JP2001197892A - ｚｗａ２遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列 - Google Patents
ｚｗａ２遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 アミノ酸、特にＬ−リジンの発酵生産に関す
る新規の改善された方法の提供。 【解決手段】 次の群： ａ）コリネバクテリウム グルタミクム由来の特定のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドに対して少なくとも７０％同一であるポリヌク
レオチド、 ｂ）コリネバクテリウム グルタミクム由来の特定のア
ミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ
酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド、 ｃ）ポリヌクレオチドａ）又はｂ）に対して相補的なポ
リヌクレオチド、かつｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）、
ｂ）又はｃ）からの配列中に少なくとも１５個のヌクレ
オチドを有するポリヌクレオチドから選択されたポリヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチドを用いる。
る新規の改善された方法の提供。 【解決手段】 次の群： ａ）コリネバクテリウム グルタミクム由来の特定のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドに対して少なくとも７０％同一であるポリヌク
レオチド、 ｂ）コリネバクテリウム グルタミクム由来の特定のア
ミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ
酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド、 ｃ）ポリヌクレオチドａ）又はｂ）に対して相補的なポ
リヌクレオチド、かつｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）、
ｂ）又はｃ）からの配列中に少なくとも１５個のヌクレ
オチドを有するポリヌクレオチドから選択されたポリヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチドを用いる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｚｗａ２遺伝子を
コードするヌクレオチド配列ならびにｚｗａ２遺伝子が
転写減衰されたコリネフォルム細菌を使用して、アミノ
酸、特にＬ−リジンを発酵生産する方法に関する。
コードするヌクレオチド配列ならびにｚｗａ２遺伝子が
転写減衰されたコリネフォルム細菌を使用して、アミノ
酸、特にＬ−リジンを発酵生産する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アミノ酸、特にＬ−リジンは、ヒト医学
および製薬工業、しかしながら特には動物飼料部門にお
いて使用されている。
および製薬工業、しかしながら特には動物飼料部門にお
いて使用されている。
【０００３】コリネフォルム細菌、特にコリネバクテリ
ウム グルタミクムの菌株を発酵することによってアミ
ノ酸を生産できることは公知である。この方法が極めて
重要であるために、製造方法の改善に関する技術は常に
進歩している。改善方法は、発酵技術の方法、例えば攪
拌および酸素供給に関するものであってよいし、あるい
は栄養媒体の組成、例えば発酵中の糖濃度に関するもの
であってもよいし、あるいは例えばイオンクロマトグラ
フィーによる、十分な生成物状態の後処理に関するもの
であってもよいし、あるいは微生物それ自体の固有の性
能特性に関するものであってもよい。
ウム グルタミクムの菌株を発酵することによってアミ
ノ酸を生産できることは公知である。この方法が極めて
重要であるために、製造方法の改善に関する技術は常に
進歩している。改善方法は、発酵技術の方法、例えば攪
拌および酸素供給に関するものであってよいし、あるい
は栄養媒体の組成、例えば発酵中の糖濃度に関するもの
であってもよいし、あるいは例えばイオンクロマトグラ
フィーによる、十分な生成物状態の後処理に関するもの
であってもよいし、あるいは微生物それ自体の固有の性
能特性に関するものであってもよい。
【０００４】これら微生物の性能特性を改善するため
に、変異法、選択法および突然変異選択法が適用され
る。抗代謝物質、例えばリジン アナログＳ−（２−ア
ミノエチル）−システインに耐性であるか、あるいは調
節に重要な代謝物質要求性であり、かつＬ−アミノ酸を
製造する菌株がこの方法において得られる。
に、変異法、選択法および突然変異選択法が適用され
る。抗代謝物質、例えばリジン アナログＳ−（２−ア
ミノエチル）−システインに耐性であるか、あるいは調
節に重要な代謝物質要求性であり、かつＬ−アミノ酸を
製造する菌株がこの方法において得られる。
【０００５】数年来、組み換えＤＮＡ技術の方法は、コ
リネバクテリウムのアミノ酸生産菌株の菌株改善のため
に使用されている。
リネバクテリウムのアミノ酸生産菌株の菌株改善のため
に使用されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アミ
ノ酸、特にＬ−リジンの改善された発酵生産のための新
規方法を提供することである。
ノ酸、特にＬ−リジンの改善された発酵生産のための新
規方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この目的は次のようにし
て達成された。
て達成された。
【０００８】Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンは、ヒト医
学、製薬工業および特に動物飼料学において使用され
る。したがって、アミノ酸、特にＬ−リジンを製造する
ための新規の改善された方法を提供することは一般に重
要である。
学、製薬工業および特に動物飼料学において使用され
る。したがって、アミノ酸、特にＬ−リジンを製造する
ための新規の改善された方法を提供することは一般に重
要である。
【０００９】Ｌ−リジンまたはリジンが以下に挙げられ
る場合には、これは塩基ばかりでなくさらに塩、例えば
リジン一塩酸塩またはリジン硫酸塩を意味する。
る場合には、これは塩基ばかりでなくさらに塩、例えば
リジン一塩酸塩またはリジン硫酸塩を意味する。
【００１０】本発明は次の群、 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％
同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０
％が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）に対して相補的な
ポリヌクレオチド、および ｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）、ｂ）またはｃ）からの
配列のヌクレオチド少なくとも１５個を有するポリヌク
レオチドから選択されたポリヌクレオチド配列を有する
コリネフォルム細菌から単離されたポリヌクレオチドを
提供する。
コードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％
同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０
％が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）に対して相補的な
ポリヌクレオチド、および ｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）、ｂ）またはｃ）からの
配列のヌクレオチド少なくとも１５個を有するポリヌク
レオチドから選択されたポリヌクレオチド配列を有する
コリネフォルム細菌から単離されたポリヌクレオチドを
提供する。
【００１１】さらに、本発明は請求項１によるポリヌク
レオチドを提供し、この場合、これは好ましくは次の群
を有する複製可能なＤＮＡである： （ｉ）ｚｗａ２遺伝子をコードする、配列番号１に示さ
れたヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列（ｉ）に遺伝暗号
の縮退の領域内で一致する配列少なくとも一つ、または
（ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に対して相補的な
配列とハイブリダイズする配列少なくとも一つ、かつ場
合によっては、（ｉｖ）（ｉ）中の機能中立センス突然
変異。
レオチドを提供し、この場合、これは好ましくは次の群
を有する複製可能なＤＮＡである： （ｉ）ｚｗａ２遺伝子をコードする、配列番号１に示さ
れたヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列（ｉ）に遺伝暗号
の縮退の領域内で一致する配列少なくとも一つ、または
（ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に対して相補的な
配列とハイブリダイズする配列少なくとも一つ、かつ場
合によっては、（ｉｖ）（ｉ）中の機能中立センス突然
変異。
【００１２】さらに提供されるのは、配列番号１に示さ
れたヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載のポリ
ヌクレオチド、請求項１、ｄ）に記載されたポリヌクレ
オチド、特にｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉｎｔを有する、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＳＭ１３１１３で寄託されたベクタ
ー、および請求項６に記載のベクターを用いて挿入突然
変異によって得られた、ホスト細胞として作用するコリ
ネフォルム細菌である。
れたヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載のポリ
ヌクレオチド、請求項１、ｄ）に記載されたポリヌクレ
オチド、特にｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉｎｔを有する、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＳＭ１３１１３で寄託されたベクタ
ー、および請求項６に記載のベクターを用いて挿入突然
変異によって得られた、ホスト細胞として作用するコリ
ネフォルム細菌である。
【００１３】また、本発明は、配列番号１またはその一
部分と一致するポリヌクレオチド配列を有する完全な遺
伝子を含む、相当する遺伝子ライブラリーをハイブリダ
イズすることによって、前記配列番号１によるポリヌク
レオチド配列またはこれらのフラグメントを有するプロ
ーブを用いてシークエンシングし、かつ前記ＤＮＡ配列
を単離することによって得ることが可能なポリヌクレオ
チド配列少なくとも一つから実際になるポリヌクレオチ
ドを提供する。
部分と一致するポリヌクレオチド配列を有する完全な遺
伝子を含む、相当する遺伝子ライブラリーをハイブリダ
イズすることによって、前記配列番号１によるポリヌク
レオチド配列またはこれらのフラグメントを有するプロ
ーブを用いてシークエンシングし、かつ前記ＤＮＡ配列
を単離することによって得ることが可能なポリヌクレオ
チド配列少なくとも一つから実際になるポリヌクレオチ
ドを提供する。
【００１４】本発明によるポリヌクレオチド配列は、Ｒ
ＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡのためのハイブリダイゼー
ションプローブとして、Ｚｗａ２遺伝子生成物をコード
する全長ｃＤＮＡを単離するために、かつこれら生成物
のｃＤＮＡｓまたはｚｗａ２遺伝子を有する配列と極め
て類似する遺伝子を単離するために適している。
ＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡのためのハイブリダイゼー
ションプローブとして、Ｚｗａ２遺伝子生成物をコード
する全長ｃＤＮＡを単離するために、かつこれら生成物
のｃＤＮＡｓまたはｚｗａ２遺伝子を有する配列と極め
て類似する遺伝子を単離するために適している。
【００１５】また、本発明によるポリヌクレオチド配列
は、ｚｗａ２遺伝子をコードする遺伝子から、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＤＮＡを製造すること
ができる方法によってプライマーとしての使用に適して
いる。
は、ｚｗａ２遺伝子をコードする遺伝子から、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＤＮＡを製造すること
ができる方法によってプライマーとしての使用に適して
いる。
【００１６】プローブまたはプライマーとして使用する
ことができるオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０
個、好ましくは少なくとも２０個、特に好ましくは少な
くとも１５個のヌクレオチドを配列中に有する。また、
少なくとも４０個または５０個のヌクレオチドの長さを
有するオリゴヌクレオチドが適している。
ことができるオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０
個、好ましくは少なくとも２０個、特に好ましくは少な
くとも１５個のヌクレオチドを配列中に有する。また、
少なくとも４０個または５０個のヌクレオチドの長さを
有するオリゴヌクレオチドが適している。
【００１７】“単離された”はその本来の環境から取り
出されたことを意味する。
出されたことを意味する。
【００１８】“ポリヌクレオチド”は一般にポリリボヌ
クレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドに関
し、この場合、これは未修飾のＲＮＡまたはＤＮＡであ
るか、あるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであって
もよい。
クレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドに関
し、この場合、これは未修飾のＲＮＡまたはＤＮＡであ
るか、あるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであって
もよい。
【００１９】“ポリペプチド”はペプチド結合を介して
つながれた２つまたはそれ以上のアミノ酸を有するペプ
チドまたはタンパク質であると認識される。
つながれた２つまたはそれ以上のアミノ酸を有するペプ
チドまたはタンパク質であると認識される。
【００２０】本発明によるポリペプチドは、配列番号２
のポリペプチド、特にｚｗａ２遺伝子からの遺伝子生成
物の生物学的活性を有するポリペプチドならびに配列番
号２に示されたポリペプチドに対して少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも８０％および特に少なくとも
９０％〜９５％が同一であり、かつ挙げられた活性を有
するポリペプチドである。
のポリペプチド、特にｚｗａ２遺伝子からの遺伝子生成
物の生物学的活性を有するポリペプチドならびに配列番
号２に示されたポリペプチドに対して少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも８０％および特に少なくとも
９０％〜９５％が同一であり、かつ挙げられた活性を有
するポリペプチドである。
【００２１】さらに、本発明はアミノ酸、特にＬ−リジ
ンを、特にすでにアミノ酸を製造するコリネフォルム細
菌を用いて、発酵生産する方法を提供し、この場合、こ
のｚｗａ２遺伝子をコードするヌクレオチド配列が転写
減衰され、特に低いレベルで発現される。
ンを、特にすでにアミノ酸を製造するコリネフォルム細
菌を用いて、発酵生産する方法を提供し、この場合、こ
のｚｗａ２遺伝子をコードするヌクレオチド配列が転写
減衰され、特に低いレベルで発現される。
【００２２】本発明によって提供された微生物は、グル
コース、ショ糖、ラクトース、フルクトース、マルトー
ス、糖蜜、デンプン、セルロースまたはグリセロールお
よびエタノールからＬ−リジンを製造することができ
る。これはコリネフォルム細菌の典型的なもの、特にコ
リネバクテリウム属であってもよい。コリネバクテリウ
ム属からは、コリネバクテリウム グルタミクム種が特
に挙げられるべきであり、この場合、これはそのＬ−ア
ミノ酸を生産する能力に関して当業者に公知である。
コース、ショ糖、ラクトース、フルクトース、マルトー
ス、糖蜜、デンプン、セルロースまたはグリセロールお
よびエタノールからＬ−リジンを製造することができ
る。これはコリネフォルム細菌の典型的なもの、特にコ
リネバクテリウム属であってもよい。コリネバクテリウ
ム属からは、コリネバクテリウム グルタミクム種が特
に挙げられるべきであり、この場合、これはそのＬ−ア
ミノ酸を生産する能力に関して当業者に公知である。
【００２３】コリネバクテリウム属の適した菌株、特に
コリネバクテリウム グルタミクム種は、例えば公知の
野生型菌株 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム アセトグルタミクム（Corynebact
erium acetoglutamicum）ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィルム（Coryneba
cterium acetoacidphium） ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム メラッセコロア（Corynebacteriu
m melassecoloa） ＡＴＣＣ１７９６５ コリネバクテリウム セルモアミノジェネス（Coryneba
cterium thermoaminogenes FERM BP-1539） ブレビバクテリウム フラブム（Brevibacterium flavu
m） ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウム（Brevib
acterium lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９および ブレビバクテリウム ジバリカトウム（Brevibacterium
divaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０、かつＬ−リジン生
産突然変異株またはこれから製造される菌株、例えば、 コリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ−Ｐ１７０
９ ブレビバクテリウム フラブムＦＥＲＭ−Ｐ１７０８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウムＦＥＲＭ
−Ｐ１７１２ コリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ−Ｐ６４６
３ コリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ−Ｐ６４６
４および コリネバクテリウム グルタミクムＤＳＭ５７１５であ
る。
コリネバクテリウム グルタミクム種は、例えば公知の
野生型菌株 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム アセトグルタミクム（Corynebact
erium acetoglutamicum）ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィルム（Coryneba
cterium acetoacidphium） ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム メラッセコロア（Corynebacteriu
m melassecoloa） ＡＴＣＣ１７９６５ コリネバクテリウム セルモアミノジェネス（Coryneba
cterium thermoaminogenes FERM BP-1539） ブレビバクテリウム フラブム（Brevibacterium flavu
m） ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウム（Brevib
acterium lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９および ブレビバクテリウム ジバリカトウム（Brevibacterium
divaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０、かつＬ−リジン生
産突然変異株またはこれから製造される菌株、例えば、 コリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ−Ｐ１７０
９ ブレビバクテリウム フラブムＦＥＲＭ−Ｐ１７０８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウムＦＥＲＭ
−Ｐ１７１２ コリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ−Ｐ６４６
３ コリネバクテリウム グルタミクムＦＥＲＭ−Ｐ６４６
４および コリネバクテリウム グルタミクムＤＳＭ５７１５であ
る。
【００２４】本発明は、Ｚｗａ２遺伝子生成物をコード
する新規ｚｗａ２遺伝子をＣ．グルタミクムから単離す
ることに成功した。
する新規ｚｗａ２遺伝子をＣ．グルタミクムから単離す
ることに成功した。
【００２５】ｚｗａ２遺伝子または任意の他の遺伝子を
Ｃ．グルタミクムから単離するために、この微生物から
の遺伝子ライブラリーを最初にＥ．ｃｏｌｉ中に集め
た。遺伝子ライブラリーの構築は一般に公知の教科書お
よび解説書中に示されている。例として、ウィナッカー
（Winnacker）による教科書：Ｇｅｎｅ ｕｎｄ Ｋｌ
ｏｎｅ、Ｅｉｎｅ Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄ
ｉｅ Ｇｅｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（Verlag Chemie,
Weinheim, Germany, 1990）またはザンブルックら（Sa
mbrook et al.）による解説書：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（Cold Spring Haebor Laboratory Press, 1988）
が挙げられてもよい。極めてよく知られた遺伝子ライブ
ラリーは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株Ｗ３１１０から
のものであり、この場合、これはコハラら（kohara et
al.）によってλ−ベクター中に構築された。ベイスら
（Molecular and General Genetics, 252:255〜265, 19
96）は、Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０２２からの遺
伝子ライブラリーを示し、この場合、これはＥ．ｃｏｌ
ｉ Ｋ−１２菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al., 1988,
Nucleic acids Research 16: 1563〜1575）中に、コス
ミドベクター ＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（Wahl et al., 198
7, Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 84: 2160〜2164）を用いて構築された。また、ボ
ルマンら（Boermann et al.）（MolecularMicrobiology
6 (3), 317〜326 (1992)）はＣ．グルタミクム ＡＴ
ＣＣ１３０３２からの遺伝子ライブラリーを、コスミド
ｐＨＣ７９（Hohn and Collins, Gene 11, 291〜298 (1
980)）を用いて記載している。Ｅ．ｃｏｌｉ中のＣ．グ
ルタミクムからの遺伝子ライブラリーを製造するため
に、プラスミド、例えばｐＢＲ３２２（Bolivar, Life
Sciences, 25, 807〜818 (1979)）またはｐＵＣ９（Vie
ira et al., 1982, Gene, 19: 259〜268）が使用されて
もよい。ホストとして特に適したＥ．ｃｏｌｉ菌株は、
制限性の欠失および組み換え系の欠失を有するものであ
る。これらの例はＤＨ５αｍｃｒ菌株であり、この場
合、これはグラントら（Grant et al.）によって記載さ
れている（Proceedings of the National Academy of S
ciences USA, 87 (1990) 4645〜4649）。コスミドによ
ってクローン化された長いＤＮＡフラグメントはその後
にシークエンシングに適した通常使用されるベクター中
にサブクローニングされ、その後に、例えばサンガーら
（Sanger et al.）によって記載されたようにシークエ
ンシングされた（Proceedings of the National Academ
y of Sciences of the United States of America, 74:
5463〜5467, 1977）。
Ｃ．グルタミクムから単離するために、この微生物から
の遺伝子ライブラリーを最初にＥ．ｃｏｌｉ中に集め
た。遺伝子ライブラリーの構築は一般に公知の教科書お
よび解説書中に示されている。例として、ウィナッカー
（Winnacker）による教科書：Ｇｅｎｅ ｕｎｄ Ｋｌ
ｏｎｅ、Ｅｉｎｅ Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄ
ｉｅ Ｇｅｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（Verlag Chemie,
Weinheim, Germany, 1990）またはザンブルックら（Sa
mbrook et al.）による解説書：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（Cold Spring Haebor Laboratory Press, 1988）
が挙げられてもよい。極めてよく知られた遺伝子ライブ
ラリーは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株Ｗ３１１０から
