KR101481142B1

KR101481142B1 - 코리네박테리아 발현용 합성프로모터

Info

Publication number: KR101481142B1
Application number: KR20130022691A
Authority: KR
Inventors: 정기준; 임성순; 안슬지
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2013-03-04
Filing date: 2013-03-04
Publication date: 2015-01-15
Also published as: KR20140110134A

Abstract

본 발명은 코리네박테리아 발현용 합성프로모터에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 코리네박테리아에서 높은 발현효율을 나타낼 수 있는 합성프로모터의 스크리닝 방법 및 상기 방법으로 제조된 코리네박테리아 발현용 합성프로모터에 관한 것이다.
본 발명의 프로모터를 사용하면, 기존의 코리네박테리움 속 균주에서 재조합 단백질 대량 생산에 사용되던 프로모터들에 비하여 훨씬 강한 유전자 발현을 나타내어, 코리네박테리움 속에서 생산되는 재조합 단백질을 보다 높은 수율로 생산할 수 있다.

Description

코리네박테리아 발현용 합성프로모터{Synthetic Promoter for Expressing Corynebacteria}

본 발명은 코리네박테리아 발현용 합성프로모터에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 코리네박테리아에서 높은 발현효율을 나타낼 수 있는 합성프로모터 및 그의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

현재 코리네박테리움 균주는 산업적으로 아미노산 생산에 가장 많이 이용되는 미생물로 1950년대 중반에 글루탐산을 효율적으로 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰이 발견되어 산업화가 이루어졌고, 코리네박테리움 글루타미쿰의 영양 요구성 변이주를 이용하여 발효법을 통해 글루탐산, 라이신, 페닐알라닌, 글루타민, 알지닌, 트립토판, 루이신, 이소루이신, 히스티딘 등이 산업적으로 생산되고 있다.

1980년대에는 대장균과 마찬가지로 코리네박테리움 균주를 위한 숙주-벡터 시스템이 개발되어 보다 합리적으로 균주 개발이 가능해졌고, 1990년대에는 다양한 대사공학 기술이 개발되어 코리네박테리움에 대한 분자생물학적 연구와 생리학적 연구가 집중되었다. 또한 대사흐름분석 및 대사조절분석과 같은 신기술이 목표 유전자를 선정하는데 적용되었으며, 복합적인 연구로부터 획득한 다양한 정보가 보다 우수한 생산 균주 개발에 접목이 되었다.

세포를 엔지니어링하는 데에는 다양한 관련 유전자의 발현 정도를 확실히 조절할 필요가 있고, 이러한 유전자 발현 조절은 다양한 효율적인 발현 시스템을 요구한다. 발현 시스템을 개발하는 데에는 프로모터의 선택이 가장 중요하게 여겨지는데 프로모터가 유전자의 발현정도와 발현조절에 상당히 크게 관여하기 때문이다. 코리네박테리움 글루타미쿰에서 이용가능한 프로모터로는 몇 가지가 보고되어 있는데 주로 코리네박테리움 유래 또는 대장균 유래의 프로모터들이다 (J. Biotechnol., 104:311-323, 2003).

그러나 대장균 유래의 프로모터는 발현유도인자의 낮은 투과성과 유전자 발현 억제 물질의 부재 등의 이유로 코리네박테리움에서 상대적으로 낮은 활성을 나타낸다. 또 같은 프로모터라 하더라도 목적단백질을 코딩하는 유전자에 따라 발현 효율이 제각각이며, 코리네박테리움에서 사용할 수 있는 프로모터들의 세기 또한 선택의 폭이 작아서 목적에 맞게 발현시스템을 제작하는 것이 용이하지 않다. 특히 대사경로의 구축과 같이 다양한 유전자들의 발현을 함께 조절해야 할 경우에 코리네박테리움에서는 대장균에서와 같이 다양한 선택을 할 수 있지 못한 것이 현실이다.

발현시스템 개발의 이와 같은 어려움을 해결하기 위해 합성 프로모터 라이브러리 기술들이 개발되어왔고, 대장균, 젖산균 등 다양한 미생물에서 합성 프로모터 라이브러리의 유용성이 확인되었다. 합성 프로모터 라이브러리는 프로모터에 해당하는 유전자 서열을 무작위 서열로 만들고 각각의 서열에 해당하는 프로모터의 활성 정도를 확인할 수 있는 효소나 형광 단백질과 같은 보고 단백질을 이용하는 기술이다. 합성 프로모터 라이브러리는 광범위한 세기를 보이는 다양한 프로모터들을 한번의 라이브러리 구축으로 쉽게 보유할 수 있다는 장점과 자연계에는 존재하지 않는 강한 활성을 보이는 프로모터를 발굴할 수 있다는 장점을 가진다.

