CN111286520B

CN111286520B - 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用

Info

Publication number: CN111286520B
Application number: CN201811505412.5A
Authority: CN
Inventors: 雷云凤; 陈玲; 周豪宏; 刘修才
Original assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Current assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Priority date: 2018-12-10
Filing date: 2018-12-10
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2038-12-10
Also published as: CN111286520A

Abstract

本发明公开了用于发酵生产L‑赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用。本发明通过增加微生物体内植物血红蛋白的含量，加速氧储存和运输过程，改善吸收氧气速度，促进葡萄糖的利用速率，从而提高工程菌的耗氧量，进而提高代谢产物的产量。进一步地，本发明通过在诱变获得的L‑赖氨酸生产水平提高的突变株中，利用强启动子或高拷贝质粒表达ppc基因及人工合成的血红蛋白编码基因lhb，改善吸收氧气速度，提高葡萄糖利用效率，进而提高L‑赖氨酸的产量。

Description

用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体地说，涉及用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用。

背景技术

通过DNA重组技术改造具有生产L-赖氨酸能力的棒杆菌属和埃希杆菌属的细菌，现已实现工业化生产。这些细菌的L-赖氨酸生产率的提高是通过过表达L-赖氨酸合成途径的相关基因和反馈抑制脱敏的相关基因，或者从葡萄糖代谢开始的能量供应途径的强化而实现的。在大肠杆菌中，ppc基因编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase，PPC)为催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸呈不可逆反应的酶。

除了不断加强生成赖氨酸的代谢途径，打开非赖氨酸代谢的其他旁路的发酵方法，也值得深入挖掘。血红蛋白的氧结合蛋白广泛存在于动物和植物中，能够储存和运输氧。植物血红蛋白，最早发现于豆科植物根瘤中，后又在其他单子叶植物和双子叶植物中有发现；根据是否与共生作用相关分为共生血红蛋白和非共生血红蛋白两大类，及拟南芥中的另一种短截血红蛋白。在细菌中共发现三类血红蛋白，包括单结构域血红蛋白、黄素血红蛋白和截断血红蛋白。由基因lhb(GenBank:AAC60563.1)编码的豆科植物四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)血红蛋白属于共生血红蛋白，是十分常见的豆血红蛋白。然而，鲜有将豆血红蛋白应用于微生物发酵生产的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供植物血红蛋白基因在微生物发酵生产中的应用。

本发明的另一目的是提供用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用。

本发明构思如下：通过增加微生物体内植物血红蛋白的含量，加速氧储存和运输过程，改善吸收氧气速度，促进葡萄糖的利用速率，从而提高工程菌的耗氧量，进而提高代谢产物的产量。进一步地，通过在诱变获得的L-赖氨酸生产水平提高的突变株中，利用强启动子或高拷贝质粒表达ppc基因及人工合成的血红蛋白编码基因lhb，改善吸收氧气速度，提高葡萄糖利用效率，进而提高L-赖氨酸的产量。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供植物血红蛋白基因在微生物发酵生产中的应用。

本发明中，所述植物血红蛋白基因经密码子优化后，通过质粒导入微生物中或通过基因工程手段整合到微生物染色体上。所述微生物为好氧或兼性厌氧微生物。

密码子优化是通过增加感兴趣的基因在宿主细胞内的翻译效率来得到最大限度的蛋白表达。一个物种的DNA核苷酸序列被优化成为另一个物种的DNA核苷酸序列。DNA序列被分成三个一组(密码子)。一种氨基酸的低频率密码子被宿主细胞中相同氨基酸的高频率密码子所取代。由此，优化的DNA序列在宿主细胞中的表达得到改善。具体可参考http://www.guptalab.org/shubhg/pdf/shubhra codon.pdf。

进一步地，本发明提供一种重组表达质粒，包括重组表达质粒的目的基因和骨架质粒，其骨架质粒是在宿主细胞中可复制的骨架质粒，优选pUC、pBR322、pACYC质粒和它们的衍生质粒中的一种。更优选是多拷贝型质粒。

