SK18352000A3 - Nukleotidové sekvencie kódujúce gén zwa2 - Google Patents

Nukleotidové sekvencie kódujúce gén zwa2 Download PDF

Info

Publication number
SK18352000A3
SK18352000A3 SK1835-2000A SK18352000A SK18352000A3 SK 18352000 A3 SK18352000 A3 SK 18352000A3 SK 18352000 A SK18352000 A SK 18352000A SK 18352000 A3 SK18352000 A3 SK 18352000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
polynucleotide
gene
sequence
ala
zwa2
Prior art date
Application number
SK1835-2000A
Other languages
English (en)
Inventor
Bettina M�Ckel
Anke Weissenborn
Walter Pfefferle
Achim Marx
Alfred Phler
Jrn Kalinowski
Brigitte Bathe
Nicole Dusch
Original Assignee
Degussa-h�ls aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa-h�ls aktiengesellschaft filed Critical Degussa-h�ls aktiengesellschaft
Publication of SK18352000A3 publication Critical patent/SK18352000A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predmetom vynálezu sú nukleotidové sekvencie kódujúce gén zwa2 a spôsob fermentačnej výroby aminokyselín, najmä L-lyzínu, použitím koryneformných baktérií, v ktorých sa zoslabuje gén zwa2.
Doterajší stav techniky
Aminokyseliny, najmä L-lyzín, sa používajú v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle, ale najmä vo výžive zvierat.
Je známe, že aminokyseliny sa vyrábajú fermentáciou kmeňov koryneformných baktérii, najmä Corynebacterium glutamicum. Kvôli veľkému významu sa stále pracuje na zlepšení spôsobov výroby. Zlepšenia spôsobov sa môžu týkať fermentačno-technologických opatrení, ako napríklad miešania a zásobovania kyslíkom, alebo zloženia živných médií, ako napríklad koncentrácie cukru počas fermentácie, alebo spracovania na produktovú formu, napríklad ionexovou chromatografiou, alebo vlastných produkčných vlastností samotného mikroorganizmu.
Na zlepšenie produkčných vlastností týchto mikroorganizmov sa používajú metódy mutagenézy, selekcie a voľby mutantov. Týmto spôsobom sa získajú kmene, ktoré sú rezistentné voči antimetabolitom, ako je napríklad analóg lyzínu S-(2-aminoetyl)cysteín, alebo sú auxotrofné vzhľadom na regulačné významné metabolity a produkujú L-aminokyseliny.
Už niekolko rokov sa taktiež používajú metódy technológie rekombinantných DNA na kmeňové zlepšenie kmeňov Corynebacterium produkujúcich aminokyseliny.
Vynálezcovia si stanovili za úlohu poskytnúť nové opatrenia na zlepšenú fermentačnú výrobu aminokyselín, najmä L-lyzínu.
L-Aminokyseliny, najmä L-lyzín, sa používajú v humánnej medicíne, vo farmaceutickom priemysle a najmä vo výžive — zvierat. Existuje preto všeobecný záujem o poskytnutie nových, zlepšených spôsobov výroby aminokyselín, najmä L-lyzínu.
Keď sa v nasledovnom texte uvedie L-lyzín alebo lyzín, mieni sa tým nielen zásada, ale aj soli, ako napríklad lyzín-monohydrochlorid alebo lyzín-sulfát.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je izolovaný polynukleotid z koryneformných baktérii, obsahujúci polynukleotidovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahŕňajúcej
a) polynukleotid, ktorý je aspoň na 70 % identický s polynukleotidom, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO 2,
b) polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 70 % identická s aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID NO 2,
c) polynukleotid,' ktorý je komplementárny k polynukleotidom a) alebo b), a
d) polynukleotid obsahujúci aspoň 15 za sebou nasledujúcich nukleotidov polynukleotidovej sekvencie a), b) alebo c).
Predmetom vynálezu je aj polynukleotid podlá nároku 1, pričom sa prednostne jedná o replikovateľnú DNA obsahujúcu:
(i) nukleotidovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID NO 1, t ktorá kóduje gén zwa2, (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencii (i) v oblasti degenerácie genetického kódu,-alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybridizuje so sekvenciami komplementárnymi k sekvenciám (i) alebo (ii), a poprípade (iv) funkčne neutrálne mutácie so' zmyslom v (i).
Ďalšími predmetmi sú polynukleotid podlá nároku 4 obsahujúci nukleotidovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID NO 1, vektor obsahujúci polynukleotid podľa nároku 1, bod d, najmä pCR2.Izwa2int, uložený v E. coli DSM 13113
a koryneformné baktérie slúžiace ako hostiteľské bunky, ktoré sa získajú integračnou mutagenézou pomocou tohto vektora podlá nároku 6.
Predmetom vynálezu sú aj polynukleotidy, ktoré sa skladajú v podstate z polynukleotidovej sekvencie, ktoré možno získať skríningom prostredníctvom hybridizácie príslušnej génovej banky, ktorá obsahuje úplný gén s polynukleotidovou sekvenciou zodpovedajúcou SEQ ID NO 1 alebo jeho časti, pomocou sondy, ktorá obsahuje sekvenciu uvedeného polynukleotidu podlá SEQ ID NO 1 alebo jej fragment, a izoláciou uvedenej sekvencie DNA.
Polynukleotidové sekvencie podľa vynálezu sú vhodné ako hybridizačné sondy pre RNA, cDNA a DNA na to, aby sa izolovali cDNA s celou dĺžkou, ktoré kódujú génový produkt Zwa2, a aby sa izolovali také cDNA alebo gény, ktoré vykazujú veľkú podobnosť sekvencie so sekvenciou génu zwa2.
Polynukleotidové sekvencie podľa vynálezu sú ďalej vhodné ako priméry, pomocou ktorých sa polymerázovu reťazovou reakciou (PCR) môže pripraviť DNA génov, ktoré kódujú gén zwa2.·
Také oligonukleotidy slúžiace ako sondy alebo priméry obsahujú aspoň 30, prednostne aspoň 20, celkom obzvlášť prednostne aspoň 15 za sebou nasledujúcich nukleotidov. Vhodné sú taktiež oligonukleotidy s. dĺžkou aspoň 40 alebo 50 nukleotidov.
„Izolovaný znamená oddelený zo svojho prirodzeného prostredia.
„Polynukleotid sa vzťahuje všeobecne na polyribonukleotidy a polydeoxyribonukleotidy, pričom sa môže jednať o nemodifikované RNA alebo DNA alebo modifikované RNA alebo DNA.
Pod pojmom „polypeptidy sa rozumejú peptidy alebo proteíny, ktoré obsahujú dve alebo viac aminokyselín spojených peptidovými väzbami.
Polypeptidy podlá vynálezu zahŕňajú polypeptidy podlá SEQ ID NO 2, najmä polypeptidy s biologickou aktivitou génového produktu génu zwa2 a aj také, ktoré sú aspoň na 70 ^identické-s polypeptidom podlá SEQ ID NO 2, prednostne aspoň na 80 % a obzvlášť také, ktoré vykazujú identitu s polypeptidom podľa SEQ ID NO 2 aspoň na 90 % až 95 % a uvedenú aktivitu.