のものであり、この場合、これはコハラら（kohara et
al.）によってλ−ベクター中に構築された。ベイスら
（Molecular and General Genetics, 252:255〜265, 19
96）は、Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０２２からの遺
伝子ライブラリーを示し、この場合、これはＥ．ｃｏｌ
ｉ Ｋ−１２菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al., 1988,
Nucleic acids Research 16: 1563〜1575）中に、コス
ミドベクター ＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（Wahl et al., 198
7, Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 84: 2160〜2164）を用いて構築された。また、ボ
ルマンら（Boermann et al.）（MolecularMicrobiology
6 (3), 317〜326 (1992)）はＣ．グルタミクム ＡＴ
ＣＣ１３０３２からの遺伝子ライブラリーを、コスミド
ｐＨＣ７９（Hohn and Collins, Gene 11, 291〜298 (1
980)）を用いて記載している。Ｅ．ｃｏｌｉ中のＣ．グ
ルタミクムからの遺伝子ライブラリーを製造するため
に、プラスミド、例えばｐＢＲ３２２（Bolivar, Life
Sciences, 25, 807〜818 (1979)）またはｐＵＣ９（Vie
ira et al., 1982, Gene, 19: 259〜268）が使用されて
もよい。ホストとして特に適したＥ．ｃｏｌｉ菌株は、
制限性の欠失および組み換え系の欠失を有するものであ
る。これらの例はＤＨ５αｍｃｒ菌株であり、この場
合、これはグラントら（Grant et al.）によって記載さ
れている（Proceedings of the National Academy of S
ciences USA, 87 (1990) 4645〜4649）。コスミドによ
ってクローン化された長いＤＮＡフラグメントはその後
にシークエンシングに適した通常使用されるベクター中
にサブクローニングされ、その後に、例えばサンガーら
（Sanger et al.）によって記載されたようにシークエ
ンシングされた（Proceedings of the National Academ
y of Sciences of the United States of America, 74:
5463〜5467, 1977）。
【００２６】ｚｗａ２遺伝子をコードする新規ＤＮＡ配
列はこの方法で得られ、かつこれは本発明の配列番号１
を構成するものである。さらに、相当する遺伝子生成物
中のｚｗａ２遺伝子のアミノ酸配列は、入手可能なＤＮ
Ａ配列から導かれた。生産されたＺｗａ２遺伝子生成物
のアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。
列はこの方法で得られ、かつこれは本発明の配列番号１
を構成するものである。さらに、相当する遺伝子生成物
中のｚｗａ２遺伝子のアミノ酸配列は、入手可能なＤＮ
Ａ配列から導かれた。生産されたＺｗａ２遺伝子生成物
のアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。
【００２７】また、遺伝子暗号の縮退によって配列番号
１から生じるコーディングＤＮＡ配列は、本発明を構成
するものである。同様に、配列番号１または配列番号１
の一部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列は本発明を構
成するものである。最後に、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）によって配列番号１から製造されたプライマーを
用いて製造されるＤＮＡ配列もまた本発明を構成するも
のである。
１から生じるコーディングＤＮＡ配列は、本発明を構成
するものである。同様に、配列番号１または配列番号１
の一部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列は本発明を構
成するものである。最後に、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）によって配列番号１から製造されたプライマーを
用いて製造されるＤＮＡ配列もまた本発明を構成するも
のである。
【００２８】当業者は、ハイブリダイゼーションによる
ＤＮＡ配列の同定に関する指示を、特に、ベーリンガー
・マンハイム社（Boehringer Mannheim GmbH）（Mannhe
im,Germany, 1993）によって作られた解説書“Ｔｈｅ
ＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏ
ｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”およ
びリーブルら（Liebl et al.）（International Journa
l of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255〜260）
で見出すはずである。当業者らは、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ配列の増幅に関する指示を、
すなわちガイト（Gait）による解説書：オリゴヌクレオ
チド合成（Oligonucleotide synthesis）：プラクティ
カルアプローチ（a practical approach）（IRL Press,
Oxford, UK, 1984）およびニュートンおよびグラハム
（Newton and Graham）:ＰＣＲ（Spektrum Akademische
r Verlag, Heidelberg, Germany, 1994）で見出すはず
である。
ＤＮＡ配列の同定に関する指示を、特に、ベーリンガー
・マンハイム社（Boehringer Mannheim GmbH）（Mannhe
im,Germany, 1993）によって作られた解説書“Ｔｈｅ
ＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏ
ｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”およ
びリーブルら（Liebl et al.）（International Journa
l of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255〜260）
で見出すはずである。当業者らは、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ配列の増幅に関する指示を、
すなわちガイト（Gait）による解説書：オリゴヌクレオ
チド合成（Oligonucleotide synthesis）：プラクティ
カルアプローチ（a practical approach）（IRL Press,
Oxford, UK, 1984）およびニュートンおよびグラハム
（Newton and Graham）:ＰＣＲ（Spektrum Akademische
r Verlag, Heidelberg, Germany, 1994）で見出すはず
である。
【００２９】本発明者らは、コリネフォルム細菌がアミ
ノ酸、特にＬ−リジンを、ｚｗａ２遺伝子の転写減衰の
後に改善された方法で生産することを見出した。
ノ酸、特にＬ−リジンを、ｚｗａ２遺伝子の転写減衰の
後に改善された方法で生産することを見出した。
【００３０】転写減衰を生じさせるために、ｚｗａ２遺
伝子の発現または酵素タンパク質の触媒的性質を減少さ
せるか、あるいはスイッチオフ（switched off）させて
もよい。場合によっては双方の方法が組み合わされても
よい。
伝子の発現または酵素タンパク質の触媒的性質を減少さ
せるか、あるいはスイッチオフ（switched off）させて
もよい。場合によっては双方の方法が組み合わされても
よい。
【００３１】遺伝子発現は適した培養方法によってか、
あるいは遺伝子発現のための単一構造の遺伝的修飾（突
然変異）によって減少されてもよい。遺伝子発現のため
の単一構造は、例えばリプレッサー遺伝子、活性遺伝
子、オペレーター、プロモーター、アテニュエーター、
リボソーム結合部位、開始コドンおよびターミネーター
である。これらのデーターは当業者によって、例えば、
特許出願ＷＯ９６／１５２４６、ボイドおよびマーフィ
ー（Boyd and Murphy）（Journal of Bacteriology 17
0: 5949 (1988) ）、ボスキルおよびチャンブレス（Vos
kuil and Chambliss）（Nucleic Acids Research 26: 3
548 (1988)）、ジェンセンおよびハマー（Jensen and H
ammer）（Biotechnology and Bioengineering 58: 191
(1998)）、パテックら（Patek et al.）（Microbiology
142: 1297 (1996)）および遺伝学および分子生物学の
公知の教科書、例えばニッパー（Knipper）による教科
書（“Molekulare Genetik”,第６版, Gerorg Thieme V
erlag, Stuttgart, Germany,1995）またはウィナッカー
（Winnacker）による教科書（“Gene und Klone”,VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990）で見
出されてもよい。
あるいは遺伝子発現のための単一構造の遺伝的修飾（突
然変異）によって減少されてもよい。遺伝子発現のため
の単一構造は、例えばリプレッサー遺伝子、活性遺伝
子、オペレーター、プロモーター、アテニュエーター、
リボソーム結合部位、開始コドンおよびターミネーター
である。これらのデーターは当業者によって、例えば、
特許出願ＷＯ９６／１５２４６、ボイドおよびマーフィ
ー（Boyd and Murphy）（Journal of Bacteriology 17
0: 5949 (1988) ）、ボスキルおよびチャンブレス（Vos
kuil and Chambliss）（Nucleic Acids Research 26: 3
548 (1988)）、ジェンセンおよびハマー（Jensen and H
ammer）（Biotechnology and Bioengineering 58: 191
(1998)）、パテックら（Patek et al.）（Microbiology
142: 1297 (1996)）および遺伝学および分子生物学の
公知の教科書、例えばニッパー（Knipper）による教科
書（“Molekulare Genetik”,第６版, Gerorg Thieme V
erlag, Stuttgart, Germany,1995）またはウィナッカー
（Winnacker）による教科書（“Gene und Klone”,VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990）で見
出されてもよい。
【００３２】酵素タンパク質の触媒的性質を変更または
減少させる突然変異は、従来技術により公知であり；キ
ューおよびグットマン（Qiu and Goodman）による文献
（Journal of Biological Chemistry 272: 8611〜8617
(1997)）、スギモトら（Sugimoto et al.）（Bioscienc
e Biotechnology and Biochemistry 61: 1760〜1762 (1
997)）およびメッヘル（Moeckel）（“Die Threonindeh
ydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung
der allosterischen Regulation und Strukturdes Enz
yms”, Reports from the Juelich Research Centre, J
uel-2906, ISSN09442952, Juelich, Germany, 1994）が
例として挙げられてもよい。簡潔な文献は、遺伝学およ
び分子生物学の公知の教科書、例えばハージマン（Hage
menn）による教科書（“Allgemeine Genetik”, Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986）に見出すことがで
きる。
減少させる突然変異は、従来技術により公知であり；キ
ューおよびグットマン（Qiu and Goodman）による文献
（Journal of Biological Chemistry 272: 8611〜8617
(1997)）、スギモトら（Sugimoto et al.）（Bioscienc
e Biotechnology and Biochemistry 61: 1760〜1762 (1
997)）およびメッヘル（Moeckel）（“Die Threonindeh
ydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung
der allosterischen Regulation und Strukturdes Enz