所述重组表达质粒的目的基因是编码多肽的聚核苷酸；所述的多肽是酶或多肽类药物；又进一步地，所述的酶是载体蛋白、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述的多肽类药物是激素、抗体和生长因子中的至少一种；更进一步地，所述载体蛋白是血红蛋白，如来自于植物或微生物(如透明颤菌)的血红蛋白；更进一步地，所述植物血红蛋白选自共生血红蛋白、非共生血红蛋白、短截血红蛋白中的至少一种。几种植物来源血红蛋白和透明颤菌血红蛋白的序列相似性比对结果见图1。

本发明所述植物血红蛋白来自于豆科植物、禾本科植物；更优选来自四棱豆、黄豆、大麦、玉米、拟南芥。

第二方面，本发明提供用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA，所述重组DNA至少包括植物血红蛋白基因，以及L-赖氨酸生物合成途径的相关基因和/或反馈抑制脱敏的相关基因。所述基因可以由相同质粒或不同质粒携带。某些基因可以由相同质粒携带。当使用两种或两种以上质粒时，优选使用具有稳定的分配系统的质粒，该系统使得这些质粒能在细胞中稳定的共存。导入所述基因的顺序没有特别限制。

优选地，所述重组DNA至少包括植物血红蛋白基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。

更优选地，所述植物血红蛋白基因是来自四棱豆的血红蛋白lhb基因(SEQ ID NO:1)或lhb基因的片段，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因是来自大肠杆菌的ppc基因。所述血红蛋白还可以是上述来源的血红蛋白的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段。四棱豆的血红蛋白lhb的氨基酸序列见SEQ ID NO:2。

第三方面，本发明提供含有所述重组DNA的生物材料，所述生物材料为表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。

第四方面，本发明提供高产L-赖氨酸的工程菌，所述工程菌的构建方法如下：

A、弱化原始菌株中与L-赖氨酸代谢途径相关的基因，获得基因弱化菌株；

所述弱化包括敲除或降低基因的表达；

所述弱化的基因选自cadA、ldcC、gltI、thrC、cynT、thrL和maeB等中的至少一个；

B、增强原始菌株中与L-赖氨酸生物合成途径相关的基因和/或反馈抑制脱敏相关的基因，或者增强步骤A基因弱化菌株中与L-赖氨酸生物合成途径相关的基因和/或反馈抑制脱敏相关的基因，获得基因增强菌株；

所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；

2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；

3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；

5)通过导入增强子而增强；

6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强；

所述与L-赖氨酸生物合成途径相关的基因选自dapA、lysC、dapB、ddh、ppc、lysA和asd等中的至少一个；

C、构建携带植物血红蛋白基因的质粒；

D、将步骤C中所述携带植物血红蛋白基因的质粒导入步骤A中所述基因弱化菌株和/或步骤B中所述基因增强菌株中，获得高产L-赖氨酸的工程菌。

由葡萄糖生物合成L-赖氨酸的路线图及其关键酶基因如图2所示。

所述原始菌株选自埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、哈夫尼菌属(Hafnia)等菌属中的菌种。优选地，所述原始菌株选自大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热菌(Thermus.thermophilus)、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，或经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。

第五方面，本发明提供以大肠杆菌MG1655(E.coli MG1655 K12)为出发菌株，通过ARTP物理诱变获得的L-赖氨酸生产水平提高的突变株M11-A3。根据布达佩斯条约，大肠杆菌(Escherichia coli)M11-A3现已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:M 2018456，保藏日期2018年7月6日。

第六方面，本发明提供一种高产L-赖氨酸的工程菌，其包含所述的重组DNA。优选地，所述工程菌的出发菌株为保藏编号CCTCC NO:M 2018456的大肠杆菌M11-A3。

所述工程菌中包含：启动子-ppc-启动子-lhb的DNA序列。

其中，所述启动子选自plac、trp、tac、trc、PL等。

优选地，所述工程菌中包含：plac-ppc-plac-lhb的DNA序列。

第七方面，本发明提供所述高产L-赖氨酸的工程菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用。

前述应用包括步骤：(1)培养所述高产L-赖氨酸的工程菌；(2)从步骤(1)得到的菌液或菌体中收集L-赖氨酸。

可采用常规方法进行培养，采用典型培养基，其中含有碳源、氮源、矿物质、以及所需要的诸如氨基酸、维生素等微量有机营养物。另外，合成或天然的培养基均可采用。只要菌株可以利用以进行培养，任何碳源和氮源均可采用。

就碳源而言，诸如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解糖，糖蜜等糖类，以及诸如醋酸、柠檬酸等有机酸均可采用。另外，乙醇等醇类也可以单独或者与其他碳源组合使用。

