Gegenstand der Erfindung sind für die Gene sucC und sucD
kodierenden Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien
und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Glutamat, unter
Verwendung von Bakterien, in denen das sucC- und/oder sucD-Gen
abgeschwächt wird.
Stand der Technik
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Glutamat, finden
in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie,
in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der
Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von
Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere
Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), hergestellt
werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der
Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet.
Verfahrensbesserungen können fermentationstechnische
Maßnahmen wie z.B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff,
oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z.B. die
Zuckerkonzentration während der Fermentation oder die
Aufarbeitung zur Produktform durch z.B.
Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen
Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst
betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser
Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion
und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man
Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph
für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die
Aminosäuren produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der
rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-Aminosäure
produzierenden Stämmen von Corynebacterium
eingesetzt.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue
Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Glutamat,
bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt,
sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich
ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin,
L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein,
L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin,
L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan
und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt sind L-Lysin
und L-Glutamat.
Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid,
enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der
Gruppe
a) Polynukleotid, das mindestens zu 70 % identisch ist mit
einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das
die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält, b) Polynukleotid, das mindestens zu 70 % identisch ist mit
einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das
die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 enthält, c) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine
Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70%
identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No.
2, d) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine
Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70%
identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No.
3, e) Polynukleotid, das komplementär ist zu den
Polynukleotiden von a), b), c) oder d), und f) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15
aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz
von a), b), c), d) oder e),
wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der Succinyl-CoA
Synthetase aufweist.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls das Polynukleotid
gemäß Anspruch 1, wobei es sich bevorzugt um eine
replizierbare DNA handelt, enthaltend:
(i) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1,
oder (ii) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i)
innerhalb des Bereichs der Degeneration des
genetischen Kodes entspricht, oder (iii) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz
(i) oder (ii) komplementären Sequenz
hybridisiert, und gegebenenfalls (iv) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i).
ein Polynukleotid gemäß Anspruch 4, enthaltend die Nukleotidsequenz
wie in SEQ ID No. 1 dargestellt, ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid
eine in coryneformen Bakterien replizierbare, bevorzugt
rekombinante DNA ist, ein Vektor, enthaltend Teile des erfindungsgemäßen
Polynukleotids, mindestens aber 15 aufeinanderfolgende
Nukleotide der beanspruchten Sequenz, und coryneforme Bakterien, in denen das sucC- und/oder
sucD-Gen, insbesondere durch eine Insertion oder
Deletion, abgeschwächt ist.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im
wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die
erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung
einer entsprechenden Genbank, die das vollständige sucC-
und/oder sucD-Gen mit der Polynukleotidsequenz entsprechend
SEQ ID No. 1 enthalten mit einer Sonde, die die Sequenz des
genannten Polynukleotids gemäß SEQ ID No. 1 oder ein
Fragment davon enthält und Isolierung der genannten DNA-Sequenz.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung
enthalten, sind als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA
und DNA, um cDNA geeignet, um Nukleinsäuren beziehungsweise
Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren, die
für Succinyl-CoA Synthetase kodieren und solche cDNA oder
Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der Sequenz
mit der der Succinyl-CoA Synthetase Gene aufweisen.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung
enthalten, sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren
Hilfe mit der Polymerase Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen
hergestellt werden kann, die für Succinyl-CoA Synthetase
kodieren.
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide
enthalten mindestens 30, bevorzugt mindestens 20, ganz
besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinanderfolgende
Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit
einer Länge von mindestens 40 oder 50 Nukleotiden.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld
herausgetrennt.
"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf
Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es
sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte
RNA oder DNA handeln kann.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine,
die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene
Aminosäuren enthalten.
Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen die Polypeptide
gemäß SEQ ID No. 2 und SEQ ID No. 3, insbesondere solche
mit der biologischen Aktivität der Succinyl-CoA Synthetase
und auch solche ein, die zu wenigstens 70% identisch sind
mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3,
bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders zu wenigstens 90
% bis 95 % Identität mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2
oder SEQ ID No. 3 und die genannte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von Aminosäuren, ausgewählt aus
der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin,
L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin,
L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin,
L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin, insbesondere L-Lysin
und L-Glutamat, unter Verwendung von coryneformen
Bakterien, die insbesondere bereits die Aminosäuren
insbesondere L-Lysin und/oder L-Glutamat produzieren und in
denen die für das sucC- und/oder sucD-Gen kodierenden
Nukleotidsequenzen abgeschwächt, insbesondere auf niedrigem
Niveau exprimiert werden.
Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der
intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme
(Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel
verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer
niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder
Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese
Maßnahmen kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können Aminosäuren, insbesondere L-Lysin,
aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose,
Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol
herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer
Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln.
Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art
Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt
für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu
produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die
bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende
Mutanten bzw. Stämme, wie beispielsweise die L-Lysin
produzierenden Stämme
- Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
- Brevibacterium flavum FERM-P 1708
- Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
- Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
- Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
- Corynebacterium glutamicum DSM 5714.
Die neuen, für das Enzym Succinyl-CoA Synthetase (EC
6.2.1.5) kodierenden Gene sucC und sucD von C. glutamicum
wurden isoliert.
Zur Isolierung des sucC- und/oder des sucD-Gens oder auch
anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank
dieses Mikroorganismus in E. coli angelegt. Das Anlegen von
Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und
Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das
Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in
die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland,
1990) oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die
des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell
50, 495 - 508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe
et al. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996)
beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die
mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
84:2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al.,
1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575) angelegt wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326
(1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum
ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und
Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). O'Donohue (The Cloning
and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid
Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. Ph.D.
Thesis, National University of Ireland, Galway, 1997)
beschreibt die Klonierung von C. glutamicum Genen unter
Verwendung des von Short et al. (Nucleic Acids Research,
16: 7583) beschriebenen λ Zap Expressionssystems.
Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli
können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, Life Sciences,
25, 807-818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene,
19:259-268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich
besonders solche E. coli-Stämme, die restriktions- und
rekombinationsdefekt sind wie beispielsweise der Stamm
DH5a (Jeffrey H. Miller: "A Short Course in Bacterial
Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia
coli and Related Bacteria", Cold Spring Harbour Laboratory
Press, 1992).
Die mit Hilfe von Cosmiden oder anderen λ-Vektoren
klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend
wiederum in gängige, für die DNA-Sequenzierung geeignete
Vektoren subkloniert werden.
Methoden zur DNA-Sequenzierung sind unter anderem bei
Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 74:5463-5467,
1977) beschrieben.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten
Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie z.B. dem von
Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), dem GCG-Programm
von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39,
74-97 (1998)) dem FASTA-Algorithmus von Pearson und Lipman
(Proceedings of the National Academy of Sciences USA
85,2444-2448 (1988)) oder dem BLAST-Algorithmus von
Altschul et al. (Nature Genetics 6, 119-129 (1994))
untersucht und mit den in öffentlich zugänglichen
Datenbanken vorhandenen Sequenzeinträgen verglichen werden.
Öffentlich zugängliche Datenbanken für Nukleotidsequenzen
sind beispielsweise die der European Molecular Biologies
Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland) oder die des
National Center for Biotechnology Information (NCBI,
Bethesda, MD, USA).
Die neuen für das sucC- und sucD-Gen kodierende DNA-Sequenzen
von C. glutamicum wurden gefunden, die als SEQ ID
No. 1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Weiterhin
wurde aus den vorliegenden DNA-Sequenzen mit den oben
beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz der
entsprechenden Proteine abgeleitet. In SEQ ID No. 2 und SEQ
ID No. 3 sind die sich ergebenden Aminosäuresequenzen des
sucC- und des sucD Genproduktes dargestellt.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch
die Degeneriertheit des genetischen Codes ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind
DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID
No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung.
Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Erfindung,
die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter
Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ
ID No. 1 ergeben.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels
Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im
Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al.
(International Journal of Systematic Bacteriology (1991)
41: 255-260). Die Hybridisierung findet unter stringenten
Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride
gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit
der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70%
identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der
Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch
Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der
Salzkonzentration beeinflußt bzw. bestimmt wird. Die
Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ
niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten
durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited,
Teddington, UK, 1996).
Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5x
SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50 - 68°C
eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit
Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70%
Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride
sind weniger stabil und werden durch Waschen unter
stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise
durch Senken der Salzkonzentration auf 2x SSC und
gegebenenfalls nachfolgend 0,5x SSC (The DIG System User's
Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim,
Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine
Temperatur von ca. 50 - 68°C eingestellt wird. Es ist
gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf 0,1x
SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der
Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1 - 2°C von
50 auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert werden,
die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens 80% oder
mindestens 90% bis 95% Identität zur Sequenz der
eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur
Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt
erhältlich (z.B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No.
1603558).
Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe
der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann
unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonukleotide
synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK,
1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer
Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach
Abschwächung des sucC- und/oder sucD-Gens in verbesserter
Weise L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, produzieren.
Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die
Expression des suc- und/oder sucD-Gens oder die
katalytischen Eigenschaften der Enzymproteine herabgesetzt
oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide
Maßnahmen kombiniert werden.
Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete
Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation)
der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen.
Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise
Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren,
Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und
Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in
der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy
(Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und
Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei
Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191
(1998)), bei Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996))
und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene
und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990).
Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der
katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind
aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die
Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological
Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al.
(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762
(1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus
Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen
Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des
Forschungszentrums Jülichs,Jül-2906, ISSN09442952, Jülich,
Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen
können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine
Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen
werden.
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen,
Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von
der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die
Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense
mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations")
gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens
einem Basenpaar in einem Gen führen zu
Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), in
deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die
Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren
Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung
derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und
können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und
Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu
mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology
9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung
("gene disruption") und des Gen-Austauschs ("gene
replacement").
Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler
Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen
Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise
E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als
Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al.,
Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob
(Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB oder
pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174:
5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI,
USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological
Chemistry 269:32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt
(Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al.,
Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder
pEM1 (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology
173:4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das
zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird
anschließend durch Konjugation oder Transformation in den
gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt.
Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer
et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759
(1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind
beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology
and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS
Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben.
Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"-Ereignisses
wird die Kodierregion des betreffenden Gens
durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei
unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'-Ende
fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von
Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology
42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C.
glutamicum verwendet. Das sucC- und/oder sucD-Gen können
auf diese Weise ausgeschaltet werden.
Bei der Methode des Genaustaussches ("gene replacement")
wird eine Mutation wie z.B. eine Deletion, Insertion oder
Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro
hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen
für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und
dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation
in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach
homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration
bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten
zweiten, eine Excision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses
im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau
der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde
beispielsweise von Peters-Wendisch (Microbiology 144, 915 -
927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum
durch eine Deletion auszuschalten. In das sucC- und/oder
sucD-Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder
ein Basenaustausch eingebaut werden.
In das sucC- und/oder sucD -Gen kann auf diese Weise eine
Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut
werden.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur
Abschwächung des sucC- und/oder sucD-Gens eines oder
mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der
Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus oder
des Aminosäure-Exports zu verstärken, insbesondere zu
überexprimieren.
So kann für die Herstellung von L- Lysin und/oder L-Glutamat
neben der Abschwächung des sucC- und/oder sucD-Gens
gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt
aus der Gruppe
- das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende dapA-Gen
(EP-B 0 197 335),
- das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase
kodierende gap-Gen (Eikmanns (1992), Journal of
Bacteriology 174:6076-6086),
- das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi
(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),
- das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk
(Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),
- das für die Pyruvat Carboxylase kodierende pyc-Gen(Eikmanns
(1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),
- das für die Malat:Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen
(Molenaar et al., European Journal of Biochemistry
254, 395-403 (1998)),
- das für eine feed-back resistente Aspartatkinase
kodierende Gen lysC (Accession No.P26512),
- das für den L-Lysin-Export kodierende lysE-Gen (DE-A-195
48 222),
- das für das Zwal-Protein kodierende Gen zwal (DE:
19959328.0, DSM 13115)
verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Lysin und/oder -
L-Glutamat vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des
sucC- und/oder sucD -Gens gleichzeitig eines oder mehrere
der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende
Gen pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),
- das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende Gen
pgi (US 09/396,478, DSM 12969),
- das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB
(DE:1995 1975.7, DSM 13114),
- das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE:
19959327.2, DSM 13113)
- abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren,
insbesondere L-Lysin und/oder L-Glutamat, vorteilhaft sein,
neben der Abschwächung des sucC- und/oder sucD-Gens
unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama:
"Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in:
Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta,
Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die das Polynukleotid gemäß Anspruch 1 enthaltenden
Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und
können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch -
Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch
(Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren
(repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, kultiviert werden.
Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden
sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1.
Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas
(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im
Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA,
1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie
z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose,
Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B.
Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren
wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure,
Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische
Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe
können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff- haltige
Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff
oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und
Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder
die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten
wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das
Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle
Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den
oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die
genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines
einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise
während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH - Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw.
Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur
Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie
z.B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z.B.
Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen
aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige
Gasmischungen wie z.B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des
gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird
normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden
erreicht.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem
Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie bei
Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)
beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit
anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, oder sie
kann durch "reversed phase" HPLC erfolgen, so wie bei
Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174)
beschrieben.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33:168-179)
beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell
gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer
Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim,
Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250)
dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1
(Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of
Sciences, USA 84:2160-2164), bezogen von der Firma
Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1
Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem
Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02)
gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase
dephosphoryliert. Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem
Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04)
gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA
wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der
Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no.27-0870-04)
behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend
mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene,
La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing
Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt. Zur Infektion
des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic
Acid Res. 16:1563-1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO4
aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension
vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie
bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory
Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei
die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) mit
100 µg/ml Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation
über Nacht bei 37°C wurden rekombinante Einzelklone
selektioniert.
Beispiel 2
Isolierung und Sequenzierung der Gene sucC und sucD
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep
Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden,
Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem
Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-0913-02)
partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit
shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular
Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung
SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach
gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung
der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp
mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021,
Qiagen, Hilden, Germany). Die DNA des Sequenziervektors
pZero-1 bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen,
Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning
Kit, Product No. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym
BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04)
gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den
Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al.
(1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring
Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit
T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über
Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde
anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990,
Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.,
87:4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS
Microbiol Letters, 123:343-7) und auf LB-Agar (Lennox,
1955, Virology, 1:190) mit 50 µg/ml Zeocin ausplattiert.
Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit
dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden,
Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Dideoxy-Kettenabbruch-Methode
von Sanger et al. (1977, Proceedings
of the National Academies of Sciences U.S.A., 74:5463-5467)
mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic
Acids Research, 18:1067). Es wurde der "RR dRhodamin
Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied
Biosystems(Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland)
verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und
Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem
"Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29:1) (Product
No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism
377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems
(Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend unter
Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic Acids
Research, 14:217-231) Version 97-0 prozessiert. Die
Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem
zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte
Kodierbereichsanalyse wurden mit dem Programm XNIP (Staden,
1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) angefertigt.
Weitere Analysen wurden mit den "BLAST search programs"
(Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402),
gegen die non-redundant Datenbank des "National
Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD,
USA) durchgeführt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1
dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein
offenes Leseraster von 1206 Basenpaaren, welches als sucC-Gen
bezeichnet wurde, sowie ein offenes Leseraster von 882
Basenparen, welches als sucD bezeichnet wurde. Das sucC-Gen
kodiert für ein Polypeptid von 402 Aminosäuren, welches in
SEQ ID No. 2 dargestellt ist. Das sucD-Gen kodiert für ein
Polypeptid von 294 Aminosäuren, welches in SEQ ID No. 3
dargestellt ist.
Beispiel 3
3.1 Herstellung eines Integrationsvektors für die
Integrationsmutagenese des sucC-Gens
Aus dem Stamm ATCC 13032 wurde nach der Methode von
Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994))
chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für
C. glutamicum bekannten Sequenz des sucC-Gens wurden die
folgenden Oligonukleotide für die Polymerase Kettenreaktion
ausgewählt:
Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech
(Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und nach der
Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR Protocols. A
Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)
mit der Pwo-Polymerase der Firma Boehringer Mannheim
(Deutschland, Produktbeschreibung Pwo DNA Polymerase,
Product No. 1 644 947) die PCR Reaktion durchgeführt. Mit
Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ermöglichen die Primer
die Amplifikation eines ca. 0,55 kb großen internen
Fragmentes des sucC-Gens. Das so amplifizierte Produkt
wurde in einem 0,8%igen Agarosegel elektrophoretisch
geprüft.
