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Gebiet der
Erfindung
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Gegenstand
der Beschreibung sind für
das citB-Gen kodierende Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien
und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin oder
L-Valin, durch Ausschalten des citB-Gens. Das citB-Gen kodiert für das CitB-Protein, welches
ein Transkriptionsregulator eines Zwei-Komponentensystems ist.
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Stand der
Technik
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L-Aminosäuren, insbesondere
L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen
Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der
Tierernährung
Anwendung.
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Es
ist bekannt, dass Aminosäuren
durch Fermentation von Stämmen
coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum,
hergestellt werden. Wegen der grossen Bedeutung wird ständig an
der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen
können
fermentationstechnische Massnahmen wie zum Beispiel Rührung und
Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien,
wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder
die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie
oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus
selbst betreffen.
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Zur
Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden
Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet.
Auf diese Weise erhält
man Stämme,
die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame
Metabolite sind und die Aminosäuren
produzieren.
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Seit
einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik
zur Stammverbesserung von L-Aminosäure-produzierenden
Stämmen
von Corynebacterium eingesetzt.
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In
Database Swall Accession Number Q 9 RC52, 1. Mai 2000 (T. Hideto
et al.) wird ein Bacillus halodurans Citt-Protein (Zweikomponenten-Anwortregulator)
offenbart, das jedoch keine relevante Sequenzübereinstimmung mit SEQ ID NO:
2 der vorliegenden Beschreibung besitzt. Dieses Dokument gibt keinen
Hinweis bezüglich
des möglichen
Einflusses eines Citt-Proteins auf die Produktion von L-Lysin oder
L-Valin.
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Aufgabe der
Erfindung
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Die
Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Massnahmen zur verbesserten
fermentativen Herstellung von L-Lysin oder L-Valin bereitzustellen.
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Darstellung
der Erfindung
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Werden
im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt, sind damit auch die Salze
wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.
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Gegenstand
der Beschreibung ist ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen
Bakterien, enthaltend eine für
das citB-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus
der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens
zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid
kodiert, das die Aminosäuresequenz
von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das für
ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die
zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden
von a) oder b), und
- d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende
Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c),
wobei
das Polypeptid bevorzugt die Aktivität des citB-Proteins aufweist.
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Gegenstand
der Beschreibung ist ebenfalls das oben genannte Polynukleotid,
wobei es sich bevorzugt um eine replizierbare DNA handelt, enthaltend:
- (i) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID
No. 1 oder
- (ii) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb
des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht,
oder
- (iii) mindestens eine Sequenz, die mit den zu den Sequenzen
(i) oder (ii) komplementären
Sequenzen hybridisiert, und gegebenenfalls
- (iv) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i).
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Weitere
Gegenstände
der Beschreibung sind
ein replizierbares Polynukleotid, insbesondere
DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt;
ein
Polynukleotid, das für
ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID No.
2 dargestellt enthält;
Gegenstände der
Erfindung sind:
ein Vektor, enthaltend Teile des erfindungsgemässen Polynukleotids,
mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der beanspruchten Sequenz
und
coryneforme Bakterien, in denen das citB-Gen, inbesondere durch
eine Insertion oder Deletion, ausgeschaltet ist.
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Gegenstand
der Beschreibung sind ebenso Polynukleotide, die im wesentlichen
aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die erhältlich sind durch Screening
mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank eines coryneformen
Bakteriums, die das vollständige
Gen oder Teile davon enthält,
mit einer Sonde, die die Sequenz des erfindungsgemässen Polynukleotids
oder ein Fragment davon enthält,
und Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz.
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Ausführliche
Beschreibung
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Polynukleotide
enthaltend die Sequenzen gemäss
der Erfindung sind als Hybridisierungs-Sonden für RNA, cDNA und DNA geeignet,
um Nukleinsäuren
beziehungsweise Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren,
die für
das CitB-Protein kodieren, oder um solche Nukleinsäuren beziehungsweise
Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit
mit der Sequenz des citB-Gens aufweisen. Sie sind ebenso zum Einbau
in sogenannte "arrays", "micro arrays" oder "DNA chips" geeignet, um die
entsprechenden Polynukleotide zu detektieren und zu bestimmen.
