MXPA00011289A

MXPA00011289A - Nuevas secuencias de nucleotidos que codifican para los genes succ y sucd.

Info

Publication number: MXPA00011289A
Application number: MXPA00011289A
Authority: MX
Inventors: Marx Achim
Original assignee: Degussa Hols Ag
Priority date: 1999-11-25
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2002-05-23
Also published as: EP1103611A1; BR0005608A; CN1298019A; HU0004715D0; JP2001190290A; MX223007B; HUP0004715A2; ID28476A; AU7183700A; KR20010051915A; ZA200006884B; SK17352000A3; DE19956686A1; US6623946B1; CA2324496A1; PL344145A1

Abstract

La invencion se relaciona con polinucleotidos que codifican para los genes sucC y sucD, que contienen secuencias de polinucletido seleccionados del grupo que comprende: polinucleotido que es al menos 70% identico a un polinucleotido que codifica para un polipeptido que contiene la secuencia de aminoacido de SEQ ID No. 2, polinucletido que es al menos 70% identico a un polipeptido que contiene la secuencia de aminoacido de SEQ IDNo. 3, polinuleotido que codifica para un polipeptido que contiene una secuencia de aminoacido que es al menos 70% identica a la secuencia de aminoacido de SEQ ID No 2, polinucleotido que codifica para polipeptido que contiene una secuencia de aminoacido que es al menos 70% identica a la se cuencia de aminoacido de SEQ ID No 3, polinucleotido complementario a los polinucleotidos de a), b), c), o d) y polinucleotido que contiene al menos 15 nucleotidos sucesivos de la secuencia de polinucleotido de a), b), c), d) o e), con un metodo para la elaboracion por fermentacion de L- aminoacidos empleando bacterias corineformes en las que existen los genes atenuados, y con el empleo de las secuencias de polinucleotido como sondas de hibridizacion.

Description

NUEVAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN PARA LOS GENES sucC y SUCD DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El objeto de la invención son las secuencias de nucleótidos de bacterias corineformes que codifican para los genes sucC y sucD, y un método para la preparación mediante fermentación de aminoácidos, en particular L-lisina y L-glutamato mediante el empleo de bacterias en que se encuentran atenuados el/los gen (es) sucC y/o sucD. ESTADO DE LA TÉCNICA Los aminoácidos, en particular la L-lisina y el L-glutamato se emplean en la medicina humana, en la industria farmacéutica, en la industria alimenticia y muy especialmente en la alimentación de animales. Se sabe que los aminoácidos se producen mediante la fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) . Debido a la gran significancia se trabaja continuamente en el mejoramiento de los procesos de producción. Las mejoras de los procesos se pueden relacionar con medidas referentes a las técnicas de la fermentación, como por ejemplo la agitación y el suministro de oxigeno, o a la composición de los medios de cultivo, como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación, o a la elaboración a la Ref.125068 forma de producto mediante, por ejemplo, cromatografía de intercambio de iones, o a las características intrínsecas de capacidad del microorganismo mismo. Para mejorar las características de capacidad de estos microorganismos se emplean métodos de la mutagenésis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas que son resistentes contra antimetabolitos o auxotrópicas para metabolitos de importancia regulatoria, y que producen los aminoácidos. Desde hace algunos años también se aplican métodos de la técnica DNA recombinante para el perfeccionamiento de las cepas de cepas de Corynebacterium que producen L-aminoácido. Objeto de la invención Los inventores se propusieron la tarea de proporcionar nuevas medidas para mejorar la producción de aminoácidos por fermentación, en particular L-lisina y L-glutamato DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Cuando a continuación se mencionan L-aminoácidos o aminoácidos nos referimos con ello a uno o varios aminoácidos inclusive sus sales, seleccionados del grupo que comprende L-aspargina, L-treonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteina, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptofano y L-arginina. Se prefieren particularmente L-lisina y L-glutamato. El objeto de la invención es un polinucleótido aislado que contiene una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que comprende a) polinucleótido que es al menos 70 % idéntico a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID No. 2, b) polinucleótido que es al menos 70 % idéntico a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID No. 3, c) polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácido que es al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de SEQ ID No 2, d) polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácido que es al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de SEQ ID No 3, e) polinucleótido complementario a los polinucleótidos de a) , b) , c) o d) y f) polinucleótido que contiene al menos 15 nucleótidos sucesivos de la secuencia de polinucleótido de a) , b) , c) , d) o e) , siendo que polipéptido preferentemente tiene la actividad de la succinil-CoA-sintetasa. También es objeto de la invención el polinucleótido según la reivindicación 1, siendo que de preferencia se trata de un DNA replicable que contiene (i) la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID No. 1, o (ii) al menos una secuencia que corresponde a la secuencia (i) dentro de la región de la degeneración del código genético, o (iii) al menos una secuencia que hibridiza con la secuencia complementaria a la secuencia (i) o (ii), y/o eventualmente (iv) mutaciones de orientación funcionalmente neutrales en (i) . Otros objetos son un polinucleótido según la reivindicación 4, que contiene la secuencia de nucleótidos como se representa en la SEQ ID No. 1, un polinucleódito según la reivindicación 1, siendo que de preferencia el polinucleótido es un DNA recombinante que se puede replicar en bacterias corineformes, un vector que contiene partes del polinucleótido conforme a la invención, pero al menos' 15 nucleótidos sucesivos de la secuencia reivindicada, y bacterias corineformes en las que se encuentra (n) atenuado (s) el/los gen (es) sucC y/o sucD, en particular mediante una inserción o deleción. Objeto de la invención son también los polinucleótidos constituidos sustancialmente por una secuencia de polinucleótido, que se pueden obtener mediante rastreo por medio de la hibridización de un banco de genes correspondiente que contiene el gen completo con la secuencia de polinucleótido correspondiente a SEQ ID No. 1, con una sonda que contiene la secuencia del polinucleótido según SEQ ID No. 1 mencionado, o un fragmento de ella, y aislamiento de la secuencia de DNA mencionada. Los polinucleótidos que contienen las secuencias de acuerdo a la invención son adecuados como sondas de hibridización para RNA, cDNA y DNA, para aislar ácidos nucleicos o bien polinucleótidos o genes en su longitud total, que codifican para la succinil-CoA-sintetasa y aislar aquellos cDNA o genes que muestran una gran similitud de la secuencia con aquella de los genes de la succinil-CoA-sintetasa . Los polinucleótidos que contienen las secuencias de acuerdo a la invención son además adecuados como cebadores para, mediante la reacción en cadena de polimerasa (RCP) , producir DNA de genes que codifican para la succinil-CoA-sintetasa. Tales oligonucleótidos que sirven como sondas o cebadores contienen al menos 30, preferiblemente al menos 20, en particular muy preferiblemente al menos 15 nucleótidos sucesivos. También son adecuados los oligonucleótidos con una longitud de al menos 40 ó 50 nucleótidos. "Aislado" significa separado de su entorno natural . "Polinucleótido" se refiere en general a poliribonucleótidos o pplideoxiribonucleótidos, siendo que se puede tratar de RNA y DNA no modificados o RNA y D?A modificados . Por "polipéptidos" se entienden péptidos o proteinas que contienen dos o mas aminoácidos ligados a través de enlaces peptídicos. Los polipéptidos según la invención incluyen los polipéptidos de acuerdo a las SEQ ID ?o. 2 y SEQ ID ?o.3, en particular aquellos con la actividad biológica de la succinil-CoA-sintetasa, y también aquellos que son al menos idénticos en un 70 % con el polipéptido de acuerdo a la SEQ ID ?o. 2 o a la SEQ ID ?o . 3, preferiblemente al menos en un 80 %, y particularmente aquellos que presentan al menos 90 % a 95 % de identidad al polipéptido de acuerdo a SEQ ID ?o. 2 o de la SEQ ID ?o. 3, y la actividad mencionada.

