NUEVAS SECUENCIAS NUCLEOTIDAS CODIFICANTES AL GEN zwa2 Descripción de la Invención El objeto de la invención son secuencias nucleótidas codificantes para el gen zwa2 y un procedimiento para la preparación por fermentación de aminoácidos, en especial L-lisina utilizando bacterias corineformes, en las cuales se debilita el gen de zwa2. Estado de la Técnica Los aminoácidos, en especial L-lisina se utilizan en la medicina humana y en la industria farmacéutica, pero en especial en la alimentación animal. Se conoce que esos aminoácidos se producen por fermentación de cepas de bacterias corineformes en especial con Corynebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia de ese grupo de productos se trabaja continuamente a la mejora de esos procedimientos de preparación. Las mejoras del procedimiento pueden consistir en medidas técnicas de fermentación como por ejemplo agitación y alimentación de oxígeno, o la composición de los medios nutritivos como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación, o la post-elaboración a la forma de un producto, por medio de cromatografía de intercambio de iones o por medio de propiedades intrínsecas propias de los microorganismos. Para mejorar las propiedades de rendimiento de
Ref: 125170 esos microorganismos se utilizan métodos como mutagenesis, selección y selección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas que son resistentes contra los anti etabolitos como por ejemplo el análogo de lisina S- (2-aminoetil) -cistenina o auxótropas para los aminoácidos regulatoriamente importantes y que producen L-aminoácídos . Desde hace algunos años se han utilizado métodos de técnica de recombinación de ADN para el mejoramiento de cepas de Corynebacterium, que producen aminoácidos. Tarea de la Invención Los inventores se propusieron la tarea de obtener nuevas medidas para mejorar la preparación por fermentación de aminoácidos, en especial L-lisina. Descripción de la Invención Los aminoácidos en especial L-lisina tienen aplicación en la medicina humana, en industria farmacéutica y en especial en ia alimentación animal. Por lo tanto existe un interés general en un procedimiento nuevo y mejorado para la producción aminoácidos y en especial L-lisina. Cuando a continuación se mencionen L-lisina o lisina, se implican no solo las bases sino también las sales como por ejemplo monoclorhidrato de lisina o sulfato de lisina. El objeto de la invención es un polinucleótido aislado de bacterias corineformes, que contiene la secuencia nucleótida, seleccionada del grupo formado por: a) Polinucleótidos que cuando menos son 70% idénticos con un polinucleótido que codifica a un polipéptido, que contiene la secuencia aminoácida de la SEQ. ID. No. 2, b) Polinucleótidos que codifican a un ' polipéptido, que contiene una secuencia aminoácida que cuando menos es 70% idéntica a la secuencia aminoácida de la SEQ. ID. No. 2, c) Polinucleótidos que son complementarios a los polinucleótidos de a) o b) , y d) Polinucleótidos que contienen cuando menos 15 nucleótidos secuenciales de la secuencia polinucleótida de a) , b) o c) . El objeto de la invención es igualmente el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde preferentemente se trata de un ADN replicable, que contiene: (i) la secuencia nucleótida, mostrada en SEQ-ID no. 1, que codifica al gen z a2, (ii) cuando menos una secuencia que corresponda a las secuencias (i) dentro del rango de degeneración del código genético, o (iii) cuando menos una secuencia que se hibridice con las secuencias complementarias a las secuencias (i) o (ii) , y eventualmente (iv) mutaciones de sentido de función neutra en (i) .