就有机营养而言，氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸，酵母提取物，玉米浆、大豆蛋白分解产物等物质均可采用。当某种营养缺陷型突变株的生长需要一种氨基酸或类似的物质时，优先添加该需要营养物。

就矿物质而言，磷酸盐、镁盐、铁盐、锰盐等均可采用。

培养条件为好氧，相对溶氧20％-50％为宜。培养温度控制在20-45℃，初始发酵培养基pH为5-9，发酵过程中无需调节pH值，用上述方法培养20-80h后，培养基中就会积累大量的L-赖氨酸。

培养结束后，可以采用常规方法从发酵培养基中收集L-赖氨酸。

第八方面，本发明提供一种产1,5-戊二胺的大肠杆菌工程菌，所述工程菌携带有表达植物血红蛋白基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和赖氨酸脱羧酶基因的质粒。

优选地，所述植物血红蛋白基因是来自四棱豆的血红蛋白lhb基因，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和赖氨酸脱羧酶基因为宿主同源基因。

优选地，出发菌株为保藏编号CCTCC NO:M 2018456的大肠杆菌M11-A3。

第九方面，本发明提供1,5-戊二胺的生产方法，包括在发酵培养基中对上述大肠杆菌工程菌进行培养以生产1,5-戊二胺。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供了一种高效生产L-赖氨酸的方法，通过表达植物血红蛋白改善工程菌氧气吸收速率，提高葡萄糖利用效率，进而提高L-赖氨酸的产量。

(二)本发明通过植物血红蛋白基因过表达不仅可以用于L-赖氨酸生产菌的基因工程改造，还可以用于其他L-氨基酸或多肽的生产。例如，利用改造的基因工程菌进行1,5-戊二胺(尸胺)的生产。1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以和二元酸进行聚合反应合成新型尼龙，在工业生产中具有很高的应用价值。

附图说明

图1为本发明几种植物来源血红蛋白和透明颤菌血红蛋白的序列相似性比对结果。

图2显示了由葡萄糖生物合成L-赖氨酸的路线图及其关键酶基因。

图3为本发明实施例2中优化后的lhb基因序列(下)与优化前来自四棱豆的lhb基因序列(上)比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

实施例1 诱变获得的L-赖氨酸生产水平提高的突变株

从大肠杆菌MG1655(E.coli MG1655K12，购自北京天恩泽基因科技有限公司)出发，通过ARTP物理诱变的方法，以及L-赖氨酸类似物添加平板进行筛选。

接种MG1655菌株至50mL的LB培养基，待菌体浓度到OD₆₀₀＝0.6时，收集菌体。将菌体转移至ARTP仪器(无锡源清天木生物科技有限公司)，选取70秒进行诱变处理(致死率达到98％)，收集诱变后的菌体，稀释10²和10³倍后，全部涂板M9培养基(其中培养基中添加4mg/L的L-赖氨酸类似物AEC)。在未添加AEC的平板上分别涂布未诱变菌(稀释10⁵倍的菌液)，以及诱变处理后的菌体(稀释10³倍的菌液)。37℃培养两天后，共获得L-赖氨酸类似物耐受能力提高的菌株36株。挑取单菌落至30μL无菌生理盐水中，从筛选平板上蘸取菌体获得浑浊的菌液。取3μL划线至不同浓度的AEC平板进行复筛。通过使用不断增加浓度的L-赖氨酸类似物的添加平板继续重复筛选。最后确认M11菌株耐受能力最强。

从新突变株M11出发，通过ARTP物理诱变和高浓度L-赖氨酸类似物添加平板进行筛选，共获得24株新的突变菌株。将获得的24个新突变株和出发株M11，分别接种于不含抗生素的5ml种子培养基((含有4％葡萄糖,0.1％KH₂PO₄,0.1％MgSO₄,1.6％(NH₄)₂SO₄,0.001％FeSO₄,0.001％MnSO₄,0.2％酵母提取物(购自英格兰OXOID LTD.)，0.01％L-苏氨酸,0.005％L-异亮氨酸)进行培养，37℃、225rpm过夜。第二天，每个菌株再分别转接至50ml新鲜的含有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO₃)₂和100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中，于37℃、170rpm继续培养72h，利用核磁检测并计算各培养基中的赖氨酸的含量(表1)。