La invención se relaciona además con un método para la producción mediante fermentación de aminoácidos, seleccionados del grupo que comprende L-aspargina, L-treonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteina, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptofano y L-arginina, en particular L-lisina y L-glutamato, mediante el empleo de bacterias corineformes que en particular ya producen los aminoácidos, en particular L-lisina y L-glutamato, y en las cuales se atenúan, en particular expresan a nivel reducido las secuencias de nucleótidos que codifican para el gen sucC y/o sucD. El concepto "atenúamiento" describe en este contexto la disminución o eliminación en un microorganismo, de la actividad intracelular de una o varias enzimas (proteinas) que se codifican mediante los DNAs correspondientes al emplear, por ejemplo, un promotor débil o un gen o alelo que codifica para una enzima correspondiente con una baja actividad o bien que inactiva la enzima (proteina) correspondiente y que eventualmente combina estas medidas. Los microorganismos que son objeto de la presente invención pueden producir aminoácidos, en particular L-lisina a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, fécula, celulosa o de glicerina y etanol.

Se puede tratar de representantes de bacterias corineformes, en particular de la especie Corynebacterium. En la especie Corynebacterium se debe mencionar en particular el tipo Corynebacterium glutamicum, que es conocido en el ámbito especializado por su capacidad de producir L-aminoácidos. Las cepas adecuadas de la especie Corynebacterium, en particular del tipo Corynebacterium glutamicum, son por ejemplo las conocidas cepas de tipo salvaje Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidofilum ATCC13870 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Corynebacterium termoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATTCC13869 y Brevibacterium divaricatum ATTCC14020 y los mutantes y cepas productores de L-aminoácidos, producidos a partir de estas, como por ejemplo las cepas que producen L-lisina Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 y Corynebacterium glutamicum DSM5714. Se aislaron los nuevos genes sucC y sucD de C. glutamicum, que codifican para la enzima succinil-CoA-sintetasa (EC 6.2.1.5). Para aislar el gen sucC y/o sucD, o también otros genes de C. glutamicum se instala primero en E. coli un banco de genes de este microorganismo. La instalación de bancos de genes se describe en libros de enseñanza y manuales generalmente conocidos. Como ejemplo mencionaremos el libro de enseñanza de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (editorial Chemie, Weinheim, Alemania, 1990) o el manual de Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989) . Un banco de genes muy conocido es el de la cepa W3110 de E. coli K-12, el cual fue instalado por Kohara et al. (Cell 50, 495 - 508 (1987)) en vectores ?. Bathe et al. (Molecular an General Genetics, 252:255- 265, 1996) describen un banco de genes de C. glutamicum ATCC13032 que se instaló con el auxilio del vector cosmido SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) en la cepa NM 554 de E.coli K-12 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575) . Por otra parte, Bórmann et al. (Molecular Microbiology 6 (3) , 317-326) ) describen un banco de genes de C. glutamicum ATTCC13032 mediante el empleo del cósmido pHC79 (Hohn y Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). O'Donohue (The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway, 1997) describe la clonación de genes de C. glutamicum mediante el empleo del sistema de expresión ? Zap descrito por Short et al. (Nucleic Acids Research, 16: 7583) . Para establecer un banco de genes de C. glutamicum en E. coli también se pueden usar plásmidos, como pBR322 (Bolívar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) o pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19:259-268). Como huespedes son especialmente adecuadas aquellas cepas de E. coli con deficiencia de restricción y recombinación, como por ejemplo la cepa DH5a (Jeffrey H. Miller: "A short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria", Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1992) . Los fragmentos largos de DNA clonados con ayuda de comidos u otros vectores ? se pueden subclonar a continuación a la forma usual de fragmentos de DNA mas cortos, adecuados para la secuenciación de DNA. Los métodos para la secuenciación de DNA se describen entre otros en Sanger et al. (Proceedings of the National (Academy) of Sciences of the United States of America USA, 74:5463-5467, 1977). Las secuencias de DNA obtenidas se pueden entonces investigar con los algoritmos o bien programas de análisis de secuencias conocidos, como por ejemplo el de Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), el programa GCG de Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)), el algoritmo FASTA de Pearson y Lipman (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85, 2444-2448 (1988)) o el algoritmo BLAST de Altschul et al.

