CN108026539A - 新型启动子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型启动子、包含该启动子的载体、包含该启动子或该载体的微生物以及使用该微生物生产目标产物的方法。

Description

新型启动子及其应用
技术领域
本公开涉及新型启动子、包含该启动子的载体、包含该启动子或载体的微生物以及使用该微生物生产目标产物的方法。
背景技术
已经进行不断的努力来使用微生物以高滴度生产目标产物，如氨基酸或包括饲料、药物、食品等的可用于各种目的的有用物质(韩国专利号10-0924065)。作为此类方法中的一种，存在诱导微生物中目标基因的过表达的方法，并且对于此目的而言，高效的基因表达系统是必需的。由于启动子是重要地参与基因表达系统的因素之一，因此对有用启动子的开发是必要的。
大肠杆菌(E.coil)来源的tac启动子被广泛认为是强启动子。就棒状微生物而言，通过修饰自身基因的启动子来开发强启动子(Gene,102,93-98,1991；Microbiology,142,1297-1309,1996)。例如，就源自产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenesis)的启动子而言，公开了与大肠杆菌中报道的tac启动子相比有约10％的提高(Biotechnol.Lett.25,1311-1316,2003)。此外，作为源自产氨棒状杆菌的强启动子，开发出具有不同强度的Pcj1至Pcj7启动子，并且它们具有比tac启动子高至少10倍的强启动子活性(韩国专利号10-0620092)。此外，开发出由谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)合成而具有强启动子活性的Po2启动子(韩国专利号10-1632642)。然而，由于与大肠杆菌的基因表达系统相比在棒状杆菌(Corynebacterium)中表现出高表达效果的系统是必要的，所以仍需要开发启动子。
在该情况下，本发明人已经做出许多努力来找到可以强有力地诱导棒状杆菌属微生物中的基因表达的启动子。结果，他们已经开发出本公开的新型的合成启动子，并证实与已知的启动子相比，该启动子具有更高的表达活性，从而完成本公开。
发明内容
技术问题
本公开的目的是提供具有启动子活性的新型核酸分子；含有该核酸分子和目标基因的基因表达盒；含有该核酸分子或基因表达盒的重组载体；含有该启动子或载体的重组微生物；以及使用该重组微生物生产目标产物的方法。
技术方案
为了实现本公开的目的，本公开一方面提供了由选自SEQ ID NO:1至3的任何一个核苷酸序列组成的具有启动子活性的核酸分子。
如本公开所使用的，术语“启动子”是指位于编码区上游的非翻译核酸序列，其包括聚合酶结合位点，并且具有启动将位于启动子下游的基因转录成mRNA的活性，即聚合酶所结合的并启动基因转录的DNA结构域。启动子可位于mRNA转录起始结构域的5'结构域。
在本公开中，由选自SEQ ID NO:1至3的任何一个核苷酸序列(即，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列)组成的具有启动子活性的核酸分子被分别命名为SPL1、SPL7和SPL13。具有启动子活性的核酸分子也可命名为启动子，并且上述所有术语都可在本公开中使用。
本公开的启动子能够表达目标基因，所述目标基因可操作地连接至目标微生物中具有启动子活性的核酸分子，并且可以用作通用(general-use)启动子。
此外，本公开的启动子序列可通过常规已知的诱变(例如，直接演化(directevolutio n)、定点诱变等)进行修饰。因此，启动子可包括而不限于与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有70％或更高、具体地80％或更高、更具体地90％或更高、甚至更具体地95％或更高、甚至还更具体地98％或更高、并且最具体地99％或更高的同源性，并且具有相似启动子活性的任何核苷酸序列。此外，其中部分序列被缺失、修饰、取代或插入的具有上述同源性的任何核苷酸序列应被理解为包括在本公开核酸分子的范围内，只要该序列具有启动子活性。
具体地，“由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列组成”的表述不排除当通过连接到目标基因使用相应的启动子时，在使用限制酶的同时将其连接到目标基因时可以发生的核苷酸的添加和/或缺失和/或修饰等的情形。
具体地，除了用于进行基因转录的启动子之外，可以包括用于控制转录的任何操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、和用于控制转录和翻译的序列。例如，适用于原核生物的控制序列可包括任何操纵子序列或核糖体结合结构域，但并不限于此。根据本领域普通技术人员的需要，具有本公开启动子活性的核酸分子可以由上述用于控制基因表达的序列组成。
具有启动子活性的由选自SEQ ID NO:1至3核苷酸序列的任何一个核苷酸序列组成的核酸分子可包括而不限于可以由已知基因序列制备的探针，例如，在严格条件下通过与本公开的SEQ ID NO:1至3的全部或部分核苷酸序列的互补序列杂交而具有本公开启动子活性的任何核苷酸序列。
如本文所使用的，术语“同源性”是指两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性百分比。可以通过本领域已知的技术测定一个部分与另一部分的序列同源性。例如，可以使用用于计算参数(如分数、同一性和相似性)的标准软件(具体地BLAST 2.0)或通过在限定的严格条件下经由Southern杂交实验比较序列来确定同源性，并且可以在相应技术的范围内通过本领域普通技术人员熟知的方法确定限定的适当杂交条件(例如，J.Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring HarborLaboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。
“严格条件”是指能够在多核苷酸之间进行特定杂交的条件。在参考文献(例如，J.Sambrook等人，同上)中详细描述了该条件。例如，可以包括这样的杂交条件，其中具有高同源性的基因(例如，具有80％或更高、具体地90％或更高、更具体地95％或更高、甚至更具体地97％或更高、甚至还更具体地99％或更高同源性的基因)被杂交，并且具有低于上述的同源性的基因不被杂交；或这样的洗涤条件，其中在对应于Southern杂交的常规洗涤条件的盐浓度和温度的条件下(即60℃，1×SSC和0.1％SDS，具体地60℃，0.1×SSC和0.1％SDS，更具体地68℃，0.1×SSC和0.1％SDS)进行一次，具体地2至3次洗涤。虽然由于杂交的严格性可能发生核苷酸之间的错配，但两个核酸具有互补序列是需要的。术语“互补”用于描述可以相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于核苷酸碱基而言，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开不仅可以包括基本上相似的核酸序列，而且可以包括与全部序列互补的分离的核酸片段。具体地，可以使用包括Tm值为55℃的杂交条件和上述条件的杂交条件来检测具有同源性的多核苷酸。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但并不限于此，并且可以根据目的由本领域普通技术人员适当地控制。众所周知，多核苷酸杂交的严格性取决于互补性多核苷酸的长度和程度，而且变量是本领域公知的(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51,11.7-11.8)。