Das amplifizierte DNA Fragment wurde mit dem Zero Blunt™
Kit der Firma Invitrogen Corporation(Carlsbad, CA, USA;
Katalog Nummer K2700-20) in den Vektor pCR®Blunt II
(Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541
(1993)) ligiert.
Anschließend wurde der E. coli Stamm TOP10 mit dem
Ligationsansatz (Hanahan, In: DNA Cloning. A Practical
Approach, Vol.I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA,
1985) elektroporiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden
Zellen erfolgte durch Ausplattieren des
Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,
1989), der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war.
Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des
QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und
durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und
anschließender Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft.
Das Plasmid wurde pCRBluntsucCint genannt und ist in Figur
1 dargestellt.
3.2 Deletion des sucD-Gen
Hierzu wurde aus dem Stamm ATCC13032 nach der Methode von
Tauch et al. (1995, Plasmid 33:168-179) chromosomale DNA
isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für C.glutamicum
bekannten Sequenz des sucD-Gens wurden die im folgenden
beschriebenen Oligonukleotide für die Erzeugung des sucD
Deletionsallels ausgewählt.
Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech
(Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und die PCR-Reaktion
unter Verwendung der Pfu-Polymerase (Stratagene, Product.
No. 600135, La Jolla, USA) und des PTC 100-Thermocyclers
(MJ Research Inc., Waltham, USA) durchgeführt. Mit Hilfe
der Polymerase-Kettenreaktion ermöglichen die Primer die
Amplifikation eines sucD Allels mit interner Deletion. Das
so amplifizierte Produkt wurde in einem 0,8%igen Agarosegel
elektrophoretisch geprüft und ebenso wie bei Sanger et al.
beschrieben (Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 74:5463-5467,
1977) sequenziert.
Beispiel 4
4.1 Integrationsmutagenese des sucC-Gens in dem Stamm
DSM 5715
Der in Beispiel 3.1 genannte Vektor pCRBluntsucCint wurde
nach der Elektroporationsmethode von Tauch et.al. (FEMS
Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)) in C.
glutamicum DSM 5715 (EP 0 435 132) elektroporiert. Bei dem
Stamm DSM 5715 handelt es sich um einen AEC resistenten L-Lysin-Produzenten.
Der Vektor pCRBluntsucCint kann in
DSM5715 nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann
in der Zelle erhalten, wenn er ins Chromosom von DSM 5715
integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom
integriertem pCRBluntsucCint erfolgte durch Ausplattieren
des Elektroporationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.),
der mit 15 mg/l Kanamycin supplementiert worden war.
Für den Nachweis der Integration wurde das sucCint-Fragment
nach der Methode "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) mit dem Dig-Hybridisierungskit
der Firma Boehringer markiert.
Chromosomale DNA eines potentiellen Integranten wurde nach
der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)) isoliert und jeweils mit den
Restriktionsenzymen SphI und HindIII geschnitten. Die
entstehenden Fragmente wurden mittels der Agarosegel-Elektrophorese
aufgetrennt und mit dem Dig-Hybrisierungskit
der Firma Boehringer bei 68°C hybridisiert. Das in Beispiel
3.1 genannte Plasmid pCRBluntsucCint hatte innerhalb des
chromosomalen sucC-Gens ins Chromosom von DSM5715
inseriert. Der Stamm wurde als DSM5715::pCRBluntsucCint
bezeichnet.
4.2 Konstruktion des Austauschvektors pK18mobsacBsucDdel
Das in Beispiel 3.2 erhaltene sucD-Deletionsderivat wurde
nach Auftrennung in einem Agarosegel (0,8%) mit Hilfe des
Qiagenquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany)
aus dem Agarosegel isoliert und mit dem mobilisierbaren
Klonierungsvektor pK18mobsacB (Schäfer et al. (1994), Gene
14: 69-73) zur Ligation eingesetzt. Dieser wurde zuvor mit
dem Restriktionsenzymen XmaI- und XbaI aufgespalten, mit
dem sucD- Deletionsallel gemischt und mit T4-DNA-Ligase
(Amersham- Pharmaecia, Freiburg, Germany) behandelt.