Otros objetos son un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4, que contiene la secuencia nucleótida representada en SEQ ID no . 1, un vector que contiene el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, punto d, en especial pCR2.1zwa2int, depositado en E. coli DSM 13113 y bacterias corineformes que sirven como células anfitrionas, que por medio de mutagenesis de integración contienen al vector de acuerdo con la reivindicación 6. El objeto de la invención también lo son polinucleótidos que en esencial consisten de una secuencia polinucleótida que pueden obtenerse por medio de selección por medio de hibridización de un banco genético correspondiente, que contienen completamente al gen con la secuencia polinucleótida correspondiente a la SEQ ID no.l, o partes de este, con una sonda que contiene la secuencia del polinucleótido mencionado de acuerdo con SEQ ID No. 1 o un fragmento de esta y aislado de la secuencia de ADN mencionada. Las secuencias polinucleótidas de acuerdo con la invención son adecuadas como sondas de hibridización para
ARN, cADN y ADN, para aislar cADN con longitud completa, que codifiquen al producto genético Zwa2 y aislar aquellos cADN o genes, que presenten una alta similitud con la secuencia del gen z a2. Las secuencias polinucleótidas de acuerdo con la invención además son adecuadas como cebadores para la preparación de ADN de genes que codifican al gen z a2, con la ayuda de la reacción en cadenas de polimerasa (PCR) . Esos oligonucleótidos que sirven co o sondas o cebadores contienen cuando menos 30, preferentemente cuando menos 20, más especialmente cuando menos 15 nucleótidos secuenciales . Adecuados son igualmente los oligonucleótidos con una longitud de cuando menos 40 o 50 pares de bases. "Aislado" significa que se retira de su ambiente natural . "Poligonucleótido" se refiere en general a polirribonucleótidos y polidesoxirribunucleótidos, en donde se puede tratar de ARN o ADN no modificados o ARN o ADN modificados . Bajo "polipéptidos" se entiende péptidos o proteínas, que contienen dos o más aminoácidos unidos a través de enlaces de péptidos. Los polipéptidos de acuerdo con la invención incluyen polipéptidos de acuerdo con la SEQ. ID no. 2, en especial aquellos con actividad biológica del producto genético del gen Z a2 y también aquellos que sean cuando menos en un 70% idénticos con el' polipéptido de acuerdo con la SEQ. ID no. 2, preferentemente en un 80% y en especial posean cuando menos un 90 a 95% de identidad con el polipéptido de acuerdo con la SEQ ID No. 2, y que presenten la actividad mencionada. La invención se refiere además a un procedimiento para la preparación por fermentación de aminoácidos, en especial L-lisina utilizando bacterias corineformes que en especial ya produzcan los aminoácidos deseados y en los cuales se debilitan, en especial se expresan en un bajo nivel, las secuencias nucleótidas que codifican al gen zwa2. , Los microorganismos que son objeto de la presente invención pueden producir L-lisina a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones, celulosa o de glicerina y etanol. Puede tratarse de un representante de las bacterias corineformes en especial del género Corynebacterium. En el género Corynebacterium debe mencionarse en especial el tipo Corynebacteri um gl utamicum, que se conoce en la técnica por su capacidad de producir L-aminoácidos . Cepas adecuadas del género Corynebacterium en especial del tipo Corynebacterium gl utamicum, son por ejemplo las cepas tipo nativo conocidas Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacteri um acetogl utamicum ATCC15806 Corynebacteri um acetoacidophil um ATCC13870 Corynebacteri um melassecola ATCC17965 Coryne acte-rium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium clivar icatum ATCC1 020 y los mutantés o cepas preparados de ellas que produzcan L-lisina, como por ejemplo Corynejacterium gl utamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712, Corynebacteri um gl utamicum FERM-P 6463, Corynebacterium gl utamicum FERM-P 6464 y Corynebacteri um gl utamicum DSM5715. Los inventores pudieron aislar el nuevo gen de z a2 codificante al producto genético Zwa2 de C. glutamicum. Para aislar el gen z a2 o también otros genes de
C. glutamicum primero se introduce un banco genético de ese microorganismo en E. coli. La introducción de los bancos genéticos es en general conocido, y se describen en libros y manuales. Ejemplos de ellos son el texto de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag
Chemie, Weinheim, Alemania, 1990) o el Manual de Sambrook et al.; Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989) . Un banco genético muy conocido es la cepa W3110 de E. coli K-12, que fue depositada por Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) en vectores D.