可以利用标准分子生物学技术分离或制备具有本公开启动子活性的核酸分子。例如，可以利用使用自动化DNA合成仪的标准合成技术来制备核酸分子，但制备并不限于此。
本公开另一方面提供了包括本公开的核酸分子和目标基因的基因表达盒。
本公开的核酸分子与上述相同。
如本文所使用的，术语“基因表达盒”是指包含启动子和目标基因，并因此可以表达可操作地连接至启动子下游的目标基因的单元盒。这种基因表达盒可包括能够有助于有效表达目标基因、盒的内部或外部的各种因子。除了与目标基因可操作地连接的启动子之外，基因表达盒可常规地包括转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。
如本文所使用的，术语“目标基因”是指编码微生物中所要表达的蛋白质的基因。
例如，目标基因可以是参与生产选自以下的产物的基因：糖类(例如，阿洛酮糖或塔格糖)、L-氨基酸(L-赖氨酸、L-缬氨酸等)、有机酸、酶及其组合，但并不限于此。具体地，目标基因可以是编码糖转化酶或与氨基酸生物合成相关的酶的基因、编码与还原力相关的酶的基因、编码与有机酸生物合成相关的酶、或编码与目标产物释放相关的酶的基因，但并不限于此。更具体地，目标基因可以是编码阿洛酮糖差向异构酶的基因、编码塔格糖差向异构酶的基因或编码塔格糖醛酸差向异构酶的基因、编码NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因、或编码支链氨基酸氨基酸转氨酶的基因，但并不限于此。
阿洛酮糖差向异构酶可以表示为ATPE，并且其是指具有将果糖转化为阿洛酮糖的活性的阿洛酮糖-3-差向异构酶。此外，塔格糖醛酸差向异构酶或塔格糖差向异构酶(己糖醛酸C4-差向异构酶；韩国专利号10-1550796)可以表示为UxaE，并且其是指具有将果糖醛酸转化为塔格糖醛酸或将果糖转化为塔格糖的活性的酶。NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶可以表示为GapN，并且其是指具有使用3磷酸甘油醛作为底物转化为3-磷酸甘油酸的活性的酶。支链氨基酸转氨酶可以表示为IlvE，并且其是指支链氨基酸生物合成途径中的最后一步的酶。编码ATPE、UxaE、GapN和IlvE的基因序列可以由本领域普通技术人员通过已知的数据库(如NIH(USA)的GenBank)容易获得。编码ATPE、UxaE、GapN和IlvE的基因是可以可操作地连接至具有本公开启动子活性的核酸分子的说明性目标基因，并且本公开的启动子可以使用而不限于可以通过通用(general-purpose)启动子在微生物中表达的任何基因作为目标基因。如本文所使用的，术语“可操作地连接”意指上述基因序列和启动子序列功能性地连接，使得具有本公开启动子活性的核酸序列可以引起和介导目标基因的转录。可以使用本领域熟知的遗传重组技术制备可操作的连接，并且可以使用本领域中的裂解酶和连接酶等(但并不限于此)制备位点特异性DNA裂解和连接。
本公开的另一方面提供了重组载体，其包括本公开的核酸分子或本公开的基因表达盒。
核酸分子和基因表达盒与上述相同。
如本文所使用的，术语“载体”是具有能够在适当宿主细胞中表达目标基因的遗传物质的人工DNA分子，并且具体是包括可操作地连接至适当调控序列的基因的核苷酸序列的DNA构建体。除了能够启动转录的启动子之外，调控序列可包括用于调控这种转录的任何操纵子序列、编码适当mRNA核糖体结合结构域的序列、和用于调控转录和翻译的序列，但并不限于此。
本公开中使用的载体可不受具体限制，只要载体在宿主细胞中是可表达的，并且可以使用本领域已知的任何载体转化宿主细胞。常规使用的载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、λBL3、λBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A、Charon21A等；作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些。本公开中使用的载体不受具体限制，而可以使用任何已知的表达载体。此外，染色体中的内源性启动子可以通过用于将染色体插入宿主细胞的载体用具有本公开启动子活性的核酸分子替换。将核酸分子插入染色体可以通过本领域公知的方法例如同源重组进行。例如，可以使用pECCG117、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC、pCES208、pXMJ19载体等，但是载体并不限于此。由于本公开的载体可以通过同源重组插入到染色体中，因此可以进一步包括用于确定插入染色体的选择标记物。选择标记物用于选择转化的细胞，即用于确定目标核酸分子的插入，并且可以使用能够提供可选择表型(如耐药性、营养需求、对细胞毒性剂的抗性和表面蛋白的表达)的标记物。在处理选择剂的情况下，只有能够表达选择标记物的细胞才能存活或表达其他表型特征，因此可以选择转化的细胞。
如本文所使用的，术语“转化”是指将包括编码目标蛋白的多核苷酸的载体导入宿主细胞，从而能够在宿主细胞中表达由蛋白质编码的多核苷酸的过程。对于转化的多核苷酸，无论是否将其插入到宿主细胞的染色体中并且位于其中或位于染色体外都不重要，只要其可以在宿主细胞中表达。此外，多核苷酸包括编码目标蛋白的DNA和RNA。可以以任何形式插入多核苷酸，只要其可以被引入宿主细胞中并在其中表达。例如，可以以表达盒(其是包括自身表达所需的所有必要元件的基因构建体)的形式或者以包括表达盒的载体的形式将多核苷酸导入宿主细胞中。包括多核苷酸的表达盒或载体可以是包括例如具有启动子活性的由本公开的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3组成的核苷酸序列组成的核酸分子的那些，并且可以是不与目标基因可操作地连接的载体。即使在该情况下，具有启动子活性的核酸分子也可以被宿主细胞(例如，棒状杆菌属微生物)内的内源启动子并且通过同源重组替换。因此，宿主细胞中的内源基因可以被表达。
转化方法可包括可以将核酸导入细胞中的任何方法，并且转化可以根据宿主细胞通过选择本领域已知的适当标准技术进行。例如，方法可包括电穿孔、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法和醋酸锂-DMSO方法等，但并不限于此。
本公开的又一方面提供了包括具有本公开启动子活性的核酸分子的重组微生物、基因表达盒或包括该基因表达盒的重组载体。
具有启动子活性的核酸分子、基因表达盒和重组载体与上述相同。
可以通过转化将基因表达盒和重组载体导入微生物中。
此外，转化与上述相同。
如本文所使用的，术语“微生物”是包括野生型微生物和天然或人工遗传修饰的微生物的概念，并且其可以是由于外源基因的插入或内源基因活性的增强或减弱而具有特定的减弱或增强机制的微生物。如本文所使用的，微生物可包括而不限于其中导入具有本公开启动子活性的核酸分子并且该核酸分子能够起到启动子作用的任何微生物。