表1核磁检测24株新突变株与出发菌株M11相比的赖氨酸产量及OD₆₀₀

注：d25表示发酵液稀释25倍之后的测定结果。

如表1所示，发酵72h后，突变株M11-A3的赖氨酸的产量为3.57g/kg，相比于出发株M11的L-赖氨酸产量提升26％，且突变株与对照相比生长无显著差异。为提高筛选条件，将发酵时间缩短为48h。三次重复发酵出发株和该突变株，确认突变株M11-A3的产量为3.00g/kg，相对L-赖氨酸产量提升维持在24～26％。M11-A3菌株保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018456。

实施例2 构建表达载体pUC18-plac-ppc和pUC18-plac-ppc-plac-lhb

首先，构建重组表达质粒pUC18-plac-ppc：根据多片段一步法克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)产品说明书设计引物，在序列的两端引入与载体SacI/XbaI双酶切后重合20～30bp的DNA序列(SEQ ID NO:3)和(SEQ ID NO:4)，获得引物对ppc-F/R(SEQID NO:5和6)。以大肠杆菌MG1655基因组DNA作为模板，使用引物对ppc-F/R(SEQ ID NO:5和6)，通过PCR扩增获得ppc基因片段(SEQ ID NO:7)。将ppc基因片段和SacI/XbaI酶切后的pUC18(购自宝生物工程(大连)有限公司)载体进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将上述两个片段进行重组。重组后的混合物全部转化至E.coli JM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证证实ppc基因已插入到质粒载体pUC18的SacI/XbaI位点，得到正确的表达载体pUC18-plac-ppc。

然后，构建重组表达质粒pUC18-plac-ppc-plac-lhb：根据多片段一步法克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)产品说明书设计引物，在plac序列的左侧引入载体XbaI单酶切后上游重合20～30bp的DNA序列(SEQ ID NO:8)获得引物plac-F1(SEQ ID NO:9)。在lhb基因序列的两端引入与plac序列及载体XbaI单酶切后下游重合20～30bp的DNA序列(SEQ ID NO:11)和(SEQ ID NO:12)获得引物对lhb-F/R(SEQ ID NO:13和14)。以pUC18-plac-ppc质粒DNA作为模板，使用引物对plac-F1/R1(SEQ ID NO:9和10)，通过PCR扩增获得plac片段1(SEQ ID NO:15)。以生工生物工程(上海)股份有限公司合成的pUC57-lhb的质粒DNA作为模板，使用引物对lhb-F/R(SEQ ID NO:13和14)，通过PCR扩增获得含有lhb基因的DNA片段(SEQ ID NO:16，其中lhb基因经密码子优化，优化的碱基见图3)。将plac、lhb基因片段和XbaI单酶切后的载体进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将上述两个片段和一个载体进行重组。重组后的混合物全部转化至E.coli JM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证证实plac-lhb表达序列已插入到质粒载体pUC18-plac-ppc的XbaI位点，得到正确的表达载体pUC18-plac-ppc-plac-lhb。

实施例3 制备L-赖氨酸生产菌株和生产L-赖氨酸

首先，制备L-赖氨酸生产菌株：使用实施例1筛选获得的M11-A3突变株，制备感受态细胞，将实施例2构建得到的表达载体pUC18-plac-ppc和pUC18-plac-ppc-plac-lhb分别转入受体菌M11-A3突变株中。涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性平板中进行筛选。分别挑取12个单菌落至添加有氨苄青霉素的600μl LB培养基中，37℃培养3h后，取1μl菌体作为模板进行PCR验证筛选正确的突变株，并甘油保种。

然后，选取实施例2中获得的3个pUC18-plac-ppc转化子和3个pUC18-plac-ppc-plac-lhb转化子及出发株M11-A3，分别涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素和不含抗生素的种子培养基(同实施例1)，平板上进行筛选。进一步分别各挑取3个单克隆，利用5ml种子培养基进行培养，37℃，225rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，超凡型小容量全温度恒温培养振荡器，型号SPH-200B)过夜(16h)。第二天，每个菌株再分别转接至50ml新鲜的含有30g/L葡萄糖,0.7％Ca(HCO₃)₂和100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中于37℃，170rpm(仪器购自上海世平实验设备有限公司，标准型大容量恒温培养摇床，型号SPH-211B)继续培养48h，利用核磁检测并计算各培养基中的赖氨酸的含量(表2)。

