドｐΔｒｐｌＫであった。
【００７５】プラスミドｐΔｒｐｌＫを含有するＥ．Ｃ
ｏｌｉ菌株ＤＨ５αの形質転換を、タウチら、ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ、
１２３、第３４３頁〜第３４７頁（１９９４）Ｉ．Ｂ．
Ｒ．で記載されたように実施した。形質転換体をカナマ
イシン（Merck, Darmstadt, Germany）（５０ｍｇ／
Ｌ）が添加されているＬＢＧアガー上で選択した。菌株
ＤＨ５α／ｐΔｒｐｌＫ菌株をこの方法で得た。
ｏｌｉ菌株ＤＨ５αの形質転換を、タウチら、ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ、
１２３、第３４３頁〜第３４７頁（１９９４）Ｉ．Ｂ．
Ｒ．で記載されたように実施した。形質転換体をカナマ
イシン（Merck, Darmstadt, Germany）（５０ｍｇ／
Ｌ）が添加されているＬＢＧアガー上で選択した。菌株
ＤＨ５α／ｐΔｒｐｌＫ菌株をこの方法で得た。
【００７６】クローンを選択し、かつＡＴＣＣ１３０３
２ΔｒｐｌＫとして特徴付けた。
２ΔｒｐｌＫとして特徴付けた。
【００７７】２．対立遺伝子交換の伝導（conduct） Ｃ．グルタミクムのｒｐｌＫ遺伝子中の１２ｂｐの染色
体性欠失体を、シェーファーら（Shaefer et al.）、Ｇ
ｅｎｅ、１４、第６９頁〜第７３頁（１９９４）Ｉ．
Ｂ．Ｒ．で記載した、ｓａｃＢ系を用いての組み込み突
然変異によって得た。この系は、当業者が、相同組み換
えによって実施される対立遺伝子交換を同定または選択
するのを可能にする。
体性欠失体を、シェーファーら（Shaefer et al.）、Ｇ
ｅｎｅ、１４、第６９頁〜第７３頁（１９９４）Ｉ．
Ｂ．Ｒ．で記載した、ｓａｃＢ系を用いての組み込み突
然変異によって得た。この系は、当業者が、相同組み換
えによって実施される対立遺伝子交換を同定または選択
するのを可能にする。
【００７８】引き続いて、可動性プラスミドｐΔｒｐｌ
Ｋを、シモンら（Simon et al.）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、１、第７８４頁〜第７９４頁（１９９３
年）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で記載されたＥ．Ｃｏｌｉ供与菌株Ｓ
１７−１から得られた、宿主としてのＣ．グルタミクム
ＡＴＣＣ１３０３２に、シエ-ファーら、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７２、第１６
６３頁〜第１６６６頁（１９９０年）によって記載され
た接合方法を用いて挿入した。それというのは、プラス
ミドｐΔｒｐｌＫがＣ．グルタミクム中で複製できない
ために、プラスミドをコードするｒｐｌＫ欠失フラグメ
ントおよび同一の染色体ｒｐｌＫ遺伝子領域間の相同組
み換えによって、Ｃ．グルタミクム染色体中に組み込む
ことによってのみ可能であることが証明されているから
である。トランス接合体（Transconjugant）を、カナマ
イシン（Merck, Darmstadt, Germany）（２５ｍｇ／
Ｌ）およびナリジン酸（Merck, Darmstadt, Germany）
（５０ｍｇ／Ｌ）が添加されているＬＢＧアガー上で選
択した。
Ｋを、シモンら（Simon et al.）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、１、第７８４頁〜第７９４頁（１９９３
年）Ｉ．Ｂ．Ｒ．で記載されたＥ．Ｃｏｌｉ供与菌株Ｓ
１７−１から得られた、宿主としてのＣ．グルタミクム
ＡＴＣＣ１３０３２に、シエ-ファーら、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７２、第１６
６３頁〜第１６６６頁（１９９０年）によって記載され
た接合方法を用いて挿入した。それというのは、プラス
ミドｐΔｒｐｌＫがＣ．グルタミクム中で複製できない
ために、プラスミドをコードするｒｐｌＫ欠失フラグメ
ントおよび同一の染色体ｒｐｌＫ遺伝子領域間の相同組
み換えによって、Ｃ．グルタミクム染色体中に組み込む
ことによってのみ可能であることが証明されているから
である。トランス接合体（Transconjugant）を、カナマ
イシン（Merck, Darmstadt, Germany）（２５ｍｇ／
Ｌ）およびナリジン酸（Merck, Darmstadt, Germany）
（５０ｍｇ／Ｌ）が添加されているＬＢＧアガー上で選
択した。
【００７９】ｓａｃＢ系を用いてのプラスミドｐΔｒｐ
ｌＫの後での切り出しの選択は、ｒｐｌＫ野生型対立遺
伝子を用いてのみ実施することができた。このために、
