CN114231476B

CN114231476B - 一种d-乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌工程菌及其应用

Info

Publication number: CN114231476B
Application number: CN202111489755.9A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 杨谨华; 吉晓梅; 陈坚; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-12-08
Filing date: 2021-12-08
Publication date: 2023-09-08
Anticipated expiration: 2041-12-08
Also published as: CN114231476A

Abstract

本发明公开了一种D‑乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌工程菌及其应用，属于微生物工程技术领域。本发明以编码氢化酶镍掺入蛋白HypB和氢化酶表达/形成蛋白HypC的基因为目的基因，以大肠杆菌为表达宿主，成功构建了一种可广泛应用于制备药品、饲料以及化学品的大肠杆菌工程菌；此大肠杆菌工程菌的D‑乳酸胁迫抗性得到了显著提高，较野生菌株最高提高了336.3倍。采用本发明的方法在D‑乳酸生产菌的发酵中，当pH控制在5.5的情况下，最终D‑乳酸产量较对照提高了113.6％。

Description

一种D-乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种D-乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌工程菌及其应用，属于微生物工程技术领域。

背景技术

大肠杆菌是原核生物中一种重要的宿主菌。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。目前，已有多种高价值的有机酸生物发酵方法成功应用，其中也有人尝试以大肠杆菌为宿主来表达，但是常常存在酸胁迫的问题。

高光学纯度D-乳酸(97％以上)作为一个手性中心是多种手性物质的前体，是重要的手性中间体与有机合成原料，广泛应用于制药、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成，并且D-乳酸也是生物塑料聚乳酸的原料。目前发酵法制备乳酸以其绿色、高效、环保，在工业上具有广泛的应用前景，虽然在大肠杆菌中有固有的乳酸生成途径，可通过乳酸脱氢酶(LdhA)将丙酮酸转化为乳酸，不需要额外引入异源LdhA来产生乳酸，但是由于大肠杆菌系统存在酸胁迫的问题，而制约着乳酸的产量的提高。

但是大肠杆菌本身存在对有机酸耐受性不高的限制发展因素，大肠杆菌适应生长环境为中性，而约50g·L^-1的有机酸即会使环境pH降低至pH 2.0左右，这对大肠杆菌的生长是一种考验。

对于酸胁迫，为维持大肠杆菌发酵生产目的蛋白的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在大肠杆菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(碳酸钙)来控制发酵环境的pH值。然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。

目前，提高大肠杆菌的酸胁迫抗性的方法则主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低是其主要缺点，且诱变后的菌种容易退化；(2)代谢工程策略，目前利用代谢工程策略提高大肠杆菌环境胁迫的方法主要包括构建新的代谢途径、拓展已有代谢途径和削弱已有代谢途径，但是，此方法存在成本高、成功率低的问题。

因此，急需找到一种新的效果优异、遗传稳定性好、成本低、成功率高、并且操作简单的可提高大肠杆菌酸胁迫性的方法。

发明内容

为了得到一种新的效果优异、遗传稳定性好、成本低、成功率高、并且操作简单的可提高大肠杆菌酸胁迫性的方法，本发明提供了一种大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌同时过表达了氢化酶镍掺入蛋白HypB和氢化酶表达/形成蛋白HypC。

在本发明的一种实施方式中，所述氢化酶镍掺入蛋白HypB的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示，所述氢化酶表达/形成蛋白HypC的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌以大肠杆菌E.coli K12MG1655为表达宿主，或以敲除了E.coli K12 MG1655基因组中的pflB，adhE和frdA基因的工程菌株(构建方法公开于ATP limitation in a pyruvate formate lyase mutant ofEscherichia coli MG1655 increases glycolytic flux to D-lactate论文)为表达宿主；。

在本发明的一种实施方式中，所述氢化酶镍掺入蛋白HypB和氢化酶表达/形成蛋白HypC来源于大肠杆菌E.coli K12 MG1655。

在本发明的一种实施方式中，编码所述氢化酶镍掺入蛋白HypB核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述氢化酶表达/形成蛋白HypC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，以pTrc99a为表达载体。