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Polynukleotide
enthaltend die Sequenzen gemäss
der Beschreibung sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren Hilfe
mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen hergestellt
werden kann, die für das
CitB-Protein kodieren.
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Solche
als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide enthalten mindestens
30, bevorzugt mindestens 20, ganz besonders bevorzugt mindestens
15 aufeinanderfolgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide
mit einer Länge
von mindestens 40 oder 50 Nukleotiden.
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"Isoliert" bedeutet aus seinem
natürlichen
Umfeld herausgetrennt.
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"Polynukleotid" bezieht sich im
allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide,
wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte
RNA oder DNA handeln kann.
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Die
Polynukleotide gemäss
Beschreibung schliessen ein Polynukleotid gemäss SEQ ID No. 1 oder ein daraus
hergestelltes Fragment und auch solche ein, die zu wenigstens 70%,
bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders zu wenigstens 90% bis
95% identisch sind mit dem Polynukleotid gemäss SEQ ID No. 1 oder einem
daraus hergestellten Fragment.
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Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide
oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene
Aminosäuren
enthalten.
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Die
Polypeptide gemäss
Beschreibung schliessen ein Polypeptid gemäss SEQ ID No. 2, insbesondere solche
mit der biologischen Aktivität
des CitB-Proteins und auch solche ein, die zu wenigstens 70%, bevorzugt zu
wenigstens 80% und besonders zu wenigstens 90% bis 95% identisch
sind mit dem Polypeptid gemäss SEQ
ID No. 2 und die genannte Aktivität aufweisen.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung
von L-Lysin oder L-Valin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien,
die insbesondere bereits L-Lysin oder L-Valin produzieren und in
denen die für
das citB-Gen kodierenden Nukleotidsequenzen ausgeschaltet sind.
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Der
Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme
(Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA
kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor
verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes
Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen
oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Massnahmen
kombiniert.
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Die
Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind,
können
L-Lysin oder L-Valin aus Glukose, Saccharose, Lactose, Fructose,
Maltose, Melasse, Stärke,
Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich
um Vertreter coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln.
Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium
glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu
produzieren.
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Geeignete
Stämme
der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium
glutamicum (C. glutamicum), sind besonders die bekannten Wildtypstämme Corynebacterium
glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum
ATCC14020 oder daraus hergestellte L-Lysin produzierende Mutanten
beziehungsweise Stämme,
wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme Corynebacterium glutamicum
FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum
FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum
FERM-P 6464 Corynebacterium glutamicum DM58-1 Corynebacterium glutamicum
DG52-5 Corynebacterium glutamicum DSM 5715 und Corynebacterium glutamicum
DSM 12866
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Den
Erfindern gelang es, das neue, für
das CitB-Protein kodierende citB-Gen von C. glutamicum, welches
ein Transkriptionsregulator eines Zwei-Komponentensystems ist, zu
isolieren.
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Zur
Isolierung des citB-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum
wird zunächst
eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli)
angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und
Handbüchern
niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker:
Gene und Klone, Eine Einführung
in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder
das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine
sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die
von Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in lambda-Vektoren angelegt
wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) beschreiben
eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors
SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy
of Sciences USA, 84: 2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh
et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde.
Börmann
et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)) wiederum beschreiben
eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmides
pHC79 (Hohn und Collins, 1980, Gene 11, 291-298).
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Zur
Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch
Plasmide wie pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences, 25, 807-818)
oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268) verwendet werden. Als
Wirte eignen sich besonders solche E. coli-Stämme, die restriktions- und
rekombinationsdefekt sind wie beispielsweise der Stamm DH5α (Jeffrey
H. Miller: "A Short
Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for
Escherichia coli and Related Bacteria", Cold Spring Harbour Laboratory Press,
1992).
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Die
mit Hilfe von Cosmiden oder anderen lambda-Vektoren klonierten langen
DNA-Fragmente können anschliessend
wiederum in gängige
für die
DNA-Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert werden.