完全なｒｐｌＫ遺伝子を含有する、例３から構築された
プラスミドｐｒｐｌＫを、リーベルら（Liebl et a
l.）、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ ６５、第２９９頁〜第３０４頁（１９８９）
Ｉ．Ｂ．Ｒ．の方法によるエレクトロポレーションによ
って必須の菌株（integrant strain）中にトランスファ
ーした。菌株の選択は、カナマイシン（Merck, Darmsta
dt, Germany）（２５ｍｇ／Ｌ）およびクロラムフェニ
コール（Merck, Darmastadt, Germany）（１０ｍｇ／
Ｌ）が添加されているＬＢＧアガー上で行った。
ｌＫの後での切り出しの選択は、ｒｐｌＫ野生型対立遺
伝子を用いてのみ実施することができた。このために、
完全なｒｐｌＫ遺伝子を含有する、例３から構築された
プラスミドｐｒｐｌＫを、リーベルら（Liebl et a
l.）、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ ６５、第２９９頁〜第３０４頁（１９８９）
Ｉ．Ｂ．Ｒ．の方法によるエレクトロポレーションによ
って必須の菌株（integrant strain）中にトランスファ
ーした。菌株の選択は、カナマイシン（Merck, Darmsta
dt, Germany）（２５ｍｇ／Ｌ）およびクロラムフェニ
コール（Merck, Darmastadt, Germany）（１０ｍｇ／
Ｌ）が添加されているＬＢＧアガー上で行った。
【００８０】選択され形質転換されたコロニーを、ＬＢ
Ｇ液体培地１００ｍＬ（バッフルを備えた三角フラスコ
２５０ｍＬ中）中に接種（transinoculate）し、３０℃
で２４時間に亘って、３００ｒｐｍでインキュベーショ
ンした。その後にこの液体培地の２×１０６細胞／ｍＬ
を１０％ショ糖（Merck, Darmstadt, Germany）を含む
ＬＢＧアガーに適用し、３０℃で４８時間に亘ってイン
キュベーションした。この培地上で増殖可能なＣ．グル
タミクム細胞は、ｒｐｌＫ欠失対立遺伝子および本来の
ｒｐｌＫ遺伝子領域との間の、２次的な組み換えの結果
として、組み込まれたプラスミドｐΔｐｌＫを失なっ
た。この２次的な組み換えは、本来の染色体ｒｐｌＫ遺
伝子の配置であるかまたは１２ｂｐのＮ−末端ＤＮＡが
損失しているＣ．グルタミクムｐｒｌＫ突然変異体の生
成を導く。染色体ＤＮＡを“ショ糖耐性”であり、かつ
潜在的にｐΔｒｌＫを含有するＣ．グルタミクム細胞か
ら抽出した。このオリゴヌクレオチドＰｄｅｌ ｕｐお
よびＰｄｅｌ ｄｏｗｎ２を含む基質として役立つもの
を、ｒｐｌＫ配列を用いて誘導した（ARK ScientificGm
bH Biosytems, Darmstadt, Germany）。ＰＣＲ実験を、
プライマー、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene,
La Jolla, USA）およびＰＴＣ１００サーモサイクラー
（MJ Research Inc., Waltham, USA）を用いて実施し
た。熱変性（９４℃、９０秒）、アニーリング（５８
℃、９０秒）およびポリメラーゼ反応（７２℃、９０
秒）から成るサイクルをＰＣＲ中で３５回に亘って実施
した。その後に、得られるＤＮＡ増幅物はをキアジェン
ＰＣＲ精製スピンキット（Qiagen, Hilden, Germany）
によって精製した。前記のように実施し、精製されたＤ
ＮＡ増幅物のヌクレオチド配列の分析は、１２ｂｐのＤ
ＮＡ領域が欠損しているＤＮＡ増幅物の場合に４３％に
おいて見られた。したがって、相当するｐΔｒｐｌＫを
有するトランス接合体中で、２次的な組み換えはｒｐｌ
Ｋ遺伝子中で１２ｂｐの染色体性欠失体の形成を導く。
Ｇ液体培地１００ｍＬ（バッフルを備えた三角フラスコ
２５０ｍＬ中）中に接種（transinoculate）し、３０℃
で２４時間に亘って、３００ｒｐｍでインキュベーショ
ンした。その後にこの液体培地の２×１０６細胞／ｍＬ
を１０％ショ糖（Merck, Darmstadt, Germany）を含む
ＬＢＧアガーに適用し、３０℃で４８時間に亘ってイン
キュベーションした。この培地上で増殖可能なＣ．グル
タミクム細胞は、ｒｐｌＫ欠失対立遺伝子および本来の
ｒｐｌＫ遺伝子領域との間の、２次的な組み換えの結果
として、組み込まれたプラスミドｐΔｐｌＫを失なっ
た。この２次的な組み換えは、本来の染色体ｒｐｌＫ遺
伝子の配置であるかまたは１２ｂｐのＮ−末端ＤＮＡが
損失しているＣ．グルタミクムｐｒｌＫ突然変異体の生
成を導く。染色体ＤＮＡを“ショ糖耐性”であり、かつ
潜在的にｐΔｒｌＫを含有するＣ．グルタミクム細胞か
ら抽出した。このオリゴヌクレオチドＰｄｅｌ ｕｐお