yms”, Reports from the Juelich Research Centre, J
uel-2906, ISSN09442952, Juelich, Germany, 1994）が
例として挙げられてもよい。簡潔な文献は、遺伝学およ
び分子生物学の公知の教科書、例えばハージマン（Hage
menn）による教科書（“Allgemeine Genetik”, Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986）に見出すことがで
きる。
【００３３】転位、転換、挿入および欠失は突然変異と
みなされる。ミスセンス突然変異またはナンセンス突然
変異は、酵素活性上のアミノ酸置換の影響に依存するも
のと言及される。遺伝子中の塩基対少なくとも一つの挿
入または欠失は、誤ったアミノ酸が組み込まれたかある
いは翻訳が早く終了した結果としてフレームシフト変異
を招く。幾つかのコドンの欠失は、典型的には酵素活性
の完全な失活を招く。これらの型の突然変異を作製する
ための指示は、従来技術の一部分であり、かつ遺伝学お
よび分子生物学の公知の教科書、例えばニッパーによる
教科書（“Molekulare Genetik”,第６版 , Georg Thie
me Verlag, Stuttgart, Germany, 1955）、ウィナッカ
ー（Winnacker）による教科書（“Gene und Klone”, V
CH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990）
またはハージマン（Hagemann）による教科書（“Allgem
eine Genetik”, Gustav Fischer Verlag, Stuuttgart,
1986）で見出されてもよい。
みなされる。ミスセンス突然変異またはナンセンス突然
変異は、酵素活性上のアミノ酸置換の影響に依存するも
のと言及される。遺伝子中の塩基対少なくとも一つの挿
入または欠失は、誤ったアミノ酸が組み込まれたかある
いは翻訳が早く終了した結果としてフレームシフト変異
を招く。幾つかのコドンの欠失は、典型的には酵素活性
の完全な失活を招く。これらの型の突然変異を作製する
ための指示は、従来技術の一部分であり、かつ遺伝学お
よび分子生物学の公知の教科書、例えばニッパーによる
教科書（“Molekulare Genetik”,第６版 , Georg Thie
me Verlag, Stuttgart, Germany, 1955）、ウィナッカ
ー（Winnacker）による教科書（“Gene und Klone”, V
CH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990）
またはハージマン（Hagemann）による教科書（“Allgem
eine Genetik”, Gustav Fischer Verlag, Stuuttgart,
1986）で見出されてもよい。
【００３４】ｚｗａ２遺伝子の挿入突然変異が実施され
たプラスミドの例はｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉｎｔ（図
１）である。
たプラスミドの例はｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉｎｔ（図
１）である。
【００３５】ミードら（Mead et al.）によって記載さ
れている（Bio/Technology 9:657〜663 (1991)）プラス
ミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯから成るプラスミドｐＣＲ
２．１は、配列番号３に示されているｚｗａ２遺伝子の
内在フラグメントが組み込まれている。このプラスミド
は、染色体ｚｗａ２遺伝子中の形質転換および相同組み
換え（挿入）の後に、機能の総合的な損失をまねく。ｚ
ｗａ２遺伝子がスイッチオフされた、菌株ＤＳＭ５７１
５：：ｐＣＲ２．１．ｚｗａ２ｉｎｔは、例えばこの方
法で製造された。挿入突然変異の他の指示および説明
は、例えばシュバルツアーおよびピューラー（Schwarze
r and Puehler）（Bio/Technology 9, 84〜87 (1991)）
またはフィッツパトリックら（Fitzpatrick et al.）
（Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575〜
580 (1994)）で見出すことができる。
れている（Bio/Technology 9:657〜663 (1991)）プラス
ミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯから成るプラスミドｐＣＲ
２．１は、配列番号３に示されているｚｗａ２遺伝子の
内在フラグメントが組み込まれている。このプラスミド
は、染色体ｚｗａ２遺伝子中の形質転換および相同組み
換え（挿入）の後に、機能の総合的な損失をまねく。ｚ
ｗａ２遺伝子がスイッチオフされた、菌株ＤＳＭ５７１
５：：ｐＣＲ２．１．ｚｗａ２ｉｎｔは、例えばこの方
法で製造された。挿入突然変異の他の指示および説明
は、例えばシュバルツアーおよびピューラー（Schwarze
r and Puehler）（Bio/Technology 9, 84〜87 (1991)）
またはフィッツパトリックら（Fitzpatrick et al.）
（Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575〜
580 (1994)）で見出すことができる。
【００３６】さらに、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンを
製造するために、ｚｗａ２遺伝子を転写減衰すると同様
に、示された生合成経路、解糖系、アナプレロティック
反応系、クエン酸回路またはアミノ酸排出系中の一つま
たはそれ以上の酵素を増大させ、特に過剰に発現させる
ことは有利であってもよい。
製造するために、ｚｗａ２遺伝子を転写減衰すると同様
に、示された生合成経路、解糖系、アナプレロティック
反応系、クエン酸回路またはアミノ酸排出系中の一つま
たはそれ以上の酵素を増大させ、特に過剰に発現させる
ことは有利であってもよい。
【００３７】したがって、例えばＬ−リジンの製造のた
めに、次の群 ●ジヒドロピコリネート シンターゼをコードするｄａ
ｐＡ遺伝子（EP-B 0197335）、 ●テトラジヒドロジピコリネート スクシニラーゼ（We
hmann et al., Journalof Bacteriology 180, 3159〜31
65 (1998)）をコードするｄａｐＤ遺伝子、 ●フィードバック耐性アスパルテート キナーゼをコー
ドするｌｙｓＣ遺伝子、 ●スクシニルジアミノピメレート デスクシニラーゼ
（Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 177: 59
91〜5993 (1995)）をコードするｄａｐＥ遺伝子、 ●グリセルアルデヒド−３−リン酸 デヒドロゲナーゼ
をコードするｇａｐ遺伝子（Eikmanns (1992), Journal
of Bacteriology 174: 6076〜6086）、 ●ピルベート カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺
伝子（DE-A-19831609）、 ●マレート：キノン オキシドレダクターゼをコードす
るｍｑｏ遺伝子（Molenaar et al., European Journal
of Biochemistry 254, 395〜403 (1998)）、 ●リジン排出をコードするｌｙｓＥ遺伝子（DE-A-19548
222）から選択された一つまたはそれ以上の遺伝子が同
時に増大され、特に過剰に発現されるか、あるいは増幅
されてもよい。
めに、次の群 ●ジヒドロピコリネート シンターゼをコードするｄａ
ｐＡ遺伝子（EP-B 0197335）、 ●テトラジヒドロジピコリネート スクシニラーゼ（We
hmann et al., Journalof Bacteriology 180, 3159〜31
65 (1998)）をコードするｄａｐＤ遺伝子、 ●フィードバック耐性アスパルテート キナーゼをコー
ドするｌｙｓＣ遺伝子、 ●スクシニルジアミノピメレート デスクシニラーゼ
（Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 177: 59
91〜5993 (1995)）をコードするｄａｐＥ遺伝子、 ●グリセルアルデヒド−３−リン酸 デヒドロゲナーゼ
をコードするｇａｐ遺伝子（Eikmanns (1992), Journal
of Bacteriology 174: 6076〜6086）、 ●ピルベート カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺
伝子（DE-A-19831609）、 ●マレート：キノン オキシドレダクターゼをコードす
るｍｑｏ遺伝子（Molenaar et al., European Journal
of Biochemistry 254, 395〜403 (1998)）、 ●リジン排出をコードするｌｙｓＥ遺伝子（DE-A-19548
222）から選択された一つまたはそれ以上の遺伝子が同
時に増大され、特に過剰に発現されるか、あるいは増幅
されてもよい。
【００３８】さらに、アミノ酸、特にＬ−リジンを生産
するために、ｚｗａ２遺伝子に加えて次の群、 ●ホスフェート ピルベート カルボキシラーゼをコー
ドする遺伝子（DE19950409.1; DSM13047）および／また
は ●グルコース−６−リン酸イソメラーゼをコードするｐ
ｇｉ遺伝子（US 09/396478; DSM12969）を同時に転写減
衰することも有利であってもよい。
するために、ｚｗａ２遺伝子に加えて次の群、 ●ホスフェート ピルベート カルボキシラーゼをコー
ドする遺伝子（DE19950409.1; DSM13047）および／また
は ●グルコース−６−リン酸イソメラーゼをコードするｐ
ｇｉ遺伝子（US 09/396478; DSM12969）を同時に転写減
衰することも有利であってもよい。
【００３９】さらに、アミノ酸、特にＬ−リジンを製造
するために、ｚｗａ２遺伝子を転写減衰することに加え
て、望ましくない２次反応をスイッチオフすることは有
利であってもよい（Nakayama: “Breeding of Amino Ac
id Producing Micro-organisms”, in: Overproduction
of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek
(eds.), Academic Press, London, UK, 1982）。
するために、ｚｗａ２遺伝子を転写減衰することに加え
て、望ましくない２次反応をスイッチオフすることは有
利であってもよい（Nakayama: “Breeding of Amino Ac
id Producing Micro-organisms”, in: Overproduction
of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek
(eds.), Academic Press, London, UK, 1982）。
【００４０】また、請求項１に記載のポリヌクレオチド
を有する微生物は、本発明によって提供されてもよく、
かつ、アミノ酸、特にＬ−リジンを製造するために、回
分法または半回分法または反復半回分法で、連続的にま
たは回分的に培養されてもよい。公知の培養方法の概要
は、シュミール（Schmiel）による教科書（Bioprozesst
echnik1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik
(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)）またはス
トーハス（Storhas）による教科書(Bioreaktroren und
Periphere Einrichtungen（Vieweg Verlag, Braunschwe
ig/Wiesbaden, 1994））に記載されている。
を有する微生物は、本発明によって提供されてもよく、
かつ、アミノ酸、特にＬ−リジンを製造するために、回
分法または半回分法または反復半回分法で、連続的にま
たは回分的に培養されてもよい。公知の培養方法の概要
は、シュミール（Schmiel）による教科書（Bioprozesst
echnik1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik
(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)）またはス
トーハス（Storhas）による教科書(Bioreaktroren und
Periphere Einrichtungen（Vieweg Verlag, Braunschwe
ig/Wiesbaden, 1994））に記載されている。
【００４１】使用されるべき培地は、適した方法で特別
な菌株の要求を満たすものでなければならない。異なる
微生物のための培地の記載は、アメリカン・ソサエティ
ー・フォー・バクテリオロジー（American Society for
bacteriology）（Washington D.C., USA, 1981）によ
る解説書“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏ
ｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”中で
得られる。使用されてもよい炭素源は糖および炭化水
素、例えばグルコース、ショ糖、ラクトース、フルクト
ース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、
油および脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油お
よびココナッツバター、脂肪酸、例えばパルミチン酸、
ステアリン酸およびリノレイン酸、アルコール、例えば
グリセロールおよびエタノールならびに有機酸、例えば
酢酸である。これらの物質は別個にかあるいは混合物と
して使用されてもよい。使用されてもよい窒素源は窒素
含有有機化合物、例えばペプトン、イーストエクストラ
クト、肉エキス、麦芽エキス、コーン浸漬液、大豆ミー
ルおよび尿素または無機酸、例えば硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニ
ウムおよび硝酸アンモニウムである。窒素源は別個にか
混合物として使用されてもよい。使用されてもよいリン
源はリン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二
カリウムまたは相当するナトリウム含有塩である。ま
た、培地は成長過程に必要な金属塩、例えば硫酸マグネ
シウムまたは硫酸鉄を含むべきである。最後に、必須成
長物質、例えばアミノ酸およびビタミンは、前記の物質
に加えて添加されてもよい。これに加えて、適した前駆
物質は培地に添加されてもよい。挙げられてもよい供給
物質は単一混合物の形で培養に添加されてもよいし、あ
るいは適した方法で培養中に少しずつ供給されてもよ
い。
な菌株の要求を満たすものでなければならない。異なる
微生物のための培地の記載は、アメリカン・ソサエティ
ー・フォー・バクテリオロジー（American Society for
bacteriology）（Washington D.C., USA, 1981）によ
る解説書“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏ
ｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”中で
得られる。使用されてもよい炭素源は糖および炭化水
素、例えばグルコース、ショ糖、ラクトース、フルクト
ース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、
油および脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油お
よびココナッツバター、脂肪酸、例えばパルミチン酸、
ステアリン酸およびリノレイン酸、アルコール、例えば
グリセロールおよびエタノールならびに有機酸、例えば
酢酸である。これらの物質は別個にかあるいは混合物と
して使用されてもよい。使用されてもよい窒素源は窒素
含有有機化合物、例えばペプトン、イーストエクストラ
クト、肉エキス、麦芽エキス、コーン浸漬液、大豆ミー
ルおよび尿素または無機酸、例えば硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニ
ウムおよび硝酸アンモニウムである。窒素源は別個にか
混合物として使用されてもよい。使用されてもよいリン
源はリン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二
カリウムまたは相当するナトリウム含有塩である。ま
た、培地は成長過程に必要な金属塩、例えば硫酸マグネ
シウムまたは硫酸鉄を含むべきである。最後に、必須成
長物質、例えばアミノ酸およびビタミンは、前記の物質
に加えて添加されてもよい。これに加えて、適した前駆
物質は培地に添加されてもよい。挙げられてもよい供給
物質は単一混合物の形で培養に添加されてもよいし、あ
るいは適した方法で培養中に少しずつ供給されてもよ
い。
【００４２】培養のｐＨを調整するために、塩基性化合
物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモ
ニアまたはアンモニア水溶液、または酸性化合物、例え
ばリン酸または硫酸は適切な方法で使用される。気泡形
成を調節するために、起泡抑制剤、例えば脂肪酸ポリグ
リコールエステルを使用することができる。プラスミド
安定性を維持するために、適した選択的物質、例えば抗
生物質は培地に添加されてもよい。好気条件を維持する
ために、酸素または酸素含有混合物、例えば空気は培養
に通されてもよい。培養温度は通常２０℃〜４５℃であ
り、かつ好ましくは２５℃〜４０℃である。培養は、最
大のリジン濃度が生産されるまで培養される。この目的
は通常１０時間〜１６０時間内に達成される。
物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモ
ニアまたはアンモニア水溶液、または酸性化合物、例え
ばリン酸または硫酸は適切な方法で使用される。気泡形
成を調節するために、起泡抑制剤、例えば脂肪酸ポリグ
リコールエステルを使用することができる。プラスミド
安定性を維持するために、適した選択的物質、例えば抗
生物質は培地に添加されてもよい。好気条件を維持する
ために、酸素または酸素含有混合物、例えば空気は培養
に通されてもよい。培養温度は通常２０℃〜４５℃であ
り、かつ好ましくは２５℃〜４０℃である。培養は、最
大のリジン濃度が生産されるまで培養される。この目的
は通常１０時間〜１６０時間内に達成される。
【００４３】Ｌ−アミノ酸を測定する方法は従来技術か
ら公知である。分析はスッパクマンら（Spackmann et a
l.）で記載されたように、アニオンクロマトグラフィー
に引き続いてのニンヒドリン誘導体化（Analytical Che
mistry, 30, (1958), 1190）またはリンドロースら（Li
ndroth et al.）で記載されたように逆相ＨＰＬＣ（Ana
lytical Chemistry (1979) 51: 1167〜1174）を用いて
実施されてもよい。
ら公知である。分析はスッパクマンら（Spackmann et a
l.）で記載されたように、アニオンクロマトグラフィー
に引き続いてのニンヒドリン誘導体化（Analytical Che
mistry, 30, (1958), 1190）またはリンドロースら（Li
ndroth et al.）で記載されたように逆相ＨＰＬＣ（Ana
lytical Chemistry (1979) 51: 1167〜1174）を用いて
実施されてもよい。
【００４４】次の突然変異に適した組み込みベクター
は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でブタペスト条約に従って、ドイチ
ェ・ザンムルング・フォン・ツエルカルトウーレン（DS
MZ, Brauschweig, Germany）（Germann Collection for
Microorganisms and cell Cultures）で寄託されてい
る： ●ＤＳＭ１３１１３としてのＥ．ｃｏｌｉ（Escherichi
a coli）菌株ＴＯＰ１０Ｆ’／ｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉ
ｎｔ ｚｗａ２遺伝子の転写減衰に加えて、ｚｗａ１遺伝子を
増大させるか、あるいは関連するＺｗａ１遺伝子生成物
の効果を増大させることは有利であってよい。相応する
遺伝子および関連する方法は、本明細書と同時に出願さ
れたドイツ特許出願第１９９５９３２８．０号中で見出
すことができる。
は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でブタペスト条約に従って、ドイチ
ェ・ザンムルング・フォン・ツエルカルトウーレン（DS
MZ, Brauschweig, Germany）（Germann Collection for
Microorganisms and cell Cultures）で寄託されてい
る： ●ＤＳＭ１３１１３としてのＥ．ｃｏｌｉ（Escherichi
a coli）菌株ＴＯＰ１０Ｆ’／ｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉ
ｎｔ ｚｗａ２遺伝子の転写減衰に加えて、ｚｗａ１遺伝子を
増大させるか、あるいは関連するＺｗａ１遺伝子生成物
の効果を増大させることは有利であってよい。相応する
遺伝子および関連する方法は、本明細書と同時に出願さ
れたドイツ特許出願第１９９５９３２８．０号中で見出
すことができる。
【００４５】突然変異体ｐＣＲ２．ｌｚｗａｌｅｘｐに
適した組み込みベクターをＤＳＭ１３１１５でＥ．ｃｏ
ｌｉ ＤＨ５α中にＤＳＭ１３１１５として寄託した。
適した組み込みベクターをＤＳＭ１３１１５でＥ．ｃｏ
ｌｉ ＤＨ５α中にＤＳＭ１３１１５として寄託した。
【００４６】
【実施例】本発明は次に、実施例を用いてより詳細に説
明された。
明された。
【００４７】例１ コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２からのゲノミックコスミド遺伝子ライブラリーの製造 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２からの染色体ＤＮＡをタウチら（Tauch et al.）によ
って記載された方法で単離し（1955, Plasmid33: 168〜
179）、かつ制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmaci
a, Freiburg,Germany, product description Sau3AI, c
ode no. 27-0913-02）で部分的に切断した。ＤＮＡフラ
グメントをエビ アルカリホスファターゼ（Roche Mole
cularBiochemicals, Mannheim, Germany, product desc
ription SAP, Code no. 1758250）で脱リン酸化した。
ストラタジーン社（Stratagene Co.）（La Jolla, USA,
prosuct description SuperCos1 cosmid vector kit, C
ode no. 251301）から購入したコスミドベクターＳｕｐ
ｅｒ Ｃｏｓ１からのＤＮＡ（Wahl et al. (1987) Pro
ceedings of the National Academy of Sciences USA 8
4: 2160〜2164）を制限酵素ＸｂａＩ（Amersham Pharma
cia, Freiburg, Germany, product description XbaI c
ode no. 27-0948-02）で切断し、かつさらにエビ アル
カリホスファターゼで脱リン酸化した。その後に、コス
ミドＤＮＡを制限酵素ＢａmＨＩ（Amersham Pharmacia,
Freiburg, Germany, product description BamHI, Cod
e no. 27-0868-04）で切断した。この方法で処理された
コスミドＤＮＡを、処理されたＡＴＣＣ１３０３２のＤ
ＮＡと混合させ、かつこの混合物をＴ４−ＤＮＡ−リガ
ーゼ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, produ
ct descriptionT4-DNA-Ligase, code no.27-870-04）で
処理した。ライゲーション混合物をその後にギガパック
ＩＩ XL パッキングエクストラクト（Stratagene, La
Jolla, USA, product description Gigapack II XL pa
cking extract, Code no. 200217）を用いてファージ中
にパッキングした。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＮＭ５５４（Rale
igh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563〜1
575）を感染させるために、細胞を１０ｍＭ ＭｇＳＯ
４中に入れ、かつファージ懸濁液のアリコートと混合さ
せた。コスミドライブラリーの感染および標準化（stan
dardisation）をザンブルックら（sambrook et al.）
（1989, Molecular Cloning: A laboratoryManual, Col
d sprong Harbor）で示されたように実施し、この場合
この細胞を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ
アガー（Lennox 1955, Virology, 1:190）上に播いた。
３７℃で一晩に亘っての培養の後に、個々の組み換えク
ローンを選択した。
２からのゲノミックコスミド遺伝子ライブラリーの製造 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２からの染色体ＤＮＡをタウチら（Tauch et al.）によ
って記載された方法で単離し（1955, Plasmid33: 168〜
179）、かつ制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmaci
a, Freiburg,Germany, product description Sau3AI, c