(Nature Genetics 6, 119-129 (1994)), y compararse con los inscriptores de secuencias que existen en bancos de datos públicamente accesibles. Los bancos de datos públicamente accesibles para secuencias de neuclotidos son por ejemplo los de European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemania) o los del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) . Se descubrieron las nuevas secuencias de DNA de C. glutamicum que codifican para el gen sucC y sucD, las cuales son parte integrante de la presente invención como SEQ ID No. 1. Además, a partir de la presente secuencia de DNA se derivó con los métodos previamente descritos la secuencia de aminoácido de la proteina correspondiente. En SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3 se representan las secuencias de aminoácido resultantes del producto del gen sucC y del gen sucD. Las secuencias de DNA que codifican que resultan de SEQ ID No. 1 mediante la degeneración del código genético son igualmente parte integrante de la invención. Igualmente son parte integrante de la invención las secuencias de DNA que hibridizan con la SEQ ID No. 1 o partes de SEQ ID No. 1. Finalmente son parte integrante de la invención las secuencias de DNA que se producen mediante la reacción en cadena de polimerasa (RCP) utilizando cebadores que resultan de la SEQ ID No. 1. Las instrucciones para la identificación de las secuencias de DNA mediante hibridización las encuentra el experto entre otros en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de la razón social Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). La hibridización tiene lugar bajo condiciones astringentes, es decir que solamente se forman híbridos en los cuales la sonda y la secuencia diana, es decir los polinucleótidos tratados con la sonda son idénticos al menos en 70%. Se sabe que es posible influir en la astringencia de la hibridización, incluso las etapas de lavado, o bien determinarla mediante la variación de la composición del regulador, de la temperatura y de la concentación de la sal. La reacción de hibridización preferiblemente se lleva a cabo con una astringencia relativamente baja en comparación a las etapas de lavado (Hybaid Hibridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996) . Para la reacción de hibridización se puede emplear por ejemplo un regulador SSC 5x a una temperatura de aproximadamente 50 - 68°C. En esto también pueden hibridizar sondas con polinucleótidos que tienen menos del 70% de identidad con la secuencia de la sonda. Tales híbridos son menos estables y se eliminan mediante lavado bajo condiciones astringentes. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la reducción de la concentración salina a 2x SSC y eventualmente a continuación 0.5x SSC (The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, " Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995) , siendo que se ajusta una temperatura de aproximadamente 50 - 68°C. También es posible reducir la concentración salina hasta O.lx SSC. Mediante el aumento paso a paso de la temperatura de hibridización en etapas de aproximadamente 1 - 2°C desde 50 hasta 68°C se pueden aislar fragmentos de polinucleótido que tienen, por ejemplo, al menos 70% o al menos 80% o al menos 90% a 95% de identidad a la secuencia de la sonda aplicada. Otras instrucciones para la hibridización se obtienen en el comercio en forma de lo que se denomina como Kits (estuches/conjuntos) (por ejemplo el DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558). Las instrucciones para la amplificación de las secuencias de DNA con el auxilio de la reacción en cadena de polimerasa (RCP) las encuentra el experto entre otros en el manual de Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) y en Newton y Graham: RCP (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994) . Se descubrió que después del atenúamiento del gen sucC y/o sucD, las bacterias corineformes producen L-aminoácidos de manera mejorada, en particular L-lisina. Para lograr un atenúamiento se pueden reducir o eliminar o bién la expresión del gen sucC y/o sucD o bién las propiedades catalíticas de la proteina de la enzima. Eventualmente es posible combinar ambas medidas. La reducción de la expresión del gen se puede llevar a cabo mediante una conducción adecuada del cultivo o mediante modificación genética (mutación) de las estructuras de señales de la expresión del gen. Las estructuras de señales de la expresión del gen son, por ejemplo, genes represores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de enlace de ribosomas, el codón de iniciación y los terminadores. Las indicaciones a este respecto las encuentra el experto, por ejemplo, en la solicitud de patente WO 96/15246, en Boyd y Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), en Voskuil y Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), en Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996) y en libros de texto conocidos de la genética y de la biología molecular, como por ejemplo el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6. edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Alemania, 1995) o el de Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) . Las mutaciones que conducen a una modificación o a una reducción de las propiedades catalíticas de proteinas de enzimas se conocen a través del estado de la técnica; como ejemplos mencionaremos los trabajos de Qiu y Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) y Móckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Alemania, 1994) . Las descripciones sumarias se pueden sacar de libros de texto conocidos de la genética y la biología molecular, como por ejemplo el de Hagemann ("Allgemeine Genetik", editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1986) . Como mutaciones entran en consideración transiciones, transversiones, inserciones y deleciones. En función del efecto del intercambio de aminoácido sobre la actividad de la enzima se habla de mutaciones de orientación contraria (missense mutations) y mutaciones sin orientación (nonsense mutations) . Las inserciones o deleciones de al menos un par de bases en un gen conducen a mutaciones por cambio en el marco de lectura (frame shift mutations), las cuales conducen a que se inserten aminoácidos falsos o que la traslación se interrumpa. Las deleciones de varios codones típicamente conducen a una perdida total de la actividad enzimática. Las instrucciones para la creación de tales mutaciones pertenecen al estado de la técnica y se pueden sacar de libros de texto conocidos de la genética y de la biología molecular, como por ejemplo el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6. edición, editorial Georg Thieme, Stuttgart, Alemania, 1995), el de Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de Hagemann ("Allgemeine Genetik", editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1986) . Un método usual para mutar genes de C. glutamicum es el método de la disrupción del gen ("gene disruption") y del reemplazo del gen ("gene replacement") descrito por Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991) . En el caso del método de la disrupción del gen se clona una parte central de la región de codificación del gen interesante en un vector plasmídico . que puede replicar en un huésped (típicamente E. coli) pero no en C. glutamicum. Como vectores entran en consideración, por ejemplo, pSUP301 (Simón et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), 784-791 (1983)), pkldmob o pkl9mob (Scháfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pkldmobsacB o pkl9mobsacB (Jáger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wl, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; US-Patent 5,487,993) pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Países Bajos: Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) o pEMl (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510- 4516) . El vector plasmídico que contiene la parte central de la región de codificación del gen se transforma a continuación a la oepa deseada de C. glutamicum mediante conjugación o transformación. El método de la conjugación se describe, por ejemplo en Schafer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759(1994)). Los métodos para la transformación se describen, por ejemplo en Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican y Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) y Tauch et al (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347) (1994)). Después de la recombinación homologa por medio de un evento "cross over" se interrumpe la región de codificación del gen respectivo mediante la secuencia vector, y se obtienen dos alelos incompletos a los cuales les falta respectivamente la terminal 3' y 5' . Este método fue empleado, por ejemplo, por Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994) ) para eliminar el gen recA de C. glutamicum. El/los gen (es) sucC y/o sucD se pueden eliminar de esta manera. En el método del reemplazo del gen ("gene replacement") se produce una mutación in vitro, como por ejemplo una deleción, inserción o reemplazo de bases en el gen interesante. El alelo producido se clona a su vez en un vector no replicable para C. glutamicum y este se transforma a continuación mediante transformación o conjugación en el huésped de C. glutamicum deseado. Después de la recombinación homologa mediante un primer evento "cross-over" que produce la integración, y un segundo evento "cross over" adecuado que produce la escisión en el gen diana o bien en la secuencia diana se consigue la inserción de la mutación o bien del alelo. Este método fue empleado, por ejemplo por Peters-Wendisch (Microbiology 144, 915-927 (1998)) para eliminar el gen pyc de C. glutamicum mediante una deleción. De esta manera es posible insertar una deleción, inserción o reemplazo de bases en el/los gen (es) sucC y/o sucD. Para la producción de L-aminoácidos, en particular la L-lisina puede ser que adicionalmente al atenúamiento del gen sucC y/o sucD, sea además conveniente reforzar, en particular sobreexpresar una o varias enzimas de la respectiva ruta de biosíntesis de la glicolisa, anaplerótica, del ciclo de ácido cítrico o de la exportación de aminoácido. Asi, para la producción de L-lisina y/o L-glutamato, además del atenúamiento del gen sucC y/o sucD es posible reforzar, en particular sobreexpresar simultáneamente uno o varios genes seleccionados del grupo que comprende * el gen dapA que codifica para la dihidropicolinato sintasa (EP-B 0 197 335), * el gen gap que codifica para la gliceraldehido-3- fosfato dehidrogenasa (Eikmanns (1992) , Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), * el gen tpi que codifica para la triosefosfato isomerasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), * el gen pgk que codifica para la 3-fosfoglicerato cinasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), * el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076- 6086), * el gen mqo que codifica para la malato: quinona oxidoreductasa (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), * el gen lysC que codifica para una aspartatocinasa resistente a la retroalimentación (Accession No.

P26512) , * el gen lysE que codifica para la exportación de la L- lisina (DE-A-195 48 222), * el gen zwal. que codifica para la proteina Zwal (DE: 19959328.0, DSM 13115). Para la producción de L-lisina y/o L-glutamato puede ser adicionalmente conveniente, además del atenúamiento del gen sucC y/o sucD simultáneamente atenuar, en particular reducir la expresión de uno o varios genes seleccionados del grupo que comprende * el gen pck que codifica para la fosfoenolpiruvato carboxicinasa, (DE 199 50 409.1, DSM 13047), * el gen pgi que codifica para la glucoso-6-fosfato isomerasa (US 09/396,478, DSM 12969), * el gen poxB que codifica para la piruvato. oxidasa (DE:1995 1975.7, DSM 13114), * el gen zwa2 que codifica para la proteina Zwa2 (DE: 19959327.2, DSM 13113) . Para la producción de aminoácidos, en particular L-lisina y/o L-glutamato puede ser que adicionalmente al atenúamiento del gen sucC y/o sucD, sea además conveniente eliminar reacciones secundarias indeseadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982). También son objeto de la invención los microorganismos que contienen el polinucleótido de acuerdo a la reivindicación 1 y se pueden cultivar en forma continua o discontinua en el cultivo por lotes o en el cultivo en discontinuo con afluencia o en el cultivo en discontinuo con reciclaje para el fin de la producción de L-aminoácidos, en particular L-lisina. Un resumen sobre los métodos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (editorial Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (editorial Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) ) . El medio de cultivo a ser empleado debe satisfacer de manera adecuada a los requisitos de las cepas respectivas. Las descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos están contenidas en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bateriology (Washington D.C., USA, 1981). Como fuente de carbono se pueden emplear azúcar y carbohidratos, como por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, fécula y celulosa, aceites y grasas como, por ejemplo, aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y aceite de coco, ácidos grasos como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoléico, alcoholes como, por ejemplo, glicerina y etanol, y ácidos orgánicos como, por ejemplo, ácido acético. Estas sustancias se pueden emplear en forma individual o como mezclas. Como fuente de nitrógeno se pueden emplear compuestos orgánicos que contienen nitrógeno como peptonas, extracto de levadura, extracto cárnico, extracto de malta, agua de remojo de maiz, harina de frijol de soya y urea, o compuestos inorgánicos como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno se pueden emplear en forma individual o como mezcla. Como fuente de fósforo se puede emplear ácido fosfórico, fosfato dihidrógeno de potasio o hidrogenofosfato dipotásico o las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe contener además, sales de metales como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente es posible aplicar sustancias de crecimiento esenciales, como aminoácidos y vitaminas adicionalmente a las sustancias precedentemente mencionadas. Al medio de cultivo se le pueden adicionar además etapas previas adecuadas. Las sustancias aplicables mencionadas se pueden agregar al cultivo en forma de una preparación única o alimentarse de manera adecuada durante el cultivo. Para controlar el pH del cultivo se aplican de manera adecuada compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o agua amoniacal, o compuestos ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para controlar la espumación se pueden emplear agentes antiespumantes como, por ejemplo, poliglicolésteres de ácidos grasos. Para mantener la estabilidad de los plásmidos se le pueden adicionar al medio sustancias adecuadas de actividad selectiva, por ejemplo antibióticos. Con el fin de mantener las condiciones aeróbicas, al cultivo se le incorpora oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno como, por ejemplo, aire. La temperatura del cultivo normalmente se encuentra a 20°C a 45°C, y preferiblemente a 25°C a 40°C. Se prosigue con el cultivo durante tanto tiempo hasta que se ha formado un máximo del producto deseado. Esta meta se alcanza normalmente dentro de 10 horas a 160 horas. Los métodos para la determinación de los L-aminoácidos se conocen a través del estado de la técnica. El análisis se puede efectuar como se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190), mediante cromatografía de intercambio de aniones con subsecuente derivación de ninhidrina, o se puede efectuar mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de "fase inversa", tal y como se describe en Lindroth er al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174). La presente invención se explica a continuación con mas detalle mediante ejemplos de realización. Ejemplo 1 Elaboración de un banco de genes cósmido genómico a partir de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Se aislaron DNA cromosonales de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como se describe en Tauch et al. (1995, Plasmid 33:168-179) y se cortaron parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, descripción del producto: Sau3AI, clave No. 27-0913-02). Los fragmentes de DNA se desfosforilaron con fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, descripción del producto: SAP, clave No. 1758250) . Los DNA del vector cósmido SuperCosl (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84:2160-2164), adquirido de la compañía Stratagene (La Jolla, USA, descripción del producto: SuperCosl Cosmid Vector Kit, clave No. 251301) se cortó con la enzima de restricción Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, descripción del producto: Xbal, clave No. 27-0948-02) y se desfosforilaron asimismo con fosfatasa alcalina de camarón. A continuación se cortó el DNA cósmido con la enzima de restricción BamHl (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, descripción del producto: BamHl, clave No. 27-0868-04) . El DNA cósmido tratado de esta manera se mezcló con el DNA-T4-ligasa de ATCC13032 tratado y la preparación se trató con la de T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, descripción del producto: T4-DNA-ligasa, clave No. 27-0870-04) . La mezcla de ligamiento se empacó a continuación en fagos con el auxilio del extracto de empacamiento Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, USA, descripción del producto: Gigapack II XL Packing Extrac, clave No. 200217) . Para la infección de la cepa E. coli NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16:1563-1575) se suspendieron las células en 10 mM de MgS04 y se mezclaron con una alícuota de la suspensión de fagos. La infección y titulación del banco cósmido se efectuó como se describe en Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), siendo que las células se extendieron sobre placas de LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con 100 µg/ml de ampicilina. Después de incubar durante la noche a 37°C se seleccionaron clones individuales recombinantes. Ejemplo 2 Aislamento y secuenciación de los genes sucC y sucD El DNA cósmido de una colonia individual se aisló con el Qiaprep Spin Miniprep Kit (Producto No. 27106, Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo a las indicaciones del fabricante y se cortó parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, descripción del producto: Sau3AI, clave No. 27-0913-02). Los fragmentos de DNA se desfosforilan con fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, descripción del producto: SAP, clave No. 1758250) . Después de la separación electroforética en gel se llevó a cabo el aislamiento de los fragmentos de cósmidos de la gama de tamaño de 1500 a 2000 bp con el QiaExII Gel Extraction Kit (Producto No. 20021, Qiagen, Hilden, Alemania) . El DNA del vector de secuenciación pZerol, adquirido a través de la compañía Invitrogen (Groningen, Países Bajos, descripción del producto: Zero Rackground Cloning Kit, No. de producto K2500-01) se cortó con la enzima de restricción BamHl (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, descripción del producto: BamHl, No. de producto 27-0868-04) . El ligamiento de los fragmentos cósmidos en el vector secuenciador pZerol se llevó a cabo como lo describe Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), siendo que la mezcla de DNA con T4-ligasa (Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) se incubó durante la noche. Esta mezcla de ligamiento se electroporó (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) a continuación en la cepa E. coli DH5aMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87: 4645-4649) y se extendió sobre placas de agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1: 90) con 50 µg/ml de Zcocina. La preparación plásmida de los clones recombinantes se llevó a cabo con el Biorobot 9600 (Producto No. 900200, Qiagen, Hilden, Alemania) . La secuenciación se llevó a cabo de acuerdo al método de interrupción de cadena dideoxi de Sanger et al.