具体地，微生物可以是棒状杆菌属微生物，更具体地，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentums)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、嗜热棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒状杆菌(Corynebacteriumefficiens)等。甚至更具体地，微生物可以是谷氨酸棒状杆菌，但并不限于此。
又一方面，本公开提供了生产目标产物的方法，包括(a)在培养基中培养本公开的重组微生物；和(b)从微生物或培养微生物的培养基中回收目标产物。
如本文所使用的，术语“目标产物”可以选自糖类(例如，阿洛酮糖或塔格糖)、L-氨基酸(例如，L-赖氨酸、L-缬氨酸等)、有机酸、酶及其组合。“糖类”是指具有甜味的碳水化合物，并且可以选自例如葡萄糖、果糖、半乳糖、阿洛酮糖、塔格糖、木糖、乳糖、蔗糖及其组合，但并不限于此。
“氨基酸”或“L-氨基酸”通常是指其中氨基和羧基结合至相同碳原子的蛋白质的基本构成单元。氨基酸可以选自例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸及其组合，但并不限于此。有机酸可以是具有酸性的有机化合物，例如，其中包括羧基和磺酸基的那些化合物。有机酸的具体实例可包括乳酸、醋酸、琥珀酸、丁酸、棕榈酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸或柠檬酸，但并不限于此。“酶”是指介导活生物体中发生的化学反应的蛋白质催化剂，具体地，酶通过与底物结合形成酶-底物复合物而起到降低反应所需的活化能的催化剂的作用。例如，一些酶可以参与糖类(例如，阿洛酮糖或塔格糖)的生产，更具体地，这些酶可以是阿洛酮糖差向异构酶、塔格糖差向异构酶、或塔格糖醛酸差向异构酶，但并不限于此。目标产物可包括可以通过可操作地连接至本公开启动子的目标基因的表达而生产的任何目标产物，但目标产物并不限于此。
如本文所使用的，术语“培养”是指在适当地且人工地控制的环境条件下使微生物生长。在本公开中，可以根据本领域公知的适当培养基和培养条件进行培养过程。具体地，培养过程可以以分批、补料分批或重复补料分批法连续进行，但并不限于此。
培养中使用的培养基必须适当地满足具体菌株的需求。用于棒状杆菌属和埃希氏杆菌属(genus Escherichia)微生物的培养基被公开(例如，Manual of Methods forGeneral Bacteriology.American Society for Bacteriology.Washington D.C.,USA,1981)。作为用于培养基中的碳源，可以包括糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，如甘油和乙醇；和有机酸，如葡萄糖酸、醋酸和丙酮酸，但并不限于此。这些物质可以单独使用或作为混合物使用。作为所使用的氮源，可以包括蛋白胨、酵母提取物、牛肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、豆粕粉、尿素或无机化合物，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、和硝酸铵，但氮源并不限于此。氮源也可以单独使用或作为混合物使用。作为磷源，可以使用磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐，但磷源并不限于此。此外，培养基可包括对生长所必需的金属盐，如硫酸镁或硫酸铁。另外，除了上述物质外，可以使用用于生长的必需物质，如氨基酸和维生素。此外，可以向培养基加入合适的前体。具体地，当生产酶作为目标产物时，酶的底物可以包含在培养基中。例如，可以充当阿洛酮糖差向异构酶、塔格糖差向异构酶或塔格糖醛酸差向异构酶的底物的果糖可包括在培养基中。上述源材料可以在培养过程中以分批或连续的方式充分地进料到培养物中。例如，在参考文献(“Biochemical Engineering”by James M.Lee,Prentice-Hall InternationalEditions，第138-176页)中公开了这些各种培养方法。
可以通过合适的碱性化合物(如氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(如磷酸或硫酸)来调节培养物的pH。此外，可以通过消泡剂(如脂肪酸聚乙二醇酯)调节泡沫。为了维持培养物的需氧条件，可以导入氧气或含氧气体混合物(例如，空气)。培养温度通常可以在20℃至45℃，具体地25℃至40℃的范围内，但温度并不限于此，并且可以根据培养条件而变化。
本公开的生产目标产物的方法可包括从本公开的微生物或培养微生物的培养基中回收目标产物的步骤。从微生物或培养微生物的培养基生产目标产物的方法是使用本领域公开的适当反应使目标产物分离或回收。例如，方法可包括蛋白质沉淀处理(盐析法)、离心、萃取、超声处理、超滤、透析、各种色谱法，如分子筛色谱法(凝胶过滤)、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等，及其组合，但并不限于此。回收步骤可包括纯化法，并且本领域普通技术人员可以根据需要从各种纯化法中选择方法并利用它。
发明的有利效果
根据诱导目标基因表达的微生物，本公开的新型启动子可具有不同活性。因此，当需要在目标产物生产过程中根据需要控制目标基因的活性时，可以使用本公开的新型启动子有效生产目标产物。
附图说明
图1显示了图示新型启动子的测量强度的GFP测定结果。图1(A)显示了基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的新型启动子的GFP测定结果，图1(B)显示了基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的新型启动子的GFP测定结果。
图2显示了确定阿洛酮糖生产的HPLC结果。图2(A)显示了使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/CJ4-ATPE-2以果糖作为底物的反应结果。图2(B)显示了使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/SPL1-ATPE-2以果糖作为底物的反应结果，图2(C)显示了使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/SPL7-ATPE-2以果糖作为底物的反应结果。
图3显示了确定塔格糖生产的HPLC结果。图3(A)显示了使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/CJ4-TN(m)以果糖作为底物的反应结果，图 3(B)显示使用ATCC13032/SPL13-TN(m)以果糖作为底物的反应结果。
具体实施方式
下文中，将参考以下实施例等对本公开进行更加详细地描述，以帮助理解本公开。然而，这些实施例可以以各种其他形式进行修改，并且本公开的范围不应被解释为受这些实施例限制。为了对具有本领域普通知识的人进行全面深入解释的目的而提供本公开的实施例。
实施例1：由新型启动子诱导的目标基因表达的确定
1-1.含有新启动子序列的重组载体的制备
为了合成能够诱导目标基因表达的新型启动子，对源自棒状杆菌属微生物和埃希氏杆菌属微生物的各种启动子序列进行分析。合成具有由SEQ ID NO:1、2和3表示的核苷酸序列的启动子，并分别命名为SPL1、SPL7和SPL13。