본 발명에서는 코리네박테리움 균주에서 강하게 유전자 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 발굴하기 위하여 예의 노력한 결과, 녹색형광단백질을 리포터단백질로 이용하는 합성 프로모터 라이브러리를 구축하고, 상기 라이브러리로부터 형광활성 세포분류기를 이용하여 강한 활성을 보이는 합성 프로모터를 스크리닝하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 강한 활성을 보이는 합성 프로모터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 코리네박테리움 속의 발현용 강한 합성 프로모터의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 코리네박테리움 속 균주 발현용 프로모터, 상기 프로모터를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하여, 목적유전자에 의해 발현되는 목적단백질을 생산하는 단계; 및 상기 생산된 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) AGGA의 염기서열을 가지는 리보솜 부착 부위의 전방에 62 개의 랜덤 염기서열과 후방에 8 개의 랜덤 염기서열을 가지는 프로모터와 리포터 유전자를 함유하는 플라스미드 라이브러리를 제작하는 단계; (b) 상기 플라스미드 라이브러리를 코리네박테리움 속 균주에 형질전환시켜, 합성프로모터 스크리닝용 라이브러리를 제작하는 단계; (c) 합성프로모터 스크리닝용 라이브러리를 배양하여, 리포터 유전자의 발현량이 우수한 균주를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 수득된 균주가 함유하는 프로모터를 수득하는 단계를 포함하는 코리네박테리움 속의 발현용 강한 합성 프로모터의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 프로모터를 사용하면, 기존의 코리네박테리움 속 균주에서 재조합 단백질 대량 생산에 사용되던 프로모터들에 비하여 훨씬 강한 유전자 발현을 나타내어, 코리네박테리움 속에서 생산되는 재조합 단백질을 보다 높은 수율로 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 합성 프로모터 라이브러리의 벡터 시스템을 나타낸 것이다.
도 2는 형광 활성 세포 분류기를 통한 합성 프로모터 라이브러리의 스크리닝 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 합성 프로모터 라이브러리에서 발굴한 두 개의 강한 프로모터(H30 및 H36)에 의하여 발현되는 녹색형광단백질의 발현정도를 (a) 형광세기분석, (b) 웨스턴 블럿, (c) RT-PCR을 통하여 확인한 것이다(Negative: pCES208 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰, Positive: pCES208 벡터에 trc 프로모터와 녹색형광단백질을 연결한 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰).
도 4는 최종적으로 발굴한 두 개의 강한 합성 프로모터에 항체 단편(scFv)을 연결하여 발현양을 비교 분석한 것으로, (a)는 웨스턴 블럿 실험을 통해 합성 프로모터를 통한 항체 단편의 발현양을 비교 분석한 것이고(pCES208 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰: (1번 레인); pCES208 벡터에 trc 프로모터와 항체 단편을 연결한 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰:(2번 레인); 합성 프로모터에 항체 단편을 연결한 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰: (H30 (3번 레인), H36(4번 레인)), (b)는 효소결합 면역 흡착검사 (Enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해 합성 프로모터를 통한 항체 단편의 발현양 및 발현된 항체 단편의 활성을 분석한 것이며(pCES208 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰: (◇); pCES208 벡터에 trc 프로모터와 항체 단편을 연결한 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰:(■); 합성 프로모터에 항체 단편을 연결한 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰: (H30 (●), H36(△)) , (c)는 웨스턴 블럿 실험을 통해 합성 프로모터를 통한 항체 단편의 발현양을 비교 분석한 것이다(pCES208 벡터에 trc 프로모터와 항체 단편을 연결한 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰: (1번 레인); pCES208 벡터에 sod 프로모터와 항체 단편을 연결한 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰: (2번 레인); 합성 프로모터에 항체 단편을 연결한 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰: (H30 (3번 레인), H36 (4번 레인)).
도 5는 H30 및 H36 합성 프로모터에 자일라나아제를 연결하여 발현양을 비교 분석한 것으로, (a)는 SDS-PAGE를 통한 합성프로모터에 의한 자일라나아제의 발현양을 비교 분석한 것이다(pCES208 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰: (1번 레인); pCES208 벡터에 trc 프로모터와 자일라나아제를 연결한 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰: (2번 레인); 합성 프로모터에 자일라나아제를 연결한 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰: (H30 (3번 레인), H36 (4번 레인)). (b)는 DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) 측정법으로 자일라나아제의 자일란 분해 활성을 비교 분석한 것이다(pCES208 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰:(◇); pCES208 벡터에 porB 프로모터와 자일라나아제를 연결한 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰:(■); 합성 프로모터에 자일라나아제를 연결한 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰 :(H30 (●), H36(△)).
도 6은 H36 프로모터에 의해 발현되는 자일라나아제를 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 이용한 자일라나아제의 발효생산 결과를 나타낸 것으로, (a)는 발효에 따른 세포 성장곡선과 배지 내의 포도당 농도, 자일라나아제 단백질 발현양을 나타낸 것이고(세포 성장 곡선 :(●); 포도당 농도: (■); 자일라나아제 단백질 농도: (◇)), (b)는 시간별로 수득한 발효액의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 H36 합성 프로모터 유전자 서열 한 부분을 달리하였을 때의 녹색형광단백질의 발현양 및 전사량을 비교 분석한 것으로, (a)는 형광 활성 세포 분류기를 통해 H36 합성 프로모터의 내부 서열 한 부분이 A, T, G, C로 달라졌을 때의 연결된 녹색형광단백질의 발현양을 형광의 세기로 비교 분석한 것이고, (b)는 정량역전사 PCR 실험을 통해 H36 합성 프로모터의 내부 서열 한 부분이 A, T, G, C로 달라졌을 때의 연결된 녹색형광단백질 유전자의 전사량을 비교 분석한 것이다.