よびＰｄｅｌ ｄｏｗｎ２を含む基質として役立つもの
を、ｒｐｌＫ配列を用いて誘導した（ARK ScientificGm
bH Biosytems, Darmstadt, Germany）。ＰＣＲ実験を、
プライマー、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene,
La Jolla, USA）およびＰＴＣ１００サーモサイクラー
（MJ Research Inc., Waltham, USA）を用いて実施し
た。熱変性（９４℃、９０秒）、アニーリング（５８
℃、９０秒）およびポリメラーゼ反応（７２℃、９０
秒）から成るサイクルをＰＣＲ中で３５回に亘って実施
した。その後に、得られるＤＮＡ増幅物はをキアジェン
ＰＣＲ精製スピンキット（Qiagen, Hilden, Germany）
によって精製した。前記のように実施し、精製されたＤ
ＮＡ増幅物のヌクレオチド配列の分析は、１２ｂｐのＤ
ＮＡ領域が欠損しているＤＮＡ増幅物の場合に４３％に
おいて見られた。したがって、相当するｐΔｒｐｌＫを
有するトランス接合体中で、２次的な組み換えはｒｐｌ
Ｋ遺伝子中で１２ｂｐの染色体性欠失体の形成を導く。
【００８１】引き続いて、プラスミドｐｒｐｌＫが選択
された欠失含有トランス接合体から、シェーファーら、
Ｊｏｕｌｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１
７６、第７３０９頁〜第７３１９頁 （１９９４）Ｉ．
Ｂ．Ｒによって記載されたプラスミド キュアリング
（curing）法によって取り除いた。したがって、得られ
るＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ΔｒｐｌＫの菌
株は、ｒｐｌＫ遺伝子の範囲内に１２ｂｐの染色性の欠
失を有し、この場合、これはＬ１１タンパク質のテトラ
ペプチド、プロリン−アラニン−ロイシン−グリシンの
損失を導く。
された欠失含有トランス接合体から、シェーファーら、
Ｊｏｕｌｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１
７６、第７３０９頁〜第７３１９頁 （１９９４）Ｉ．
Ｂ．Ｒによって記載されたプラスミド キュアリング
（curing）法によって取り除いた。したがって、得られ
るＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ΔｒｐｌＫの菌
株は、ｒｐｌＫ遺伝子の範囲内に１２ｂｐの染色性の欠
失を有し、この場合、これはＬ１１タンパク質のテトラ
ペプチド、プロリン−アラニン−ロイシン−グリシンの
損失を導く。
【００８２】例６ リシンの製造 例５中で得られるＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
菌株は、リシン製造に適した栄養培地中で培養され、か
つ培養懸濁液中のリシン含量を測定した。
菌株は、リシン製造に適した栄養培地中で培養され、か
つ培養懸濁液中のリシン含量を測定した。
【００８３】このために、菌株を最初にアガープレート
（脳−心臓アガー）上で、３３℃で２４時間に亘ってイ
ンキュベーションした。前記アガープレート培養から生
じた、前培養物を接種した（１００ｍＬ三角フラスコ中
１０ｇ／Ｌ培地）。完全培地ＣｇＩＩＩ（１０ｇ／Ｌバ
クトペプトン、１０ｇ／Ｌイーストエクストラクト、
２．５ｇ／Ｌ Ｎａｃｌ、２０ｇ／Ｌ グルコース、ｐ
Ｈ７．４）を前培養のための培地として使用した。前培
養を１３０℃で２４時間に亘って、振とう器上で２４０
ｒｐｍでインキュベーションした。主培養物を、この前
培養物から接種し、したがって、主培養物の開始光学濃
度（６６０ｎｍ）は０．１ＯＤであった。ＭＭ培地を主
培養のために使用した。
（脳−心臓アガー）上で、３３℃で２４時間に亘ってイ
ンキュベーションした。前記アガープレート培養から生
じた、前培養物を接種した（１００ｍＬ三角フラスコ中
１０ｇ／Ｌ培地）。完全培地ＣｇＩＩＩ（１０ｇ／Ｌバ
クトペプトン、１０ｇ／Ｌイーストエクストラクト、
２．５ｇ／Ｌ Ｎａｃｌ、２０ｇ／Ｌ グルコース、ｐ
Ｈ７．４）を前培養のための培地として使用した。前培
養を１３０℃で２４時間に亘って、振とう器上で２４０
ｒｐｍでインキュベーションした。主培養物を、この前
培養物から接種し、したがって、主培養物の開始光学濃
度（６６０ｎｍ）は０．１ＯＤであった。ＭＭ培地を主
培養のために使用した。