基于通过合成制备的SPL1、SPL7和SPL13启动子作为模板，使用包括KpnI/EcoRV限制位点的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的引物进行PCR[Sambrook等人,Molecular Cloning,a Laboratory Manual(1989),Cold Spring Harbor Laboratories]。在以下条件下进行PCR：94℃变性5分钟；94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸30秒，30个循环；和72℃延伸7分钟。结果，获得大小为约300bp的SPL1、SPL7和SPL13。
通过使用pGFPuv载体(Clontech，USA)作为模板与包括PstI/EcoRV限制位点的SEQID NO:6和SEQ ID NO:7引物一起进行PCR而获得GFP基因的开放阅读框(ORF)。在以下条件下进行PCR：94℃变性5分钟；94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟，30个循环；和72℃延伸7分钟。结果，获得约716bp的GFP基因片段(SEQ ID NO:14)。
在可以在大肠杆菌和棒状微生物中表达的穿梭载体pECCG117(Biotechnologyletters，13卷10期，721-726页(1991)，(韩国专利号10-1992-0007401))的PstI和KpnI限制位点，使用DNA连接酶将用限制酶KpnI和EcoRV处理的SPL1、SPL7和SPL13中的每个和用PstI和EcoRV处理的GFP基因的ORF彼此可操作地连接，从而制得SPL1、SPL7和SPL13中的每个与GFP连接的重组载体，并将它们分别命名为pSPL1-GFP、pSPL7-GFP和pSPL13-GFP。
1-2.转化菌株的制备
通过电脉冲法(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541-545)将载体pECCG117、上述制备的重组载体(pSPL1-GFP、pSPL7-GFP和pSPL13-GFP)和包括先前公开的启动子pcj4(韩国专利号10-0620092)的p117-CJ4-GFP分别转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032和谷氨酸棒状杆菌ATCC13869中，并在含卡那霉素(25mg/L)的Luria-Bertani(LB)琼脂板中获得转化菌株。将基于ATCC13032获得的菌株分别命名为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/pECCG117、谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/SPL1-GFP、谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/SPL7-GFP、谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/SPL13-GFP和谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/CJ4-GFP。此外，将基于ATCC13869获得的菌株分别命名为谷氨酸棒状杆菌ATCC13869/pECCG117、谷氨酸棒状杆菌ATCC13869/SPL1-GFP、谷氨酸棒状杆菌ATCC13869/SPL7-GFP、谷氨酸棒状杆菌ATCC13869/SPL13-GFP和谷氨酸棒状杆菌ATCC13869/CJ4-GFP。
将通过上述转化获得的6种菌株(即ATCC13032/SPL7-GFP、ATCC13032/SPL13-GFP、ATCC13032/SPL1-GFP、ATCC13869/SPL7-GFP、ATCC13869/SPL13-GFP和ATCC13869/SPL1-GFP)分别命名为CA01-2301、CA01-2302、CA01-2303、CA01-2304、CA01-2305和CA01-2306，然后于2017年2月17日保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，登录号为KCCM11971P、KCCM11972P、KCCM11973P、KCCM11974P、KCCM11975P和KCCM11976P。
1-3.新型启动子的活性的确定
为了确定SPL1、SPL7和SPL13启动子的活性，将实施例1-2中获得的转化菌株(即谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/pECCG117、谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/CJ4-GFP、谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/SPL1-GFP、谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/SPL7-GFP、谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/SPL13-GFP、谷氨酸棒状杆菌ATCC13869/pECCG117、谷氨酸棒状杆菌ATCC13869/CJ4-GFP、谷氨酸棒状杆菌ATCC13869/SPL1-GFP、谷氨酸棒状杆菌ATCC13869/SPL7-GFP和谷氨酸棒状杆菌ATCC13869/SPL13-GFP)通过下述方法进行培养并测量其GFP活性。
将转化菌株接种到含有25mL培养基(葡萄糖(20g)、硫酸铵((NH4)2SO4)(5g)、酵母提取物(5g)、尿素(1.5g)、KH2PO4(4g)、K2HPO4(8g)、MgSO4·7H2O(0.5g)、生物素(150μg)、盐酸硫胺素盐(1.5mg)、泛酸钙(3mg)和烟酰胺(3mg)(基于1L蒸馏水)，pH7.2)的每个烧瓶中，并在30℃下振荡培养箱中培养20小时。通过离心(5,000rpm，15分钟)回收细菌细胞，用50mMTris-HCl(pH 8.0)缓冲液洗涤两次，并悬浮在相同缓冲液中。将玻璃珠添加至悬浮液(1.25g/1.5mL)，并使用珠磨器(bead beater)将细菌细胞粉碎6分钟。然后，使生成物进行离心(15,000rpm，20分钟)，从中回收上清液，并通过Bradford方法定量蛋白质的浓度。对于等量的细菌细胞提取物，根据Laure Gory等人介绍的方法(FEMS Microbiology Letters,194,127-133,2001)，在488nm处照射激发光，并使用LS-50B分光光度计(Perkin-Elmer)测量511nm处的发射光，并因此测得GFP基因的表达水平(表1)。
[表1]
菌株 荧光灵敏度
ATCC13032/pECCG117 0.0
ATCC13032/CJ4-GFP 850.2
ATCC13032/SPL1-GFP 3197.4
ATCC13032/SPL7-GFP 3097.7
ATCC13032/SPL13-GFP 3051.1
ATCC13869/pECCG117 0.0
ATCC13869/CJ4-GFP 921.7