Vynález sa ďalej týka spôsobu fermentačnej výroby aminokyselín, najmä lyzínú, použitím koryneformných baktérií, ktoré najmä už produkujú aminokyseliny a v ktorých sa zoslabujú, najmä na nízkej úrovni exprimujú nukleotidové sekvencie kódujúce gén zwa2.
Mikroorganizmy, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, môžu produkovať L-lyzín z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy,· škrobu, celulózy alebo z glycerolu a etanolu. Môže sa jednať o zástupcov koryneformných baktérií, najmä rodu Corynebacterium. Pri rode Corynebacterium treba uviesť najmä druh Corynebacterium glutamicum, ktorý je v odbornom svete známy pre svoju schopnosť produkovať L-aminokyseliny.
Vhodnými kmeňmi rodu Corynebacterium, najmä druhu Cory nebacterium glutamicum, sú napríklad známe kmene divého typu
Corynebacterium glutamicum ATCC13032,
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806,
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870,
Corynebacterium melassecola ATCC17965,
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539,
Brevibacterium flavum ATCC14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a
Brevibacterium divaricatum ATCC14020 a z nich vytvorené mutanty, poprípade kmene, produkujúce L-lyzín, ako napríklad
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709,
Brevibacterium flavum FERM-P 1708,
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712,
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463,
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 a
Corynebacterium glutamicum DSM5715.
Vynálezcom sa podarilo izolovať nový gén zwa2 z C. glutamicum, kódujúci génový produkt Zwa2.
Na izoláciu génu zwa2 alebo aj iných génov z C. glutamicum sa najskôr založí génová banka tohto mikroorganizmu v E. coli. Založenie génových bánk je opísané vo všeobecne známych učebniciach a príručkách. Ako príklad možno uviesť učebnicu od Winnackera: Gene und Klone, Eine Einfiihrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo príručku od Sambrooka et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Ί
-·*<·· • · • · * i»·*1 99 9 9 9 9 99
• 9 9 9 9 9
• · 9 9 9 9 9
• · · 99 • 9 99 99
1989). Veľmi známou génovou bankou je génová banka kmeňa W3110 E. coli K-12, ktorú založili Kohara et al. (Celí 50, 495 - 508 (1987)) v λ-vektoroch. Bathe et al. (Molecular and Generál Genetics, 252:255-265, 1996) opisujú génovú banku C. glutamicum ATCC13032, ktorá bola založená pomocou kozmidového vektora SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) v kmeni NM554 E. coli K12 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Bôrmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326)) zasa opisujú génovú banku C. glutamicum ATCC13032 s použitím kozmidu pHC79 (Hohn a Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). Na vytvorenie génovej banky C. glutamicum v E. coli sa-môžu použiť aj plazmidy, ako napríklad pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979) alebo pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19:259-268). Ako hostitelia sú vhodné najmä také kmene E. coli, ktoré sú reštrikčné a rekombinačne defektné. Príkladom toho je kmeň DH5amcr, ktorý opísal Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). Dlhé fragmenty DNA klonované pomocou kozmidov sa potom zasa môžu subklonovať do bežných vektorov vhodných na sekvenovanie a potom sekvenovať, ako sa opisuje napríklad v Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74:5463-5467 (1977)).
Týmto spôsobom sa získala nová sekvencia DNA z C.' glutamicum, kódujúca gén zwa2, ktorá je ako SEQ ID NO 1 súčasťou predloženého vynálezu. Ďalej sa z tejto sekvencie DNA odvodila aminokyselinová sekvencia príslušného génového produktu génu zwa2. V SEQ ID NO 2 je znázornená vyplývajúca aminokyselinová sekvencia génového produktu Zwa2.
Kódujúce sekvencie DNA, ktoré vyplývajú z SľQ ID NO 1
v dôsledku degenerovatelnosti genetického kgdu, sú taktiež súčasťou vynálezu. Rovnako sú súčasťou vynálezu sekvencie DNA, ktoré hybridizujú s SEQ ID NO 1 alebo časťami SEQ ID NO 1. Napokon sú súčasťou vynálezu sekvencie DNA, ktoré sa pri4 pravúj ú polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) použitím primérov, ktoré vyplývajú z SEQ ID No. 1.
Návody na identifikáciu sekvencií DNA pomocou hybridizácie nájde odborník medzi iným v príručke „The DIG Systém Users Guide for Filter Hybridization od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993) a v Liebl. et al.
(International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). Návody na amplifikáciu sekvencií DNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) nájde odborník medzi iným v príručke Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, Veľká Británia, 1984) a v Newton a Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Nemecko, 1994).
Vynálezcovia zistili, že koryneformné baktérie po zoslabení génu zwa2 zlepšeným spôsobom produkujú aminokyseliny, najmä L-lyzin.
Na dosiahnutie zoslabenia sa môže zoslabiť alebo vylúčiť buď expresia génu zwa2 alebo katalytické vlastnosti enzýmových proteinov. Poprípade sa môžu obidve tieto opatrenia kombinovať.
Zníženie expresie génov môže nastať vhodným uskutočnením kultivácie alebo genetickou zmenou (mutáciou) signálnych štruktúr expresie génov. Signálnymi štruktúrami expresie génov sú napríklad represorové gény, aktivátorové gény, operátory, promótory, atenuátory, väzbové miesta
7. ·
ribozómov, iniciačný kodón a terminátory. Údaje k tomu nájde odborník napríklad v patentovej prihláške WO 96/15246, v Boyd a Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), vo Voskuil a Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), v Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), v Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) a v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie, ako napríklad v učebnici od Knippers („Molekulare Genetik, 6. vydanie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nemecko, 1995) alebo Winnacker („Gene und Klone”, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Nemecko, 1990).
Mutácie, ktoré vedú k zmene, poprípade zoslabeniu katalytických vlastností enzýmových proteínov, sú známe zo stavu techniky; ako príklady sa môžu uviesť práce Qiu a Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) a Móckel („Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms, správy výskumného centra Júlichs, Jul-2906, ISSN09442952, Julich, Nemecko, 1994). Súborné opísania sa môžu prevziať zo známych učebníc genetiky a molekulovej biológie, ako napríklad Hagemann („Allgemeine Genetik, Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Ako mutácie prichádzajú do úvahy tranzície, transverzie, inzercie a delécie. V závislosti od účinku zámeny aminokyselín na enzýmovú aktivitu sa hovorí o mutáciách s pozmeneným zmyslom („missense mutations) alebo mutáciách bez zmyslu („nonsense mutations). Inzercie alebo delécie aspoň jedného páru báz v géne vedú k posunovým mutáciám („frame shift mutations), následkom ktorých sa vkladajú
nesprávne aminokyseliny alebo sa predčasne prerušuje translácia. Delécie viacerých kodónov vedú typicky k úplnému zlyhaniu enzýmovej aktivity. Návody na vytvorenie takých mutácií patria do stavu techniky a môžu sa nájsť v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie, ako napríklad v učebnici Knippers („Molekulare Genetik, 6. vydanie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nemecko, 1995), Winnacker („Gene -.und Klone, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo Hagemann („Allgemeine Genetik, Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Príkladom plazmidu, pomocou ktorého sa môže uskutočniť inzerčná mutagenéza génu zwa2, je pCR2.Izwa2int (obr. 1).