本发明还提供了一种组合蛋白在提高大肠杆菌的乳酸胁迫抗性中的应用，所述应用是在大肠杆菌中过表达组合蛋白，所述组合蛋白为氢化酶镍掺入蛋白HypB和氢化酶表达/形成蛋白HypC。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌E.coli K12 MG1655，或敲除了E.coli K12 MG1655基因组中的pflB，adhE和frdA基因的工程菌株。

在本发明的一种实施方式中，编码所述氢化酶镍掺入蛋白HypB和氢化酶表达/形成蛋白HypC的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种提高大肠杆菌乳酸胁迫抗性的方法，在大肠杆菌中串联过量表达氢化酶镍掺入蛋白HypB和氢化酶表达/形成蛋白HypC。

在本发明的一种实施方式中，所述氢化酶镍掺入蛋白HypB和氢化酶表达/形成蛋白HypC的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述氢化酶镍掺入蛋白HypB和氢化酶表达/形成蛋白HypC基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述过量表达为先通过编码氢化酶镍掺入蛋白HypB和氢化酶表达/形成蛋白HypC基因与表达载体，构建含有氢化酶镍掺入蛋白HypB和氢化酶表达/形成蛋白HypC基因的重组质粒，再将重组质粒导入大肠杆菌中。

本发明还提供了一种乳酸的制备方法，所述方法为，采用重组大肠杆菌发酵制备得到，所述重组大肠杆菌为：以敲除了E.coli K12 MG1655基因组中的pflB，adhE和frdA基因的工程菌株为表达宿主，同时过表达了氢化酶镍掺入蛋白HypB和氢化酶表达/形成蛋白HypC；所述氢化酶镍掺入蛋白HypB的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述氢化酶表达/形成蛋白HypC的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供上述一种酸胁迫抗性提高的大肠杆菌工程菌在发酵生产代谢产物中的应用，所述代谢产物是参与有机酸代谢的物质。

在本发明的一种实施方式中，所述代谢产物是甲酸、乙酸、乳酸。

本发明还提供了一种抗酸胁迫元器件，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.6的氢化酶镍掺入蛋白HypB和氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示氢化酶表达/形成蛋白HypC。

本发明还提供了上述抗酸胁迫元器件在提高大肠杆菌制备乳酸产量中的应用，所述大肠杆菌为以敲除了E.coli K12 MG1655基因组中的pflB，adhE和frdA基因的工程菌株。

有益效果

(1)本发明通过在大肠杆菌中串联过量表达HypB和HypC蛋白，得到了酸胁迫抗性显著提高的重组大肠杆菌E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypB-HypC；本发明的操作简单，可广泛的应用到工业生产中。

(2)利用本发明的方法得到的重组大肠杆菌E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypB-HypC对酸胁迫抗性较对照菌株有了明显的提高，其对D-乳酸的抗性是对照菌株的336.3倍。

(3)利用本发明的方法，使MG1655基因组中靶基因pflB，adhE和frdA基因缺失后得到工程菌株E.coli K12 LBBE317，制备得到一株可生产D-乳酸的重组菌株，在E.coli K12LBBE317菌株中过表达HypB和HypC基因后，其产物D-乳酸的产量比原始菌株E.coli K12LBBE317提升了113.6％，且副产物含量减少。

(4)本发明的抗酸元器件中，抗酸蛋白的过表达可能完全不会影响菌株原有的代谢能力，反之，极大的提高了菌株的代谢能力，能够广泛的应用于工业生产当中。

附图说明

图1：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypB-HypC和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在正常条件下的生长曲线图。

图2：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypB-HypC和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在D-乳酸胁迫(pH 4.0)耐受性试验的存活率图。

图3：重组菌株E.coli K12 LBBE317/pTrc99a-HypB-HypC和对照菌株E.coliK12LBBE317/pTrc99a在D-乳酸发酵(pH 5.5)下的生产情况。

具体实施方式

下述实施例中涉及的E.coli K12 MG1655菌株购自北京百欧博伟生物技术有限公司，pTrc99a载体购自武汉淼灵生物科技有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB固体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g·L^-1、酵母粉(Oxoid)5g·L^-1、氯化钠10g·L^-1及琼脂粉20g·L^-1。

LB液体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g·L^-1、酵母粉(Oxoid)5g·L^-1、氯化钠10g·L^-1。