ATCC13869/SPL1-GFP 3342.3
ATCC13869/SPL7-GFP 3425.5
ATCC13869/SPL13-GFP 3287.3
如上表1所示，所有SPL1、SPL7和SPL13都在两种不同种类的谷氨酸棒状杆菌中显示出其启动子活性，并且还显示出比已知为强启动子的pcj4启动子更高的荧光灵敏度。从这些结果中发现，SPL1、SPL7和SPL13是可以在谷氨酸棒状杆菌中表达目标基因的非常强的启动子。
实施例2.生产目标产物的能力的评价
2-1.生产阿洛酮糖的能力的评价
(1)包括SPL1和SPL7启动子序列的用于ATPE表达的载体和转化菌株的制备
使用SPL1和SPL7制备具有ATPE(源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的阿洛酮糖差向异构酶)的增强表达的用于棒状杆菌菌株的载体。通过使用pET24-ATPE-2载体(SEQ ID NO:8)作为模板，与SEQ ID NO:9和10的引物一起，进行PCR(94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟，30个反应循环)来扩增ATPE基因的开放阅读框(ORF)。用限制酶EcoRV和PstI处理实施例1中制备的扩增ATPE基因以及用于棒状杆菌菌株的pSPL1-GFP和pSPL7-GFP载体，并使用BD In-Fusion试剂盒将由PCR获得的ATPE-2与其可操作地连接，从而最终制得用于棒状杆菌菌株的pSPL1-ATPE-2和pSPL7-ATPE-2载体。
通过电穿孔将由此制得的pSPL1-ATPE-2和pSPL7-ATPE-2载体导入到ATCC13032菌株，从而制得SPL1-ATPE-2和SPL7-ATPE-2菌株。
(2)通过转化菌株生产阿洛酮糖的能力的评价
使用与实施例1相同组成的培养基培养通过以上程序制备的菌株，并对其ATPE活性进行测量。ATCC13032/pECCG117和ATCC13032/CJ4-ATPE-2用作对照组。
将菌株在置于30℃培养箱的固体LB培养基中培养过夜，并且将每个菌株的过夜培养物接种到25mL培养基中，并于30℃在振荡培养箱中培养24小时。将培养物离心并去除上清液。用EPPS溶液(pH 8.0)洗涤回收的细菌体，并将由此获得的微粒(pellet)溶解在EPPS溶液(pH 8.0)中。向其添加POESA(1mg/mL)，在室温下反应1小时，并离心。然后，将通过离心得到的最终微粒溶解在EPPS溶液(pH 8.0)中，向其添加作为底物的果糖溶液(350g/L)，在50℃反应3小时，并通过热处理终止反应。然后，通过离心回收上清液，并通过HPLC分析测量阿洛酮糖生产量(图1(A)、1(B)和1(C))。反应后的阿洛酮糖生产量显示在下表2中。
[表2]
菌株 果糖(g/L) 阿洛酮糖(g/L)
ATCC13032/pECCG117 348.7 0
ATCC13032/CJ4-ATPE-2 329.9 18.8
ATCC13032/SPL1-ATPE-2 263.2 79.2
ATCC13032/SPL7-ATPE-2 280.1 67.4
如表2所示，确定了与谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/CJ4-ATPE-2相比，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/SPL1-ATPE-2和ATCC13032/SPL7-ATPE-2的阿洛酮糖生产能力分别提高了321％和258％。从上述确定，当使用本公开的SPL1和SPL7启动子时，编码ATPE的基因的表达量增加，从而确定ATPE活性显著增加。
2-2.生产塔格糖的能力的评价
(1)包括SPL13启动子序列的用于UxaE表达的载体和转化菌株的制备
通过使用其中插入GFP的CJ4-GFP和实施例1中制备的SPL13-GFP克隆源自新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的塔格糖差向异构酶基因(UxaE)来制备用于棒状杆菌菌株的载体。通过使用pET28a-TN(m)载体(SEQ ID NO:11)作为模板，与SEQ ID NO:12和13的引物一起，进行PCR(94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟，30个反应循环)来扩增TN(m)基因的开放阅读框(ORF)。用限制酶EcoRV和PstI处理扩增的TN(m)基因以及用于棒状杆菌菌株的CJ4-GFP和SPL13-GFP载体，然后进行连接，从而最终制得用于棒状杆菌菌株的pCJ4-TN(m)和SPL13-TN(m)载体。
通过电穿孔将由此制得的pCJ4-TN(m)和pSPL13-TN(m)载体导入ATCC13032菌株，从而制得ATCC13032/CJ4-TN(m)和SPL13-TN(m)菌株。
(2)通过转化菌株生产塔格糖的能力的评价
在实施例1所述的相同培养基和培养条件下培养和预处理通过上述程序制备的菌株，得到用于激活UxaE的菌株。以与实施例2-1相同的方式，通过仅改变底物量、反应温度和时间(在添加果糖溶液(100g/L)后于60℃反应2小时)进行活性评价。然后，通过离心回收上清液，并通过HPLC分析测量塔格糖的生产量(图2(A)和2(B))。反应后的塔格糖生产量显示在下表3中。
[表3]
菌株 果糖(g/L) 塔格糖(g/L)
ATCC13032/pECCG117 100 0
ATCC13032/CJ4-TN(m) 92.2 6.9
ATCC13032/SPL13-TN(m) 82.7 16.8
如表3所示，与谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/CJ4-TN(m)相比，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/SPL13-TN(m)的塔格糖生产能力提高了143％。从上述确定，当使用本公开的SPL13启动子时，编码UxaE的基因的表达量增加，从而确定UxaE活性显著增加。
2-3.生产缬氨酸的能力的评价
(1)包括SPL7启动子序列的pECCG117-SPL7-ilvE载体和转化菌株的制备
为了确定作为L-氨基酸实例的L-缬氨酸生产能力，按如下制备pECCG117-CJ7-ilvE和pECCG117-SPL7-ilvE载体，以提高编码支链氨基酸转氨酶的ilvE(NCgl2123)(其是缬氨酸生物合成的主要基因)的酶活性。具体地，使用ATCC14067染色体作为模板，与SEQ IDNO:14和15的引物一起进行PCR(94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟，30个反应循环)，结果扩增出具有NCgl2123基因的5'末端的EcoRV限制位点和3'末端的PstI限制位点的大小为约1104bp的PCR片段。将由此获得的PCR片段纯化并分别与用EcoRV和PstI限制酶处理的pECCG117-CJ7-GFP(韩国专利号10-0620092)和pECCG117-SPL7-GFP混合，并使用In-fusion克隆试剂盒制备载体。将由此制得的载体分别命名为pECCG117-CJ7-ilvE和pECCG117-SPL7-ilvE。
SEQ ID NO:14 5’GAGATCAAAACAGATATCATGACGTCATTAGAGTTC 3’