Plazmid pCR2.Izwa2int sa skladá z plazmidu pCR2.1-TOPO opísaného v Mead et al. (Bio/Technology 9:657-663 (1991)), do ktorého sa vsunul interný fragment génu zwa2 znázornený v SEQ No. 3. Tento plazmid vedie po transformácii a homológnej rekombinácii do chromozómového génu zwa2 (inzercia) k úplnej strate funkcie. Týmto spôsobom sa pripravil napríklad kmeň DSM5715::pCR2.Izwa2int, ktorého gén zwa2 je eliminovaný. Ďalšie návody a vysvetlenia inzerčnej mutagenézy sa nachádzajú napríklad v Schwarzer und Piihler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) alebo Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)).
Prídavné môže byť pre produkciu L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, výhodné prídavné k zoslabeniu génu zwa2 zosilniť, najmä nadmerne exprimovať jeden alebo viac enzýmov danej biosyntetickej dráhy, glykolýzy, anaplerotiky, cyklu kyseliny citrónovej alebo exportu aminokyselín.
·· · · · ···· • · · · . · · · ·· · · · ···
999 9 99 · ·· 999
Takto sa napríklad môže -na produkciu L-lyzínu súčasne zosilniť, najmä nadmerne exprimovať alebo amplifikovať jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej • gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu (EP-B 0 197 335), • gén dapD kódujúci tetradihydrodipikolinátsukcinylázu (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 180, 31593165 (1998)), • gén lysC kódujúci feed back rezistentnú aspartátkinázu, ,-RI· J. j • gén pre gén dapE kódujúci sukcinyldiaminopimelátdesukcinylázu (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 111: 5991-5993 (1995)), • gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:60766086), • gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu (DE-A-198 31 609), • gén mqo kódujúci malát-chinónoxidoreduktázu (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254: 395-403 (1998)), • gén lysE kódujúci export lyzínu (DE-A-195 48 222).
Ďalej môže byť pre produkciu aminokyselín, najmä L-lyzínu, výhodné okrem génu zwa2 súčasne zoslabiť ·· ····
• gén kódujúci fosfátpyruvátkarboxykinázu (DE
199 50 409.1, DSM 13047) a/alebo • gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu (US 09/396,478; DSM 12969).
Ďalej môže byť pre produkciu aminokyselín, najmä L-lyzínu, okrem zoslabenia génu zwa2 výhodné vylúčiť nežiaduce vedľajšie reakcie (Nakayama: „Breeding of Amino. Acid Producing Micro-organisms, in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londýn, Veľká Británia, 1982).
t
Mikroorganizmy obsahujúce polynukleotid podľa nároku 1 sú taktiež predmetom vynálezu a môžu sa na účely proďukcie aminokyselín, najmä L-lyzínu, kultivovať kontinuálne alebo diskontinuálne spôsobom batch (vsádzková kultivácia) alebo spôsobom fed batch (prítokový systém) alebo spôsobom repeated fed batch (opakovaný prítokový systém). Zhrnutie známych kultivačných metód je opísané v učebnici ôd Chmiela (Bioprozesstechnik 1. Einfíihrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) alebo v učebnici od Storhasa (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).
Použité kultivačné médium musí vhodným spôsobom vyhovovať nárokom daných kmeňov. Opisy kultivačných médií rozličných mikroorganizmov sa nachádzajú v príručke „Manual of Methods for Generál Bacteriology od Američan Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Ako zdroje uhlíka sa môžu používať cukry a sacharidy, ako je napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky, ako napríklad sójový olej, slneční-
·· • · · • · f*· cový olej, podzemnicový olej a kokosový olej; mastné kyseliny, ako je kyselina palmitová, kyselina stearová, kyselina linolová; alkoholy, ako je napríklad glycerol a etanol; a organické kyseliny, ako je napríklad kyselina octová. Tieto látky sa môžu používať ako jednotlivé zložky alebo ako zmes. Ako zdroje dusíka sa môžu používať organické zlúčeniny obsahujúce dusík, napríklad peptóny, kvasnicový extrakt, mäsový extrakt, sladový extrakt, kukuričný extrakt, sójová múka a močovina, alebo anorganické zlúčeniny, ako je napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Zdroje dusíka sa môžu používať jednotlivo alebo ako zmes. Ako zdroje fosforu sa môžu používať kyselina fosforečná, dihydroge'n'fosforečnan draselný alebo hydrogenfosforečnan draselný alebo príslušné sodné soli. Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železa, ktoré sú potrebné na rast. Napokon sa môžu prídavné k vyššie, uvedeným látkam používať esenciálne rastové látky, ako sú aminokyseliny a vitamíny. Ku kultivačnému médiu sa môžu okrem toho pridávať vhodné prekurzory. Uvedené vsádzkové suroviny sa môžu ku kultúre pridávať vo forme jednorazovej vsádzky alebo sa môžu vhodným spôsobom pridávať počas kultivácie.
Na kontrolu pH kultúry sa vhodne’ používajú zásadité zlúčeniny, ako je hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak, poprípade amoniaková voda, alebo kyslé zlúčeniny, ako je kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Na kontrolu tvorby peny sa môžu používať odpeňovadlá, ako napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Na udržiavanie stability plazmidov sa môžu k médiu pridávať vhodné selektívne pôsobiace látky, napríklad antibiotiká. Aby sa udržiavali aeróbne podmienky, zavádza sa do kultúry kyslík alebo zmesi
L .
plynov obsahujúce kyslík, napríklad vzduch. Teplota kultúry je zvyčajne približne 20 °C až 45 °C a najmä približne 25 °C až 40 °C. Kultivácia prebieha tak dlho, kým sa nevytvorí maximum lyzínu. Tento ciel sa zvyčajne dosiahne za 10 hodín äž 160 hodín.
Metódy stanovenia L-aminokyselín sú známe zo stavu techniky. Analýza sa môže uskutočňovať anexovou chromatografiou s následnou ninhydrínovou derivatizáciou tak, ako opisuje Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958)
1190) alebo sa môže uskutočňovať pomocou HPLC v obrátenej fáze (reversed phase) tak, ako opisuje Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).
Integračný vektor vhodný na mutagenézu bol uložený v E. coli v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) podľa Budapeštianskej zmluvy:
• kmeň Escherichia coli TOP10F'/pCR2.Izwa2int ako DSM 13113.
Prídavné k zoslabeniu génu zwa2 môže byť výhodné zosilniť gén zwal alebo účinok príslušného génového produktu Zwal. Príslušný gén a príslušné opatrenia sa nachádzajú v paralelne podanej nemeckej patentovej prihláške 199 59 528.0.