【００８４】 ＭＭ培地 ＣＳＬ（コーン浸漬液） ５ｇ／Ｌ ＭＯＰＳ（モルフォリノプロパン スルホン酸） ２０ｇ／Ｌ グルコース（別個にオートクレーブしたもの） ５０ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２（ＳＯ４） ２５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．０ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ５．０ｍｇ／Ｌ ビオチン（濾過滅菌したもの） ０．３ｍｇ／Ｌ チアミン・ＨＣｌ（濾過滅菌したもの） ０．２ｍｇ／Ｌ ＣａＣＯ３ ２５ｇ／Ｌ ＣＳＬ、ＭＯＰＳおよび塩溶液をアンモニア水を用いて
ｐＨ７に調整し、かつオートクレーブした。その後に滅
菌した基質およびビタミン溶液、ならびに乾燥オートク
レーブ（dry autoclave）されたＣａＣＯ３を添加し
た。
ｐＨ７に調整し、かつオートクレーブした。その後に滅
菌した基質およびビタミン溶液、ならびに乾燥オートク
レーブ（dry autoclave）されたＣａＣＯ３を添加し
た。
【００８５】培養を、バッフルを備えた１００ｍＬの三
角フラスコ中で、１０ｍｌの容量で行った。培養を３３
℃で、８０％の空気湿度で行った。
角フラスコ中で、１０ｍｌの容量で行った。培養を３３
℃で、８０％の空気湿度で行った。
【００８６】測定波長６６０ｎｍのＯＤで、４８時間後
に、バイオメク１０００（Biomek 1000）（Beckmann In
struments GmbH, Munich）を用いて測定した。形成され
たリシンの量はエッペンドルフ−ビオトロニク社（Eppe
ndorf-Biotronik Company）（Hamburg, Germany）から
のアミノ酸分析器によって、イオン交換クロマトグラフ
ィーおよび引き続いてのニンヒドリン検出を含むカラム
誘導化によって測定した。
に、バイオメク１０００（Biomek 1000）（Beckmann In
struments GmbH, Munich）を用いて測定した。形成され
たリシンの量はエッペンドルフ−ビオトロニク社（Eppe
ndorf-Biotronik Company）（Hamburg, Germany）から
のアミノ酸分析器によって、イオン交換クロマトグラフ
ィーおよび引き続いてのニンヒドリン検出を含むカラム
誘導化によって測定した。
【００８７】実験結果を第１表に示す。
【００８８】
【表１】
【００８９】前記の詳細な説明は、単なる教示のみであ
って、かつ多くの変法は本発明の精神から逸脱すること
なく、かつ本明細書中に加えられた請求項によって達成
されうることは当然のことである。
って、かつ多くの変法は本発明の精神から逸脱すること
なく、かつ本明細書中に加えられた請求項によって達成
されうることは当然のことである。
【００９０】
【００９１】
【外３】
【００９２】
【外４】
【００９３】
【外５】
【００９４】
【外６】
【００９５】
【外７】
【図１】プラスミドｐΔｒｐｌＫの制限地図
【符号の説明】 ｐｄｅｌｔａｒｐｌＫ： ｐΔｒｐｌＫ、 ｓａｃＢ ｇｅｎｅ： 酵素レバンスクラーゼをコー
ドする、バチルス スブチリスからのｓａｃＢ遺伝子、 ｌａｃＺ ａｌｐｈａ： β−ガラクトシダーゼ遺伝
子の５’末端部分、 ｏｒｉＶ： 複製起点、 ＫｍＲ： カナマイシン耐性、 ＲＰ４ｍｏｂ： プラスミドＲＰ４の可動性（ｍｏ
ｂ）領域、 ＢａｍＨＩ： 制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位、 ＥｃｏＲＩ： 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位、 ΔｒｐｌＫ： Ｎ−末端領域で１２ｂｐの欠失を有す
るｒｐｌＫ対立遺伝子。
ドする、バチルス スブチリスからのｓａｃＢ遺伝子、 ｌａｃＺ ａｌｐｈａ： β−ガラクトシダーゼ遺伝
子の５’末端部分、 ｏｒｉＶ： 複製起点、 ＫｍＲ： カナマイシン耐性、 ＲＰ４ｍｏｂ： プラスミドＲＰ４の可動性（ｍｏ
ｂ）領域、 ＢａｍＨＩ： 制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位、 ＥｃｏＲＩ： 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位、 ΔｒｐｌＫ： Ｎ−末端領域で１２ｂｐの欠失を有す