SEQ ID NO:15 5’ATCCCCCGGGCTGCAGTTAGCCAACCAGTGGGTA 3’
通过电脉冲法将由此制得的pECCG117-CJ7-ilvE和pECCG117-SPL7-ilvE重组载体以及pECCG117载体转化到缬氨酸生产菌株，谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P(韩国专利号10-1117022)中，并在含有卡那霉素(25mg/L)的LB琼脂板中得到转化菌株。将由此获得的菌株分别命名为KCCM11201P/pECCG117、KCCM11201P/CJ7-ilvE和KCCM11201P/SPL7-ilvE。
(2)通过转化菌株生产缬氨酸的能力的评价
通过下述培养分析由3种不同种类的转化菌株生产L-缬氨酸的能力。
将一定量接种环中的每个菌株接种到含有25mL生产培养基的250mL角挡板(corner-baffle)烧瓶中，并于30℃在振荡培养箱(200rpm)中培养72小时。在培养完成后，通过HPLC(SHIMADZU LC-20AD)分析每种培养物中L-缬氨酸的浓度。
<生产培养基(pH 7.2)>
葡萄糖(50g)、(NH4)2SO4(20g)、玉米浸渍固体(Corn Steep Solid)(20g)、KH2PO4(1g)、MgSO4·7H2O(0.5g)、生物素(200μg)(基于1L蒸馏水)
重复进行上述培养和分析，并且分析的L-缬氨酸浓度显示在下表4中。
[表4]
如表4所示，确定了与导入已知启动子的谷氨酸棒状杆菌KCCM11201P/CJ7-ilvE相比，由导入本公开启动子的KCCM11201P/SPL7-ilvE菌株生产缬氨酸的能力提高了21.8％，另外，与对照组(KCCM11201P/pECCG117)相比，其提高了39.2％。从上述结果确定，SPL7启动子增强了ilvE基因的表达，从而显著增加由对应基因编码的酶的活性。
2-4.生产赖氨酸的能力的评价
(1)包括SPL13启动子序列的pDZTn-SPL13-gapN1载体和转化菌株的制备
为了确定作为L-氨基酸的代表性实例的L-赖氨酸生产能力，按如下制备载体，以提高源自已知链球菌突变体(Streptococcus mutant)的NADP依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GapN)的酶活性。
为了在棒状杆菌属微生物中插入转座基因NCgl2392，根据NIH(USA)的NIHGenbank，使用野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032作为模板，与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的以下引物一起，进行PCR(94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟，30个反应循环)，结果，扩增出包括NCgl2392基因的5'末端和3'末端的片段。使用pECCG122-Pcj7-gapN1载体(韩国专利号10-1182033)，与SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的以下引物一起，进行PCR(94℃30秒、55℃30秒、72℃2分钟，30个反应循环)，结果扩增出Pcj7-gapN1。使用pECCG122-Pcj7-gapN1载体和实施例1中制备的SPL13-GFP载体，与SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:21的以下引物一起，进行PCR(94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟，30个反应循环)，结果分别扩增出SPL13和gapN基因，并与上述制备的NCgl2392基因片段一起，将这些基因克隆到在谷氨酸棒状杆菌中不可复制的pDZ载体(韩国专利号0924065)中，由此制得pDZTn-Pcj7-gapN1和pDZTn-SPL13-gapN1载体。
通过电脉冲法(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541-545)使用具有增强的生产赖氨酸能力的KCCM11016P菌株(该微生物被公开为KFCC10881，重新保藏至布达佩斯条约下的国际保藏机构，并指定登录号为KCCM11016P；韩国专利号10-0159812)作为亲本菌株转化上述载体(pDZTn-Pcj7-gapN1和pDZTn-SPL13-gapN1)中的每一种，并在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基中获得转化菌株。为了选取其中通过二次重组法(secondaryrecombination process)(交换)在基因组中插入gapN1基因的菌落，使用SEQ ID NOS:20和21以及SEQ ID NOS:21和22的引物对获得分别插入Pcj7-gapN1和SPL13-gapN1基因的那些菌落。将由此获得的菌落分别命名为KCCM11016P/CJ7-gapN1和KCCM11016P/SPL13-gapN。
(2)通过转化菌株生产赖氨酸的能力的评价
通过下述培养分析由3种不同种类的转化菌株生产L-赖氨酸的能力。
将每个菌株接种到含有25mL种子培养基的250mL角挡板烧瓶中，并于30℃在振荡培养箱(200rpm)中培养20小时。然后，将1mL种子培养物接种到含有24mL生产培养基的250mL角挡板烧瓶中，并于30℃在振荡培养箱(200rpm)中培养72小时。通过HPLC(SHIMADZU，LC-20AD)分析每种培养物中的L-赖氨酸的浓度。
<种子培养基(pH 7.0)>
葡萄糖(20g)、蛋白胨(10g)、酵母提取物(5g)、尿素(1.5g)、KH2PO4(4g)、K2HPO4(8g)、MgSO4·7H2O(0.5g)、生物素(100μg)、盐酸硫胺素(1000μg)、泛酸钙(2000μg)、烟酰胺(2000μg)(基于1L蒸馏水)
<生产培养基(pH 7.0)>
葡萄糖(100g)、(NH4)2SO4(40g)、大豆蛋白(2.5g)、玉米浸渍固体(5g)、尿素(3g)、KH2PO4(1g)、MgSO4·7H2O(0.5g)、生物素(100μg)、盐酸硫胺素(1000μg)、泛酸钙(2000μg)、烟酰胺(3000μg)和CaCO3(30g)(基于1L蒸馏水)
重复进行上述培养和分析，并且分析的L-赖氨酸浓度显示在下表5中。
[表5]
如表5所示，确定了与导入已知启动子的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P/CJ7-gapN1相比，由导入本公开启动子的KCCM11016P/SPL13-gapN1菌株生产赖氨酸的能力提高了7.2％，另外，与对照组(KCCM11016P)相比，其提高了22.7％。从上述结果确定，SPL13启动子增强了gapN1基因的表达，从而显著增加由对应基因编码的酶的活性。
总结上述结果，与常规已知的启动子相比，本公开的SPL1、SPL7和SPL13启动子可以显著增强重组微生物中目标基因的表达。因此，本公开的启动子不仅可以提供有效的表达系统，而且可以有效地用于高产量生产目标产物(如糖类、功能性物质和氨基酸)的各种工业领域中。
序列表
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 新型启动子及其应用