(Proceedings of the National (Academy) of Sciences of the United States of America USA, 74:5463-5467, 1977) con modificaciones según Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Se empleó el Kit "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" de PE Applied Biosystems (Producto No. 403044, Weiterstadt, Alemania) . La separación y análisis electroforéticos en gel de la reacción de secuenciación se llevaron a cabo en un gel "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" (29:1) (producto No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el aparato de secuenciación "ABl Prism 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania) . Los datos obtenidos de la secuencia cruda se procesaron a continuación empleandoel paquete de programa Staden (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) versión 97-0. Las secuencias individuales de los derivados de pZerol se ensamblaron para obtener un Contig continuo. El análisis de la región de codificación apoyado por computadora se elaboró con el programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231). Se llevaron a cabo otros análisis con los "BLAST search programs" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402), contra el banco de datos no redundante del "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA) . La secuencia de nucleótidos obtenida se representa en SEQ ID No. 1. El análisis de la secuencia de nucleótidos dio por resultado un marco de lectura abierto de 1206 pares de bases que se caracterizó como gen sucC, así como un marco de lectura abierto de 882 pares de bases que se caracterizó como sucD. El gen sucC codifica para un polipéptido de 402 aminoácidos, el cual se representa en la SEQ ID No. 2. El gen sucD codifica para un polipéptido de 294 aminoácidos que se representa én la SEQ ID No. 3.