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Methoden
zur DNA-Sequenzierung sind unter anderem bei Sanger et al. (Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America
USA, 74: 5463-5467,
1977) beschrieben.
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Die
erhaltenen DNA-Sequenzen können
dann mit bekannten Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie
z. B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), dem von
Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) oder dem GCG-Programm
von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)) untersucht
werden.
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Auf
diese Weise wurde die für
das citB-Gen kodierende DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die
als SEQ ID No. 1 Bestandteil der vorliegenden Beschreibung ist.
Weiterhin wurde aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen
Methoden die Aminosäuresequenz
des entsprechenden Proteins abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die
sich ergebende Aminosäuresequenz
des citB-Genproduktes
dargestellt.
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Kodierende
DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch die Degeneriertheit
des genetischen Kodes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder
Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung.
In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche
wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen
Glutaminsäure
in Proteinen als "Sinnmutationen" (sense mutations)
bekannt, die zu keiner grundsätzlichen
Veränderung
der Aktivität
des Proteins führen,
d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt, dass Änderungen
am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich
beeinträchtigen
oder sogar stabilisieren können.
Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat
et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene
77: 237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:
240-247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321-1325
(1988)) und in bekannten Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender
Weise aus SEQ ID No. 2 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
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Schliesslich
sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Beschreibung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich
aus SEQ ID No. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise
eine Länge
von mindestens 15 Nukleotiden.
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Anleitungen
zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet
der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der
Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und
bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41:
255-260 (1991)). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen
statt, das heisst, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde
und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide,
mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz
der Hybridisierung einschliesslich der Waschschritte durch variieren
der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration
beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird
vorzugsweise bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den
Waschschritten durchgeführt
(Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
Für die
Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5 × SSC-Puffer bei einer
Temperatur von ca. 50-68°C
eingesetzt werden. Dabei können
Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70%
Identität zur
Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil
und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt.
Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf
2 × SSC
und gegebenenfalls nachfolgend 0,5 × SSC (The DIG System User's Guide for Filter
Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995)
erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50-68°C eingestellt
wird. Durch schrittweise Erhöhung
der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1-2°C von 50
auf 68°C
können
Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise mindestens
70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% Identität zur Sequenz
der eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung
sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb
von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog
No. 1603558).
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Anleitungen
zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonukleotide
Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und
bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland,
1994).
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Bei
der Arbeit an der vorliegenden Erfindung konnte festgestellt werden,
dass coryneforme Bakterien nach Ausschaltung des citB-Gens in verbesserter
Weise L-Lysin oder
L-Valin produzieren.
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Zur
Erzielung einer Ausschaltung können
entweder die Expression des citB-Gens oder die katalytischen Eigenschaften
des Enzymproteins herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls
können beide
Massnahmen kombiniert werden.
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Die
Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder
durch genetische Veränderung
(Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen
der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene,
Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen,
das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann
z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal
of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic
Acids Research 26: 3548 (1998), bei Jensen und Hammer (Biotechnology
and Bioengineering 58: 191 (1998)), bei Pátek et al. (Microbiology
142: 1297 (1996)), Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181:
6188 (1999)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie
wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart,
Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim,
Deutschland, 1990).
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Mutationen,
die zu einer Veränderung
bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen
führen,
sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die
Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272:
8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry
61: 1760-1762 (1997)) und Möckel
("Die Threonindehydratase
aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation
und Struktur des Enzyms",
Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland,
1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
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Als
Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und
Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit
von der Wirkung des Aminosäureaustausches
auf die Enzymaktivität
wird von Fehlsinnmutationen (missense mutations) oder Nichtsinnmutationen
(nonsense mutations) gesprochen. Insertionen oder Deletionen von
mindestens einem Basenpaar (bp) in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen
(frame shift mutations), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut
werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren
Kodonen führen
typischerweise zu einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen
zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und
können
bekannten Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg
Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker
("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft,
Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
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Eine
gebräuchliche
Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer
und Pühler (Bio/Technology
9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung (gene
disruption) und des Gen-Austauschs
(gene replacement).