<130> OPA17051-CN
<150> KR 10-2016-0111810
<151> 2016-08-31
<160> 14
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SPL1
<400> 1
ggcgcttcat gtcaacaatc tttaacgttt tcaagttcac aagtcgtgtt caaatggtga 60
caagattgga cactgtgctg aattggcacc aagccctcat aaatgataga tctaaatcga 120
atatcaatat atggtctgtt tattggaacg cgtcccagtg gctgagacgc atccgctaaa 180
gccccaggaa ccctgtgcag aaagaacaaa taatcgtgaa ttttggcagc aacagtgagt 240
cctgatacaa ttgaaaacgt gcaaaagcat aaattattgg aggagatcaa aaca 294
<210> 2
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SPL7
<400> 2
ggcgcttcat gtcaacaatc tttaacgttt tcaagttcac aagtcgtgtt caaatggtga 60
caagattgga cactgtgctg aattggcacc aagccctcat aaatgataga tctaaatcga 120
atatcaatat atggtctgtt tattggaacg cgtcccagtg gctgagacgc atccgctaaa 180
gccccaggaa ccctgtgcag aaagaacaaa taatcgtgaa ttttggcagc aacagcaatt 240
cctgctacaa ttgaaaacgt gcaaaagcat agattattgg aggagatcaa aaca 294
<210> 3
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SPL13
<400> 3
ggcgcttcat gtcaacaatc tttaacgttt tcaagttcac aagtcgtgtt caaatggtga 60
caagattgga cactgtgctg aattggcacc aagccctcat aaatgataga tctaaatcga 120
atatcaatat atggtctgtt tattggaacg cgtcccagtg gctgagacgc atccgctaaa 180
gccccaggaa ccctgtgcag aaagaacaaa taatcgtgaa ttttggcagc aacagcgggg 240
cctggtataa ttgaaaacgt gcaaaagcat agattattgg aggagatcaa aaca 294
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SPL引物-1
<400> 4
ggtaccggcg cttcatgtca acaatc 26
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SPL引物-2
<400> 5
gatatctgtt ttgatctcct ccaat 25
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP引物-1
<400> 6
gatatcatga gtaaaggaga aga 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP引物-2
<400> 7
ctgcagttat ttgtagagct cat 23
<210> 8
<211> 870
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pET24-ATPE-2
<400> 8
atgaaacacg gcatctatta ttcttactgg gaacatgagt ggagcgccaa gttcggtccc 60
tatatcgaga aggtcgccaa gctcggtttc gacatcctcg aagtcgccgc ccaccatatc 120
aacgaataca gcgacgccga actcgcgacc atcaggaaga gcgcgaagga taacggcatc 180
atcctcaccg ccggcatcgg tccgtcgaaa accaagaacc tgtcgtcgga agatgctgcg 240
gtgcgtgcgg ccggcaaggc gttctttgaa agaacccttt cgaacgtcgc caagctcgat 300
atccacacca tcggcggcgc attgcattcc tattggccaa tcgattattc gcagcccgtc 360
gacaaggcag gcgattatgc gcgcggcgtc gagggtatca acggcattgc cgatttcgcc 420
aatgatctcg gcatcaacct gtgcatcgaa gtcctcaacc gctttgaaaa ccacgtcctc 480
aacacggcgg cggaaggcgt cgcttttgtg aaggatgtcg gcaagaacaa tgtgaaagtc 540
atgctggata ccttccacat gaacatcgag gaagacagtt tcggtgacgc catccgcacg 600
gccggcccgc ttctggggca cttccatacc ggtgaatgca atcgccgcgt accgggcaag 660
ggcagaatgc cgtggcacga aatcggcctt gcgctgcgtg atatcaacta caccggcgcg 720
gtaatcatgg agcctttcgt caagacaggc ggcaccatcg gctcggatat caaggtgtgg 780
cgcgacctga gcggtggcgc cgacatcgcg aaaatggatg aagatgcccg caatgcgctg 840
gcattctccc gcttcgttct tggtggctga 870
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATPE引物-1
<400> 9
atctaggaga ttaagatatc atgaaacacg gcatctatta tt 42
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATPE引物-2
<400> 10
gtggatcccc cgggctgcag tcagccacca agaacg 36
<210> 11
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pET28a-TN(m)
<400> 11
atggtcttga aagtgttcaa agatcacttt ggaaggggat acgaagttta cgaaaagtct 60