Ejemplo 3 3.1 Elaboración de un vector de integración para la mutagénesis de integración del gen sucC A partir de la cepa ATCC 13032 se aisló DNA cromosonal de acuerdo al método de Eikmanns et al (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)). Tomando como base la secuencia del gen sucC para C. glutamicum conocida por el ejemplo 2 se seleccionaron los siguientes oligonucleótidos para la reacción en cadena de polimerasa: sucC-inl: 5' CGC GCG AAT CGT TCG TAT 3' sucC-in2 : 5'CGC CAC CAA TGT CTA GGA 3' Los cebadores representados fueron sintetizados por la compañía MWG Biotech (Ebersberg, Alemania) y la reacción en cadena de polimerasa se llevó a cabo de acuerdo al método PCR estándar de Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) con la polimerasa Pwo de la compañía Boehringer Mannheim (Alemania, descripción del producto: Pwo DNA Polimerase, producto No. 1 644 947) . Con el auxilio de la reacción en cadena de polimerasa los cebadores permiten la amplificación de un fragmento interno de aproximadamente 0.55 kb de tamaño del gen sucC. El producto amplificado de esta manera se ensayó electroforéticamente en un gel de agarosa al 0.8%. El fragmento de DNA amplificado se ligó al vector pCR®Blunt II (Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534:541 (1993)) con el Kit Zero Blurít™ de la compañía Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; número de catálogo K2700-20) . A continuación se electroporó la cepa E. coli TOP10 con la preparación de ligamiento (Hanahan, en: DNA Cloning. A Practical Approach, Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) . La selección de células portadoras de plásmidos se llevó a cabo extendiendo la preparación de transformación sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) que se complementó con 25 mg/l de canamicina. El DNA plásmido se aisló a partir de un transformado con el auxilio del Kit "QIAprep Spin Miniprep Kit" de la compañía Qiagen, y se examinó mediante restricción con la enzima de restricción EcoRI y subsecuente electroforésis con gel de agarosa (0.8%). El plásmido se nombró pCRBluntsucCint y esta representado en la figura 1. 3.2 Deleción del gen sucD Para este propósito se aisló DNA cromosonal a partir de la cepa ATCC13032 según el método de Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179) . Tomando como base la secuencia del gen sucD conocida para C. glutamicum por el ejemplo 2 se seleccionaron los oligonucleótidos que se describen a continuación para la producción del alelo de deleción de sucD. sucD-dl : 5' -CGA TGT GAT TGC GCT TGA TG -3' sucD-d2 : 5' -ACC-TCA-CGC-ATA-AGC-TTC-GCA-TGC-TCT-GAA-CCT-TCC-GAA-C - 3' sucD-d3: 5' -GTT CGG AAG GTT CAG AGC ATG CGA AGC TTA TGC GTG AGG T - 3' sucD-d4 : 5' -ATG AAG CCA GCG ACT GCA GA -3' Los cebadores representados fueron sintetizados por la compañía MWG Biotech (Ebersberg, Alemania) y la reacción en cadena de polimerasa se llevó a cabo empleando la polimerasa Pfu (Stratagene, producto No. 600135, La Jolla, USA) y el termociclador PTC-100 (MJ Research Inc., Waltham, USA) . Con el auxilio de la reacción en cadena de polimerasa los cebadores permiten la amplificación de un alelo de sucD con deleción interna. El producto amplificado de esta manera se ensayó electroforéticamente en un gel de agarosa al .0.8% y fué secuenciado igualmente como se describe en Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977). Ejemplo 4 4.1 Mutagénesis de integración del gen sucC en la cepa DSM 5715 El vector pCRBluntsucCint mencionado en el ejemplo 3 se electroporó en C. glutamicum DSM 5715 según el método de electroporación de Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347) . En el caso de la cepa DSM 5715 se trata de un productor de L-lisina resistente a AEC. El vector pCRBluntsucCint no puede replicar independientemente en DSM5715 y solo se conserva en la célula si se ha integrado al cromosoma de DSM 5715. La selección de clones con pCRBluntsucCint integrado al cromosoma se llevó a cabo extendiendo la preparación de electroporación sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) que se complementó con 15 mg/l de canamicina. Para la comprobación de la integración el fragmento sucCint se marcó con el Kit de hibridización Dig de la compañía Boehringer de acuerdo al método "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de la compañía Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) . El DNA cromosomal de un inegrante potencial se aisló según el método de Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) y se cortó respectivamente con las enzimas de restricción Sphl y HindIII. Los fragmentos resultantes se separaron mediante la electroforésis de gel de agarosa y se hibridizaron a 68°C con el Kit de hibridización Dig de la compañía Boehringer. El plásmido pCRBluntsucCint mencionado en el ejemplo 3.1 se había insertado en el cromosoma de DSM5715 dentro del gen sucC cromosomal. La cepa se caracterizó como DSM5715: :pCRBluntsucCint . 4.2 Construcción del vector de reemplazo pKldmobsacBsucDdel Después de la separación en un gel de agarosa (0.8%), el derivado de deleción sucD obtenido en el ejemplo 3.2 se aisló del gel de agarosa con ayuda del Kit "Quiagenquick Gel Extraction Kit" (Qiagen, Hilden, Alemania) y se aplicó para la ligación con el vector de clonación movilizable pKldmobsacB (Scháfer et al., (1994), Gene 14: 69-73) . Este se cortó previamente con las enzimas de restricción Xmal y Xbal, se mezcló con el alelo de deleción sucD y se trató con T4-DNA-ligasa (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania) . A continuación se electroporó la cepa E. coli DH5amcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87: 4645-4649) con la preparación de ligamiento (Hanahan, en: DNA Cloning. A Practical Approach, Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) . La selección de células portadoras de plásmidos se llevó a cabo extendiendo la preparación de transformación sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) que se complementó con 25 mg/l de canamicina. El DNA plásmido se aisló a partir de un transformado con el auxilio del Kit "QIAprep Spin Miniprep Kit" de la compañía Qiagen, y el alelo de deleción sucD clonado se verificó mediante secuenciación por la compañía MWG Biotech (Ebersberg, Alemania) . El plásmido se nombró pK18mobsacBsucDdel. La cepa se caracterizó como E.coliDH5ocmcr/pKldmobsacBsucDdel . 4.3 Mutagénesis de deleción del gen sucD en la cepa C. glutamicum DSM 5715 El vector pKldmobsacBsucDdel mencionado en el ejemplo 4.2 se electroporó según el método de electroporación de Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347). El vector no puede replicar independientemente en DSM5715 y solo se conserva en la célula si se ha integrado al cromosoma. La selección de clones con pKldmobsacBsucDdel integrado se llevó a cabo extendiendo la preparación de electroporación sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) que se complementó con 15 mg/l de canamicina. Los clones incrementados se extendieron sobre placas de agar LB con 25 mg/l de canamicina y se incubaron durante 16 horas a 33°C. Para lograr la excisión del plásmido junto con la totalidad de la copia cromosomal del gen sucD, a continuación los clones se cultivaron sobre agar LB con 10% de sucrosa. El plásmido pKldmobsacB contiene una copia del gen sacB, el cual transforma la sucrosa en la levanosucrasa tóxica para C. glutamicum. Por consiguiente, sobre agar LB con sucrosa únicamente crecen aquellos clones en los que el pKldmobsacBsucDdel integrado nuevamente ha excisado. En la excisión puede excisar junto con el plásmido o bién la copia cromosomal completa del gen sucD o la copia incompleta con la deleción interna. Para comprobar que en el cromosoma quedó la copia incompleta de sucD, el fragmento de plásmido pKldmobsacBsucDdel se marcó con el Kit de hibridización Dig de la compañía Boehringer de acuerdo al método "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de la compañía Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) . El DNA cromosomal de un mutante de deleción potencial se aisló según el método de Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1617-ld2d (1994)) y se cortó respectivamente con las enzimas de restricción Sphl y PstI en preparaciones separadas. Los fragmentos resultantes se separaron mediante electroforésis de gel de agarosa y se hibridizaron a 6d°C con el Kit de hibridización Dig de la compañía Boehringer. En base a los fragmentos resultantes se pudo demostrar que la cepa DSM5715 perdió una copia completa del gen sucD y en cambio solo dispone de la copia delecionada. La cepa se caracterizó como C. glutamicum DSM5715?sucD. Ejemplo 5 5.1 Elaboración de L-glutamato con la cepa DSM5715: :pCRBluntsucCint La cepa DSM5715: :pCRBluntsucCint de C. glutamicum obtenida en el ejemplo 4.1 se cultivó en un medio de cultivo adecuado para la producción de L-glutamato, y se determinó el contenido de L-glutamato en el sobrenadante del cultivo. Para este propósito la cepa primero se incubó sobre placa de agar durante 24 horas a 33°C con el antibiótico correspondiente (agar de cerebro-corazón con canamicina (25 mg/l) . A partir de este cultivo de placas de agar se inoculó un precultivo (10 ml de medio en un matraz Erlenmeyer de 100 ml) . Como medio para el precultivo se empleó el medio integral Cg III.

Medio integral Cg III NaCl 2.5 g/1 Bacto-peptona 10 g/1 Extracto de bacto-levadura 10 g/1 Glucosa (tratada en autoclave por separado 2% (p/v) El valor pH se ajustó en pH 7.4 A este (medio) se le adicionó canamicina (25 mg/l) . El precultivo se incubó durante 16 horas a 33°C a 240 rpm en el agitador. A partir de este precultivo se inoculó un cultivo principal, de manera que la OD inicial (660 nm) del cultivo principal fué de 0.1 de OD. Para el cultivo principal se empleó el medio MM.

Medio MM CSL (Licor de maíz empapado) 5 g/1 MOPS (ácido morfolinopropansulfónico) 20 g/1 Glucosa (tratada en autoclave por separado) 50 g/1 Sales: (NH4)2S04) 25 g/1 KH2P04 0.1 g/1 MgS04 * 7 H20 1.0 g/1 CaCl2 * 2 H20 10 mg/l FeS04 * 7 H20 10 mg/l MnS04 * H20 5.0 mg/l Biotina (filtrada a esterilidad) 0.3 mg/l Tiamina * HCl (filtrada a esterilidad) 0.2 mg/l Fumarato (filtrado a esterilidad) 5.61 g/1 Leucina (filtrada a esterilidad) 0.1 g/1 CaC03 25 g/1 El CSL, el MOPS y la solución salina se ajustan con agua amoniacal a pH 7 y se tratan en autoclave. A continuación se adicionan las soluciones estériles de sustrato y vitaminas, así como el CaC03 tratado en autoclave en seco. El cultivo se lleva a cabo en 10 ml de volumen de un matraz Erlenmeyer de 100 ml con sepentines. Se adicionó canamicina (25 mg/l) . El cultivo se efectuó a 33°C y 80% de humedad ambiente. Después de 24 horas se determinó la OD a una longitud de onda de 660 nm con el aparato Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich) . La cantidad de glutamato formada se determinó con un analizador de aminoácidos de la compañía Eppendorf-Biotronik (Hamburgo, Alemania) mediante cromatografía de intercambio de iones y derivación posterior en columna con detección mediante ninhidrina. En la tabla 1 se representa el resultado de la prueba.