ode no. 27-0913-02）で部分的に切断した。ＤＮＡフラ
グメントをエビ アルカリホスファターゼ（Roche Mole
cularBiochemicals, Mannheim, Germany, product desc
ription SAP, Code no. 1758250）で脱リン酸化した。
ストラタジーン社（Stratagene Co.）（La Jolla, USA,
prosuct description SuperCos1 cosmid vector kit, C
ode no. 251301）から購入したコスミドベクターＳｕｐ
ｅｒ Ｃｏｓ１からのＤＮＡ（Wahl et al. (1987) Pro
ceedings of the National Academy of Sciences USA 8
4: 2160〜2164）を制限酵素ＸｂａＩ（Amersham Pharma
cia, Freiburg, Germany, product description XbaI c
ode no. 27-0948-02）で切断し、かつさらにエビ アル
カリホスファターゼで脱リン酸化した。その後に、コス
ミドＤＮＡを制限酵素ＢａmＨＩ（Amersham Pharmacia,
Freiburg, Germany, product description BamHI, Cod
e no. 27-0868-04）で切断した。この方法で処理された
コスミドＤＮＡを、処理されたＡＴＣＣ１３０３２のＤ
ＮＡと混合させ、かつこの混合物をＴ４−ＤＮＡ−リガ
ーゼ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, produ
ct descriptionT4-DNA-Ligase, code no.27-870-04）で
処理した。ライゲーション混合物をその後にギガパック
ＩＩ XL パッキングエクストラクト（Stratagene, La
Jolla, USA, product description Gigapack II XL pa
cking extract, Code no. 200217）を用いてファージ中
にパッキングした。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＮＭ５５４（Rale
igh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563〜1
575）を感染させるために、細胞を１０ｍＭ ＭｇＳＯ
４中に入れ、かつファージ懸濁液のアリコートと混合さ
せた。コスミドライブラリーの感染および標準化（stan
dardisation）をザンブルックら（sambrook et al.）
（1989, Molecular Cloning: A laboratoryManual, Col
d sprong Harbor）で示されたように実施し、この場合
この細胞を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ
アガー（Lennox 1955, Virology, 1:190）上に播いた。
３７℃で一晩に亘っての培養の後に、個々の組み換えク
ローンを選択した。
【００４８】例２ ｚｗａ２遺伝子の単離およびシークエンシング 個々のコロニーからのコスミドＤＮＡを、キアプレップ
スピン ミニプレップ キット（Product No.27106,
Qiagen, Hilden, Germany）を用いて製品データに従っ
て単離し、かつ部分的に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersh
am Pharmacia,Freiburg, Germany, product descriptio
n Sau3AI, Product No. 27-0913-02）で切断した。ＤＮ
Ａフラグメントをエビ アルカリホスファターゼ（shri
mp alkaline phosphatase）（Roche Molecular Biochem
icals, Mannheim, Germany, produce descriotion SAP,
Product No. 1758250）で脱リン酸化した。ゲル電気泳
動での分離の後に、１５００〜２０００の大きさの範囲
のコスミドフラグメントをキアＥｘＩＩゲル抽出キット
（product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany）を用
いて単離した。インビトロジェン社（Invitrogen Co.）
から購入したシークエンシングベクターｐＺｅｒｏ−１
（Groningen, the Netherlands, productdescription z
ero background cloning kit, 製品番号K2500-01）から
のＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmaci
a, Freiburg, Germany, product description BamHI,
製品番号27-0868-04）を用いて切断した。コスミドフラ
グメントをザンブルックら（Sambrook et al.）（1989,
Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spri
ng Harbor）で記載されたような方法を用いてシークエ
ンシングベクターｐＺｅｒｏ−１中にライゲートし、こ
の場合、このＤＮＡ混合物をＴ４リガーゼ（Pharmacia
Biotech, Freiburg, Germany）と一緒に一晩に亘ってイ
ンキュベートした。その後にこのライゲーション混合物
をＥ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Grant, 1990, Pro
ceedinds of the National Academy ofＳciences U.S.
A., 87: 4645〜4649）中に電気穿孔し（Tauch et al. 1
994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343〜７）、かつ
ゼオシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢアガー（Lennox, 19
55, Virology, 1: 190）上に播いた。組み換えクローン
のプラスミド製造はバイオロボット９６００（Biorobot
9600）（製品番号９００２００, Qiagen, Hilden, Ger
many）を用いて達成した。シークエンシングは、ツイメ
ルマンら（Zimmermann et al.）（1990, Nucleic Acids
Research, 18: 1067）によって修正された、サンガー
ら（Sanger et al.）（1977, Proceedingdof the Natio
nal Academy od Sciences U.S.A., 74: 5463〜5467）に
よるジデオキシ連鎖停止法を用いて達成した。ＰＥ ア
プライド バイオシステムズ社（PEApplied Biosystem
s）からの“ＲＲ ｄローダミン ターミネーター サ
イクル シークエンシング キット（RR dRhodamin Ter
minator Cycle Sequencing Kit）”を使用した。ゲル電
気泳動の分離およびシークエンシング反応の分析を“ロ
ーチホレス ＮＦ アクリルアミド／ビスアクリルアミ
ド（Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid）”ゲル
（２９：１）（製品番号 A124.1, Roth, Karlsruhe, G
ermany）中でＰＥ アプライド バイオシステムズ（PE
Applied Biosystems）（Weiterstadt, Germany）から
の“ＡＢＩ プリズム ３７７”シークエンシング装置
を用いて実施した。
スピン ミニプレップ キット（Product No.27106,
Qiagen, Hilden, Germany）を用いて製品データに従っ
て単離し、かつ部分的に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersh
am Pharmacia,Freiburg, Germany, product descriptio
n Sau3AI, Product No. 27-0913-02）で切断した。ＤＮ
Ａフラグメントをエビ アルカリホスファターゼ（shri
mp alkaline phosphatase）（Roche Molecular Biochem
icals, Mannheim, Germany, produce descriotion SAP,
Product No. 1758250）で脱リン酸化した。ゲル電気泳
動での分離の後に、１５００〜２０００の大きさの範囲
のコスミドフラグメントをキアＥｘＩＩゲル抽出キット
（product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany）を用
いて単離した。インビトロジェン社（Invitrogen Co.）
から購入したシークエンシングベクターｐＺｅｒｏ−１
（Groningen, the Netherlands, productdescription z
ero background cloning kit, 製品番号K2500-01）から
のＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmaci
a, Freiburg, Germany, product description BamHI,
製品番号27-0868-04）を用いて切断した。コスミドフラ
グメントをザンブルックら（Sambrook et al.）（1989,
Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spri
ng Harbor）で記載されたような方法を用いてシークエ
ンシングベクターｐＺｅｒｏ−１中にライゲートし、こ
の場合、このＤＮＡ混合物をＴ４リガーゼ（Pharmacia
Biotech, Freiburg, Germany）と一緒に一晩に亘ってイ
ンキュベートした。その後にこのライゲーション混合物
をＥ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Grant, 1990, Pro
ceedinds of the National Academy ofＳciences U.S.
A., 87: 4645〜4649）中に電気穿孔し（Tauch et al. 1
994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343〜７）、かつ
ゼオシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢアガー（Lennox, 19
55, Virology, 1: 190）上に播いた。組み換えクローン
のプラスミド製造はバイオロボット９６００（Biorobot
9600）（製品番号９００２００, Qiagen, Hilden, Ger
many）を用いて達成した。シークエンシングは、ツイメ
ルマンら（Zimmermann et al.）（1990, Nucleic Acids
Research, 18: 1067）によって修正された、サンガー
ら（Sanger et al.）（1977, Proceedingdof the Natio
nal Academy od Sciences U.S.A., 74: 5463〜5467）に
よるジデオキシ連鎖停止法を用いて達成した。ＰＥ ア
プライド バイオシステムズ社（PEApplied Biosystem
s）からの“ＲＲ ｄローダミン ターミネーター サ
イクル シークエンシング キット（RR dRhodamin Ter
minator Cycle Sequencing Kit）”を使用した。ゲル電
気泳動の分離およびシークエンシング反応の分析を“ロ
ーチホレス ＮＦ アクリルアミド／ビスアクリルアミ
ド（Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid）”ゲル
（２９：１）（製品番号 A124.1, Roth, Karlsruhe, G
ermany）中でＰＥ アプライド バイオシステムズ（PE
Applied Biosystems）（Weiterstadt, Germany）から
の“ＡＢＩ プリズム ３７７”シークエンシング装置
を用いて実施した。
【００４９】得られた粗シークエンシングデータをその
後にスターデン ソフトウェア パーッケージ（Staden
software package）（1986, Nucleic Acids Research,
14:217〜231）バージョン９７−０を用いて続けた。ｐ
Ｚｅｒｏ１誘導体中の個々の配列をまとまったコンティ
グに組み立てた。コンピューター処理によるコーディン
グ領域の分析を、XNIPプログラムを用いて（Staden, 19
86, Nucleic AcidsResearch, 14: 217〜231）作製し
た。相補性（homology）の分析を、“NationalCenter f
or Biotechnology Information”（NCBI, Bethesda, M
D, USA）の非冗長的データバンクに対して“BLAST sera