Integračný vektor pCR2.lzwalexp vhodný na mutagenézu bol uložený pod číslom DSM13115 v E. coli DH5a.
·· • 9· •·
999
Príklady uskutočnenia vynálezu
Predložený vynález sa v nasledovnom texte bližšie vysvetľuje na základe príkladov uskutočnenia.
Príklad 1
Vytvorenie genomickej kozmidovej génovej banky z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromozómová DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 sa izolovala tak, ako sa opisuje v Tauch et al., (1995, Plasmid 33: 168-179), a čiastočne rozštiepila reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu Sau3AI, Code no. 27-0913-02). Fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z garnátov (shrimp) (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, opis produktu SAP, Code no. 1758250). DNA kozmidového vektora SuperCosl (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164), získaná od firmy Stratagene (La Jolla, USA, opis produktu SuperCosl Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301), sa štiepila reštrikčným enzýmom Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu Xbal, Code no. 27-0948-02) a taktiež defosforylovala alkalickou fosfatázou z garnátov. Následne sa kozmidová DNA štiepila reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu BamHI, Code no. 27-086804). Týmto spôsobom spracovaná kozmidová DNA sa zmiešala so spracovanou DNA ATCC13032 a zmes sa spracovala T4-DNA-1Ígázou (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu T4-DNA-ligáza, Code no. 27-0870-04). Ligačná zmes sa potom pomocou Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, opis produktu Gigapack II XL Packing Extract,
• · • —- ŕr-t»irŤ---··
• · • • · ·
• •
• • • · • • ·
·· · • * ·· • ·· ·
Code no. 200217) vbalila do fágov. Na infekciu kmeňa E. coli NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16:15631575) sa bunky extrahovali v lOmM MgSO4 a zmiešali s alikvótom suspenzie fágov. Infekcia a titrácia kozmidovej banky sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom sa bunky naniesli na agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) so 100 pg/ml ampicilinu. Po inkubácii cez noc pri 37 °C sa selektovali jednotlivé rekombinantné klony. Príklad 2
IzoJLácia a sekvenovanie génu zwa2
Kozmidová DNA jednej jednotlivej kolónie sa izolovala pomocou Qiaprep Spin Miniprep Kit (produkt č. 27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa návodov výrobcu a čiastočne rozštiepila reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu Sau3AI, produkt č. 27-091302). Fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z garnátov (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, opis produktu SAP, produkt č. 1758250). Po separácii gélovou elektroforézou sa uskutočnila izolácia kozmidových plazmidov s rozsahom veľkostí 1 500 až 2 000 bp pomocou QiaExII gel Extraction Kit (produkt č. 20021, Qiagen, Hilden, Nemecko). DNA sekvenovacieho vektora pZero1, získaná od firmy Invitrogen (Groningen, Holandsko, opis produktu Zero Background Cloning Kit, produkt č. K2500-01), sa štiepila reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu BamHI, produkt č. 27-086804). Ligácia kozmidových fragmentov do sekvenovacieho vektora pZero-1 sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v Sambrook et al. (Molecular Cloning: A laboratory Manual,
- ··
Cold Spring Harbor), pričom zmes DNA s T4-ligázou (Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko) sa inkubovala cez noc. Táto ligačná zmes sa následne elektroporovala (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) do kmeňa E. coli DH5aMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649) a naniesla na agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) s 50 μς/πιΐ zeocinu. Plazmidová preparácia rekombinantných klonov sa uskutočňovala pomocou Biorobot 9600 (produkt č. 900200, Qiagen, Hilden, Nemecko). Sekvenovanie sa uskutočňovalo dideoxymetódou prerušenia reťazca od Sanger et al. (1997, Proceedings of the National of Sciences U.S.A., 74:5463-5467) s modifikáciami podľa Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Použil sa „RR dRhodamin Terminátor Cycle Sequencing Kit od PE Applied Biosystems (produkt č. 403044, Weiterstadt, Nemecko). Separácia gólovou elektroforézou a analýza sekvenačnej reakcie sa uskutočňovala v géle „Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) (produkt č. A124.1, Roth, Karslruhe, Nemecko) pomocou pristroja na sekvenovanie „ABI prism 377 od PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Nemecko).
Získané nespracované údaje o sekvenciách sa následne spracovali procesorom použitím programového balíka Staden (1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) Version 97-0. Jednotlivé sekvencie derivátov pZerol sa zostavili do jedného súvislého celku. Počítačová analýza kódujúcich oblasti sa uskutočnila pomocou programu XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231). Analýzy homológie sa uskutočnili pomocou „BLAST search programs (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402) proti neredundantnej databanke od „National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA).
Získaná nukleotidová sekvencia génu zwa2 je znázornená v SEQ ID NO 1. Analýza nukleotidovej sekvencie poskytla otvorený čítací raster s 1740 pármi báz, ktorý sa označil ako gén zwa2. Gén zwa2 kóduje polypeptid s 385 aminokyselinami, ktorý je znázornený v SEQ ID NO 2.
Príklad 3
Príprava integračného vektora na inzerčnú mutagenézu génu zwa2
Z kmeňa ATCC 13032 sa metódou podľa Eikmanns et al.. (Microbiology 140: 1817-1828'(1994)) izolovala chromo’zómová DNA. Na základe sekvencie génu zwa2 známej z príkladu 2 pre
C. glutamicum sa selektovali nasledovné oligonukleotidy pre f polymerázovú reťazovú reakciu:
zwa2-inl:
5' GGA ACT TGG TGA CCA GGA CA 3' zwa2-in2:
5' CTG GCT TTG CTG CGG TGA TT 3'
Znázornené priméry syntetizovala firma MWG Biotech (Ebersberg, Nemecko) a podľa štandardnej metódy PCR od Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) sa uskutočnila PCR reakcia s polymerázou Pwo od firmy Boehringer. Pomocou tejto polymerázovej reťazovej reakcie sa izoloval fragment DNA s veľkosťou približne 0,6 kb, znázornený v SEQ ID No. 3, ktorý obsahuje interný fragment génu zwa2.
Amplifikovaný fragment DNA sa ligoval pomocou TOPO TA Cloning Kit od firmy Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; katalógové číslo K4500-01) do vektora pCR2.1-TOPO (Mead et al. (1991) Bio/Technology 9:657-663). Kmeň E. coli ToplOF' sa potom elektroporoval s ligačnou zmesou (Hánahan, In: DNA cloning. A practical approach. zv. I., IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). Selekcia buniek nesúcich plázmid sa uskutočnila nanesením transformačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), ktorý bol doplnený 25 mg/l kanamycínu. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu použitím QIAprep Spin Miniprep Kit od firmy Qiagen a analyzovala reštrikciou reštrikčným enzýmom EcoRI a následnou elektroforézou v agarózovom géle (0,8%). Plazmid sa nazval pCR2.1zwa2int.