일 관점에서 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 가지는 코리네박테리움 속 균주 발현용 프로모터, 상기 프로모터를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.

서열번호 1: GGTACCAAAGTAACTTTTCGGTTAAGGTAGCGCATTCGTGGTGTTGCCCGTGGCCCGGTTGGTTGGGCAGGAGTATATTGGGATCC

본 발명의 프로모터는 강한 합성프로모터로, 코리네박테리움속 균주에서 기존에 사용되는 sod 프로모터나 porB 프로모터보다 월등히 높은 효율로 목적단백질을 발현할 수 있는 프로모터이다.

본 발명의 일양태에서는 코리네박테리움 속 균주에서 외래단백질을 높은 발현량으로 발현시킬 수 있는 강한 합성 프로모터를 스크리닝하기 위하여, AGGA의 염기서열을 가지는 리보솜 부착 부위의 전방에 62 개의 래덤 염기서열과 후방에 8 개의 랜덤염기 서열을 가지는 프로모터와 리포터 유전자로 녹색형광 단백질(GFP)을 함유하는 플라스미드 라이브러리를 제작하고, 상기 플라스미드 라이브러리를 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 형질전환시켜, 강한 합성프로모터 스크리닝용 라이브러리를 제작하고, 합성프로모터 스크리닝용 라이브러리의 코리네박테리움 균주를 배양한 후, 형광 활성 세포분류기를 이용하여, 높은 형광세기를 나타내는 균주를 선택하고, 이들 중 우수한 형광세기를 나타내는 균주를 선택하여, 상기 균주가 함유하고 있는 본 발명의 프로모터를 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 코리네박테리움 속 미생물인 것이 바람직하면, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰인것이 바람직하다.

다른 관점에서 본 발명은 서열번호 2의 염기서열을 가지는 코리네박테리움 속 균주 발현용 프로모터, 상기 프로모터를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.

서열번호 2:

GGTACCTCTATCTGGTGCCCTAAACGGGGGAATATTAACGGGCCCAGGGTGGTCGCACCTTGGTTGGTAGGAGTAGCAT N GGATCC

본 발명의 상기 프로모터는 서열번호 2의 N 서열에 A, T, G, C의 서열을 각각 가지는 서열번호 3~6에서 선택되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

용어 “벡터 (vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드 (plasmid)” 및 “벡터 (vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터를 포함할 수 있으며, 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 일양태로, (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있는 것이 바람직하다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터들은 여러 개의 제한효소 절단부위를 모아놓은 멀티클로닝사이트(MCS)를 포함하고 있는데 이들은 lacZ 유전자 내에 위치한다. MCS는 lacZ 유전자의 리딩 프레임(reading frame)을 파괴하지 않으므로 적당한 숙주세포에서는 lacZ의 발현이 이루어져 생물학적 활성을 지닌 베타-갈락토시다제 효소를 합성해낸다. 이 숙주세포를 무색 화학물질인 X-gal을 포함하는 배지에서 배양하면 이 효소에 의해서 X-gal이 분해되어 불용성의 청색물질을 만들게 된다. 그러므로 MCS에 외래 DNA의 삽입이 이루어지지 않은 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포 콜로니는 청색을 띈다. 반대로 MCS에 외래 DNA가 삽입되면 플라스미드 벡터의 lacZ 리딩 프레임이 깨지면서 베타-갈락토시다제가 만들어지지 않고 그 결과 무색의 숙주세포 콜로니가 형성된다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에서, 바람직한 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E.coli균주 DH5a, E.coli균주 JM101, E.coli K12균주 294, E.coli균주 W3110, E.coli균주 X1776, E.coli XL-1Blue(Stratagene) 및 E.coli B, 코리레박테리움 속 균주 등을 포함하며, 본 발명의 프로모터의 발현량 확인하고 목적단백질을 생산하는데 사용되는 가장 바람직한 숙주세포는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.

원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982))이 또한 이러한 세포들을 형질전환하는데 사용될 수 있다.

“발현 조절 서열 (expression control sequence)”이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다.

진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결 (operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 “발현 벡터”는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