表2核磁检测过表达突变株与出发菌株相比的赖氨酸产量及OD₆₀₀

如表2所示，含有质粒pUC18-plac-ppc的突变株的赖氨酸的产量为3.72g/kg.该突变株的赖氨酸相对产量是对照M11-A3菌株的124％，且突变株与对照相比生长速率有一定程度的提升。含有质粒pUC18-plac-ppc-plac-lhb的突变株的赖氨酸的产量为4.58g/kg.该突变株的赖氨酸相对产量是对照M11-A3菌株的153％，且突变株与对照相比生长速率提高22％。由此分析是由于lhb和ppc基因过表达导致赖氨酸生产水平提高，从而引起了突变株M11-A3/pUC18-plac-ppc-plac-lhb细胞内赖氨酸转化率的提升。以上结果表明，lhb基因的过表达能够促进菌体生长和提高L-赖氨酸的产量。

实施例4 制备1,5-戊二胺生产菌株和生产1,5-戊二胺

首先，构建重组表达质粒pUC18-plac-ppc-plac-lhb-plac-cadA：根据多片段一步法克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)产品说明书设计引物，在plac序列的左侧引入与pUC18-plac-ppc-plac-lhb载体HindIII单酶切后上游重合20～30bp的DNA序列(SEQ ID NO:17)获得引物plac-F2(SEQ ID NO:18)。在cadA基因序列的两端引入与plac序列及载体HindIII单酶切后下游重合20～30bp的DNA序列(SEQ ID NO:20)和(SEQ ID NO:21)获得引物对cadA-F/R(SEQ ID NO:22和23)。以pUC18质粒DNA作为模板，使用引物对plac-F2/R2(SEQ ID NO:18和19)，通过PCR扩增获得plac片段2(SEQ ID NO：24)。以MG1655的基因组DNA作为模板，使用引物对cadA-F/R，通过PCR扩增获得cadA片段(SEQ ID NO:25)。将plac，cadA片段和HindIII单酶切后的pUC18-plac-ppc-plac-lhb载体进行切胶回收纯化，使用多片断一步法克隆试剂盒将上述两个片段和载体进行重组。重组后的混合物全部转化至E.coli JM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证证实plac-cadA表达序列已插入到质粒载体pUC18-plac-ppc-plac-lhb的HindIII位点，得到正确的表达载体pUC18-plac-ppc-plac-lhb-plac-cadA。

然后，使用实施例1筛选获得的M11-A3突变株，制备感受态。将表达载体pUC18-plac-ppc-plac-lhb-plac-cadA转入受体菌M11-A3突变株中。涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性平板中进行筛选。挑取12个单菌落至添加有氨苄青霉素的600μl LB培养基中，37℃培养3h后，取1μl菌体作为模板进行PCR验证筛选正确的突变株，并甘油保种。

选取上述3个转化子和出发株M11-A3，分别涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素和不含抗生素的种子培养基(同实施例1)平板上进行筛选。进一步，分别各挑取3个单克隆，利用5ml种子培养基进行培养，37℃、225rpm过夜。第二天，每个菌株再分别转接至50ml新鲜的含有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO₃)₂和100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基中于37℃、170rpm继续培养48h，利用核磁检测并计算各培养基中的戊二胺的含量(表3)。

表3核磁检测3株PPC/Lhb和CadA同时过表达突变株与出发菌株相比的戊二胺产量及OD₆₀₀

如表3所示，含有质粒pUC18-plac-ppc-plac-lhb-plac-cadA的转化株的戊二胺的产量为2.13g/kg。该转化株的L-赖氨酸转化率为83.2％，且转化株与对照相比生长无显著差异。由此分析ppc、lhb和cadA基因同时过表达能够将L-赖氨酸高效转化为戊二胺，突变株M11-A3/pUC18-plac-ppc-plac-lhb-plac-cadA能够应用于戊二胺的生产。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司凯赛生物产业有限公司