Príklad 4
Integračná mutagenéza génu zwa2 v kmeni DSM 5715 produkujúcom lyzín
Vektor pCR2.Izwa2int uvedený v príklade 2 sa elektroporoval do C. glutamicum DSM 5715 podlá elektroporačnej metódy od Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)). Pri kmeni DSM 5715 sa jedná o producenta L-lyzínu rezistentného na AEC. Vektor pCR2.Izwa2int sa nemôže samostatne replikovať v DSM5715 a zachováva sa v bunke len vtedy, keď sa integruje do chromozómu DSM 5715. Selekcia klonov pomocou pCR2.Izwa2int integrovaného do chromozómu sa uskutočnila nanesením elektroporačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold «« —’-j—, * · · · • · · · · · · • · · 9 · 9 9
999 9 99 9 99 999
Spring Harbor, N.Y., 1989), ktorý bol doplnený 15 mg/1 kanamycínu. Na dôkaz integrácie sa podľa štandardnej metódy od Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) uskutočnili kontrolné PCR reakcie s polymerázou Pwo od firmy Boehringer. Kombináciou primárov zwal-inl a zwa2-in2 (porovnaj príklad
3) s primérmi M13 universal forward (5'-gttttcccagtcagac-3 ' ; Invitrogen Corporation, katalógové číslo N540-02) a M13 universal reverse (5'-caggaaacagctatgac-3 '; Invitrogen Corporation, katalógové číslo N530-02), ktoré sa môžu viazať len vnútri sekvencie vektora pCR2.Izwa2int, sa mohlo ukázať, že sa plazmid pCR2.Izwa2int inzeroval vnútri chromozómového génu zwa2 .do chromozómu producenta lyzinu DSM5715. Kmeň sa označil ako DSM5715::pCR2.Izwa2int.
Príklad 5
Príprava lyzinu
Kmeň C. glutamicum.DSM5715::pCR2.1zwa2int získaný v príklade 3 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom na produkciu lyzinu a obsah lyzinu sa stanovoval v kultivačnom supernatante.
Na tento účel sa kmeň najskôr inkuboval 24 hodín pri 33 °C na agarovej platni s vhodným antibiotikom (mozgovo-srdcový agar s kanamycínom (25 mg/1)). Vychádzajúc z kultúry z tejto agarovej platne sa naočkovala predkultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Ako médium pre predkultúru sa použilo kompletné médium Cg III. K tomu sa pridal kanamycin (25 mg/1). Predkultúra sa inkubovala 48 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min v pretrepávačke. Hlavná kultúra sa naočkovala touto predkultúrou tak, aby začiatočná optická
hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola kultúru sa použilo médium MM. 0,1. Pre hlavnú
Médium MM
CSL (Corn Steep Liquor) 5 g/1
MOPS 20 g/1
Glukóza (oddelene autoklávovaná) 50 g/1
Soli:
(NH4)2SO4 25 g/1
KH2PO4 0,1 g/1
MgSO4.7H2O 1,0 g/1
CaCl2.2H2O 10 mg/l
FeSO4.7H2O 10 mg/l
MnSO4.H2O 5,0 mg/l
Biotín (sterilné filtrovaný) 0,3 mg/l
Tiamín.HCl (sterilné filtrovaný) 0,2 mg/l
t Leucín (sterilné filtrovaný) . 0,1 g/1
CaCO3 25 g/1
CSL, MOPS a roztok solí sa roztokom amoniaku nastavili na pH 7 a autoklávovali. Potom sa pridali sterilné roztoky substrátu a vitamínov, ako aj za sucha autoklávovaný CaCO3.
Kultivácia sa uskutočňovala v 10 ml objemoch v 100 ml Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Pridal sa kanamycín (25 mg/l). Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 °C a 80% vlhkosti vzduchu.
Po 48 hodinách sa určila optická hustota (OD) pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm pomocou Biomek 1000 (Beckmann —r*-**··'·' ·· ·
Instruments GmbH, Mníchov). Vytvorené množstvo lyzínu sa stanovilo pomocou analyzátora aminokyselín od firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou chromatografiou a derivatizáciou na prídavnom stĺpci s ninhyd rínovou detekciou.
Výsledok pokusu je uvedený v tabuľke 1.
Tabuľka 1
Kmeň Optická hustota (660 nm) Lyzin-HCl g/i
DSM5715::pCR2.Izwa2int . 12,7 12,29
DSM5715 13,1 9, 54
t
··· · ·· · ·· ···
PROTOKOL SEKVENCIÍ <110> Degussa-HUls AG <120> Nové nukleotidové sekvencie kódujúce gén zwa2 <130> 990153 BT <140>
<141>
<160> 3 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1740 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>
<221> CDS <222> (341)..(1495) <400> 1
gtattgcgcc gatttcccag attttgattg aaaccgatgc gccgtatatg acgccggagc 60
cgtttcgggg gagtaggaat gagccgtcgt tgattggtca tacggcgcta tgcattgcgg 120
aggttcgggg gatggctgtg gaggatgttg cggcggcttt gaatgagaat tttgatcgcg 180
tttatggggt cacaaatcta taacgtgagg tagctcacag tcaatctgtt ggccgtggtc 240
agctgtgggg gttgtggtgg gtgtgactga agtttatgaa gttgcacgcc acggcgtttt 300
ggtgatggac gggggtagtt tgttaccgta ttgtgactaa ttg tta att ccc ccg Leu Leu Ile Pro Pro 1 5 355
aga Arg gcg Ala aag aag ttt tac atg gcg ccc cat cag aag Lys tca Ser cgg atc aac Asn 403
Lys Lys Phe Tyr 10 Met Ala Pro His 15 Gin Arg íle 20
cgg atc aac agc acc cgc tcg gtg ccg ttg cgt ttg get acc ggt ggc 451
Arg Ile Asn Ser Thr Arg Ser Val Pro Leu Arg Leu Ala Thr Gly Gly
25 30 35
gtg ctc gcc acc ttg ctt atc ggc gga gtc acc get gca get acc aaa 499
Val Leu Ala Thr Leu Leu íle Gly Gly Val Thr Ala Ala Ala Thr Lys
40 45 50
aag gac atc att gtt gat gtc aac ggc gag cag atg tcc cta gtg act 547
Lys Asp íle Ile Val Asp Val Asn Gly Glu Gin Met Ser Leu Val Thr
55 60 65
atg tcc ggc act gtt gaa ggt gtg ctg gcg caa get ggt gtg gaa ctt 595
Met Ser Gly Thr Val Glu Gly Val Leu Ala Gin Ala Gly Val Glu Leu
70 75 80 85
• ·
t'll
29·
ggt Gly gac Asp cag Gin gac att gtt tcc cct tca ctg gat tca Ser ĽCC Ser atc íle agt Ser 100 gat Asp 643
Asp íle 90 Val Ser Pro Ser Leu 95 Asp
gaa gac act gtg act gtt cgt act gcc aag cag gtg gcg ctc gtg gtg 691
Glu Asp Thr Val Thr Val Arg Thr Ala Lys Gin Val Ala Leu Val Val
105 110 115
gaa ggt caa atc caa aac gtg acc acc act gcg gtt tcc gtg gag gac 739
Glu Gly Gin íle Gin Asn Val Thr Thr Thr Ala Val Ser Val Glu Asp
120 125 130
ctc ctg cag gaa gtc ggt ggc att acc ggt get gat gcg gtg gac get 787
Leu Leu Gin Glu Val Gly Gly íle Thr Gly Ala Asp Ala Val Asp Ala