tatagagaaa aggattctct ctctttcttc ttgacaaagg gagaggaagg aaaaattctg 120
gtagtggctg gagaaaaggc acctgagggt ctgtcgtttt tcaaaaaaca gcgggtggag 180
ggtgtttcgt tctttttctg tgagagaaat catgagaact tggaagttct cagaaaatac 240
tttccagatc tcaaaccagt tcgagcagga ttgagagcgt cttttggaac aggtgacaga 300
ctcggtatca ccacaccggc tcacgtgagg gcgttgaagg attcagggct ttttcccatc 360
tttgcgcagc aggacgtgag ggagaacgaa agaacgggaa ggacctggag agatgtgctg 420
gacgatgcca catggggagt tttccaggag ggatacagtg agggattcgg agcagacgcc 480
gatcacgcga agcggccgga ggatcttgtt tcggctgcaa gggaaggttt caccatgttc 540
acaatcgatc cttcgaatca tgtgaggaat ctttcaaaac tcagtgaaag agaaaagaac 600
gagatgttcg aggaaatact gaaaaaagag cgaatcgaca ggatctatct tgggaaaaaa 660
tacaccgtcc tcggtgaaag actggagttc gacgagaaaa atttgaggga tgctgctctg 720
gtgtactatg atgcgatcgc ccacgtggat atgatgtatc aaattttgaa agacgaaacc 780
ccggatatcg acttcgaagt gtcagttgac gaaacagaaa ctcccacgag tcctctcttc 840
cacattttcg ttgtggaaga actcagacga agaggtgtgg agttcaccaa tcttgccctg 900
agattcatcg gcgaatggga aaagggaata ggttacaagg gggatcttgc acagttcgag 960
agagaaatca aaatgcacgc agaaatcgca aggatgttcg aaggatacaa aatatcactc 1020
cactctggaa gcgacaaatt ttccgtgtat cctgcttttg cttccgcgac aggaggcctt 1080
ttccacgtga agacagccgg aacgagttat cttgaggcgg tgaaggtcat atccatggtc 1140
aacccggagc tcttccggga gatctacagg tgtgctctcg atcactttga ggaagacaga 1200
aagtcctatc acatatctgc ggatctgtcg aaagttccgg aagtagagaa agtgaaagat 1260
gaagatcttc caggtctttt tgaagacatc aacgtgagac agttgatcca tgtcacctat 1320
ggctctgttc tgaaagatgc atctttgaaa gaacggctgt ttaagacgct tgaacaaaat 1380
gaggaactct tctacgagac cgtggcaaaa catataaaaa ggcacgtaga cctgttgaag 1440
gggtgactcg agcaccacca ccaccaccac tga 1473
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TN(m)引物-1
<400> 12
gatatcatgg tcttgaaagt gttcaaag 28
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TN(m)引物-2
<400> 13
ctgcagtcac cccttcaaca ggtctacgtg 30
<210> 14
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP
<400> 14
atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60
gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120
aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180
gtcactactt tctcttatgg tgttcaatgc ttttcccgtt atccggatca tatgaaacgg 240
catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaacgcac tatatctttc 300
aaagatgacg ggaactacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360
aatcgtatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct cggacacaaa 420
ctcgagtaca actataactc acacaatgta tacatcacgg cagacaaaca aaagaatgga 480
atcaaagcta acttcaaaat tcgccacaac attgaagatg gatccgttca actagcagac 540
cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600
ctgtcgacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agcgtgacca catggtcctt 660
cttgagtttg taactgctgc tgggattaca catggcatgg atgagctcta caaataa 717

Claims (7)

1.核酸分子，其具有启动子活性，由选自SEQ ID NO:1至3的任何一个核苷酸序列组成。
2.基因表达盒，其包括权利要求1所述的核酸分子和目标基因。
3.重组载体，其包括权利要求1所述的核酸分子或权利要求2所述的基因表达盒。
4.棒状杆菌属的重组微生物，其包括权利要求1所述的核酸分子或权利要求3所述的载体。
5.根据权利要求4所述的重组微生物，其中所述棒状杆菌属的微生物是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenesis)。
6.生产目标产物的方法，包括：
(a)在培养基中培养权利要求4所述的重组微生物；和
(b)从所述微生物或所述培养基中回收目标产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述目标产物是阿洛酮糖、塔格糖或氨基酸。
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