<120> 用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用

<130> KHP181115117.6

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggtggtt tcaccgaaaa acaggaagcg ctggttaact cttcttacga agcgttcaaa 60

gcgaacgtac cgcagtactc tgttgttttc tacacctcta tcctggaaaa agcgcctgca 120

gcgaaagacc tgttcccgtt cctggcgaac ggtgttgacc cgacgaaccc gaaactgatc 180

ggtcacgcag aaaaactgtt cggtctggtt cacgactctg cggcgcaact gcgtgcgaaa 240

ggcgcggttg ttgcggacgc cgctctgggt tctctgcacg cgcagaaagg tgttaccgac 300

ccgcagttcg ttgtagttaa ggaagcactg ctgaaaaccg ttaaagaagc ggttggtgac 360

aaatggtctg acgagctgtc taacgcgtgg gaagttgcgt ataatgaact ggcggctgcc 420

ctcaagaaag cgttttaa 438

<210> 2

<211> 145

<212> PRT

<213> 四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)

<400> 2

Met Gly Gly Phe Thr Glu Lys Gln Glu Ala Leu Val Asn Ser Ser Tyr

1 5 10 15

Glu Ala Phe Lys Ala Asn Val Pro Gln Tyr Ser Val Val Phe Tyr Thr

20 25 30

Ser Ile Leu Glu Lys Ala Pro Ala Ala Lys Asp Leu Phe Pro Phe Leu

35 40 45

Ala Asn Gly Val Asp Pro Thr Asn Pro Lys Leu Ile Gly His Ala Glu

50 55 60

Lys Leu Phe Gly Leu Val His Asp Ser Ala Ala Gln Leu Arg Ala Lys

65 70 75 80

Gly Ala Val Val Ala Asp Ala Ala Leu Gly Ser Leu His Ala Gln Lys

85 90 95

Gly Val Thr Asp Pro Gln Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Lys

100 105 110

Thr Val Lys Glu Ala Val Gly Asp Lys Trp Ser Asp Glu Leu Ser Asn

115 120 125

Ala Trp Glu Val Ala Tyr Asn Glu Leu Ala Ala Ala Leu Lys Lys Ala

130 135 140

Phe

145

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggag gagctc 36

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt 30

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggag gagctcatga acgaacaata ttccgcat 58

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ttagccggta ttacgcatac ctgc 54

<210> 7

<211> 2718

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggag gagctcatga acgaacaata ttccgcattg 60