Tabla 1 5.2 Elaboración de L-glutamato con la cepa DSM5715?sucD La cepa DSM5715/pK18mobsacBsucDdel de C. glutamicum obtenida en el ejemplo 4.3 se cultivó en un medio de cultivo adecuado para la producción de L- glutamato, y se determinó el contenido de L-glutamato en el sobrenadante del cultivo. Para este propósito la cepa primero se incubó sobre placa de agar durante 24 horas a 33°C. A partir de este cultivo de placas de agar se inoculó un precultivo (10 ml de medio en un matraz Erlen eyer de 100 ml) . Como medio para el precultivo se empleó el medio integral Cg III. A este se le adicionó canamicina (25 mg/l) . El precultivo se incubó durante 16 horas a 33°C a 240 rpm en el agitador. A partir de este precultivo se inoculó un cultivo principal, de manera que la OD inicial (660 nm) del cultivo principal fué de 0.1 de OD. Para el cultivo principal se empleó el medio MM.

El cultivo se lleva a cabo en 10 ml de volumen de un matraz Erlenmeyer de 100 ml con sepentines. Se adicionó canamicina (25 mg/l) . El cultivo se efectuó a 33°C y 60% de humedad ambiente. Después de 72 horas se determinó la OD a una longitud de onda de 660 nm con el aparato Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich) . La cantidad de glutamato formada se determinó con un analizador de aminoácidos de la compañía Eppendorf-Biotronik (Hamburgo, Alemania) mediante cromatografía de intercambio de iones y derivación posterior en columna con detección mediante ninhidrina. En la tabla 2 se representa el resultado de la prueba.