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Bei
der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Kodierregion
des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in
einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren
kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al.,
Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al.,
Gene 145, 69-73 (1994)), pK19mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al.,
Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega Corporation,
Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO
(Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-Patent
5,487,993), pCR®Blunt
(Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal
of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et
al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in Frage. Der
Plasmidvektor, der den zentralen Teil der Kodierregion des Gens
enthält,
wird anschliessend durch Konjugation oder Transformation in den
gewünschten
Stamm von C. glutamicum überführt. Die
Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur
Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied
Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und
Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS
Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer
Rekombination mittels eines "cross-over"-Ereignisses wird
die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und
man erhält
zwei unvollständige
Allele, denen jeweils das 3'-
bzw. das 5'- Ende
fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al.
(Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) zur
Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.
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Bei
der Methode des Genaustausches (gene replacement) wird eine Mutation
wie z. B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden
Gen in vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in
einen für
C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschliessend
durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach
homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und
eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen
bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw.
des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch
et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen
von C. glutamicum durch eine Deletion auszuschalten.
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In
das citB-Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder
ein Basenaustausch eingebaut werden.
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Zusätzlich kann
es für
die Produktion von L-Lysin oder L-Valin vorteilhaft sein, zusätzlich zur
Abschwächung
des citB-Gens ein oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges,
der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus,
des Aminosäure-Exports
und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.
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Der
Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Erhöhung
der intrazellulären
Aktivität
eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus,
die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor
verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes
Enzym (Protein) mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls
diese Massnahmen kombiniert.
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So
kann beispielsweise für
die Herstellung von L-Lysin gleichzeitig eines oder mehrere der
Gene, ausgewählt
aus der Gruppe
- 1. das für die Dihydrodipicolinat-Synthase
kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
- 2. das für
die Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns
(1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- 3. das für
die Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),
- 4. das für
die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A-198 31 609),
- 5. das für
den Lysin-Export kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222)
- 6. das für
eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (EP-B-0387527;
EP-A-0699759; WO 00/63388), oder
- 7. das für
das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115)
verstärkt,
insbesondere überexprimiert
werden.
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Ausserdem
kann es für
die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des citB-Gens
gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- 1. das für
die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck ( DE 199 50 409.1 , DSM 13047),
- 2. das für
die Glukose-6-phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi (US 09/396,478,
DSM 12969),
- 3. das für
die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE: 1995 1975.7, DSM 13114)
- 4. das für
das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113)
auszuschalten.
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Weiterhin
kann es für
die Produktion von L-Lysin oder L-Valin vorteilhaft sein, neben
der Ausschaltung des citB-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten
(Nakayama: "Breeding
of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl,
Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
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Die
erfindungsgemäss
hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung
und können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im
fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives
Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Lysin oder L-Valin
kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden
ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in
die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
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Das
zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der
jeweiligen Stämme
genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind
im Handbuch "Manual of
Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können
Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glukose, Saccharose, Lactose, Fructose,
Maltose, Melasse, Stärke
und Cellulose, Öle
und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl,
Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett,
Fettsäuren,
wie zum Beispiel Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole wie zum Beispiel Glycerin und Ethanol und organische Säuren, wie
zum Beispiel Essigsäure
verwendet werden. Diese Stoffe können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
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Als
Stickstoffquelle können
organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
-
Als
Phosphorquelle können
Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium
muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat
oder Eisensulfat, die für
das Wachstum notwendig sind. Schliesslich können essentielle Wuchsstoffe
wie Aminosäuren
und Vitamine zusätzlich
zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies
geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe
können
zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in
geeigneter Weise während
der Kultivierung zugefüttert
werden.
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Zur
pH-Kontrolle der Kultur können
basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak
beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder
Schwefelsäure in
geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung
können
Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt
werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika
hinzugefügt
werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in
die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C
bis 45°C
und vorzugsweise bei 25°C
bis 40°C.
Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes
gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden
bis 160 Stunden erreicht.