cgtagtaatg tcagtatgct cggcaaagtg ctgggagaaa ccatcaagga tgcgttggga 120

gaacacattc ttgaacgcgt agaaactatc cgtaagttgt cgaaatcttc acgcgctggc 180

aatgatgcta accgccagga gttgctcacc accttacaaa atttgtcgaa cgacgagctg 240

ctgcccgttg cgcgtgcgtt tagtcagttc ctgaacctgg ccaacaccgc cgagcaatac 300

cacagcattt cgccgaaagg cgaagctgcc agcaacccgg aagtgatcgc ccgcaccctg 360

cgtaaactga aaaaccagcc ggaactgagc gaagacacca tcaaaaaagc agtggaatcg 420

ctgtcgctgg aactggtcct cacggctcac ccaaccgaaa ttacccgtcg tacactgatc 480

cacaaaatgg tggaagtgaa cgcctgttta aaacagctcg ataacaaaga tatcgctgac 540

tacgaacaca accagctgat gcgtcgcctg cgccagttga tcgcccagtc atggcatacc 600

gatgaaatcc gtaagctgcg tccaagcccg gtagatgaag ccaaatgggg ctttgccgta 660

gtggaaaaca gcctgtggca aggcgtacca aattacctgc gcgaactgaa cgaacaactg 720

gaagagaacc tcggctacaa actgcccgtc gaatttgttc cggtccgttt tacttcgtgg 780

atgggcggcg accgcgacgg caacccgaac gtcactgccg atatcacccg ccacgtcctg 840

ctactcagcc gctggaaagc caccgatttg ttcctgaaag atattcaggt gctggtttct 900

gaactgtcga tggttgaagc gacccctgaa ctgctggcgc tggttggcga agaaggtgcc 960

gcagaaccgt atcgctatct gatgaaaaac ctgcgttctc gcctgatggc gacacaggca 1020

tggctggaag cgcgcctgaa aggcgaagaa ctgccaaaac cagaaggcct gctgacacaa 1080

aacgaagaac tgtgggaacc gctctacgct tgctaccagt cacttcaggc gtgtggcatg 1140

ggtattatcg ccaacggcga tctgctcgac accctgcgcc gcgtgaaatg tttcggcgta 1200

ccgctggtcc gtattgatat ccgtcaggag agcacgcgtc ataccgaagc gctgggcgag 1260

ctgacccgct acctcggtat cggcgactac gaaagctggt cagaggccga caaacaggcg 1320

ttcctgatcc gcgaactgaa ctccaaacgt ccgcttctgc cgcgcaactg gcaaccaagc 1380

gccgaaacgc gcgaagtgct cgatacctgc caggtgattg ccgaagcacc gcaaggctcc 1440

attgccgcct acgtgatctc gatggcgaaa acgccgtccg acgtactggc tgtccacctg 1500

ctgctgaaag aagcgggtat cgggtttgcg atgccggttg ctccgctgtt tgaaaccctc 1560

gatgatctga acaacgccaa cgatgtcatg acccagctgc tcaatattga ctggtatcgt 1620

ggcctgattc agggcaaaca gatggtgatg attggctatt ccgactcagc aaaagatgcg 1680

ggagtgatgg cagcttcctg ggcgcaatat caggcacagg atgcattaat caaaacctgc 1740

gaaaaagcgg gtattgagct gacgttgttc cacggtcgcg gcggttccat tggtcgcggc 1800

ggcgcacctg ctcatgcggc gctgctgtca caaccgccag gaagcctgaa aggcggcctg 1860

cgcgtaaccg aacagggcga gatgatccgc tttaaatatg gtctgccaga aatcaccgtc 1920

agcagcctgt cgctttatac cggggcgatt ctggaagcca acctgctgcc accgccggag 1980

ccgaaagaga gctggcgtcg cattatggat gaactgtcag tcatctcctg cgatgtctac 2040

cgcggctacg tacgtgaaaa caaagatttt gtgccttact tccgctccgc tacgccggaa 2100

caagaactgg gcaaactgcc gttgggttca cgtccggcga aacgtcgccc aaccggcggc 2160

gtcgagtcac tacgcgccat tccgtggatc ttcgcctgga cgcaaaaccg tctgatgctc 2220

cccgcctggc tgggtgcagg tacggcgctg caaaaagtgg tcgaagacgg caaacagagc 2280

gagctggagg ctatgtgccg cgattggcca ttcttctcga cgcgtctcgg catgctggag 2340

atggtcttcg ccaaagcaga cctgtggctg gcggaatact atgaccaacg cctggtagac 2400

aaagcactgt ggccgttagg taaagagtta cgcaacctgc aagaagaaga catcaaagtg 2460

gtgctggcga ttgccaacga ttcccatctg atggccgatc tgccgtggat tgcagagtct 2520

attcagctac ggaatattta caccgacccg ctgaacgtat tgcaggccga gttgctgcac 2580

cgctcccgcc aggcagaaaa agaaggccag gaaccggatc ctcgcgtcga acaagcgtta 2640

atggtcacta ttgccgggat tgcggcaggt atgcgtaata ccggctaatc tagagtcgac 2700

ctgcaggcat gcaagctt 2718

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcaggtatgc gtaataccgg ctaatctaga 30

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcaggtatgc gtaataccgg ctaatctaga ggataaccgt attaccgcct tt 52

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagctcctcc tgtgtgaaat tgtt 24

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcggataaca atttcacaca ggaggagctc 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt 30

<210> 13

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcggataaca atttcacaca ggaggagctc atgggtggtt tcaccgaaaa acag 54

<210> 14

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ttaaaacgct ttcttgaggg cagc 54

<210> 15

<211> 344

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

attgcggcag gtatgcgtaa taccggctaa tctagaggat aaccgtatta ccgcctttga 60

gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 120

agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg 180

cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt 240

gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 300

gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggagga gctc 344

<210> 16

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcggataaca atttcacaca ggaggagctc atgggtggtt tcaccgaaaa acaggaagcg 60

ctggttaact cttcttacga agcgttcaaa gcgaacgtac cgcagtactc tgttgttttc 120

tacacctcta tcctggaaaa agcgcctgca gcgaaagacc tgttcccgtt cctggcgaac 180

ggtgttgacc cgacgaaccc gaaactgatc ggtcacgcag aaaaactgtt cggtctggtt 240

cacgactctg cggcgcaact gcgtgcgaaa ggcgcggttg ttgcggacgc cgctctgggt 300

tctctgcacg cgcagaaagg tgttaccgac ccgcagttcg ttgtagttaa ggaagcactg 360

ctgaaaaccg ttaaagaagc ggttggtgac aaatggtctg acgagctgtc taacgcgtgg 420

gaagttgcgt ataatgaact ggcggctgcc ctcaagaaag cgttttaatc tagagtcgac 480

ctgcaggcat gcaagctt 498

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt 30

<210> 18

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt ggataaccgt attaccgcct tt 52