Bathe et al., (Molecular and General Genetics, 252; 255-265, 1996) describen un banco genético de C. glutamicum ATCC13032, que con la ayuda del vector de cosmido SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences US, 84:2160-2164) en la cepa NM554 de E. coli K-12 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Bdrmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326)) describe otra vez un banco genético de C. glutamicum ATCC13032 utilizando el cosmido pHC79 (Hohn y Collins, Gene 11, 291-2989 (1980)). Para la preparación de un banco genético de C. glutamicum en
E. coli también pueden utilizarse los plásmidos como pBR322
(Bolívar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) o pUC9 (Viera et al., 1982, Gene, 19:259-268). Como anfitriones son adecuados en especial aquellas cepas de E.coli, que están defectuosas en restricción y recombinación. Un ejemplo de esto es la cepa DH5csncr, que fue descrita por Grant et al. (Proceedings of the National Academv of Sciences US, 87 (1990) 4645-4649) . Los fragmentos de ADN largos clonados con la ayuda de los cosmidos pueden ser subclonados y subsecuentemente secuenciados en vectores adecuados para la secuenciación, como lo describe por ejemplo Sanger et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America US, 74:5463-5467, 1977) . De esta manera se obtuvieron las nuevas secuencias de ADN de C. glutamicum que codifican al gen z a2, que como SEQ ID NO. 1 son parte de la presente invención. Además a partir de la presente secuencia de ADN puede seleccionarse la secuencia aminoácida de la proteína correspondiente por medio de los métodos antes descritos. En la SEQ ID NO. 2 se representa la secuencia aminoácida obtenida del producto genético de z a2. Las secuencias de ADN, que se obtienen de la SEQ ID NO. 1 por medio de la unidad de degeneración del código genético, también son parte de la invención. De igual manera son parte de la invención las secuencias de ADN que hibridizan con la SEQ ID no. l o partes de SEQ ID No. 1. Finalmente también son partes constitutivas de la invención las secuencias de ADN que se prepararon por medio de reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores, que se obtienen de la SEQ ID . no. 1. Indicaciones respecto a la identificación de secuencias de ADN por medio de hibridización las encuentra el técnico entre otros en el Manual "The DIG System Users Guide for Filter Hibridization", de la firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993), y por Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41:255-260). Indicaciones sobe la amplificación de secuencias de ADN con la ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se encuentran entre otros en el manual de Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) y por Newton y Graham: PCR (Spektrum
Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994) . Los inventores encontraron que las bacterias corineformes después del debilitamiento del gen zwa2 producen L-lisina de forma mejorada. Para obtener un debilitamiento pueden reducirse o desactivarse la expresión del gen zwa2 o las propiedades catalíticas de la proteína enzimática. Eventualmente pueden combinarse ambas medidas . La reducción de la expresión genética puede realizarse por medio de realización de cultivo adecuado o por medio de modificación genética (mutación) de las estructuras de señal de la expresión gen-ética. Las estructuras de la señal de la expresión genética son por ejemplo genes represores, gene activadores, operadores, promotores, atenuadores, puntos de enlace de ribosoma, el codón de inicio y las terminales. Datos sobre esto los encuentra el técnico por ejemplo en la solicitud de patente WO 96/15246, de Boyd y Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1088), por Voskuil y Chambliss
(Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), por Jensen y Hammer
(Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), por Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996) y en textos conocidos de genética y biología molecular, como por ejemplo el texto de Knippers ("Genética Molecular", 6a. edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995) o por Winnacker ("Genes y
Clones", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) . Las mutaciones que conducen a una modificación o reducción de las propiedades catalíticas de las proteínas enzimáticas se conocen por el estado de la técnica; como ejemplos pueden mencionarse los trabajos de Qiu y Goodman
(Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)),
Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry
61: 1760-1762 (1997)) y Móckel ("La hidratasa de treonina de Corynebacterium glutamicum: conservación de la regulación alóstrica y la estructura de la enzima"D, reportes del Centro de Investigación Jülich, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Alemania, 1994) . Resúmenes pueden encontrarse en libros de texto conocidos de genética y biología molecular, como por ejemplo de von Hagemann ("Genética general", Gustav Fischer Verlag, Sttutgart, 1986) . Como mutaciones entran en consideración transiciones, transversiones, inserciones y delecciones. Dependiendo del efecto del intercambio del aminoácido sobre la actividad enzimática, se habla de mutaciones de sentido erróneo (missense mutations) o mutaciones sin sentido (nonsense mutations) . Las inserciones o delecciones de cuando menos un par de bases en .un .gen conducen a mutaciones por desplazamiento del marcado (frame shift mutations) que como consecuencia se forman aminoácidos falsos o interrumpen la traslación permanentemente. Las delecciones de múltiples codones conducen típicamente a una reducción completa de la actividad enzimática. Instrucciones para lograr ese tipo de mutaciones pertenecen al estado de la técnica y pueden obtenerse de textos conocidos sobre genética y biología molecular, como por ejemplo el texto de Knippers ("Genética Molecular", 6a. edición, Georg Thieme
Verlag, Stuttgar, Alemania, 1995) o por Winnacker ("Genes y
Clones", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann ("Genética General"; Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) . Un ejemplo de un plásmido con cuya ayuda se puede realizar una mutagenesis por inserción del gen zwa2 es pCR2. Izwa2int (figura 1). El plásmido pCR2. Izwa2int consiste del plásmido descrito por Mead et al. (Bio/Technology 9:657-663 (1991)) pCR2.1-TOPO, construido en el fragmento interno del gen zwa2, representado en la secuencia SEQ-ID. No. 3. Este plásmido conduce después de la transformación y recombinación homologa en el gen cromosómico zwa2
(inserción) a una perdida total de la función enzimática. De esta manera se preparó por ejemplo la cepa
DSM5715: :pCR2. Izwa2int, cuyo gen zwa2 está desactivado.
Otras introducción es y aclaraciones sobre la mutagenesis por inserción se encuentran por ejemplo en los textos de Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) o
Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994) ) . Además puede ser ventajoso para la producción de aminoácidos én especial L-lisina el reforzar en especial sobre-expresar además del gen zwa2, una o varias enzimas de la vía de biosintesis, de la glicólisis, de la anapletórica, del ciclo del ácido cítrico o de la exportación de aminoácidos . Así puede ser ventajoso, por ejemplo para la preparación de L-lisina, el reforzar, en especial el sobre-expresar simultáneamente: • el gen dapA que codifica a la sintasa de dihidropicolinato (EP-B 0 197 335), o • el gen dapD codificante succinilasa de tetrahidopicolinato (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 180, 3159-3165 (1998)), • el gen lysC codificante a quinasa de aspartato resistente a la retroalimentación • el gen dapE codificante desuccinilasa de succinildiaminopimelato (Wehrmann et al., Journal of Bacteriology 177: 5991-5993 (1995)), • el gen gap codificante a la dehidrbgenása de 3-fosfato de gliceraldehido (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriólogy 174:6076-6086), • el gen pyc codificante a la carboxilasa de piruvato (DE-A - 198 31 609) • el gen qo codificante a oxidorreductasa de malato.: quinona (Molenaar et al., (1998), European Journal of Biochemistry 254: 395-403), • al gen lysE codificante al exportador de lisina (DE-A- 195 48 222) . Además puede ser ventajoso para la producción de aminoácidos, en especial L-lisina, adicionalmente debilitar en forma simultáne-a al gen zwa2, • el gen codificante a la carboxiquinasa de fosfoenolpiruvato (DE 19950 409.1; DSM 13047) y/o • el gen pgi codificante a isomerasa de glucosa-6-fosfato (US 09/396,478, DSM 12969). Además puede ser ventajoso para la producción de aminoácidos, en especial L-lisina, además del debilitamiento del gen zwa2, el desactivar reacciones indeseables (Nakayama: t "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", en: Overproduction of ?mino Acid Products, Kru phanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, UK, 1982). Los microorganismos gue contienen el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, igualmente son objeto de la invención y pueden cultivarse continua o discontinuamente en procedimientos por lotes o en procedimiento de alimentación (fed batch) o procedimiento de alimentación repetitivo (repeated fed batch) con el fin de producir aminoácidos, en especial L-lisina. Un resumen de métodos de cultivo conocidos se encuentra en el texto de