본원 명세서에 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 코리네박테리움 속 균주 발현용 프로모터, 상기 프로모터를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 일양태(실시예 5)에서는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 프로모터의 특정 G 염기서열을, A, T, C로 치환시키고, 프로모터의 외래 유전자 발현능을 확인한 결과, 서열번호 3의 염기서열을 가지는 프로모터의 발현능과 유사한 정도의 발현능을 가지는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열과 90%이상 상동성을 가지는 프로모터가 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열과 유사한 외래유전자 발현능을 가진다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 코리네박테리움 속 균주 발현용 프로모터와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하여, 목적유전자에 의해 발현되는 목적단백질을 생산하는 단계; 및 상기 생산된 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) AGGA의 염기서열을 가지는 리보솜 부착 부위의 전방에 62 개의 래덤 염기서열과 후방에 8 개의 랜덤염기 서열을 가지는 프로모터와 리포터 유전자를 함유하는 플라스미드 라이브러리를 제작하는 단계; (b) 상기 플라스미드 라이브러리를 코리네박테리움 속 균주에 형질전환시켜, 합성프로모터 스크리닝용 라이브러리를 제작하는 단계; (c) 합성프로모터 스크리닝용 라이브러리를 배양하여, 리포터 유전자의 발현량이 우수한 균주를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 수득된 균주가 함유하는 프로모터를 수득하는 단계.를 포함하는 코리네박테리움 속의 발현용 강한 합성 프로모터의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 리포터유전자는 형광단백질, 항생제 내성단백질, 탄수화물 가수분해 효소 등으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일양태에서는 코리네박테리움 속 균주에서 외래단백질을 높은 발현량으로 발현시킬 수 있는 강한 합성 프로모터를 스크리닝하기 위하여, 프로모터 부위에 해당하는 70개 유전자 서열을 무작위 적으로 디자인하고, 그 뒤에 녹색형광 단배질을 프로모터 활성의 리포터 유전자로 연결하여, 합성 프로모터 라이브러리를 제작하였다, 구체적으로는 AGGA의 염기서열을 가지는 리보솜 부착 부위의 전방에 62 개의 랜덤 염기서열과 후방에 8 개의 랜덤염기 서열을 가지는 프로모터와 리포터 유전자로 녹색형광 단백질(GFP)을 함유하는 플라스미드 라이브러리를 대장균에서 제작하고, 상기 플라스미드 라이브러리를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주에 형질전환시켜, 합성프로모터 스크리닝용 라이브러리를 제작하고, 강한 합성프로모터 스크리닝용 라이브러리의 코리네박테리움 균주를 배양한 후, 형광 활성 세포분류기를 이용하여, 높은 형광세기를 나타내는 균주를 선택하고, 이들 중 우수한 형광세기를 나타내는 균주를 선택하여, 상기 균주가 함유하고 있는 본 발명의 프로모터를 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업게에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 프로모터 라이브러리의 제작

코리네박테리움에서 단백질의 대량생산에 사용될 수 있는 코리네박테리움 발현용 합성프로모터를 스크리닝하기 위한 라이브러리를 구축하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 프로모터 부분에 해당하는 70 개의 유전자 서열을 모두 무작위적으로 디자인하고, 녹색형광 단백질을 프로모터 활성의 리포터 단백질로 연결하여 합성프로모터 라이브러리 플라스미드를 제작하였다.

먼저 형질전환 효율이 높은 대장균 균주 Jude-1(Invitrogen)을 사용하여 라이브러리를 구축하였다. 구축한 라이브러리 플라스미드의 탈메틸화를 위해 대장균 균주 JM110(New England Biolabs)를 대장균 균주 Jude-1에서 구축한 라이브러리 플라스미드로 형질전환한 다음, 탈메틸화된 라이브러리 플라스미드로 최종 목표인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주에 형질 전환하였다. 구축한 합성 프로모터 라이브러리 플라스미드 시스템은 도 1에 나타내었다.

합성 프로모터 라이브러리의 모 벡터로는 대장균-코리네박테리움 셔틀 벡터 (shuttle vector)인 pCES208 (J. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)이 사용되었다.

합성 프로모터 라이브러리 부분 및 녹색형광단백질을 코딩하는 유전자 절편을 제작하는 방법으로는 PCR이 사용되었다. PCR을 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드들의 T_m 은 모두 55 ℃이상이 되도록 제작되었다.

먼저, 녹색형광단백질을 코딩하는 유전자 단편은 녹색형광단백질을 코딩하는 유전자를 주형으로 하고 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 진행하였다. PCR의 결과로 표지분자인 FLAG tag을 C-터미너스에 가지는 GFP를 코딩하는 DNA 서열이 얻어졌다.

서열번호 7:5'-GAGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGG-3'

서열번호 8:5'-GCGCGGCCGCTTATTTGTCATCGTCATCTTTATAATCGTCGACCT

TGGATAGTTCATC-3'

GFP 유전자의 주형으로는 pEGFP 플라스미드(제조사: Clontech)를 이용하였다.

합성 프로모터 라이브러리는 62 개의 N 염기 서열 뒤에 AGGA 리보솜 부착 부위 그리고 그 뒤에 8 개의 N 염기 서열이 디자인된 정방향 프라이머(서열번호 3)와 역방향 프라이머 (서열번호 4)를 사용하여 PCR을 통해 합성하였다.

서열번호 9:5'-GCAGGTACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGGANNNNNNNNGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3'

서열번호 10:5'-GTGCCATGCCCGAAGGTTATG-3'

상기 PCR에서 얻어진 녹색형광단백질과 모 벡터 pCES208을 제한효소 BamHI과 NotI으로 절단한 후 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션 하였고, 녹색형광단백질이 클로닝된 벡터와 합성 프로모터 라이브러리 유전자를 제한효소 KpnI과 NdeI으로 절단하고 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션 하여 합성 프로모터 라이브러리 플라스미드를 제조하였다.

상기 제조된 플라스미드를 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC 13032)에 형질전환하여 합성프로모터 라이브러리를 제조하였다.