るｒｐｌＫ対立遺伝子。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:15） 1:15） (Ｃ１２Ｎ 15/09 (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/09 (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:13） Ａ (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:15） 1:15） (72)発明者 アルフレート ピューラー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト アム ヴァルトシュレスヒェン ２ (72)発明者 イェルン カリノヴスキー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト レン バッハシュトラーセ 19 (72)発明者 ベッティーナ メッケル ドイツ連邦共和国 デュッセルドルフ ベ ンローデシュトラーセ 35 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA72 CA06 CA09 DA10 EA06 GA14 HA01 4B063 QA08 QQ43 QR32 QS34 4B064 AE25 CA02 CC24 CE11 DA10 4B065 AA22Y AA24X AA24Y AB01 BA02 CA17 CA42
Claims (32)
- 【請求項１】 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも
７０％同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一
であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）に対して相補
性を有するポリヌクレオチド、および ｄ）ポリヌクレオチド配列（ａ）、（ｂ）または（ｃ）
の連続する塩基少なくとも１５個を含むポリヌクレオチ
ドから成る群から選択されたポリヌクレオチド配列を含
む単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドが複製可能なＤＮＡで
ある、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドが組み換えＤＮＡであ
る、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求
項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 配列番号１の核酸配列を含む、請求項２
に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項６】 配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求
項２に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項７】 配列番号３に記載のヌクレオチド配列を
含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項８】 配列番号３に記載のヌクレオチド配列の
連続する塩基を少なくとも１５個含む、請求項１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項９】 配列番号４に記載のアミノ酸配列の連続
するアミノ酸を少なくとも５個含むポリペプチドをコー
ドする、ポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載
のポリヌクレオチド。 - 【請求項１０】 （ｉ）配列番号１に記載のヌクレオチ
ド配列、または（ｉｉ）遺伝子コード縮退の領域の範囲
内で、配列（ｉ）に相当する少なくとも一つの配列、ま
たは（ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に対して相補
的な配列とハイブリダイズする少なくとも一つの配列、
および場合によっては、（ｉｖ）（ｉ）の機能中立セン
ス突然変異を含む、請求項２に記載の複製可能なＤＮ
Ａ。 - 【請求項１１】 ポリヌクレオチドが、ＤＳＭ１３１５
８としてＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α／ｐΔｒｐ１Ｋ中で寄託
されている、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含有
するベクター。 - 【請求項１２】 ポリヌクレオチドが配列番号３の配列
を含む、請求項１１に記載のベクター。 - 【請求項１３】 ｒｐｌＫ遺伝子中の欠失体または挿入
体を含むホスト細胞として使用されるコリネフォルム細
菌または該細菌の細胞溶解物。 - 【請求項１４】 ａ）アミノ酸を製造するために、少な
くともｒｐｌＫ遺伝子が転写減衰された細菌を発酵さ
せ、かつ、ｂ）媒体中または細菌の細胞中でアミノ酸を
濃縮することを含む、アミノ酸の製造方法。 - 【請求項１５】 さらにアミノ酸の単離を含む、請求項
１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 アミノ酸がＬ−リシンである、請求項