Ch iel (Bioprozestechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1991) ) o en el texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere
Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). El medio de cultivo utilizado debe de una forma adecuada ser suficiente para los requisitos de las cepas de microorganismos en cuestión. La descripción de medios de cultivo de diferentes microorganismos se encuentra en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Americana de Bacteriología (Washington D.C., US, 1981) . Como fuente de carbono pueden utilizarse azucares y carbohidratos como por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones y celulosa, aceites y grasas como por ejemplo aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y aceite de coco, ácidos grasos como por ejemplo ácido palmitíco, ácido estearínico y ácido linoléico, alcoholes como por ejemplo glicerina y etanol y ácidos orgánicos como por ejemplo ácido acético. Esas substancias pueden utilizarse individualmente o en mezclas. Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse compuestos orgánicos que contengan nitrógeno como peptona, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de remojo de maíz, harina de soya y urea o compuesto inorgánicos como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse solas o como mezclas. Como fuentes de fósforo pueden utilizarse ácido fosfórico, dihidrofosfato de potasio o hidrofosfato dipotásico o las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe además contener sales de metales como por ejemplo sulfato de magnesio o de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente pueden utilizarse promotores del crecimiento como aminoácidos y vitaminas adicionalmente a las substancias mencionadas. Al medio de cultivo pueden agregarse precursores adecuados. Los aditivos mencionados pueden agregarse al cultivo en forma de una carga única o en una forma adecuada agregarse durante el cultivo. Para controlar el pH del cultivo se utilizan compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o compuestos ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico en forma adecuada. Para controlar la formación de espuma pueden utilizarse agentes anti-espumantes como por ejemplo poliglicoléster de ácido graso o aceites de silicona. Para mantener la estabilidad de los plásmidos pueden agregarse al medio substancias de efecto selectivo, por ejemplo antibióticos. Para mantener las condiciones aeróbicas se introducen al cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contengan oxígeno como por ejemplo aire. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente a 20DC a 45fJC y preferentemente a 25DC a 40DC. El cultivo se continua hasta que se ha formado una cantidad máxima de lisina. Este objetivo se alcanza normalmente en el transcurso de 10 a 160 horas . Los métodos para determinar los L-aminoácidos son conocidos en el estado de la técnica. El análisis puede realizarse por medio de una cromatografía de intercambio de aniones con la subsecuente derivación de ninhidrina tal como lo describe Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958) 1190), o puede realizarse por medio de CLAP de fase inversa, como lo describen Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174). Un vector de inserción adecuado para la mutagenesis se depositó en E.coli en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest: D Cepa de Escherichia coli ToplOFApCR2. Izwa2int como DSM 13113 Adicionalmente al debilitamiento del gen zwa2 puede ser ventajoso el reforzar el gen zwal o el efecto del producto genético Zwal correspondiente. El gen correspondiente y las medidas correspodíentes se encuentran en la solicitud de patente alemana presentada paralelamente no. 199 59 328.0. Un vector de integración adecuado para la mutagenesis pCR2. lzwalexp fue depositado bajo el número DSM13115 en E. coli