Anschließend wurde der E.coli Stamm DHSαmcr (Grant, 1990,
Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.,
87:4645-4649) mit dem Ligationsansatz (Hanahan, In. DNA
Cloning. A Practical Approach, Vol.1, ILR-Press, Cold
Spring Habor, New York, 1989) elektroporiert. Die Selektion
der Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren
des Tansformationsansatzes auf LB Agar(Sambrock et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring
Habor, New York, 1989), der mit 25 mg/l Kanamycin
supplementiert worden war.
Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des
QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und das
klonierte sucD-Deletionsallel mittels Sequenzierung durch
die Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) verifiziert.
Das Plasmid wurde pK18mobsacBsucDdel genannt. Der Stamm
wurde als E.coliDH5αmcr/pK18mobsacBsucDdel bezeichnet.
4.3 Deletionsmutagenese des sucD-Gens in dem C. glutamicum
Stamm DSM 5715
Der in Beispiel 4.2 genannte Vektor pK18mobsacBsucDdel
wurde nach der Elekroporationsmethode von Tauch et
al., (1989 FEMS Microbiology Letters 123: 343-347)
elekroporiert. Der Vektor kann in DSM 5715 nicht
selbständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle
erhalten, wenn er ins Chromosom integriert hat. Die
Selektion von Klonen mit integriertem pK18mobsacBsucDdel
erfolgte durch Ausplattieren des Elekroporationsansatzes
auf LB-Agar (Sambrock et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Habor, New York,
1989), der mit 15 mg/l Kanamycin supplementiert worden war.
Angewachsene Klone wurden auf LB-Agarplatten mit 25 mg/l
Kanamycin ausgestrichen und für 16 Stunden bei 33°C
inkubiert.
Um die Excision des Plasmides zusammen mit der
vollständigen chromosomalen Kopie des sucD-Gens zu
erreichen, wurden die Klone anschließend auf LB-Agar mit
10% Sucrose angezogen. Das Plasmid pK18mobsacB enthält eine
Kopie des sacB-Gens, welches Sucrose in die für C.
glutamicum toxische Levansucrase umwandelt. Auf LB-Agar mit
Sucrose wachsen daher nur solche Klone an, bei denen das
integrierte pK18mobsacBsucDdel wiederum excisiert hat. Bei
der Excision kann zusammen mit dem Plasmid entweder die
vollständige chromosomale Kopie des sucD-Gens excisieren,
oder die unvollständige Kopie mit der internen Deletion.
Um nachzuweisen, daß die unvollständige Kopie von sucD im
Chromosom verblieben ist, wurde das Plasmid
pK18mobsacBsucDdel Fragment nach der Methode "The DIG
System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma
Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) mit
dem Dig-Hybridisierungskit der Firma Boehringer markiert.
Chromosomale DNA einer potentiellen Deletionsmutante wurde
nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140:
1817-1828 (1994)) isoliert und jeweils mit dem
Restriktionsenzymen SphI und PstI in getrennten Ansätzen
geschnitten. Die entstehenden Fragmente wurden mit
Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und mit dem Dig-Hybrisierungskit
der Firma Boehringer bei 68°C
hybridisiert. Anhand der enstandenen Fragmente konnte
gezeigt werden, daß der Stamm DSM5715 seine vollständige
Kopie des sucD-Gens verloren hat und stattdessen nur noch
über die deletierte Kopie verfügt.
Der Stamm wurde als C. glutamicum DSM5715ΔsucD bezeichnet.
Beispiel 5
5.1 Herstellung von L-Glutamat mit dem Stamm
DSM 5715::pCRBluntsucCint
Der in Beispiel 4.1 erhaltene C. glutamicum Stamm
DSM5715::pCRBluntsucCint wurde in einem zur Produktion von
L-Glutamat geeigneten Nährmedium kultiviert und der
Glutamatgehalt im Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurde der Stamm zunächst auf Agarplatte mit dem
entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar mit Kanamycin
(25 mg/l) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von
dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10
ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die
Vorkultur wurde das Vollmedium Cg III verwendet.