실시예 2: 형광 활성 세포 분류기를 통한 합성 프로모터 라이브러리의 스크리닝

실시예 1에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 합성 프로모터 라이브러리를 BHI (Brain heart infusion) 배지에 접종하여 약 24시간동안 30℃, 200 RPM에서 배양한 후, 신선한 BHI 배지에 1/100의 부피만큼 옮겨져 동일 조건에서 24시간동안 배양하였다. 배양한 코리네박테리움 글루타미쿰을 6000rpm으로 5 분간 원심분리하여 균체를 수득한 후, PBS(phosphate buffered saline)에 현탁하여, 녹색형광단백질의 발현에 의하여 형광을 나타내는 세포를 형광활성 세포분류기를 통해서 스크리닝하였다. 상위 5% 미만의 강한 형광세기를 보이는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 분류하고, 분류한 코리네박테리움 글루타미쿰은 다시 신선한 BHI 배지에 배양하여 스크리닝을 반복하였다. 4회에 걸친 세포분류 스크리닝 이후 최종적으로 분류된 코리네박테리움 글루타미쿰은 고체 BHI agar 배지에서 배양하여, 콜로니를 수득하여, 분석하였다(도 2).

실시예 3: 최종적으로 발굴한 두 개의 강한 합성 프로모터의 녹색 형광단백질 발현을 통한 활성 분석

실시예 2에서 개별적인 콜로니 분석을 통하여 선정된 두개의 강한 합성 프로모터를 H30 및 H36으로 명명하고, 하기와 같이 서열을 분석하였다.

H30:GGTACCAAAGTAACTTTTCGGTTAAGGTAGCGCATTCGTGGTGTTGCCCGTGGCCCGGTTGGTTGGGCAGGAGTATATTGGGATCC(서열번호 1)

H36:GGTACCTCTATCTGGTGCCCTAAACGGGGGAATATTAACGGGCCCAGGGTGGTCGCACCTTGGTTGGTAGGAGTAGCATGGGATCC(서열번호 3)

상기 H30 및 H36 프로모터를 함유하는 플라스미드와 양성대조군인 trc 프로모터를 가지는 플라스미드를 이용하여, 리포터 단백질인 녹색형광 단백질의 발현에 따른 형광 세기, 발현양, 전사량을 비교 분석하였다.

pCES208 벡터를 가진 코리네박테리움, trc 프로모터에 녹색형광단백질이 연결된 유전자 단편이 클로닝된 벡터를 함유하는 코리네박테리움, H30과 H36 합성 프로모터에 녹색형광단백질이 연결된 유전자 단편이 클로닝된 벡터를 가진 코리네 박테리움은 BHI (Brain heart infusion) 배지에 접종하여, 24시간 동안 30℃, 200RPM에서 배양한 후, 신선한 BHI 배지에 1/100의 부피만큼 옮겨져 동일 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 각각의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 배양액을 6000 rpm으로 5 분간 원심분리하여 균체를 수득하고, PBS에 현탁하여 녹색형광 단백질의 발현량을 알아보기 위하여, 형광세기 분석 및 웨스턴 블럿을 수행하였다.

형광분석기를 이용한 형광세기 분석 결과, 도 3의 a에 나타난 바와 같이 합성프로모터 H30 및 H36을 함유한 플라스미드를 가진 코리네박테리움 균주가 양성대조군인 trc 프로모터를 함유한 코리네박테리움보다 월등히 높은 형광을 나타내었다.

웨스턴 블럿을 위하여, 상기 PBS에 현탁하여 수득된 균체에 pCES208 벡터를 가진 코리네박테리움, trc 프로모터에 녹색형광단백질이 연결된 유전자 단편이 클로닝된 벡터를 함유하는 코리네박테리움, H30과 H36 합성 프로모터에 녹색형광단백질이 연결된 유전자 단편이 클로닝된 벡터를 가진 코리네 박테리움 균주를 초음파로 용해시키고, 전세포 lysate로 웨스턴 블럿을 수행하여, 각각의 녹색형광단백질의 발현양을 비교 분석하였다.

웨스턴 블럿 실험에 사용한 항체는 Anti-FLAG M2 항체에 Horseradish peroxidase (HRP)가 연결된 항체 (Sigma-Aldrich, 미국)를 사용하였다.

그 결과, 도 3의 b에 나타난 바와 같이, trc 프로모터를 통한 녹색형광단백질의 발현양보다 H30 및 H36의 합성 프로모터를 통한 녹색형광단백질의 발현양이 더 많음을 확인하였다.

각각의 프로모터에 의하여 전사되는 mRNA의 양을 확인하기 위하여, RT-PCR을 수행하였다.

먼저, pCES208 벡터를 함유하는 코리네박테리움, trc 프로모터에 녹색형광단백질이 연결된 유전자 절편이 클로닝된 벡터를 함유하는 코리네박테리움, H30과 H36 합성 프로모터에 녹색형광단백질이 연결된 유전자 절편이 클로닝된 벡터를 가진 코리네 박테리움을 BHI 배지에 접종하여 24시간 동안 30℃, 200 RPM 에서 배양한 후, 신선한 BHI 배지에 1/100의 부피만큼 옮겨 동일조건에서 mid-exponentical phase까지 배양하였다. 배양된 각각의 코리네박테리움 균주를 Qiagen RNeasy Mini kit를 통해 total RNA를 분리하였고, 분리한 RNA를 One step SYBR PrimeScript RT-PCR kit(TAKARA Bio, 일본)와 Bio-Rad CFX Connect 기기(Bio-Rad, 미국)를 통해 정량 역전사 PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 3의 c에 나타난 바와 같이, 정량 역전사 PCR 결과로 trc 프로모터를 통한 전사량보다 H30과 H36의 전사량이 많음을 확인하였다.