D-乳酸LB液体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g·L^-1、酵母粉(Oxoid)5g·L^-1、氯化钠10g·L^-1，pH 4.0(D-乳酸调节)。

AM2培养基：补充100g·L^-1的葡萄糖(pH用NH₃·H₂O调节至7.0)和(每升)2.63g(NH₄)₂HPO₄、0.87g NH₄H₂PO₄、0.5g酵母粉(Oxoid)，1.0mL MgSO₄.7H₂O(1M)，1.0mL甜菜碱(1M)，1.5mL微量元素溶液，1.0mL KCl(2M)。微量元素溶液(每升)含1.6克FeCl₃、0.2克CoCl₂·6H₂O，0.1克CuCl₂、0.2克ZnCl₂·4H₂O，0.2克Na₂MoO₄、0.05克H₃BO₃和0.33克MnCl₂·4H₂O。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

细胞生长密度检测：使用分光光度计检测，将菌液稀释合适的倍数，使吸光度(OD₆₀₀)介于0.2-0.8之间，再乘稀释倍数，得到最终值为细胞生长密度值。

代谢产物检测：通过高效液相色谱HPLC法在安捷伦Agilent 1260仪器完成检测。

大肠杆菌活菌数的测定方法：

分别将胁迫0h，1h，2h，3h，4h后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点，并接种于LB固体培养基上测定活菌数。活菌数选取当前稀释梯度中，单菌落数介于30-300之间的稀释梯度，并计数。

实施例1：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypB-HypC的构建

具体步骤如下：

(1)基于NCBI数据库中的hypB，hypC基因序列(氢化酶镍掺入蛋白HypB和氢化酶表达/形成蛋白HypC基因，参与氢化酶合成途径，调控氢气与质子的可逆催化，所述编码氢化酶镍掺入蛋白HypB和氢化酶表达/形成蛋白HypC的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示)设计分别如SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物pTrc99a/HypB-F，pTrc99a/HypB-R，pTrc99a/HypC-F，pTrc99a/HypC-R；

(2)设计分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物环p-pTrc99a-F，环p-pTrc99a-R；

(3)以E.coli K12 MG1655的基因组为模板，以pTrc99a/HypB-F，pTrc99a/HypB-R为引物通过PCR扩增获得SEQ ID NO.1所示的基因片段；以pTrc99a/HypC-F，pTrc99a/HypC-R为引物通过PCR扩增获得SEQ ID NO.2所示的基因片段；

(4)以载体pTrc99a为模板，以环p-pTrc99a-F，环p-pTrc99a-R为引物通过PCR扩增获得载体线性化的长片段；

(5)将步骤(3)和(4)中获得的PCR产物进行连接，得到连接产物，然后将连接产物转化大肠杆菌E.coli K12 MG1655感受态，得到转化产物，将转化产物接种至含有浓度为100ng·mL^-1的氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证片段大小正确后，再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pTrc99a-HypB-HypC的重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypB-HypC。

(6)基于以上相同的方法，将空载质粒转化大肠杆菌E.coli K12 MG1655，构建对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a。

实施例2：重组菌株和对照菌株在正常条件下的生长情况

(1)将实施例1中得到的重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypB-HypC和对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a分别接种于LB液体培养基中进行活化，放在37℃摇床中220rpm培养12h，得到种子液；

(2)分别以2％(v/v)的接种量将上述步骤(1)中得到的种子液转接至LB液体培养基中，放在37℃摇床中220rpm培养；每隔2小时取样，测定600nm波长下的OD值，绘制生长曲线(绘制得到的生长曲线如图1)。

结果如图1所示，经生长性能试验分析，培养10h后，重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypB-HypC的生长情况与对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a无明显差异，说明在E.coli MG1655中过量表达HypB-HypC蛋白对菌株的生长性能没有影响。

实施例3：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypB-HypC在D-乳酸胁迫(pH4.0)耐受性试验

具体步骤如下：

(1)将实施例1中得到的对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a和重组菌株E.coliK12 MG1655/pTrc99a-HypB-HypC分别接种于LB液体培养基中，在37℃，220rpm条件下培养12h，得到种子液；