ch programs”（Altschul et al., 1997, Nucleic acid
s Research, 25: 3389〜3402）を用いて実施した。
後にスターデン ソフトウェア パーッケージ（Staden
software package）（1986, Nucleic Acids Research,
14:217〜231）バージョン９７−０を用いて続けた。ｐ
Ｚｅｒｏ１誘導体中の個々の配列をまとまったコンティ
グに組み立てた。コンピューター処理によるコーディン
グ領域の分析を、XNIPプログラムを用いて（Staden, 19
86, Nucleic AcidsResearch, 14: 217〜231）作製し
た。相補性（homology）の分析を、“NationalCenter f
or Biotechnology Information”（NCBI, Bethesda, M
D, USA）の非冗長的データバンクに対して“BLAST sera
ch programs”（Altschul et al., 1997, Nucleic acid
s Research, 25: 3389〜3402）を用いて実施した。
【００５０】ｚｗａ２遺伝子のために得られたヌクレオ
チド配列は、配列番号１に示されている。ヌクレオチド
配列の分析は、１７４０塩基対の転写解読枠をもたら
し、この場合、これはｚｗａ２遺伝子と呼称された。ｚ
ｗａ２遺伝子は、配列番号２に示された３８５個のアミ
ノ酸のポリペプチドをコードした。
チド配列は、配列番号１に示されている。ヌクレオチド
配列の分析は、１７４０塩基対の転写解読枠をもたら
し、この場合、これはｚｗａ２遺伝子と呼称された。ｚ
ｗａ２遺伝子は、配列番号２に示された３８５個のアミ
ノ酸のポリペプチドをコードした。
【００５１】例３ ｚｗａ２遺伝子の挿入突然変異に対する組み込みベクタ
ーの製造 菌株ＡＴＣＣ１３０３２からの染色体ＤＮＡをエイクマ
ンら（Eikmanns et al.）の方法によって単離される（M
icrobiology 140: 1817〜1828 (1994)）。例２でＣ．グ
ルタミクムのために開示されたｚｗａ２遺伝子のための
配列に基づいて、次のオリゴヌクレオチドをポリメラー
ゼ連鎖反応のために選択した：
ーの製造 菌株ＡＴＣＣ１３０３２からの染色体ＤＮＡをエイクマ
ンら（Eikmanns et al.）の方法によって単離される（M
icrobiology 140: 1817〜1828 (1994)）。例２でＣ．グ
ルタミクムのために開示されたｚｗａ２遺伝子のための
配列に基づいて、次のオリゴヌクレオチドをポリメラー
ゼ連鎖反応のために選択した：
【００５２】
【外１】
【００５３】示されたプライマーをＭＷＧバイオテク社
（MWG Biotech Co.）（Ebersberg,Germany）によって合
成し、かつＰＣＲ反応をイニスら（Innis et al.）の標
準ＰＣＲ方法を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって
ベーリンガー社（Boehringer Co.）からのＰｗｏポリメ
ラーゼを用いて実施し（PCR protocols. A guide to me
thods and applications, 1990, Academic Press）、配
列番号３に示されている約０．６ｋｂの大きさのＤＮＡ
フラグメントを単離し、この場合、このフラグメントは
ｚｗａ２遺伝子の内在フラグメントを含む。
（MWG Biotech Co.）（Ebersberg,Germany）によって合
成し、かつＰＣＲ反応をイニスら（Innis et al.）の標
準ＰＣＲ方法を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって
ベーリンガー社（Boehringer Co.）からのＰｗｏポリメ
ラーゼを用いて実施し（PCR protocols. A guide to me
thods and applications, 1990, Academic Press）、配
列番号３に示されている約０．６ｋｂの大きさのＤＮＡ
フラグメントを単離し、この場合、このフラグメントは
ｚｗａ２遺伝子の内在フラグメントを含む。
【００５４】増幅されたＤＮＡフラグメントを、インビ
トロジェン社（Invitrogen Corporation）からのＴＯＰ
Ｏ ＴＡ クローニング キットで、ベクターｐＣＲ
２．１−ＴＯＰＯ（Mead et al. (1991) Bio/Technolog
y 9: 657〜663）中にライゲートした。Ｅ．Ｃｏｌｉ菌
株 Ｔｏｐ１０Ｆ’をライゲーション混合物を用いて電
気穿孔した（Hanahan, In: DNA cloning. A practical
approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington D
C, USA）。プラスミドを有する細胞を、カナマイシン２
５ｍｇ／ｌが補われているＬＢアガー（Sambrook et a
l., Molecular cloning: a laboratory manual. 2ｎｄ
Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spri
ng Harbor, N.Y.）上で形質転換回分を播くことによっ
て得た。プラスミドＤＮＡをキアジェン社（Qiagen C
o.）からのキアプレップ スピン ミニプレップ キッ
ト（QIAprep spin miniprep kit）を用いて形質転換体
の一つから単離し、かつ制限酵素ＥｃｏＲＩを用いての
制限、引き続いてのアガロースゲル電気泳動（０．８
％）によって試験した。プラスミドをｐＣＲ２．１ｚｗ
ａ２ｉｎｔと名付けた。
トロジェン社（Invitrogen Corporation）からのＴＯＰ
Ｏ ＴＡ クローニング キットで、ベクターｐＣＲ
２．１−ＴＯＰＯ（Mead et al. (1991) Bio/Technolog
y 9: 657〜663）中にライゲートした。Ｅ．Ｃｏｌｉ菌
株 Ｔｏｐ１０Ｆ’をライゲーション混合物を用いて電
気穿孔した（Hanahan, In: DNA cloning. A practical
approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington D
C, USA）。プラスミドを有する細胞を、カナマイシン２
５ｍｇ／ｌが補われているＬＢアガー（Sambrook et a
l., Molecular cloning: a laboratory manual. 2ｎｄ
Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spri
ng Harbor, N.Y.）上で形質転換回分を播くことによっ
て得た。プラスミドＤＮＡをキアジェン社（Qiagen C
o.）からのキアプレップ スピン ミニプレップ キッ
ト（QIAprep spin miniprep kit）を用いて形質転換体
の一つから単離し、かつ制限酵素ＥｃｏＲＩを用いての
制限、引き続いてのアガロースゲル電気泳動（０．８
％）によって試験した。プラスミドをｐＣＲ２．１ｚｗ
ａ２ｉｎｔと名付けた。
【００５５】例４ ｚｗａ２遺伝子のリジン製造体ＤＳＭ５７１５への組み
込み突然変異誘発 例２でｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉｎｔと呼称されたベクタ
ーを、コリネバクテリウム グルタミクム ＤＳＭ５７
１５中に、タウチら（Tauch et al.）の電気穿孔法（FE
MS Microbiological Letters, 123: 343〜347 (1994)）
を用いて電気穿孔した。菌株ＤＳＭ５７１５はＡＥＣ−
耐性リジン生産体である。ベクターｐＣＲ２．１ｚｗａ
２ｉｎｔは、自動的にＤＳＭ５７１５中で複製すること
ができず、かつそれがＤＳＭ５７１５の染色体中に組み
込まれる場合には、単に細胞中で維持される。染色体中
に組み込まれたｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉｎｔを有するク
ローンの選択は、カナマイシン１５ｍｇ／ｌが補われて
いるＬＢアガー（Sambrooket al., Molecular cloning:
a Laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor L
aboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）
上に電気穿孔回分を播くことによって達成された。組み
込みを検出するために、コントロール群のＰＣＲ反応
を、イニスら（Innis et al.）の標準反応を用いて、ベ
ーリンガー社（Boehringer Co.）からのＰｗｏポリメラ
ーゼを用いて実施した。プライマーｚｗａｌ−ｉｎ１お
よびｚｗａ２−ｉｎ２（例３参照）と、ベクターｐＣＲ
２．１ｚｗａ２ｉｎｔの配列の範囲内でのみ結合しても
よい、プライマーＭ１３ユニバーサル フォワード
（５’−gttttcccagtcacgac−３’；Invitrogen Corpor
ation,Cat. No. N540-02）およびＭ１３ユニバーサル
リバース（５’−caggaaacagctatgac−３’；invitorog
en Corporation, Cat. No. N530-02）を組み合わせるこ
とによって、プラスミドｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉｎｔが
リジン生産体ＤＳＭ５７１５の染色体中の染色体ｚｗａ
２遺伝子内で挿入されていることを示すことができる。
この菌株はＤＳＭ５７１５：：ｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉ
ｎｔと呼称された。
込み突然変異誘発 例２でｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉｎｔと呼称されたベクタ
ーを、コリネバクテリウム グルタミクム ＤＳＭ５７
１５中に、タウチら（Tauch et al.）の電気穿孔法（FE
MS Microbiological Letters, 123: 343〜347 (1994)）
を用いて電気穿孔した。菌株ＤＳＭ５７１５はＡＥＣ−
耐性リジン生産体である。ベクターｐＣＲ２．１ｚｗａ
２ｉｎｔは、自動的にＤＳＭ５７１５中で複製すること
ができず、かつそれがＤＳＭ５７１５の染色体中に組み
込まれる場合には、単に細胞中で維持される。染色体中
に組み込まれたｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉｎｔを有するク
ローンの選択は、カナマイシン１５ｍｇ／ｌが補われて
いるＬＢアガー（Sambrooket al., Molecular cloning:
a Laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor L
aboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）
上に電気穿孔回分を播くことによって達成された。組み
込みを検出するために、コントロール群のＰＣＲ反応
を、イニスら（Innis et al.）の標準反応を用いて、ベ
ーリンガー社（Boehringer Co.）からのＰｗｏポリメラ
ーゼを用いて実施した。プライマーｚｗａｌ−ｉｎ１お
よびｚｗａ２−ｉｎ２（例３参照）と、ベクターｐＣＲ
２．１ｚｗａ２ｉｎｔの配列の範囲内でのみ結合しても
よい、プライマーＭ１３ユニバーサル フォワード
（５’−gttttcccagtcacgac−３’；Invitrogen Corpor
ation,Cat. No. N540-02）およびＭ１３ユニバーサル
リバース（５’−caggaaacagctatgac−３’；invitorog
en Corporation, Cat. No. N530-02）を組み合わせるこ
とによって、プラスミドｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉｎｔが
リジン生産体ＤＳＭ５７１５の染色体中の染色体ｚｗａ
２遺伝子内で挿入されていることを示すことができる。
この菌株はＤＳＭ５７１５：：ｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉ
ｎｔと呼称された。
【００５６】例５ リジンの生産 例３で得られたＣ．グルタミクム菌株ＤＳＭ５７１
５：：ｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉｎｔをリジン生産に適し
た栄養媒体中で培養し、かつ培養懸濁液中のリジン濃度
を測定した。
５：：ｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉｎｔをリジン生産に適し
た栄養媒体中で培養し、かつ培養懸濁液中のリジン濃度
を測定した。
【００５７】これを行うために、菌株は最初に、相当す
る抗生物質を含むアガープレート（カナマイシン（２５
ｍｇ／ｌ）を含む脳／心臓アガー）上で、３３℃で２４
時間に亘って培養した。このアガープレート培養から出
発して、前培養を接種した（１００ｍｌのコニカルフラ
スコ中の培地１０ｍｌ）。完全培地ＣｇＩＩＩを前培養
のための培地として使用した。カナマイシン（２５ｍｇ
／ｌ）をこれに添加した。前培養を３３℃で４８時間に
亘って、振とう器上で２４０ｒｐｍで培養した。主培養
をこの前培養物を用いて接種し、したがって主培養物の
最初のＯＤ（６６０ｎｍ）は０．１であった。ＭＭ培地