DH5a. Ejemplos La presente invención se explicara más detalladamente con la ayuda de los ejemplos de realización. Ejemplo 1 Preparación de un banco genético de cosmido genómico a partir de Corynebacterium gl utamicum ATCC 13032. ADN cromosómico de Corynebacterium gl utamicum ATCC 13032 fue aislado como lo describe Tauch et al. (1995, Plasmid 33:168-179), y se disoció parcialmente con enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Friburgo Alemania, descripción del producto Sau3AI, código no. 27-0913-02). Los fragmentos de ADN se desfofosforilaron con la ayuda de fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, descripción del producto SAP, código no. 1758250). El ADN del vector de cosmido SuperCosl (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences US 84:2160-2164), en referencia a la firma Stratagene (La Jolla, US, descripción del producto SuperCosl Cos id Vektor Kit, código no. 251301) se disoció con la enzima de restricción Xbal (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, denominación del producto Xbal, código no. 27-0948-02) e igualmente se desfosforiló con fosfatasa alcalina. A continuación se disoció el ADN de cosmido con la enzima de restricción Ba Hl
(Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, denominación del producto BamHl, código no. 27-0868-04) . El ADN de cosmido tratado de esa manera se mezcló con el ADN ATCC13032 tratado y el producto se trató con ligasa de ADN T4, (Amersham
Pharmacia Biotech. Friburgo, Alemania, descripción del producto ligasa de ADN T4, producto no. 27-0870-04) . La mezcla de ligado se empacó en fagos con la ayuda de Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, US, denominación del producto Gigapack II XL Packing Extracts, código no. 200217) . Para la infección de la cepa de E. coli NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acid Research 16:1563-1575) , las células se tomaron en 10 mM MgS04 y se mezclaron con una alicuota de suspensión de fagos. La infección y la titulación del banco de Cosmido fueron realizadas como lo describe Sambrook et al.; (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor) , en donde las células se trasplantan sobre agar LB (Lennox 1955, Virology, 1:190) con 100 Dg/ml de ampicilina. Después de la incubación durante la noche a 37DC se seleccionaron las colonias individuales recombinantes . Ejemplo 2 Aislado y Secuenciación del gen zwa2 El. ADN de cosmido de una colonia individual se aisló de acuerdo con las indicaciones del fabricante del
Qiaprep Spin Miniprep Kit (producto no. 27106, Qiagen,
Hilden, Alemania) y se disoció parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Friburgo Alemania, descripción del producto Sau3AI, código no. 27-0913-02) . Los fragmentos de ADN se desfofosforilaron con la ayuda de fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals,
Mannheim, Alemania, descripción del producto SAP, código no.
1758250) . Después de la separación electroforética de gel se realizó el aislado de los fragmentos de cosmido en el rango de 1500 a 2000 bp con el equipo QiaExII Gel Extraction Kit
(producto no. 20021, Qiagen, Hilden, Alemania) . El ADN del vector de secuenciación pZero-1 en relación al de la firma
Invitrogen (Groningen, Holanda, denominación del producto Zero Background Cloning Kit, producto no. K2500-01) se disoció con la enzima de restricción BamHl (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, denominación del producto BamHl, código no. 27-0868-04). El ligado de los fragmentos de cosmido en el vector de secuenciación pZero-1 se realizó como se describe por S mbrook et al. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor) , en donde la mezcla de ADN se incuba durante la noche con ligasa T4 (Pharmacia Biotech, Friburgo. Alemania) . Esa mezcla de ligado se electroporó a continuación en la cepa de E. coli DH5amcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649) (Tauch et al. 1994, FEMS microbiology
Letters, 123:343-7), y sobre agar LB (Lennox 1955, Virology,
1:190) con 50 Dg/ml de zeocina. La preparación de plásmido de los clones recombinantes se realizó con el Birobot 9600 (producto no. 900200, Qiagen, Hilden, Alemania) . La secuenciación se realizó de acuerdo con el método de ruptura de la cadena didesoxi de Sanger et al, (1977, Proceedings of the National of Sciences of the United States of America US,