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Methoden
zur Bestimmung von L-Aminosäuren
sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel
so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)
beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschliessender
Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed
phase HPLC erfolgen, so wie z. B. bei Lindroth et al. (Analytical
Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung
einer Aminosäure,
ausgewählt
aus der Gruppe L-Valin und L-Lysin, insbesondere L-Lysin, unter Verwendung
von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits eine oder mehrere
der genannten Aminosäuren
produzieren.
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Folgender
Mikroorganismus wurde am 23.08.2000 als Reinkultur bei der Deutschen
Sammlung für
Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)
gemäss
Budapester Vertrag hinterlegt:
- – Escherichia
coli Stamm Top10/pCR2.1citBint als DSM 13672.
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Die
vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert.
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Die
Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken
zur Restriktion, Klenow- und alkalischen Phosphatasebehandlung wurden
nach Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 1989,
Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)
durchgeführt.
Methoden zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls
in diesem Handbuch beschrieben.
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Die
Zusammensetzung gängiger
Nährmedien
wie LB- oder TY-Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook
et al. entnommen werden.
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Beispiel 1
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Herstellung einer genomischen
Cosmid-Genbank aus C. glutamicum ATCC 13032
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Chromosomale
DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al. (1995,
Plasmid 33: 168-179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym
Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden
mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals,
Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 17588250)
dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987),
Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84: 2160-2164),
bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung
SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym
XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI,
Code no. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer
Phosphatase dephosphoryliert.
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Anschliessend
wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04) gespalten.
Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten
ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase,
Code no. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschliessend
mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA,
Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) in
Phagen verpackt.
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Zur
Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic
Acid Res. 16: 1563-1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO4 aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension
vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei
Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1: 190) + 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert
wurden. Nach Inkubation über
Nacht bei 37°C
wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.
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Beispiel 2
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Isolierung
und Sequenzierung des Gens citB
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Die
Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep
Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben
isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia,
Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-0913-02)
partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer
Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert.
Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung
der Cosmidfragmente im Grössenbereich
von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product
No. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland).
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Die
DNA des Sequenziervektors pZero-1 bezogen von der Firma Invitrogen
(Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning
Kit, Product No. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
BamHI, Product No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente
in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben
durchgeführt,
wobei das DNA-Gemisch
mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht
inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschliessend in
den E. coli Stamm DH5aMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National
Academy of Sciences, U. S. A., 87 4645-4649) elektroporiert (Tauch
et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 μg/ml Zeocin ausplattiert.
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Die
Plasmidpräparation
der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Product
No. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte
nach der Dideoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977,
Proceedings of the National Academies of Sciences, U. S. A., 74:
5463-5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic
Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing
Kit" von PE Applied
Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet.
Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion
erfolgten in einem "Rotiphorese
NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel
(29 : 1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE
Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).
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Die
erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschliessend unter Anwendung
des Staden-Programmpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231)
Version 97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZerol-Derivate
wurden zu einem zusammenhängenden
Contig assembliert. Die computergestützten Kodierbereichsanalysen
wurden mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research,
14: 217-231) angefertigt. Weitere Analysen wurden mit den "BLAST search program" (Altschul et al.,
1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402) gegen die non-redundant
Datenbank des "National
Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA) durchgeführt.
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Die
erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1 dargestellt. Die
Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 657
Basenpaaren, welches als citB-Gen bezeichnet wurde. Das citB-Gen
kodiert für
ein Polypeptid von 219 Aminosäuren.
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Beispiel 3 Herstellung
eines Integrationsvektors für
die Integrationsmutagenese des citB-Gens
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Aus
dem Stamm ATCC 13032 wurde nach der Methode von Eikmanns et al.
(Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert.
Aufgrund der aus Beispiel 2 für
C. glutamicum bekannten Sequenz des citB-Gens wurden die folgenden
Oligonukleotide für
die Polymerase-Kettenreaktion ausgewählt (siehe SEQ ID No. 4 und
SEQ ID No. 5):
citB-int1:
5' CCC GGA TCT CCT ACT TGT TG 3'
citB-int2:
5' TCT GTG GCG GAT
CTA GAG AC 3'
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Die
dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg,
Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von
Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990,
Academic Press) mit der Taq-Polymerase der Firma Boehringer Mannheim
(Deutschland, Produktbeschreibung Taq DNA Polymerase, Product No.