Tabla 2 Se anexan las figuras siguientes: Figura 1: Mapa del plásmido pCRBluntsucCint Las abreviaturas y designaciones usadas tienen los significados siguientes: KmR: Gen resistente a la canamicina Zeocin: Gen resistente a la zeocina HindIII Sitio de corte de la enzima de restricción HindIII Sphl Sitio de corte de la enzima de restricción Sphl EcoRI Sitio de corte de la enzima de restricción EcoRI sucCint : Fragmento interno del gen sucC ColEl ori Origen de la replicación del plásmido ColEl Figura 2: Mapa del plásmido pKldmobsacBsucDdel Las abreviaturas y designaciones usadas tienen los significados siguientes: oriV: Origen similar a ColEl de pMBl sacB el gen sacB que codifica para la proteina levanosucrosa RP4mob: Sitio de movilización de RP4 Kan: Gen resistente a la canamicina sucDdel: Alelo delecionado del gen sucD de C. glutamicum Sphl Sitio de corte de la enzima de restricción Sphl PstI Sitio de corte de la enzima de restricción PstI X al Sitio de corte de la enzima de restricción Xmal Xbal Sitio de corte de la enzima de restricción Xbal PROTOCOLO DE SECUENCIAS <110> Degussa-Hüls AG <120> Nuevas secuencias de nucleótidos que codifican para los genes sucC y sucD <130> 990171BT <140> <141> <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2410 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (142) .. (1347) <223> sucD <400> 1 gcaccacgga tccaattttg ttgcaatttg caaagtttac agtgttagac ttcacaatac 60 gatcatattg gtgagttgaa acacttactt ttacggyaag actttgttaa agacgcagaa 120 ggclclaagc atgggccgga a atg gaa ttg gca gtg gat ctt ttt gaa tac 171 Met Glu Leu Ala Val Asp Leu Phe Glu Tyr 10 caá gca cgg gac etc ttt gaa acc cat ggt gtg cea gtg ttg aag gga 219 Gln Ala Arg Asp Leu Phe Glu Thr His Gly Val Pro Val Leu Lys Gly 15 20 25 att gtg gca tea acá cea gag gcg gcg agg aaa gcg gct gag gaa ate 267 lie Val Ala Ser Thr Pro Clu Ala Ala Arg Lys Ala Ala Glu Glu lie 30 35 40 ggc gga ctg acc gtc gtc aag gct cag gtc aag gtg ggc gga cgt ggc 315 Gly Gly Leu Thr Val Val Lyb Ala Gln Val Lys Val Gly Gly Arg Gly 45 50 55 aag gcg ggt ggc gtc cgt gtg gca ccg acg tcg gcl cag gct ttt gat 363 Lys Ala Gly Gly Val Arg Val Ala Pro Thr Ser Ala Gln Ala Phe Asp 60 65 70 gct gcg gat gcg att etc ggc atg gat ate aaa gga cae act gtt aat 411 Ala Ala Asp Ala lie Leu Cly Met Asp lie Lys Gly His Thr Val Asn 75 80 85 90 cag gtg atg gtg gcg cag ggc gct gac att gct gag gaa tac tat ttc 459 Gln Val Met Val Ala Gln Gly Ala Asp lie Ala Glu Glu Tyr Tyr Phe 95 100 105 tcc att ttg ttg gat cgc gcg aat cgt tcg tat ctg gct atg tgc tct 507 Ser Tle Leu Leu Asp Arg Ala Asn Arg Ser Tyr Leu Ala Met Cys Ser 110 ' 115 120 gtt gaa ggt ggc atg gag ate gag ate ctg gcg aag gaa aag ect gaa 555 Val Glu Gly Cly Met Clu lie Glu He Leu Ala Lys Glu Lys Pro Glu 125 130 135 gct ttg gca aag gtg gaa gtg gat ccc etc act ggt att gat gag gac 603 Ala Leu Ala Lys Val Glu Val Asp Pro Leu Thr Gly He Asp Glu Asp 140 145 150 aaa gcg cgg gag att gtc act gct gct ggc ttt gaa act gag gtg gca 651 Lys Ala Arg Glu He Val Thr Ala Ala Gly Phe Glu Thr Glu Val Ala 155 160 165 170 gag aaa gtc att ccg gtg ctg ate aag ate tgg cag gtg tat tac gaa 699 Glu Lys Val He Pro Val Leu He Lys He Trp Gln Val Tyr Tyr Glu 175 180 185 gag gaa gca acá etc gtt gag gtg aac ccg ttg gtg etc acg gat gac 747 Glu Glu Ala Thr Leu Val Glu Val Asn Pro Leu Val Leu Thr Asp Asp 190 195 200 ggc gat gtg att gcg ctt gat ggc aag ate acg ctg gat gat aac gct 795 Gly Asp Val He Ala Leu Asp Gly Lys He Thr Leu Asp Asp Asn Ala 205 210 215 gat ttc cgc cat gat aac cgt ggt gcg ttg gct gaa tct gcc ggt ggc 843 Asp Phe Arg His Asp Asn Arg Gly Ala Leu Ala Glu Ser Ala Gly Gly 220 225 230 ttg gac att ttg gaa ctg aag gcc aag aag aat gat ctg aac tac gtg 891 Leu Asp He Leu Glu Leu Lys Ala Lys Lys Asn Asp Leu Asn Tyr Val 235 240 245 250 aaa ctt gat ggc tct gtg ggc ate att ggc aat ggt gca ggt ttg gtg 939 Lys Leu Asp Gly Ser Val Gly He He Gly Asn Gly Ala Gly Leu Val 255 260 265 atg tcc acg ttg gat ate gtg gct gca gct ggt gaa cgc cat ggt ggg 987 Met Ser Thr Leu Asp He Val Ala Ala Ala Gly Glu Arg His Gly Gly 270 275 280 cag cgc ccc gcg aac ttc cta gac all ggt ggc gga gca tea gct gaa 1035 Gln Arg Pro Ala Asn Phe Leu Asp He Gly Gly Gly Ala Ser Ala Glu 285 290 295 tcg atg gct gct ggt etc gat gtg ate ctt ggg gat age cag gta cgc 1083 Ser Met Ala Ala Gly Leu Asp Val He Leu Gly Asp Ser Gln Val Arg 300 305 310 agt gtg 111 glg aat gtg ttt ggt ggc ate acc gcg tgt gal gtg gtg 1131 Ser Val Phe Val Asn Val Phe Gly Gly He Thr Ala Cys Asp Val Val 315 320 325 330 gca aag gga ate gtt gga gct ttg gat gtg etc ggc gat caá gca acg 1179 Ala Lys Gly He Val Gly Ala Leu Asp Val Leu Gly Asp Gln Ala Thr 335 340 345 aag ect ctt gtg gtg cgc ctt gat ggc aac aac gtg gtg gaa ggc aga 1227 Lys Pro Leu Val Val Arg Leu Asp Gly Asn Asn Val Val Glu Gly Arg 350 355 360 cga ate etc gcg gaa tat aac cae ect ttg gtc acc gtt gtg gag ggt 1275 Arg He Leu Ala Glu Tyr Asn His Pro Leu Val Thr Val Val Glu Gly 365 370 375 atg gat gca gcg gct gat cae gct gcc cat ttg gcc aat ctt gcc cag 1323 Met Asp Ala Ala Ala Asp His Ala Ala His Leu Ala Asn Leu Ala Gln 380 385 390 cae ggc cag ttc gca acc gct aat tagttaagga gcacctgttt aatc atg 1374 His Gly Gln Phe Ala Thr Ala Asn Met 395 400 tct att ttt etc aat tea gat tcc cgc ate ate att cag ggc att acc 1422 Ser He Phe Leu Asn Ser Asp Ser Arg He He He Gln Gly He Thr 405 410 415 ggt tcg gaa ggt tea gag cat gcg cgt cga att tta gcc tct ggt gcg 1470 Gly Ser Glu Gly Ser Glu His Ala Arg Arg He Leu Ala Ser Gly Ala 420 425 430 435 aag etc gtg ggt ggc acc aac ccc cgc aaa gcl ggg caá acc att ttg 1518 Lys Leu Val Gly Gly Thr Asn Pro Arg Lys Ala Gly Gln Thr He Leu 440 445 450 ate aat gac act gag ttg ect gta ttt ggc act gtt aag gaa gca atg 1566 He Asn Asp Thr Glu Leu Pro Val Phe Gly Thr Val Lys Glu Ala Met 455 460 465 gag gaa acg ggt gcg gat gtc acc gta att ttc gtt ect cea gcc ttt 1614 Glu Glu Thr Gly Ala Asp Val Thr Val He Phe Val Pro Pro Ala Phe 470 475 480 gcc aaa gct gcg ate att gaa gct ate gac gct cae ate cea ctg tgc 1662 Ala Lys Ala Ala He He Glu Ala He Asp Ala His He Pro Leu Cys 485 490 495 gtg att att act gag ggc ate cea gtg cgt gac gct tct gag gcg tgg 1710 Val He He Thr Glu Gly He Pro Val Arg Asp Ala Ser Glu Ala Trp 500 505 510 515 gct tat gcc aag aag gtg gga cae acc cgc ate att ggc ect aac tgc 1758 Ala Tyr Ala Lys Lys Val Gly His Thr Arg He He Gly Pro Asn Cys 520 525 530 cea ggc att att act ccc ggc gaa tct ctt gcg gga att acg ccg gca 1806 Pro Gly He He Thr Pro Gly Glu Ser Leu Ala Gly He Thr Pro Ala 535 540 545 aac att gca ggt tcc ggc ccg ate ggg ttg ate tea aag tcg gga acá 1854 Asn He Ala Gly Ser Gly Pro He Gly Leu He Ser Lys Ser Gly Thr 550 555 560 ctg act tat cag atg atg tac gaa ctt tea gat att ggc att tct acg 1902 Leu Thr Tyr Gln Met Met Tyr Glu Leu Ser Asp He Gly He Ser Thr 565 570 575 gcg att ggt att ggc ggt gac cea ate ate ggt acá acc cat ate gac 1950 Ala He Gly He Gly Gly Asp Pro He He Gly Thr Thr His He Asp 580 585 590 595 gct ctg gag gcc ttt gaa gct gat ect gag acc aag gca ate gtc atg 1998 Ala Leu Glu Ala Phe Glu Ala Asp Pro Glu Thr Lys Ala He Val Met 600 605 610 ate ggt gag ate ggt gga gat gca gag gaa cgc gct gct gac ttc att 2046 He Gly Glu He Gly Gly Asp Ala Glu Glu Arg Ala Ala Asp Phe He 615 620 625 tct aag cae gtg acá aaa cea gil gtg ggt tac gtg gca ggc til acc 2094 Ser Lys His Val Thr Lys Pro Val Val Gly Tyr Val Ala Gly Phe Thr 630 635 640 gcc ect gaa gga aag acc atg ggg cat gct ggc gcc ate gtg acá ggt 2142 Ala Pro Glu Gly Lys Thr Met Gly His Ala Gly Ala He Val Thr Gly 645 650 655 tea gaa ggc act gcg cga gca aag aag cat gca ttg gag gcc gtg ggt 2190 Ser Glu Gly Thr Ala Arg Ala Lys Lys His Ala Leu Glu Ala Val Gly 660 665 670 675 gtt cgc gtg gga acá act ccg agt gaa acc gcg aag ctt atg cgt gag 2238 Val Arg Val Gly Thr Thr Pro Ser Glu Thr Ala Lys Leu Met Arg Glu 680 685 690 gta gtt gca gct ttg taactaacag gccacagatc ttagctttga ccagcggatt 2293 Val Val Ala Ala Leu 695 tgtggctaat cgcccggtct gtgtagagta tteatetgtg cgcaggacag tgtgacaaac 2353 actgaatagt gcatggcttt aaggccctgt ggcgcagttg gttagcgcgc cgccctg 2410 <210> 2 <211> 402 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Glu Leu Ala Val Asp Leu Phe Glu Tyr Gln Ala Arg Asp Leu Phe 1 5 10 15 Glu Thr His Gly Val Pro Val Leu Lys Gly He Val Ala Ser Thr Pro 20 25 30 Glu Ala Ala Arg Lys Ala Ala Glu Glu He Gly Gly Leu Thr Val Val 35 40 45 Lys Ala Gln Val Lys Val Gly Gly Arg Gly Lys Ala Gly Gly Val Arg 50 55 60 Val Ala Pro Thr Ser Ala Gln Ala Phe Asp Ala Ala Asp Ala He Leu 65 70 75 80 Gly Met Asp He Lys Gly His Thr Val Asn Gln Val Met Val Ala Gln 85 90 95 Gly Ala Asp He Ala Glu Glu Tyr Tyr Phe Ser He Leu Leu Asp Arg 100 105 110 Ala Asn Arg Ser Tyr Leu Ala Met Cys Ser Val Glu Gly Gly Met Glu 115 120 125 He Glu He Leu Ala Lys Glu Lys Pro Glu Ala Leu Ala Lys Val Glu 130 135 140 Val Asp Pro Leu Thr Gly He Asp Glu Asp Lys Ala Arg Glu He Val 145 150 155 160 Thr Ala Ala Gly Phe Glu Thr Glu Val Ala Glu Lys Val He Pro Val 165 170 175 Leu He Lys He Trp Gln Val Tyr Tyr Glu Glu Glu Ala Thr Leu Val 180 185 190 Glu Val Asn Pro Leu Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Val He Ala Leu 195 200 205 Asp Gly Lys He Thr Leu Asp Asp Asn Ala Asp Phe Arg His Asp Asn 210 215 220 Arg Gly Ala Leu Ala Glu Ser Ala Gly Gly Leu Asp He Leu Glu Leu 225 230 235 240 Lys Ala Lys Lys Asn Asp Leu Asn Tyr Val Lys Leu Asp Gly Ser Val 245 250 255 Gly He He Gly Asn Gly Ala Gly Leu Val Met Ser Thr Leu Asp He 260 265 270 Val Ala Ala Ala Gly Glu Arg His Gly Gly Gln Arg Pro Ala Asn Phe 275 280 285 Leu Asp He Gly Gly Gly Ala Ser Ala Glu Ser Met Ala Ala Gly Leu 290 295 300 Asp Val He Leu Gly Asp Ser Gln Val Arg Ser Val Phe Val Asn Val 305 310 315 320 Phe Gly Gly He Thr Ala Cys Asp Val Val Ala Lys Gly He Val Gly 325 330 335 Ala Leu Asp Val Leu Gly Asp Gln Ala Thr Lys Pro Leu Val Val Arg 340 345 350 Leu Asp Gly Asn Asn Val Val Glu Gly Arg Arg Tle Leu Ala Glu Tyr 355 360 365 Asn His Pro Leu Val Thr Val Val Glu Gly Met Asp Ala Ala Ala Asp 370 375 380 His Ala Ala His Leu Ala Asn Leu Ala Gln His Gly Gln Phe Ala Thr 385 390 395 400 Ala Asn <210> 3 <211> 294 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicuni <4O0> 3 Met Ser He Phe Leu Asn Ser Asp Ser Arg He He He Gln Gly He 1 5 10 15 Thr Gly Ser Glu Gly Ser Glu His Ala Arg Arg He Leu Ala Ser Gly 20 25 30 Ala Lys Leu Val Gly Gly Thr Asn Pro Arg Lys Ala Gly Gln Thr He 35 40 45 Leu He Asn Asp Thr Glu Leu Pro Val Phe Gly Thr Val Lys Glu Ala 50 55 60 Met Glu Glu Thr Gly Ala Asp Val Thr Val He Phe Val Pro Pro Ala 65 70 75 80 Phe Ala Lys Ala Ala He He Glu Ala He Asp Ala His He Pro Leu 85 90 95 Cys Val He He Thr Glu Gly He Pro Val Arg Asp Ala Ser Glu Ala 100 105 110 Trp Ala Tyr Ala Lys Lys Val Gly His Thr Arg He He Gly Pro Asn 115 120 125 Cys Pro Gly He He Thr Pro Gly Glu Ser Leu Ala Gly He Thr Pro 130 135 140 Ala Asn He Ala Gly Ser Gly Pro He Gly Leu He Ser Lys Ser Gly 145 150 155 160 Thr Leu Thr Tyr Gln Met Met Tyr Glu Leu Ser Asp Tle Gly He Ser 165 170 175 Thr Ala He Gly He Gly Gly Asp Pro He He Gly Thr Thr His He 180 185 190 Asp Ala Leu Glu Ala Phe Glu Ala Asp Pro Glu Thr Lys Ala He Val 195 200 205 Met He Gly Glu He Gly Gly Asp Ala Glu Glu Arg Ala Ala Asp Phe 210 215 220 He Ser Lys His Val Thr Lys Pro Val Val Gly Tyr Val Ala Gly Phe 225 230 235 240 Thr Ala Pro Glu Gly Lys Thr Met Gly His Ala Gly Ala He Val Thr 245 250 255 Gly Ser Glu Gly Thr Ala Arg Ala Lys Lys His Ala Leu Glu Ala Val 260 265 270 Gly Val Arg Val Gly Thr Thr Pro Ser Glu Thr Ala Lys Leu Met Arg 275 280 285 Glu Val Val Ala Ala Leu 290