135 140 145
gat ctt tca gag acc atc cca gaa tct ggt ttg aag gtg agt gtt acc 835
Asp Leu Ser Glu Thr íle Pro Glu Ser Gly Leu Lys Val Ser Val Thr
150 155 160 165
aag ccg aag att att tcc atc aat gat ggt ggc aag gtc act tac gtt 883
Lys Pro Lys íle íle Ser íle Asn Asp Gly Gly Lys Val Thr Tyr Val
170 175 180
tct ttg gca get cag aac gta cag gaa gcc cta gag ctg cgg gat att 931
Ser Leu Ala Ala Gin Asn Val Gin Glu Ala Leu Glu Leu Arg Asp íle
185 190 195
gag ctg ggt get cag gac cgc att aat gtg cct ctg gat cag cag ctg 979
Glu Leu Gly Ala Gin Asp Arg íle Asn Val Pro Leu Asp Gin Gin Leu
200 205 210
aag aac aac get gcg atc cag atc gac cgc gtt gac aac acc gaa atc 1027
Lys Asn Asn Ala Ala íle Gin íle Asp Arg Val Asp Asn Thr Glu íle
215 220 225
act gaa act gtg tct ttc gat get gag cca acc tac gtg gat gat cca 1075
Thr Glu Thr Val Ser Phe Asp Ala Glu Pro Thr Tyr Val Asp Asp Pro
230 235 240 245
gaa get cca get ggc gat gaa act gtg gtc gaa gaa ggc get cct gga 1123
Glu Ala Pro Ala Gly Asp Glu Thr Val Val Glu Glu Gly Ala Pro Gly
250 255 260
acc aag gaa gtt act cgc acc gta aca acc gtt aat ggt cag gaa gaa 1171
Thr Lys Glu Val Thr Arg Thr Val Thr Thr Val Asn Gly Gin Glu Glu
265 270 275
tct tcc acg gtg atc aat gaa gtt gaa atc acc gca gca aag cca gca 1219
Ser Ser Thr Val íle Asn Glu Val Glu íle Thr Ala Ala Lys Pro Ala
280 285 290
acc att age cgt ggc acc aaa act gtc get gca aac tcc gtg tgg gat 1267
Thr íle Ser Arg Gly Thr Lys Thr Val Ala Ala Asn Ser Val Trp Asp
295 300 305
cag ctg gca cag tgt gaa tcc ggc gga aac tgg gca atc aac aca ggt 1315
Gin Leu Ala Gin Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp Ala íle Asn Thr Gly
310 315 320 325
·· . . '—/v , , « k'.^? x -i'·. ..*7^.^4.^-α·.ιχ£ΆΑ.*Λλ*-*—»»’-----ι .
·. » *
aat Asn ggc ttc Gly Phe tcc Ser ggc ggc Gly Gly 330 cta Leu cag ttc cac cca cag acc tgg ctc gca Ala 1363
Gin Phe His 335 Pro Gin Thr Trp Leu 340
tac ggt ggt gga get ttc tcc ggt gac get tcc ggt gca age cgt gaa 1411
Tyr Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Asp Ala Ser Gly Ala Ser Arg Glu
345 350 355
cag caa atc tcc atc gca gaa aag gtt cag get gca caa ggt tgg gga 1459
Gin Gin íle Ser íle Ala Glu Lys Val Gin Ala Ala Gin Gly Trp Gly
360 365 370
gca tgg cct get tgc acc gca age ttg ggc atc ega tagtagaaat 1505
Ala Trp Pro Ala Cys Thr Ala Ser Leu Gly íle Arg
375 380 385
ctggcatcca ataggtagat tgggatgcta tggaagaacc ctcaggtgca cagctgctcg 1565 gcccggtaga aatccgtgcg ctggcagaaa agctcgacgt cacaccaact aagaagttgg 1625 ggcagaactt tgttcacgat cccaacacgg tgcgtcgcat tgttgctgcg gcagagctca 1685 ccccagacga ccacgtggtg gaagttggcc ctggtctggg ctctctgacc cttgc 1740 <210> 2 <211> 385 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2
Leu 1 Leu íle Pro Pro Arg Ala Lys Lys 5 Phe Tyr 10 Met Ala Pro His 15 Gin
Lys Ser Arg íle Asn Arg íle Asn Ser Thr Arg Ser Val Pro Leu Arg
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Gly Val Leu Ala Thr Leu Leu íle Gly Gly Val Thr
35 40 45
Ala Ala Ala Thr Lys Lys Asp íle íle Val Asp Val Asn Gly Glu Gin
50 55 60
Met Ser Leu Val Thr Met Ser Gly Thr Val Glu Gly Val Leu Ala Gin
65 70 75 80
Ala Gly Val Glu Leu Gly Asp Gin Asp íle Val Ser Pro Ser Leu Asp
85 90 95
Ser Ser íle Ser Asp Glu Asp Thr Val Thr Val Arg Thr Ala Lys Gin
100 105 110
Val Ala Leu Val Val Glu Gly Gin íle Gin Asn Val Thr Thr Thr Ala
115 120 125
Val Ser Val Glu Asp Leu Leu Gin Glu Val Gly Gly íle Thr Gly Ala
130 135 140
Asp Ala Val Asp Ala Asp Leu Ser Glu Thr íle Pro Glu Ser Gly Leu
145 150 155 160
Λ' • ·
Lys Val Ser Val Thr 165 Lys Pro Lys íle íle Ser 170 íle Asn Asp Gly 175 Gly
Lys Val Thr Tyr Val Ser Leu Ala Ala Gin Asn Val Gin Glu Ala Leu
180 185 190
Glu Leu Arg Asp íle Glu Leu Gly Ala Gin Asp Arg íle Asn Val Pro
195 200 205
Leu Asp Gin Gin Leu Lys Asn Asn Ala Ala íle Gin íle Asp Arg Val
210 215 220
Asp Asn Thr Glu íle Thr Glu Thr Val Ser Phe Asp Ala Glu Pro Thr
225 230 235 240
Tyr Val Asp Asp Pro Glu Ala Pro Ala Gly Asp Glu Thr Val Val Glu
245 250 255
Glu Gly Ala Pro Gly Thr Lys Glu Val Thr Arg Thr Val Thr Thr Val
260 265 270
Asn Gly Gin Glu Glu Ser Ser Thr Val íle Asn Glu Val Glu íle Thr
275 280 285 •
Ala Ala Lys Pro Ala Thr íle Ser Arg Gly Thr Lys Thr Val Ala Ala
290 295 300
Asn Ser Val Trp Asp Gin Leu Ala Gin Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp
305 310 315 320
Ala íle Asn Thr Gly Asn Gly Phe Ser Gly Gly Leu Gin Phe His Pro
325 330 335
Gin Thr Trp Leu Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Asp Ala Ser
340 345 350
Gly Ala Ser Arg Glu Gin Gin íle Ser íle Ala Glu Lys Val Gin Ala
355 360 365
Ala Gin Gly Trp Gly Ala Trp Pro Ala Cys Thr Ala Ser Leu Gly íle
370 375 380
Arg
385 <210> 3 <211> 629 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 ggaacttggt cactgtgact cgtgaccacc tgctgatgcg tgttaccaag ggcagctcag ccgcattaat cgttgacaac gaccaggaca gttcgtactg actgcggttt gtggacgctg ccgaagatta aacgtacagg gtgcctctgg accgaaatca ttgtttcccc ccaagcaggt ccgtggagga atctttcaga tttccatcaa aagccctaga atcagcagct ctgaaactgt ttcactggat tcatccatca gtgatgaaga 60 ggcgctcgtg gtggaaggtc aaatccaaaa 120 cctcctgcag gaagtcggtg gcattaccgg 180 gaccatccca gaatctggtt tgaaggtgag 240 tgatggtggc aaggtcactt acgtttcttt 300 gctgcgggat attgagctgg gcgctcagga 360 gaagaacaac gctgcgatcc agatcgaccg 420 gtctttcgat gctgagccaa cctacgtgga 480
tgatccagaa gctccagctg gcgatgaaac tgtggtcgaa gaaggcgctc ctggaaccaa ggaagttact cgcaccgtaa caaccgttaa tggtcaggaa gaatcttcca cggtgatcaa tgaagttgaa atcaccgcag caaagccag
540
600
629
• ···· ·· ···· ·· •
· · • • • • • ··
• • • • • • •
• · • · • • • e • •
• · • • • • •
··· · ·· • ·· 999
Prehľad obrázkov na výkresoch
Priložený je nasledovný obrázok:
Obrázok 1: Mapa plazmidu pCR2.Izwa2inť
Dĺžkové údaje sa majú chápať ako približné hodnoty.