1 146 165) die PCR-Reaktion
durchgeführt.
Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion
ermöglichen
die Primer die Amplifikation eines 318 bp grossen internen Fragmentes des
citB-Gens. Das so amplifizierte Produkt wurde in einem 0,8%igen
Agarosegel elektrophoretisch geprüft.
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Das
amplifizierte DNA-Fragment (siehe SEQ ID No. 3) wurde mit dem TOPO
TA Cloning Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA;
Katalog Nummer K4500-01)
in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9:
657-663) ligiert.
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Anschliessend
wurde der E. coli Stamm TOP10 mit dem Ligationsansatz (Hanahan,
In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford,
Washington DC, USA, 1985) elektroporiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen
erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar
(Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), der mit 50 mg/l Kanamycin supplementiert
worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe
des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch
Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschliessende Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das
Plasmid wurde pCR2.1citBint genannt und ist in 1 dargestellt.
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Beispiel 4
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Integrationsmutagenese
des citB-Gens in den Stämmen
DSM 5715 und FERM-BT 1763
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Der
in Beispiel 3 genannte Vektor pCR2.1citBint wurde nach der Elektroporationsmethode
von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994))
in die Stämme
Corynebacterium glutamicum DSM 5715 und Brevibacterium lactofermentum
FERM-BP 1763 elektroporiert. Bei dem Stamm DSM 5715 handelt es sich
um einen AEC-resistenten Lysin-Produzenten (EP-B-0435132), bei dem Stamm FERM-BP 1763
um einen Mycophenolsäure-resistenten
Valin-Produzenten (US-A-5,188,948).
Der Vektor pCR2.1citBint kann in DSM5715 und FERM-BP 1763 nicht
selbständig
replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er ins
Chromosom von DSM 5715 bzw. FERM-BP 1763 integriert hat. Die Selektion
von Klonen mit ins Chromosom integriertem pCR2.1citBint erfolgte
durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook
et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.),
der mit 15 mg/l Kanamycin supplementiert worden war.
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Für den Nachweis
der Integration wurde das citBint-Fragment nach der Methode "The DIG System Users
Guide for Filter Hybridization" der
Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) mit
dem Dig-Hybridisierungskit
der Firma Boehringer markiert. Chromosomale DNA je eines potentiellen
Integranien wurde nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology
140: 1817-1828 (1994)) isoliert und jeweils mit den Restriktionsenzymen
EcoRI, BamHI und HindIII geschnitten. Die entstehenden Fragmente
wurden mittels der Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und mit
dem Dig-Hybridisierungskit der Firma Boehringer bei 68°C hybridisiert.
Das in Beispiel 3 genannte Plasmid pCR2.1citBint hatte innerhalb
des chromosomalen citB-Gens
ins Chromosom von DSM5715 und ins Chromosom von FERM-BP 1763 inseriert.
Die Stämme
wurden als DSM5715::pCR2.1citBint und FERM-BP 1763::pCR2.1citBint
bezeichnet.