(2)分别以2％(v/v)的接种量将上述(1)中得到的种子液转接至新鲜的LB液体培养基中，37℃摇床中220rpm培养4.5h，培养至对数生长中期，此时的OD₆₀₀为1.4～1.5，得到发酵液；

(3)将步骤(2)中得到的发酵液在6000rpm条件下离心5min，收集菌体，将得到的菌体经等体积的生理盐水洗涤两次后，重悬于等体积的新鲜的D-乳酸LB液体培养基(pH 4.0)中，胁迫不同时间；

分别将胁迫0h，1h，2h，3h，4h后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点，并接种于LB固体培养基上测定活菌数和存活率。

存活率＝(N/N₀)×100％；

其中，N₀是未经酸胁迫处理的菌悬液在平板上的活菌数；N是胁迫后平板上长出的活菌数，结果如图2和表1～2所示。

表1酸胁迫处理的菌悬液在平板上的活菌数

表2重组菌株和对照菌株在D-乳酸胁迫(pH 4.0)耐受性试验的存活率

结果显示，经耐受性实验分析，胁迫4h后，E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypB-HypC存活率为对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a的336.3倍，可见，E.coli K12 MG1655中过量表达HypB-HypC蛋白，重组菌株对D-乳酸胁迫的耐受性提高。

实施例4：重组菌株E.coli K12 LBBE317/pTrc99a-HypB-HypC的构建

具体步骤如下：

(1)构建D-乳酸生产菌株大肠杆菌E.coli K12 LBBE317：

选择λ-Red同源重组系统，通过设计引物以扩增FRT-Kan-FRT或FRT-spe-FRT使MG1655基因组中靶基因pflB，adhE和frdA基因缺失，构建为LBBE317菌株，最终消除所有抗生素标记(构建方法公开于ATP limitation in a pyruvate formate lyase mutant ofEscherichia coli MG1655 increases glycolytic flux to D-lactate论文)。

(2)分别将实施例1中得到的重组质粒pTrc99a-HypB-HypC和pTrc99a转化至D-乳酸生产菌株大肠杆菌E.coli K12 LBBE317感受态，得到转化产物，将转化产物接种至含有氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆。

(3)将阳性克隆分别接种于LB液体培养基中进行活化，放在37℃摇床中220rpm培养过夜，分别得到重组菌株E.coli K12 LBBE317/pTrc99a和E.coli K12 LBBE317/pTrc99a-HypB-HypC。

实施例5：重组菌株E.coli K12 LBBE317/pTrc99a-HypB-HypC在D-乳酸发酵实验中(pH 5.5)试验

本实施例选择pH5.5的D-乳酸做耐受性试验，原因如下：通过以上实施例的分析，共表达组合HypB-HypC被证明在酸致死胁迫条件pH 4.0下可一定程度上延长细胞的存活，是一种有效的新型抗酸元器件，这为其被应用于有机酸的生产提供了可能性，众所周知，在有机酸生产中，为缓解由产物积累引起的培养环境酸化对细胞生理活性和产能的损伤，通常工业中会选择添加CaCO₃，Ca(OH)₂等中和剂，这对于细胞而言又增加了一重渗透压风险，所以，一株能够有效抵御产物胁迫且不影响细胞生长代谢的生产菌株至关重要。

具体步骤如下：

(1)将实施例4制备得到的重组细胞E.coli K12 LBBE317/pTrc99a和E.coli K12LBBE317/pTrc99a-HypB-HypC在pH 7.0条件下进行预培养，然后转移到150mL新鲜LB培养基(在1000mL烧瓶中)中，在37℃下以220rpm摇动孵育9小时后，得到种子液；

(2)将制备得到的种子液以5％(v/v)的接种量(此时，OD₆₀₀为0.08)转接至5L生物反应器中(Bioflow110；New Brunswick Scientific Co)，其中，生物反应器中含有3L AM2培养基和20g·L^-1葡萄糖，在37℃下，采用分批补料发酵模式进行两阶段发酵：