Použité skratky a značky majú nasledovný význam:
ColEl ori: počiatok replikácie plazmidu ColEl
lacZ: 5'-koniec génu pre β-galaktozidázu
fl ori: počiatok replikácie fága fl
KanR: rezistenia na kanamycin
ApR: rezistenia na ampicilin
EcoRI: štiepne miesto pre reštrikčný enzým EcoRI
zwa2: interný fragment génu zwa2
• ···· • · • · ·· • • • · • · ·· • · • · ··
• · • • · • ·
·· · ·· • ·· ··

Claims (18)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaný polynukleotid obsahujúci polynukleotidovú sekvenciu, vybranú zo skupiny zahŕňajúcej
    a) polynukleotid, ktorý je aspoň na 70 % identický s polynukleotidom, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO 2,
    b) polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 70 % identická s aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID NO 2,
    c) polynukleotid, ktorý je komplementárny k polynukleotidom a) alebo b), a
    d) polynukleotid obsahujúci aspoň 15 za sebou nasledujúcich nukleotidov polynukleotidovej sekvencie
    a), b) alebo c).
  2. 2. Polynukleotidy podlá nároku 1, pričom polynukleotidom je prednostne rekombinantná DNA, replikovatelná v koryneformných baktériách.
  3. 3. Polynukleotidy podľa nároku 1, pričom polynukleotidom je RNA.
  4. 4. Polynukleotidy podľa nároku 2, obsahujúce sekvenciu nukleovej kyseliny znázornenú v SEQ ID NO 1.
  5. 5. Replikovatelná DNA podlá nároku 2 obsahujúca: (i) nukleotidovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID NO 1,
    • ···· ·· 0000 00 • ·· · · • • • • 0 ·· • · • • • • 9 • • · 0 • • • · • 0 • • · • • • • • 9 III · 00 • 99 999
    alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvenciám (i) v oblasti degenerácie genetického kódu, alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybridizuje so sekvenciami komplementárnymi k sekvenciám (i) alebo (ii), a poprípade (iv) funkčne neutrálne mutácie so zmyslom v (i).
  6. 6. Vektor, najmä kyvadlový vektor (shuttle vektor) pCR2.1zwa2int, vyznačujúci sa reštrikčnou mapou znázornenou na obrázku 1 a uložený pod označením DSM 13113 v E. coli DH5a.
  7. 7. Koryneformné baktérie získané integračnou mutagenézou pomocou vektora podľa nároku 6.
  8. 8. Spôsob výroby L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňujú nasledovné kroky:
    a) fermentácia baktérií produkujúcich žiadanú
    L-aminokyselinu, v ktorých sa zoslabuje aspoň gén zwa2,
    b) koncentrovanie žiadaného produktu v médiu alebo v bunkách baktérií a
    c) izolácia L-aminokyseliny.
    • ···· 99 9999 99 ·· · • · · 9 • 9 9 9 9 9 9 • • · • · · · · • • • · 9 9 9 • • ··· 9 99 9 ··
  9. 9. Spôsob podlá nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa prídavné zosilňujú ďalšie gény pre biosyntetickú dráhu žiadanej L-aminokyseliny, najmä gén zwal.
  10. 10. Spôsob podlá nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa aspoň čiastočne eliminujú metabolické dráhy, ktoré znižujú tvorbu žiadanej L-aminokyseliny.
  11. 11. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa znižuje expresia polynukleotidu’, ktorý kóduje gén zwa2.
  12. 12. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa zoslabujú katalytické vlastnosti polypeptidu (enzýmového. proteínu), ktorý kóduje polynukleotid zwa2.
    t
  13. 13. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že na dosiahnutie zoslabenia sa používa spôsob integračnej mutagenezy pomcou vektora pCR2.lzwažint znázorneného na obrázku 1 a uloženého v E. coli ako DSM 13113.
  14. 14. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že na výrobu L-lyzínu sa fermentujú baktérie, v ktorých sa súčasne zosilňuje, najmä nadmerne exprimuje alebo amplifikuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej
    14.1 gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu,
    • ···· 9 9 • · 99 9 9 9999 9 9 9 9 99 • · 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9 99 9 99 9 99 • ·
    14.2 gén lysC kódujúci feed back rezistentnú aspartátkinázu,
    14.3 gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu, • 14.4 gén dapD kódujúci tetradihydrodipikolinátsukcinylázu,
    14.5 gén pre gén dapE kódujúci sukcinyldiaminopimelátdesukcinylázu,
    14.6 gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu,
    14.7 gén mqo kódujúci malát-chinónoxidoreduktázu,
    14.8 gén lysE kódujúci export lyzínu.
  15. 15. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že na výrobu L-lyzinu sa fermentujú baktérie, v ktorých sa súčasne zoslabuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej , * 15.1 gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu, * 15.2 gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu.
  16. 16. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa používajú mikroorganizmy rodu Corynebacterium glutamicum.