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agctgtttcc tgtgtgaaat tgtt 24

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct 30

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg 30

<210> 22

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgggtggtt tcaccgaaaa acag 54

<210> 23

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt ccacttccct tgtacgagct aattatttt 59

<210> 24

<211> 338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 60

tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 120

agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 180

gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 240

gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 300

aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagct 338

<210> 25

<211> 2230

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg 60

ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac 120

ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg 180

cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt 240

agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat 300

gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct 360

gaagatattg ctaataagat caagcagacc actgacgaat atatcaacac tattctgcct 420

ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct 480

ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc 540

tttggtccga ataccatgaa atctgatatt tccatttcag tatctgaact gggttctctg 600

ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca 660

gaccgcagct acatggtgac caacggtact tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac 720

tctgctccag caggcagcac cattctgatt gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac 780

ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt 840

attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa 900

gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt 960

ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa acactggatg tgaaatccat ccactttgac 1020

tccgcgtggg tgccttacac caacttctca ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc 1080

ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg 1140

gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac 1200

gaagcctaca tgatgcacac caccacttct ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa 1260

accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa 1320

cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc 1380

tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat acgactgaat gctggccgct gcgttctgac 1440

agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa 1500

gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa gacggcacca tgagcgactt tggtattccg 1560

gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg 1620

tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg 1680

cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg 1740

ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct 1800

cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt 1860

gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt 1920

atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt 1980

ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt 2040

ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa 2100

accgatattc acggtgcata ccgtcaggct gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa 2160

gaagaaagca aaaaataatt agctcgtaca agggaagtgg aagcttggca ctggccgtcg 2220

ttttacaacg 2230

Claims

1.用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA，其特征在于，所述重组DNA至少包括植物血红蛋白基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因；

其中，所述植物血红蛋白基因是来自四棱豆的血红蛋白lhb基因，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因是来自大肠杆菌的ppc基因；

来自四棱豆的血红蛋白lhb基因经密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；来自大肠杆菌的ppc基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。

2.含有权利要求1所述重组DNA的生物材料，所述生物材料为表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

3.高产L-赖氨酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌的构建方法如下：

A、增强原始菌株中与L-赖氨酸生物合成途径相关的基因，获得基因增强菌株；

所述增强的途径选自以下1)和/或2)：

1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；

2)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；

所述与L-赖氨酸生物合成途径相关的基因为ppc；

B、构建携带植物血红蛋白基因的质粒；

C、将步骤B中所述携带植物血红蛋白基因的质粒导入步骤A中所述基因增强菌株中，获得高产L-赖氨酸的工程菌；

其中，所述植物血红蛋白基因是来自四棱豆的血红蛋白lhb基因；来自四棱豆的血红蛋白lhb基因经密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述原始菌株为大肠杆菌(Escherichiacoli)。

5.高产L-赖氨酸的工程菌，其特征在于，其包含权利要求1所述的重组DNA。

6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌的出发菌株为保藏编号CCTCC NO:M 2018456的大肠杆菌(Escherichia coli)M11-A3。

7.根据权利要求5或6所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌中包含：启动子-ppc-启动子-lhb的DNA序列；所述启动子为plac；

其中，ppc是来自大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因；

lhb为四棱豆的血红蛋白基因，经密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

8.权利要求5-7任一项所述工程菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用。

9.产1,5-戊二胺的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌携带有表达植物血红蛋白基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和赖氨酸脱羧酶基因的质粒；

所述植物血红蛋白基因是来自四棱豆的血红蛋白lhb基因，经密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和赖氨酸脱羧酶基因为宿主同源基因，出发菌株为保藏编号CCTCC NO:M 2018456的大肠杆菌(Escherichia coli)M11-A3。

10.1,5-戊二胺的生产方法，其特征在于，包括在发酵培养基中对权利要求9所述的工程菌进行培养以生产1,5-戊二胺。