실시예 4: 합성 프로모터를 통한 항체 단편 및 자일라나아제의 생산

합성 프로모터 H30과 H36에 분비 생산에 응용할 수 있는 porB 시그널 서열(signal sequence)을 연결하고 항체 단편을 코딩하는 유전자와 자일라나아제를 코딩하는 유전자를 연결하여 상기 두 단백질에 대해서 분비 생산에 응용하였다.

porB signal sequence에 연결된 항체 단편, porB signal sequence에 연결된 자일라나아제 유전자 절편을 제작하는 방법으로는 PCR이 사용되었다. PCR을 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드들의 T_m은 모두 55 ℃ 이상이 되도록 제작되었다.

우선 porB signal sequence에 연결된 항체 단편을 코딩하는 유전자 절편의 제조에는 항체 단편을 코딩하는 유전자를 주형으로 하고 하기 서열번호 11~12의 프라이머쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR의 결과로 표지분자인 FLAG tag을 C-터미너스에 가지는 항체 단편를 코딩하는 DNA 서열이 얻었다.

porB signal sequence 증폭을 위한 주형으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 크로모좀을 사용하였으며, 항체 단편을 코딩하는 유전자의 주형으로는 pMoPac16-M18 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 101:9193-9198, 2004) 플라스미드를 사용하였다.

서열번호 11:5'-TGGGATCCATGAAGCTTTCACACCGCATCGCAGCAATGGCAGCAACCGCAGGCATCACAGTGGCAGCATTCGCAGCACCTGCTTCCGCAATGGACATTCAGATGACCC-3'

서열번호 12:5'-GTGGCGGCCGCTTATCACTTATCATCGTCGTCCTTGTAGTCGGAAGACACGGTAACGGAGG-3'

pCES208벡터를 함유하는 코리네박테리움, trc 프로모터 및 sod 프로모터 (Gene ID: 3343659) 에 항체 단편이 연결된 유전자단편이 클로닝된 벡터를 함유하는 코리네박테리움, H30과 H36 합성 프로모터에 항체단편이 연결된 유전자 절편이 클로닝된 벡터를 가진 코리네 박테리움은 BHI 배지에 접종하여 24시간 동안 30℃, 200 RPM에서 배양하고, 신선한 BHI 배지에 1/100의 부피만큼 옮겨 동일 조건에서 24시간 배양하였다. 배양된 코리네박테리움 글루타미쿰을 13000 rpm으로 10 분간 원심분리한 후, 상층액에서 아세톤 침전방법을 통해서 단백질을 수득하였다. 상기 수득한 상층액 단백질 샘플로 웨스턴 블럿을 수행하여, 각각의 항체 단편의 발현양을 비교 분석하였다.

그 결과, 도 4의 a에 나타난 바와 같이, trc 프로모터를 통한 항체 단편의 발현양보다 H30 및 H36의 합성 프로모터를 통한 항체 단편의 발현양이 더 많음을 확인하였다.

또한, 도 4의 c에 나타난 바와 같이, trc와 sod 프로모터를 통한 항체 단편의 발현양보다 H30 및 H36의 합성 프로모터를 통한 항체 단편의 발현양이 더 많음을 확인하였다.

또한, 항체 단편의 활성과 상대적인 양을 비교 분석하기 위해 면역 흡착반응 실험을 수행하였다. 면역흡착 반응실험은 Jeong KJ 및 Rani M의 방법과 같이 진행하였다(Jeong KJ and Rani M., Bioprocess Biosyst Eng, 34(7):811, 2011). 항원 PA toxin의 초기 코팅 후 배양된 코리네 박테리움의 세포를 제외한 배양액이 반응에 이용되었고, 항체 단편 양 측정은 anti-FLAG M2 항체에 Horseradish peroxidase가 접합된 항체 (Sigma-Aldrich, 미국)를 이용하였다.

그 결과, 도 4의 b에 나타난 바와 같이, trc 프로모터로 생산된 항체 단편보다 합성 프로모터 H30과 H36을 통해 생산된 항체 단편의 양이 훨씬 많다는 것을 확인하였다.

또 porB signal sequence에 연결된 자일라나아제를 코딩하는 유전자 절편의 제조에는 자일라나아제를 코딩하는 유전자를 주형 (template)으로 하고 서열번호 12~13의 프라이머쌍을 사용하여 PCR을 진행하였다. PCR의 결과로 표지분자인 FLAG tag을 C-터미너스에 가지는 자일라나아제를 코딩하는 DNA 서열을 얻었다.

porB signal sequence의 주형으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 크로모좀 유전자의 정보를 바탕으로 유전자 자일라나아제 유전자는 스트렙토마이시트 코엘리컬러 A3(2)의 크로모좀 유전자(GenBank 등재번호 AL939125.1)를 주형으로 사용하였다.