１４に記載の方法。 - 【請求項１７】 細菌中で、アミノ酸の生合成経路の付
加的な遺伝子が増強される、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１８】 細菌中で、アミノ酸の形成を減少させ
る代謝経路が、少なくとも部分的に遮断される、請求項
１４に記載の方法。 - 【請求項１９】 細菌中のポリヌクレオチドの発現が減
少され、かつ前記ポリヌクレオチドが、 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一であ
るポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一
であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）に対して相補
性を有するポリヌクレオチド、および ｄ）ポリヌクレオチド配列（ａ）、（ｂ）または（ｃ）
の連続する塩基を少なくとも１５個含むポリヌクレオチ
ドから成る群から選択されたポリヌクレオチド配列を含
む、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項２０】 細菌中で、ポリペプチドの触媒活性が
減少され、かつポリペプチドが、 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一であ
るポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一
であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）に対して相補
性を有するポリヌクレオチド、および ｄ）ポリヌクレオチド配列（ａ）、（ｂ）または（ｃ）
の連続する塩基を少なくとも１５個含むポリヌクレオチ
ドから成る群から選択されたポリヌクレオチド配列を含
むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１４
に記載の方法。 - 【請求項２１】 ＤＳＭ１３１５８として寄託されたプ
ラスミドｐΔｒｐ１Ｋを用いて、アテニュエーションの
ための挿入突然変異がつくられた細菌を使用する、請求
項１４に記載の方法。 - 【請求項２２】 一つまたはそれ以上の次の遺伝子が過
剰に発現される細菌が発酵され、前記の一つまたはそれ
以上の遺伝子が、 ａ）ジヒドロジピコリネート シンターゼをコードする
ｄａｐＡ遺伝子、 ｂ）フィードバック耐性アスパルテート キナーゼ、 ｃ）Ｓ−（２−アミノエチル）システイン耐性を介在す
るＤＮＡフラグメント、 ｄ）ピルベート カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ
遺伝子、 ｅ）マレートをコードするｍｑｏ遺伝子：キノン オキ
シドレダクターゼ、 ｆ）リシン排出をコードするｌｙｓＥ遺伝子、および ｇ）ｚｗａ１遺伝子からなる群から選択される、請求項
１４に記載の方法。 - 【請求項２３】 一つまたはそれ以上の次の遺伝子が転
写減衰された細菌が発酵され、前記の一つまたはそれ以
上の遺伝子が、 ａ）ホスホエノル ピルベート カルボキシキナーゼを
コードするｐｃｋ遺伝子、 ｂ）グルコース６−ホスフェート イソメラーゼをコー
ドするｐｇｉ遺伝子、 ｃ）ピルベート オキシダーゼをコードするｐｏｘＢ遺
伝子、 ｄ）ｚｗａ２遺伝子、および ｅ）ＰＰＧＰＰシンターゼＩをコードするｒｅｌａ遺伝
子から成る群から選択される、請求項１４に記載の方
法。 - 【請求項２４】 細菌がコリネバクテリウム グルタミ
クム ファミリーの微生物である、請求項１４に記載の
方法。 - 【請求項２５】 ポリメラーゼ連鎖反応によってｒｐ１
Ｋ遺伝子に相当する作用が欠けている遺伝子のＤＮＡを
製造するために、プライマーとして請求項１に記載のポ
リヌクレオチド配列を使用する方法。 - 【請求項２６】 ハイブリダイゼーションプローブとし
て、請求項１に記載のポリヌクレオチド配列を使用する
方法。 - 【請求項２７】 少なくともｒｐ１Ｋ遺伝子が修飾さ
れ、アミノ酸の製造が増強された細菌。 - 【請求項２８】 細菌が発酵される、請求項２７に記載
の細菌。 - 【請求項２９】 少なくともｒｐ１Ｋ遺伝子が修飾さ
れ、一つのアミノ酸の製造が増強された細菌を含有する
組成物。 - 【請求項３０】 細菌が生菌である、請求項２９に記載
の組成物。 - 【請求項３１】 細菌が死滅している、請求項２９に記
載の組成物。 - 【請求項３２】 細菌がコリネフォルム細菌である、請
求項２９に記載の組成物。
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