Claims

REIVINDICACIONES 1. Polinucleótido aislado que contiene una secuencia de polinucleótido que codifica para el gen sucC y/o sucD, caracterizado porque se selecciona a) polinucleótido que es al menos 70 % idéntico a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID No. 2, b) polinucleótido que es al menos 70 % idéntico a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID No. 3, c) polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácido que es al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de SEQ ID No 2, d) polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácido que es al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de SEQ ID No 3, e) polinucleótido complementario a los polinucleótidos de a) , b) , c) o d) y f) polinucleótido que contiene al menos 15 nucleótidos sucesivos de la secuencia de polinucleótido de a) , b) , c) , d) o e) , siendo que polipéptido preferentemente tiene la actividad de la succinil-CoA-sintetasa. 2. Polinucleótidos según la reivindicación 1, caracterizado para el polinucleótido es un DNA de preferencia recombinante, replicable en bacterias corineformes . 3. Polinucleótidos según la reivindicación 1, caracterizado para el polinucleótido es un RNA. 4. Polinucleótidos según la reivindicación 2, caracterizado porque contiene la secuencia de ácido nucleico según se muestra en SEQ ID No. 1. 5. DNA replicable según la reivindicación 2, caracterizado porque (i) la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID No. 1, o (ii) al menos una secuencia que corresponde a las secuencias (i) dentro de la región de la degeneración del código genético, o (iii) al menos una secuencia que hibridiza con las secuencias complementarias a la secuencia (i) o (ii) , y opcionalmente (iv) mutaciones de orientación funcionalmente neutrales en (i) . 6. ENA repicable según la reivindicación 5, en que la hibridización se lleva a cabo bajo una astringencia que corresponde como máximo a 2x SSC. 7. Secuencia de polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque codifica para un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácido que se muestra en SEQ ID No. 2. 6. Bacterias corineformes en las que se atenúa el gen sucC y/o sucD. 9. Método para producir L-aminoácidos, en particular L-lisina y/o L-glutamato, caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes etapas: a) fermentación de las bacterias que producen el L- aminoácido deseado en las que primeramente se atenúan, en particular se eliminan los genes sucC y/o sucD o las secuencias de nucleótidos que codifican para ellos; b) acumulación del L-aminoácido en el médium o en las células bacterianas, y c) aislamiento del L-aminoácido. 10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque se emplean bacterias en las que adicionalmente se refuerzan otros genes del curso de la biosíntesis del aminoácido deseado. 11. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque se emplean bacterias en las que están al menos parcialmente eliminados los cursos del metabolismo que disminuyen la formación del L-aminoácido deseado. 12. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque se atenúa, en particular se elimina la expresión de el/los polinucleótido (s) que codifica (n) para el gen sucC y sucD. 13. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque se disminuyen las propiedades catalíticas del polipéptido (proteina enzima) para el que codifican los polinucleótidos sucC y sucD. 14. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque para la elaboración de L-aminoácidos se fermentan microorganismos en los que simultáneamente se refuerzan o sobreexpresan uno o varios genes seleccionados del grupo que comprende 14.1 el gen dapA que codifica para la dihidrodipicolinato- sintasa, 14.2 el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa, 14.3 el gen gap que codifica para la gliceraldehido-3- fosfato dehidrogenasa, 14.4 el gen tpi que codifica para la triosefosfato isomerasa, 14.5 el gen pgk que codifica para la 3-fosfoglicerato cinasa, 14.6 el gen mqo que codifica para la malato: quinona oxidoreductasa, 14.7 el gen lysE que codifica para la exportación de la L- lisina, 14.8 el gen lysC que codifica para una aspartatocinasa resistente a la retroalimentación, 14.9 el gen zwal que codifica para la proteina Zwal. 15. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque para la elaboración de L-aminoácidos se fermentan microorganismos en los que simultáneamente se atenúan uno o varios genes seleccionados del grupo que comprende 15.1 el gen pck que codifica para la fosfoenolpiruvato carboxicinasa, 15.2 el gen pgi que codifica para la glucoso-6-fosfato isomerasa, 15.3 el gen poxB que codifica para la piruvato.oxidasa, 15.4 el gen zwa2 que codifica para la proteina Zwa2. 16. Bacterias corineformes que contienen un vector que porta partes del polinucleótido según la reivindicación 1, pero al menos 15 nucleótidos sucesivos de la secuencia reivindicada. 17. Método según una o varias de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se emplean microorganismos del tipo Corynebacterium glutamicum. 18. Método para encontrar RNA, cDNA y DNA para aislar ácidos nucleicos, o bién polinucleótidos o genes que codifican para la succinil-CoA-sintasa y tienen una gran similitud a la secuencia del' gen sucC y/o sucD, caracterizado porque se emplea el polinucleótido que contiene las secuencias de polinucleótido según las reivindicaciones 1, 2, 3 o 4 como sondas de hibridización. RESUMEN La invención se relaciona con polinucleótidos que codifican para los genes sucC y sucD, que contienen secuencias de polinucleótido seleccionados del grupo que comprende a) polinucleótido que es al menos 70 % idéntico a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID No. 2, b) polinucleótido que es al menos 70 % idéntico a un polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID No. 3, c) polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácido que es al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de SEQ ID No 2, d) polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácido que es al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácido de SEQ ID No 3, e) polinucleótido complementario a los polinucleótidos de a) , b) , c) o d) y f) polinucleótido que contiene al menos 15 nucleótidos sucesivos de la secuencia de polinucleótido de a) , b) , c) , d) o e) , con un método para la elaboración por fermentación de L-aminoácidos empleando bacterias corineformes en las que existen los genes atenuados, y con el empleo de las secuencias de polinucleótido como sondas de hibridización.