有氧阶段：通气量设为3L min^-1，搅拌速度为400～600rpm，控制pH 7.0，有氧生长14小时后，过渡到产酸阶段。

产酸阶段：将搅拌速度降低至100rpm，停止通风，并添加121g葡萄糖(50％w/v)，使用15％的氨水将pH控制在5.5。

其中，当残留葡萄糖浓度低于10g·L^-1时，添加剩余葡萄糖，添加的葡萄糖总量为300g，当葡萄糖利用率低于0.2g·L^-1·h^-1时停止发酵。

(3)发酵结束后，通过高效液相色谱HPLC法在安捷伦Agilent 1260仪器完成检测主产物D-乳酸，代谢副产物乙酸和琥珀酸的含量，以评估抗酸元器件HypB-HypC在有机酸生产中的应用潜力，对其是否可以通过对产物D-乳酸的耐受性以提高在由D-乳酸堆积酸化的发酵环境中具备更好的生产效果，从而达到降低成本的作用。

结果如图3所示，搭载了串联表达氢化酶辅助蛋白HypB-HypC的生产菌株E.coliK12 LBBE317/pTrc99a-HypB-HypC在pH 5.5时仍可以保持一定的产酸活性，最终D-乳酸盐产量为20.3g·L^-1，相对对照E.coli K12 LBBE317/pTrc99a的D-乳酸盐产量9.5g·L^-1提升了113.6％，且副产物含量减少。同时，在约相同酸产量在控制pH 7.0的情况下，氨水量用量约减少35％。

对比例1：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypB和重组菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a-HypC在D-乳酸胁迫(pH 4.0)耐受性试验

(1)重组菌株的构建：

具体实施方式同实施例1，区别在于，分别将SEQ ID NO.1所示的基因片段、SEQ IDNO.2所示的基因片段与载体线性化片段连接，分别得到连接产物pTrc99a-HypB、pTrc99a-HypC；

将上述重组载体pTrc99a-HypB、pTrc99a-HypC转化至大肠杆菌E.coli K12MG1655感受态；最终获得重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypB和重组菌株E.coliK12 MG1655/pTrc99a-HypC。

(2)重组菌株在D-乳酸胁迫耐受性试验

具体实施方式同实施例3，重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypB和重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypC在D-乳酸胁迫(pH 4.0)耐受性试验，区别在于，调整菌株分别为：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypB和重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-HypC。

结果如下表3～4所示：

表3酸胁迫处理的菌悬液在平板上的活菌数

表4重组菌株和对照菌株在D-乳酸胁迫(pH 4.0)耐受性试验的存活率

结果显示，在E.coli K12 MG1655宿主细胞中，只表达HypB基因或HypC基因的效果，均没有同时过表达HypB和HypC得到的重组菌株，对D-乳酸胁迫(pH 4.0)耐受性强。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种D-乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌工程菌及其应用

<130> BAA210610A

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<170> PatentIn version 3.3

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atgtgtacaa catgcggttg cggtgaaggc aacctgtata tcgagggtga tgaacataac 60

cctcattccg cgtttcgtag cgcgccattt gccccggcgg cacgcccgaa gatgaaaatc 120

accggcatta aagcgcctga atttaccccc agccagactg aagaaggcga cctgcattac 180

ggtcatggcg aagcgggcac tcacgcaccg ggcatgagcc agcgtcggat gctggaagtc 240

gaaattgacg tgctggacaa aaataaccgt ctggctgaac gcaaccgcgc gcgctttgct 300

gcccgcaagc aactggtgct caacctggtt tccagccctg gttccggtaa aaccaccctg 360

ctgacggaaa ccctaatgcg cctgaaagac agcgttccgt gcgcagttat tgaaggcgac 420

cagcaaaccg tgaacgatgc cgcacgcatt cgcgctaccg gcacaccagc gattcaggtg 480

aacaccggta aaggctgcca tcttgacgca cagatgattg ccgacgccgc accgcgtctg 540

ccactggacg ataacggtat tctgtttatc gaaaacgttg gcaacctcgt atgcccggcc 600

agcttcgatc tcggtgaaaa acacaaagtg gcggtgcttt ccgttaccga aggtgaagac 660

aaaccactga aatatccgca tatgtttgcc gccgcctcgc tgatgctgct caacaaagtt 720

gacctgttgc cgtatctcaa ctttgacgtt gaaaagtgca tcgcctgcgc ccgcgaagtc 780

aatccagaaa ttgaaatcat ccttatttcc gccaccagcg gcgaagggat ggaccagtgg 840

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gtctgcggca ttcagcgcga tgtcgattta acgttagtcg gcagctgcga tgaaaacggt 120