を主培養に使用した。
る抗生物質を含むアガープレート（カナマイシン（２５
ｍｇ／ｌ）を含む脳／心臓アガー）上で、３３℃で２４
時間に亘って培養した。このアガープレート培養から出
発して、前培養を接種した（１００ｍｌのコニカルフラ
スコ中の培地１０ｍｌ）。完全培地ＣｇＩＩＩを前培養
のための培地として使用した。カナマイシン（２５ｍｇ
／ｌ）をこれに添加した。前培養を３３℃で４８時間に
亘って、振とう器上で２４０ｒｐｍで培養した。主培養
をこの前培養物を用いて接種し、したがって主培養物の
最初のＯＤ（６６０ｎｍ）は０．１であった。ＭＭ培地
を主培養に使用した。
【００５８】 ＭＭ培地 ＣＳＬ（コーン浸漬液） ５ｇ／ｌ ＭＯＰＳ ２０ｇ／ｌ グルコース（別個にオートクレーブしたもの） ５０ｇ／ｌ 塩： （ＮＨ４）２ＳＯ４ ２５ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．０ｇ／ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ５．０ｍｇ／ｌ ビオチン（濾過滅菌したもの） ０．３ｍｇ／ｌ チアミン・ＨＣｌ（濾過滅菌したもの） ０．２ｍｇ／ｌ ロイシン（濾過滅菌したもの） ０．１ｇ／ｌ ＣａＣＯ３ ２５ｇ／ｌ ＣＳＬ、ＭＯＰＳおよび塩溶液をアンモニア水溶液を用
いてｐＨ７に調整し、かつオートクレーブした。その後
に滅菌物質およびビタミン溶液、ならびに乾式オートク
レーブされたＣａＣＯ３を添加した。
いてｐＨ７に調整し、かつオートクレーブした。その後
に滅菌物質およびビタミン溶液、ならびに乾式オートク
レーブされたＣａＣＯ３を添加した。
【００５９】培養を、バッフルを備えた１００ｍｌのコ
ニカルフラスコ中で１０ｍｌの容量で実施した。カナマ
イシン（２５ｍｇ／ｌ）を添加した。培養を３３℃で大
気湿分８０％で実施した。
ニカルフラスコ中で１０ｍｌの容量で実施した。カナマ
イシン（２５ｍｇ／ｌ）を添加した。培養を３３℃で大
気湿分８０％で実施した。
【００６０】４８時間の後に、ＯＤを６６０ｎｍの測定
波長で、バイオメク１０００（Biomek 1000）（Backman
n Instruments GｍbH, Munich）を用いて測定した。生
産されたリジン量は、エッペンドルフ−ビオトロニク社
（Eppendorf-BioTronik Co.）（Hamburg, Germany）か
らのアミノ酸分析器を用いて、イオン交換クロマトグラ
フィーおよびニンヒドリン検出を含むポストカラム誘導
体化（post-column derivasation）によって測定した。
波長で、バイオメク１０００（Biomek 1000）（Backman
n Instruments GｍbH, Munich）を用いて測定した。生
産されたリジン量は、エッペンドルフ−ビオトロニク社
（Eppendorf-BioTronik Co.）（Hamburg, Germany）か
らのアミノ酸分析器を用いて、イオン交換クロマトグラ
フィーおよびニンヒドリン検出を含むポストカラム誘導
体化（post-column derivasation）によって測定した。
【００６１】第１表はこの試験結果を示す。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【配列表】
【００６４】
【外２】
【００６５】
【外３】
【００６６】
【外４】
【００６７】
【外５】
【図１】プラスミドｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉｎｔの制限
地図
地図
ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ：プラスミドＣｏｌＥ１の複製起点 ｌａｃＺ：β−ガラクトシダーゼの５’末端 ｆ１ ｏｒｉ：ファージｆ１の複製起点 ＫａｎＲ：カナマイシン耐性 ＡｐＲ：アンピシリン耐性 ＥｃｏＲＩ：制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位 ｚｗａ２：ｚｗａ２遺伝子の内在フラグメント
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｘ (72)発明者 アンケ ヴァイセンボルン ドイツ連邦共和国 テュービンゲン ファ ルケンヴェーク 66 (72)発明者 ヴァルター プフェフェルレ ドイツ連邦共和国 ハレ ヤーンシュトラ ーセ 33 (72)発明者 アーヒム マルクス ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト アル テンブレーデ ４ベー (72)発明者 アルフレート ピューラー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト アム ヴァルトシュレスヒェン ２ (72)発明者 イェルン カリノフスキ ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト レン バッハシュトラーセ 19 (72)発明者 ブリギッテ バーテ ドイツ連邦共和国 ザルツコッテン ツヴ ィーテン １ (72)発明者 ニコル ドゥーシュ ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト アム ポッゲンポール 38
Claims (18)
- 【請求項１】 次の群： ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％
同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０
％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）に対して相補的な
ポリヌクレオチド、かつ ｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）、ｂ）またはｃ）からの
配列中のヌクレオチド少なくとも１５個を有するポリヌ
クレオチドから選択されたポリヌクレオチド配列を有す
る、単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドが、好ましくはコリネ
フォルム細菌中で複製可能な組み換えＤＮＡである、請
求項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求
項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号１に示された核酸配列を有す
る、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 （ｉ）配列番号１に示されたヌクレオチ
ド配列、または（ｉｉ）遺伝子暗号の縮退の領域内で、
配列（ｉ）と一致する配列少なくとも一つ、または（ｉ
ｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に対して相補的な配列
とハイブリダイズする配列少なくとも一つ、および場合
によっては、（ｉｖ）（ｉ）中の機能中立センス突然変
異を有する、請求項２に記載の複製可能なＤＮＡ。 - 【請求項６】 図１に示された制限地図によって特徴付
けられ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α中にＤＳＭ１３１１３
として寄託された、ベクター、特にシャトルベクターｐ
ＣＲ２．１ｚｗａ２ｉｎｔ。 - 【請求項７】 請求項６に記載のベクターを用いて挿入
突然変異によって得られる、コリネフォルム細菌。 - 【請求項８】 Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンを製造す
るための方法において、 ａ）少なくともｚｗａ２遺伝子が転写減衰された、要求
されるＬ−アミノ酸を生産する細菌を発酵させ、 ｂ）培地または細菌の細胞中で要求される生成物を濃縮
し、かつ ｃ）Ｌ−アミノ酸を単離することを特徴とする、Ｌ−ア
ミノ酸、特にＬ−リジンを生産するための方法。 - 【請求項９】 要求されるＬ−アミノ酸のための生合成
経路中でさらに他の遺伝子、特にｚｗａ１遺伝子が増大
された細菌を使用する、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 要求されたＬ−アミノ酸の形成を減少
させる代謝経路が少なくとも部分的にスイッチオフされ
ている細菌を使用する、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 ｚｗａ２遺伝子をコードするポリヌク
レオチドの発現を減少させる、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１２】 ポリヌクレオチドｚｗａ２をコードす
るポリペプチドの触媒的性質を減少させる、請求項８に
記載の方法。 - 【請求項１３】 転写減衰を生じさせるために、図１に
示され、かつＥ．ｃｏｌｉ中にＤＳＭ１３１１３として
寄託された、ベクターｐＣＲ２．１ｚｗａ２ｉｎｔを用
いての挿入突然変異の方法を使用する、請求項８に記載
の方法。 - 【請求項１４】 次の群、 １４．１ ジヒドロジピコリネート シンターゼをコー
ドするｄａｐＡ遺伝子、 １４．２ フィードバック耐性アスパルテート キナー
ゼをコードするｌｙｓＣ遺伝子、 １４．３ ピルベート カルボキシラーゼをコードする
ｐｙｃ遺伝子、 １４．４ テトラジヒドロジピコリネート スクシニラ
ーゼをコードするｄａｐＤ遺伝子、 １４．５ スクシニルジアミノピメレート デスクシニ
ラーゼをコードするｄａｐＥ遺伝子、 １４．６ グルセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼをコードするｇａｐ遺伝子、 １４．７ マレート：キノンオキシドレダクターゼをコ
ードするｍｑｏ遺伝子、 １４．８ リジン排出をコードするｌｙｓＥ遺伝子を同
時に増大させ、特に過剰に発現させるか、あるいは増幅
させる、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１５】 Ｌ−リジンの生産のために、次の群 １５．１ ホスホエノルピルベート カルボキシラーゼ
をコードするｐｃｋ遺伝子、 １５．２ グルコース−６−リン酸 イソメラーゼをコ
ードするｐｇｉ遺伝子から選択された遺伝子一つまたは
それ以上が同時に転写減衰された細菌を発酵させる、請
求項８に記載の方法。 - 【請求項１６】 コリネバクテリウム グルタミクム種
からの微生物を使用する、請求項１から１５までのいず
れか１項に記載の方法。 - 【請求項１７】 Ｚｗａ２遺伝子生成物をコードするｃ
ＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションプロー
ブとしての、請求項１に記載のポリヌクレオチド配列ま
たはその一部分の使用。 - 【請求項１８】 ｚｗａ２遺伝子中の配列に対して高い
類似性を有するｃＤＮＡまたは遺伝子を単離するための
ハイブリダイゼーションプローブとしての、請求項１に
記載のポリヌクレオチド配列またはその一部分の使用。
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|---|---|---|---|
| DE19959327A DE19959327A1 (de) | 1999-12-09 | 1999-12-09 | Neue für das zwa2-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| DE19959327.2 | 1999-12-09 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP2000371850A Pending JP2001197892A (ja) | 1999-12-09 | 2000-12-06 | ｚｗａ２遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列 |
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| PL (1) | PL344387A1 (ja) |
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| US20060014259A9 (en) * | 1999-07-09 | 2006-01-19 | Kevin Burke | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene |
| US20050112733A1 (en) * | 2000-03-20 | 2005-05-26 | Degussa Ag | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene |
| DE10039044A1 (de) * | 2000-08-10 | 2002-02-21 | Degussa | Neue für das IysR1-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
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-
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-
2000
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