서열번호 13:5'-TGGGATCCATGAAGCTTTCACACCGCATCGCAGCAATGGCAGCAACCGCAGGCATCACAGTGGCAGCATTCGCAGCACCTGCTTCCGCAGCCGAGAGCACGCTC-3'

서열번호 14'-CGCATATGCTATTAATGATGGTGATGGTGATGGGTGCGGGTCCAGC-3'

pCES208 벡터를 함유하는 코리네박테리움, porB 프로모터에 자일라나아제가 연결된 유전자 절편이 클로닝된 벡터를 함유하는 코리네박테리움, H30과 H36 합성 프로모터에 자일라나아제가 연결된 유전자 절편이 클로닝된 벡터를 가진 코리네박테리움을 BHI 배지에 접종하여, 24시간 동안 30℃, 200 RPM에서 배양한 후 신선한 BHI 배지에 1/100의 부피만큼 옮겨 동일 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 배양액을 13000 rpm으로 10 분간 원심분리하여, 상층액을 취하여, 아세톤 침전방법을 통해서 단백질을 수득하였다. 상기 수득된 단백질로 SDS-PAGE를 수행하여, 각각의 균주에서 생산된 자일라나아제의 양을 비교하였다. porB 프로모터를 통한 자일라나아제의 발현양보다 본 발명에 따른 합성 프로모터를 통한 자일라나아제의 발현양이 더 많음을 확인하였디(도 5a).

분비 생산된 자일라나아제의 활성 및 발현양 비교를 위하여 DNS 측정 실험을 통해서 자일라나아제 활성을 측정하였다. 각각의 코리네박테리움의 배양 상층액과 DNS 용액 (1 L 당 7.5 g 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS), 14 g NaOH, 216.1 g Rochelle salt, 5.4 mL phenol and 5.9 g Na₂S₂O₅)을 1:3으로 섞은 후 100℃에서 5분간 반응시키고 분광광도계를 통해 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 도 5의 b에 나타난 바와 같이, porB 프로모터를 통한 자일라나아제의 발현양보다 합성 프로모터인 H30과 H36의 발현양이 훨씬 높은을 확인하였다.

상기 실험을 통해 가장 강한 합성 프로모터로 H36 프로모터를 선정하였고, H36 프로모터에 자일라나아제가 연결된 벡터를 함유하는 코리네박테리움으로 발효 실험을 통해 자일라나아제의 대량생산을 하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 발효 실험을 통해 35.6 시간동안 자일라나아제 746 mg/L가 세포 외부로 분비 생산되었다.

실시예 5: 최종적으로 발굴한 가장 강한 합성 프로모터의 유전자 서열 염기 치환을 통한 활성의 변화 분석

최종적으로 발굴한 가장 강한 합성 프로모터 H36 프로모터의 임의의 한 부분을 정하여 그 부분을 A, T, G, C를 통해 치환하였고 그 각각의 치환된 프로모터의 활성 정도를 녹색형광단백질을 연결하여 그 단백질의 발현양과 형광 세기, 전사량을 통하여 비교 분석하였다.

H36 프로모터의 서열 치환은 PCR을 통하여 이루어졌다. 서열 3 (H36)의 염기서열을 주형으로 서열번호 15 및 16, 서열번호 15 및 17, 서열번호 15 및 18의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다.

서열번호 15: CGCGCAATTAACCCTC

서열번호 16: tGGATCCtATGCTACTC

서열번호 17: tGGATCCgATGCTACTC

서열번호 18: tGGATCCaATGCTACTC

상기 PCR에서 얻어진 서열이 치환된 H36 프로모터와 녹색형광단백질에 H36 프로모터를 연결한 벡터를 각각 제한효소 KpnI과 BamHI으로 절단한 후 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션 하여 서열이 치환된 H36 프로모터와 녹색형광단백질이 연결된 플라스미드 (H36_ATA, H36_ATC, H36_ATT)를 합성하였다.

상기 치환된 H36 프로모터의 서열은 서열번호 4~6와 같으며, 실시예 3과 동일한 방법으로 리포터 단백질인 녹색형광 단백질의 발현을 형광세기와, 정량분석을 수행하였다 (도 7).

도 7의 a와 b는 형광활성 세포분류기를 통해 H36 합성 프로모터의 내부 서열 한 부분이 A, T, G, C로 달라졌을 때의 연결된 녹색형광단백질의 발현양을 형광의 세기로 비교 분석한 것이다. 음성 대조군으로 pCES208 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Negative), 양성 대조군으로 pCES208 벡터에 trc 프로모터와 녹색형광단백질을 연결한 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Positive), 그리고 H36 합성 프로모터 유전자 서열 한 부분을 A, T, G, C로 달리하고 녹색형광단백질을 연결한 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰 (H36, H36_ATA, H36_ATC, H36_ATT)을 분석하였다.

도 7의 c는 정량역전사 PCR 실험을 통해 H36 합성 프로모터의 내부 서열 한 부분이 A, T, G, C로 달라졌을 때의 연결된 녹색형광단백질 유전자의 전사량을 비교 분석한 것이다. H36 합성 프로모터 유전자 서열 한 부분을 A, T, G, C로 달리하고 녹색형광단백질을 연결한 벡터를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰 (H36, H36_ATA, H36_ATC, H36_ATT)을 분석하였다.