    • ···· Φ · ·· ··♦· • · · ·· • · • • f • · · • · ·· · ·· •
  17. 17. Použitie polynukleotidových sekvencií podlá nároku 1 alebo ich častí ako hybridizačné sondy na izoláciu cDNA, ktorá kóduje génový produkt Zwa2.
  18. 18. Použitie polynukleotidových sekvencií podlá nároku 1 alebo ich častí ako hybridizačné sondy na izoláciu cDNA alebo génov, ktoré vykazujú vysokú podobnosť so sekvenciou génu Zwa2 .
SK1835-2000A 1999-12-09 2000-12-01 Nukleotidové sekvencie kódujúce gén zwa2 SK18352000A3 (sk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19959327A DE19959327A1 (de) 1999-12-09 1999-12-09 Neue für das zwa2-Gen codierende Nukleotidsequenzen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK18352000A3 true SK18352000A3 (sk) 2001-12-03

Family

ID=7931968

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1835-2000A SK18352000A3 (sk) 1999-12-09 2000-12-01 Nukleotidové sekvencie kódujúce gén zwa2

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20020106748A1 (sk)
EP (1) EP1106693A1 (sk)
JP (1) JP2001197892A (sk)
KR (1) KR20010062279A (sk)
CN (1) CN1312373A (sk)
AU (1) AU7198700A (sk)
BR (1) BR0005811A (sk)
CA (1) CA2325766A1 (sk)
DE (1) DE19959327A1 (sk)
HU (1) HUP0004876A2 (sk)
ID (1) ID28602A (sk)
MX (1) MXPA00012091A (sk)
PL (1) PL344387A1 (sk)
SK (1) SK18352000A3 (sk)
ZA (1) ZA200007270B (sk)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060014259A9 (en) * 1999-07-09 2006-01-19 Kevin Burke Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene
US20050112733A1 (en) * 2000-03-20 2005-05-26 Degussa Ag Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene
DE10039044A1 (de) * 2000-08-10 2002-02-21 Degussa Neue für das IysR1-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
US6825030B2 (en) 2000-08-31 2004-11-30 Degussa Ag Nucleotide sequences encoding a sensor kinase, citA, from corynebacterium glutamicum
WO2002020573A2 (en) * 2000-09-09 2002-03-14 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the gpmb gene
DE10045486A1 (de) * 2000-09-14 2002-04-11 Degussa Neue für das pstC2-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
AU2001293741A1 (en) * 2000-09-14 2002-03-26 Degussa A.G. Nucleotide sequences coding for the suga gene
DE10047865A1 (de) * 2000-09-27 2002-04-18 Degussa Neue für das deaD-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
US7026158B2 (en) 2000-09-27 2006-04-11 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the mikE17 gene
DE10210527A1 (de) 2002-03-09 2003-09-18 Degussa Allele des aceA-Gens aus coryneformen Bakterien
DE102004011248A1 (de) * 2004-03-09 2005-09-22 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
US20070092951A1 (en) * 2005-03-24 2007-04-26 Degussa Ag Alleles of the zwf gene from coryneform bacteria
KR100822041B1 (ko) 2006-12-21 2008-04-15 씨제이제일제당 (주) 몰리브덴 보조인자 생합성 효소 에이 코딩 유전자의 발현이강화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한엘-라이신 생산방법
KR101294935B1 (ko) 2011-04-01 2013-08-08 씨제이제일제당 (주) 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
KR101582008B1 (ko) 2013-10-15 2015-12-31 씨제이제일제당 (주) 생물막 형성 억제 활성을 가지는 유전자 및 이 유전자가 불활성화된 균주를 이용한 l-라이신 생산 방법
CA3007635A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Zymergen Inc. Promoters from corynebacterium glutamicum
KR102345898B1 (ko) 2016-06-30 2022-01-03 지머젠 인코포레이티드 글루코오스 투과 효소 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도
WO2018005655A2 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Zymergen Inc. Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof
KR20200026881A (ko) 2017-06-07 2020-03-11 지머젠 인코포레이티드 코리네박테리움 글루타미컴으로부터의 프로모터 및 보조 유전자 발현을 조절하는 데 이의 용도
CN111286520B (zh) * 2018-12-10 2021-05-07 上海凯赛生物技术股份有限公司 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19831609B4 (de) * 1997-10-04 2009-11-12 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie und im Verfahren einsetzbare Mittel
KR100878334B1 (ko) * 1999-06-25 2009-01-14 백광산업 주식회사 대사 경로 단백질을 코딩하는 코리네박테리움 글루타미쿰유전자

Also Published As

Publication number Publication date
HU0004876D0 (sk) 2001-02-28
ID28602A (id) 2001-06-14
CN1312373A (zh) 2001-09-12
MXPA00012091A (es) 2002-08-06
AU7198700A (en) 2001-06-14
HUP0004876A2 (en) 2002-09-28
ZA200007270B (en) 2001-06-07
EP1106693A1 (de) 2001-06-13
PL344387A1 (en) 2001-06-18
DE19959327A1 (de) 2001-06-13
US20020106748A1 (en) 2002-08-08
KR20010062279A (ko) 2001-07-07
JP2001197892A (ja) 2001-07-24
BR0005811A (pt) 2002-07-23
CA2325766A1 (en) 2001-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6632644B2 (en) Nucleotide sequences which code for the zwa1 gene
SK18352000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén zwa2
SK17352000A3 (sk) Nukleotidov sekvencie kdujce gn succ a sucd
US7416863B2 (en) Nucleotide sequences for encoding of the lysR2-gene
SK18572000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gény sdha, sdhb a sdhc
US7129066B2 (en) Nucleotide sequences coding for the citE gene
US20020086372A1 (en) Nucleotide sequences which code for the citB gene
US20020102669A1 (en) Nucleotide sequences which code for the clpC gene
US6924134B2 (en) Nucleotide sequences which code for the gorA gene
KR100828451B1 (ko) ｌｙｓＲ3 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
EP1307478B1 (en) Luxr gene from coryneform bacteria and a process for the production of l-amino acids
EP1319077B1 (en) Nucleotide sequences which code for the tmk gene
US20020142404A1 (en) Nucleotide sequences which code for the atr43 gene
US7029904B2 (en) Nucleotide sequences which code for the dep34 gene
US6838267B2 (en) Nucleotide sequences coding for the ccpA1 gene
US6946271B2 (en) Nucleotide sequences which code for the menE gene
US7202061B2 (en) Process for the preparation of L-amino acids by attenuating the mikE17 gene
EP1313759A1 (en) Nucleotide sequences which code for the ccpa2 gene
US20020155554A1 (en) Nucleotide sequences which code for the chrA gene
WO2002020771A2 (en) Nucleotide sequences coding for the hisc2 gene
US20020106750A1 (en) Nucleotide sequences which code for the def gene
US20020102668A1 (en) Nucleotide sequences which code for the cobW gene
EP1311685B1 (en) Nucleotide sequences which code for the ccpa1 gene
WO2002020572A2 (en) Nucleotide sequences coding for the chrs gene
SK4252001A3 (en) Nucleotide sequences which code for the rp1k gene