74:5463-5467) y modificaciones de acuerdo con Zimmerman et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Se utilizó el "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" de PE Applied Biosystems (producto no. 403044, Weiterstadt, Alemania). La separación electroforética y el análisis de la reacción de secuenciación se realizó en un gel de "acrilamida/ bisacrilamida para Rotiphoresis NF" (29:1) (producto no. A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el aparato de secuenciación "ABl Prism 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania) . Los datos de la secuencia en bruto obtenidos fueron procesados subsecuentemente utilizando el paquete de programación Staden (1986, Nucleic Acids, Research, 14:217-231) versión 97-0. Las secuencias individuales de los derivadas de pZerol se ensamblaron en un Contig dependiente. El análisis de rango de codificación apoyado por computadora se realizó con el programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231). Otros análisis se realizaron con
"BLAST search programs" (Altschiul et al., 1997, Nucleic Acids research, 25: 3389-3402), frente al banco de datos no redundante del "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, US) . La secuencia nucleótida obtenida del gen zaw21 se representa en SEQ ID no. 1. Los análisis de la secuencia nucleótida dio un marcador de lectura abierto con 1740 pares de bases, que fue denominado como el gen zwa2. El gen zwa2 codifica a una polipéptido de 385 aminoácidos, que está representado en SEQ ID No. 2. Ejemplo 3 Preparación de un vector de integración para la mutagenesis de integración del gen zwa2 De la cepa ATCC 13032 se aisló ADN cromosómico de acuerdo con el método de Eikmanns et al. (Microbiology
140:1817-1828 (1994)). Debido a la secuencia conocida por el ejemplo 2 para C. glutamicum, del gen zwa2 se seleccionaron los siguientes oligonucleótidos para la reacción de cadenas de polimerasa: zwa2-ínl : 5' GGA ACT TGG TGA CCA GGA CA 3' zwa2-in2 : 5' CTG GCT TTG CTG CGG TGA TT 3' Los cebadores representados fueron sintetizados por la firma MWG Biotech (Ebersberg, Alemania) y se realizó la reacción PCR de acuerdo con el método estándar PCR de Innis et al. (PCR protocols, A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) con polimerasa Pwo de la firma Boehringer. Con ayuda de la reacción de cadenas de polimerasa se aisló un fragmento de ADN de aproximadamente 0.6 kb, que porta un fragmento interno del gen zwa2 y se encuentra representado en la SEQ ID no. 3. El fragmento de ADN amplificado se ligó, con el equipo TOPO TA Cloning Kit de la firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, US; número de catalogo K45000- 01) en el vector pCR2.1-T0P0 (Mead et al. (1991) Bio/Technology 9:657-663). A continuación se electroporó la cepa de ToplOF' con el producto de ligado (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach, vol. I IRL-Press, Oxford, Washington DC, US, 1985) . La selección de las células que portan el plásmido se realizó por medio de trasplantado del producto de transformación sobre ' agar LB (Sambrook et al. Molecular cloning: a laboratory manual. 2a. edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) , que había sido suplementado con 25 mg/l de kanamicina. El ADN de plásmido se aisló del transformante con la ayuda del QIAprep Spin Miniprep Kit de la firma Quagen y se verificó por medio de restricción con la " enzima de restricción EcoRI y finalmente electroforesis de gel de agarosa (0.8%), El plasmido fue llamado pCR2.1ZWA2int. Ejemplo 4 Mutagenesis de integración del gen zwa2 en los productores de lisina DSM 5715 El vector pCR2. Izwa2int mencionado en- el ejemplo
2 se electroporó de acuerdo con el método de electroporación, de Tauch et.al. (FEMS Microbiological
Letters, 123:343-347 (1994)) en Corynebacterium glutamicum DSM 57125. La cepa DSM 5715 se trata de productores de lisina resistentes a AEC. El vector pCR2. Izwa2int no puede replicarse autónomamente en DSM5715 y permanece así contenido en las células, cuando se integra en el cromosoma de DSM 5715. La selección de los clones con el pCR2. Izwa2int integrado en el cromosoma se realiza por trasplante del producto de electroporación sobre agar LB (Sambrook, et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2a. edición., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), que fue suplementado con 15 mg/l de kanamicina. Para la determinación de la integración se procedió de acuerdo con los métodos estándar de Innis et al.
(PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990,
Acadmic Press) con realiza con reacciones PCR de control con polimerasa Pwo de la Firma Boehringer. por medio de la combinación del cebador zwal-inl y zwa2-in2 (ver ejemplo 3) con los cebadores M13 universal fordward (5'-gttttcccagtcacgac-3 ' ; Invitrogen Corporation, cat. No. n540-02) y M13 universal reverse (5 ' -caggaaacagctatgac-3 ' ; invitrogen corporation, cat. No. N530-02), que solo pueden ligarse dentro de la secuencia del vector pCR2. Izwa2int, pudo mostrarse que el plásmido pCR2. Izwa2int se había insertado dentro del gen zwa2 en el cromosoma de los productores de lisina DSM5715. La cepa fue denominada como DSM5715: :pCR2. Izwa2int . Ejemplo 5 Preparación de Lisina La cepa de Corynebacterium glutamicum DSM5715: :pCR2. Izwa2int obtenida en el ejemplo 3 se cultivo en un medio nutritivo adecuado para la producción de lisina y el contenido de lisina se determinó en el residuo de cultivo. Para esto se incubó primero la cepa sobre placas de agar con el antibiótico correspondiente (agar de cerebro-corazón con kanamicina (25 mg/l) ) se incubó durante 24 horas a 33°C. A partir de este cultivo en las placas de agar se inoculó un precultivo (10 ml de medio en un matraz Erlenmeyer de 100 ml) . Como medio para el precultivo se utilizó el medio completo CglII. Este se mezcló con kanamicina (25 mg/l). El precultivo se incubó durante 48 horas _ a 33DC a 240 rpm en un agitador. De este precultivo se inoculó un cultivo principal, de tal forma que el OD inicial (660 nm) del cultivo principal fue de 0.1. Para el cultivo principal se utilizó el medio MM. Medio MM CSL (Licor de remojo de maíz) 5 g/1 MOPS 20 g/1 Glucosa (en autoclave separado) 50g/l Sales : (NH4 ) 2S0 25g/l KH2P04 0.1g/l MgS04*2H20 1.0g/l CaCl2*7H20 10 mg/(l FeS04 *7H20 10mg/l MnS04*H20 5.0mg/l Biotina (filtrada estéril) 0.3 mg/l Tiamina*HCl (filtrada estéril) 0.2 mg/l Leucina (filtrada estéril) 0.1 g/1 CaC03 25 g/1
CSL, MOPS y la solución salina se ajustan a un pH de 7 con amoAaco acuoso y se someten autoclave. Finalmente se agregan las soluciones estériles de substrato y vitamina, así como el C CÜ3 sometido a autoclave. El cultivo se realiza en 10 ml- de volumen en un matraz Erlen eyer de 100 ml con chicanas. Se agregó kanamicina (25 mg/l) . El cultivo se realizó a 33D C y 80% de humedad de aire. Después de 48 horas se determinó la OD a una longitud de onda de medición de 660 nm con el Biomek 1000
(Beckmann Instruments GmbH, Munich) . La cantidad de lisina formada se determinó con un analizador ' de aminoácidos de la firma Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por medio de cromatografia de intercambio de iones y la derivatización de columna posterior con detección de ninhidrina. En al tabla 1 se presentan los resultados de la prueba. Tabla 1
Se anexan las siguientes figuras: Figura 1: mapa del plásmido pCR2. Izwa2int Los datos sobre longitudes deben entenderse como valores aproximados. Las abreviaturas y denominaciones usadas tienen los siguientes significados: ColEl ori: origen de replicación del plásmido ColEl lacZ: extremo 5 "del gen ß-galactosidasa fl ori: origen de replicación del fago fl KanR: resistencia a la kanamicina ApR: resistencia a la ampicilina EcoRI : punto de corte de la enzima de restricción EcoRI zwa2 : fragmento interno del gen zwa2 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.