Medium Cg III |
NaCl | 2,5 g/l |
Bacto-Pepton | 10 g/l |
Bacto-Yeast-Extrakt | 10 g/l |
Glucose (getrennt autoklaviert) | 2% (w/v) |
Der pH-Wert wurde auf pH 7.4 eingestellt |
Diesem wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur
wurde 16 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler
inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur
angeimpft, so daß die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur
0,1 OD betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM
verwendet
Medium MM |
CSL (Corn Steep Liquor) | 5 g/l |
MOPS (Morpholinopropansufonsäure) | 20 g/l |
Glucose (getrennt autoklaviert) | 50g/l |
Salze: |
(NH4)2SO4) | 25 g/l |
KH2PO4 | 0,1 g/l |
MgSO4 * 7 H2O | 1,0 g/l |
CaCl2 * 2 H2O | 10 mg/l |
FeSO4 * 7 H2O | 10 mg/l |
MnSO4 * H2O | 5,0 mg/l |
Biotin (sterilfiltriert) | 0,3 mg/l |
Thiamin * HCl (sterilfiltriert) | 0,2 mg/l |
Fumarat (sterilfiltriert) | 5,81 g/l |
Leucin (sterilfiltriert) | 0,1 g/l |
CaCO3 | 25 g/l |
CSL, MOPS und die Salzlösung werden mit Ammoniakwasser auf
pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend werden die
sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das
trocken autoklavierte CaCO3 zugesetzt.
Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in einem 100 ml
Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25
mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und 80%
Luftfeuchtigkeit.
Nach 24 Stunden wurde die OD bei einer Meßwellenlänge von
660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH,
München) ermittelt. Die gebildete Glutamatmenge wurde mit
einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie
und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion
bestimmt.
In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
Stamm | OD
(660 nm) | L-Glutamat
mg/l |
DSM5715 | 10,4 | 20 |
DSM5715::pCRBlunt
sucCint | 3,9 | 154 |
5.2 Herstellung von L-Glutamat mit dem Stamm DSM5715ΔsucD
Der in Beispiel 4.3 erhaltene C. glutamicum Stamm
DSM5715/pK18mobsacBsucDdel wurde in einem zur Produktion
von L-Glutamat geeigneten Nährmedium kultiviert und der
Glutamatgehalt im Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurde der Stamm zunächst auf Agarplatte für 24 Stunden
bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur
wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml
Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das
Vollmedium CgIII verwendet. Diesem wurde Kanamycin (25
mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 16 Stunden bei 33°C
bei 240 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Von dieser
Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so daß die
Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD betrug. Für die
Hauptkultur wurde das Medium MM verwendet.
Die Kultivierung erfolgte in 10 ml Volumen in einem 100 ml
Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Die Kultivierung erfolgte
bei 33°C und 80% Luftfeuchte.
Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Meßwellenlänge von
660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH,
München) ermittelt. Die gebildete Glutamatmenge wurde mit
einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie
und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion
bestimmt.
In Tabelle 2 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt.
Stamm | OD
(660 nm) | L-Glutamat
mg/l |
DSM5715 | 8,1 | 7 |
DSM5715ΔsucD | 13,3 | 33 |
Folgende Figuren sind beigefügt:
Figur 1: Karte des Plasmids pCRBluntsucCint.
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben
folgende Bedeutung.
- KmR:
- Kanamycin Resistenz-Gen
- Zeocin:
- Zeocin Resistenz-Gen
- HindIII
- Schnittstelle des Restriktionsenzyms
HindIII
- SphI
- Schnittstelle des Restriktionsenzyms SphI
- EcoRI:
- Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
- sucCint:
- internes Fragment des sucC-Gens
- ColE1 ori:
- Replikationsursprung des Plasmides ColE1
Figur 2: Karte des Plasmids pK18mobsacBsucDdel
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben
folgende Bedeutung.
- oriV:
- ColE1-ähnlicher Origin aus pMB1
- sacB
- das für das Protein Levansucrose kodierende
sacB-Gen
- RP4mob:
- RP4-Mobilisierungs-Site
- Kan:
- Resistenzgen für Kanamycin
- sucDdel:
- deletiertes Allel des sucD-Gens aus C.
glutamicum
- SphI:
- Schnittstelle des Restriktionsenzyms SphI
- PstI:
- Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
- XmaI:
- Schnittstelle des Restriktionsenzyms XmaI
- XbaI:
- Schnittstelle für das Restriktionsnzym XbaI