그 결과, 치환된 서열을 가지는 프로모터도 우수한 발현량을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

서열번호 2:

H36_ATA(서열번호 4)

:GGTACCTCTATCTGGTGCCCTAAACGGGGGAATATTAACGGGCCCAGGGTGGTCGCACCTTGGTTGGTAGGAGTAGCAT a GGATCC

H36_ATT(서열번호 5)

:GGTACCTCTATCTGGTGCCCTAAACGGGGGAATATTAACGGGCCCAGGGTGGTCGCACCTTGGTTGGTAGGAGTAGCAT t GGATCC

H36_ATC (서열번호 6)

:GGTACCTCTATCTGGTGCCCTAAACGGGGGAATATTAACGGGCCCAGGGTGGTCGCACCTTGGTTGGTAGGAGTAGCAT c GGATCC

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Synthetic Promoter for Expressing Corynebacteria <130> P13-B040 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic promoter <400> 1 ggtaccaaag taacttttcg gttaaggtag cgcattcgtg gtgttgcccg tggcccggtt 60 ggttgggcag gagtatattg ggatcc 86 <210> 2 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic promoter <400> 2 ggtacctcta tctggtgccc taaacggggg aatattaacg ggcccagggt ggtcgcacct 60 tggttggtag gagtagcatn ggatcc 86 <210> 3 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic promoter <400> 3 ggtacctcta tctggtgccc taaacggggg aatattaacg ggcccagggt ggtcgcacct 60 tggttggtag gagtagcatg ggatcc 86 <210> 4 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic promoter <400> 4 ggtacctcta tctggtgccc taaacggggg aatattaacg ggcccagggt ggtcgcacct 60 tggttggtag gagtagcata ggatcc 86 <210> 5 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic promoter <400> 5 ggtacctcta tctggtgccc taaacggggg aatattaacg ggcccagggt ggtcgcacct 60 tggttggtag gagtagcatt ggatcc 86 <210> 6 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic promoter <400> 6 ggtacctcta tctggtgccc taaacggggg aatattaacg ggcccagggt ggtcgcacct 60 tggttggtag gagtagcatc ggatcc 86 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gaggatccat gagtaaagga gaagaacttt tcactgg 37 <210> 8 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcgcggccgc ttatttgtca tcgtcatctt tataatcgtc gaccttggat agttcatc 58 <210> 9 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gcaggtaccn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn naggannnnn nnnggatcca tgagtaaagg agaagaact 109 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gtgccatgcc cgaaggttat g 21 <210> 11 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tgggatccat gaagctttca caccgcatcg cagcaatggc agcaaccgca ggcatcacag 60 tggcagcatt cgcagcacct gcttccgcaa tggacattca gatgaccc 108 <210> 12 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gtggcggccg cttatcactt atcatcgtcg tccttgtagt cggaagacac ggtaacggag 60 g 61 <210> 13 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tgggatccat gaagctttca caccgcatcg cagcaatggc agcaaccgca ggcatcacag 60 tggcagcatt cgcagcacct gcttccgcag ccgagagcac gctc 104 <210> 14 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cgcatatgct attaatgatg gtgatggtga tgggtgcggg tccagc 46 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cgcgcaatta accctc 16 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tggatcctat gctactc 17 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tggatccgat gctactc 17 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tggatccaat gctactc 17

Claims

서열번호 1의 염기서열을 가지는 코리네박테리움 속 균주 발현용 프로모터.
제1항의 프로모터를 함유하는 재조합 벡터.
제2항에 있어서, 목적단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제3항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
제4항에 있어서, 코리네박테리움 속인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제4항 또는 제5항의 재조합 미생물을 배양하여, 목적단백질을 생산하는 단계; 및 상기 생산된 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법.
서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 코리네박테리움 속 균주 발현용 프로모터.
삭제
제7항의 프로모터를 함유하는 재조합 벡터.
제9항에 있어서, 목적유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제9항의 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
제11항에 있어서, 코리네박테리움 속인 것을 특징으로 하는 미생물.
제11항의 재조합 미생물을 배양하여, 목적단백질을 생산하는 단계; 및 상기 생산된 목적단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법.
다음 단계를 포함하는 코리네박테리움 속의 발현용 합성 프로모터의 스크리닝 방법.
(a) AGGA의 염기서열을 가지는 리보솜 부착 부위의 전방에 62 개의 랜덤 염기서열과 후방에 8 개의 랜덤염기 서열을 가지는 프로모터와 리포터 유전자를 함유하는 플라스미드 라이브러리를 제작하는 단계;
(b) 상기 플라스미드 라이브러리를 코리네박테리움 속 균주에 형질전환시켜, 합성프로모터 스크리닝용 라이브러리를 제작하는 단계;
(c) 합성프로모터 스크리닝용 라이브러리를 배양하여, 리포터 유전자의 발현량이 우수한 균주를 수득하는 단계; 및
(d) 상기 수득된 균주가 함유하는 프로모터를 수득하는 단계.
제14항에 있어서, 리포터유전자는 형광단백질, 항생제 내성단백질 및 탄수화물 가수분해 효소로 구성된 군에서 선택되는 단백질을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
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