-
Beispiel 5
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Herstellung von Lysin
-
Der
in Beispiel 4 erhaltene C.glutamicum Stamm DSM5715::pCR2.1citBint
wurde in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium
kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
-
Dazu
wurde der Stamm zunächst
auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar
mit Kanamycin (25 mg/l) für
24 Stunden bei 33°C
inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur
angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium
für die
Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet. Medium
CgIII
NaCl | 2,5
g/l |
Bacto-Pepton | 10
g/l |
Bacto-Hefeextrakt | 10
g/l |
Glukose
(getrennt autoklaviert) | 2%
(w/v) |
Der
pH-Wert wird auf pH 7,4 eingestellt. | |
-
Diesem
wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 16 Stunden
bei 33°C
bei 240 rpm auf dem Schüttler
inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft,
so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD beträgt. Für die Hauptkultur
wurde das Medium MM-L verwendet. Medium
MM-L
CSL
(Maisquellwasser) | 5
g/l |
MOPS
(Morpholinopropansulfonsäure) | 20
g/l |
Glukose
(getrennt autoklaviert) | 50
g/l |
Salze: | |
(NH4)2SO4 | 25
g/l |
KH2PO4 | 0,1
g/l |
MgSO4·7H2O | 1,0
g/l |
CaCl2·2H2O | 10
mg/l |
FeSO4·7H2O | 10
mg/l |
MnSO4·H2O | 5,0
mg/l |
Biotin
(sterilfiltriert) | 0,3
mg/l |
Thiamin·HCl (sterilfiltriert) | 0,2
mg/l |
Leucin
(sterilfiltriert) | 0,1
g/l |
CaCO3 | 25
g/l |
-
CSL,
MOPS und die Salzlösung
wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschliessend
wurden die sterilen Substrat-, Aminosäure- und Vitaminlösungen sowie
das trocken autoklavierte CaCO3 zugesetzt.
-
Die
Kultivierung erfolgte in 10 ml Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben
mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung
erfolgte bei 33°C
und 80% Luftfeuchtigkeit.
-
Nach
72 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek
1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete
Lysinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung
mit Ninhydrindetektion bestimmt.
-
In
Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt. Tabelle
1
-
Beispiel 6
-
Herstellung
von Valin
-
Der
in Beispiel 4 erhaltene B. lactofermentum Stamm FERM-BP 1763::pCR2.1citBint
wurde in einem zur Produktion von Valin geeigneten Nährmedium
kultiviert und der Valingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
-
Dazu
wurde der Stamm zunächst
auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar
mit Kanamycin (25 mg/l) für
24 Stunden bei 33°C
inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur
angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium
für die
Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet. Diesem wurde Kanamycin
(25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur wurde 16 Stunden bei 33°C bei 240
rpm auf dem Schüttler
inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft,
so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD betrug. Für die Hauptkultur
wurde das Medium MM-V verwendet. Medium
MM-V
CSL
(Maisquellwasser) | 5
g/l |
MOPS
(Morpholinopropansulfonsäure) | 20
g/l |
Glukose
(getrennt autoklaviert) | 50
g/l |
Salze: | |
(NH4)2SO4) | 25
g/l |
KH2PO4 | 0,1
g/l |
MgSO4·7H2O | 1,0
g/l |
CaCl22H2O | 10
mg/l |
FeSO4·7H2O | 10
mg/l |
MnSO4·H2O | 5,0
mg/l |
Isoeucin
(sterilfiltriert) | 0,1
g/l |
Methionin
(sterilfiltriert) | 0,1
g/l |
Thiamin·HCl (sterilfiltriert) | 0,2
mg/l |
Leucin
(sterilfiltriert) | 0,1
g/l |
CaCO3 | 25
g/l |
-
CSL
(Corn Steep Liquor – Maisquellwasser),
MOPS (Morpholinopropansulfonsäure)
und die Salzlösung
wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert.
Anschliessend wurden die sterilen Substrat-, Aminosäure- und
Vitaminlösungen
sowie das trocken autoklavierte CaCO3 zugesetzt.
-
Die
Kultivierung erfolgte in 10 ml Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben
mit Schikanen. Es wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung
erfolgte bei 33°C
und 80% Luftfeuchte.
-
Nach
48 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek
1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete
Valinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung
mit Ninhydrindetektion bestimmt.
-
In
Tabelle 2 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt. Tabelle
2
-
Kurzbeschreibung der Figur:
-
1:
Karte des Plasmids pCR2.1citBint.
-
Die
verwendeten Abkürzungen
und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung.
- KmR:
- Kanamycin Resistenz-Gen
- EcoRI:
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms EcoRI
- HindIII:
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms HindIII
- BamHI:
- Schnittstelle des
Restriktionsenzyms BamHI
- citBint:
- internes Fragment
des citB-Gens
- ColE1:
- Replikationsursprung
des Plasmides ColE1.
SEQUENZPROTOKOLL