cagccgcgcg tgggccagtg ggtactggta cacgttggct ttgccatgag cgtaattaat 180

gaagccgaag cacgcgacac tctcgacgcc ttacaaaaca tgtttgacgt tgagccggat 240

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<213> 人工序列

<400> 8

gaattccatg gtctgtttcc tg 22

<210> 9

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Cys Thr Thr Cys Gly Cys Gly Glu Gly Asn Leu Tyr Ile Glu Gly

1 5 10 15

Asp Glu His Asn Pro His Ser Ala Phe Arg Ser Ala Pro Phe Ala Pro

20 25 30

Ala Ala Arg Pro Lys Met Lys Ile Thr Gly Ile Lys Ala Pro Glu Phe

35 40 45

Thr Pro Ser Gln Thr Glu Glu Gly Asp Leu His Tyr Gly His Gly Glu

50 55 60

Ala Gly Thr His Ala Pro Gly Met Ser Gln Arg Arg Met Leu Glu Val

65 70 75 80

Glu Ile Asp Val Leu Asp Lys Asn Asn Arg Leu Ala Glu Arg Asn Arg

85 90 95

Ala Arg Phe Ala Ala Arg Lys Gln Leu Val Leu Asn Leu Val Ser Ser

100 105 110

Pro Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Leu Thr Glu Thr Leu Met Arg Leu

115 120 125

Lys Asp Ser Val Pro Cys Ala Val Ile Glu Gly Asp Gln Gln Thr Val

130 135 140

Asn Asp Ala Ala Arg Ile Arg Ala Thr Gly Thr Pro Ala Ile Gln Val

145 150 155 160

Asn Thr Gly Lys Gly Cys His Leu Asp Ala Gln Met Ile Ala Asp Ala

165 170 175

Ala Pro Arg Leu Pro Leu Asp Asp Asn Gly Ile Leu Phe Ile Glu Asn

180 185 190

Val Gly Asn Leu Val Cys Pro Ala Ser Phe Asp Leu Gly Glu Lys His

195 200 205

Lys Val Ala Val Leu Ser Val Thr Glu Gly Glu Asp Lys Pro Leu Lys

210 215 220

Tyr Pro His Met Phe Ala Ala Ala Ser Leu Met Leu Leu Asn Lys Val

225 230 235 240

Asp Leu Leu Pro Tyr Leu Asn Phe Asp Val Glu Lys Cys Ile Ala Cys

245 250 255

Ala Arg Glu Val Asn Pro Glu Ile Glu Ile Ile Leu Ile Ser Ala Thr

260 265 270

Ser Gly Glu Gly Met Asp Gln Trp Leu Asn Trp Leu Glu Thr Gln Arg

275 280 285

Cys Ala

290

<210> 10

<211> 90

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Cys Ile Gly Val Pro Gly Gln Ile Arg Thr Ile Asp Gly Asn Gln

1 5 10 15

Ala Lys Val Asp Val Cys Gly Ile Gln Arg Asp Val Asp Leu Thr Leu

20 25 30

Val Gly Ser Cys Asp Glu Asn Gly Gln Pro Arg Val Gly Gln Trp Val

35 40 45

Leu Val His Val Gly Phe Ala Met Ser Val Ile Asn Glu Ala Glu Ala

50 55 60

Arg Asp Thr Leu Asp Ala Leu Gln Asn Met Phe Asp Val Glu Pro Asp

65 70 75 80

Val Gly Ala Leu Leu Tyr Gly Glu Glu Lys

85 90

Claims

1.一种大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌同时过表达了氢化酶镍掺入蛋白HypB和氢化酶表达/形成蛋白HypC；所述氢化酶镍掺入蛋白HypB的氨基酸序列如SEQID NO.9所示，所述氢化酶表达/形成蛋白HypC的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述大肠杆菌工程菌以大肠杆菌E. coli K12 MG1655为表达宿主，或以敲除了E. coli K12MG1655基因组中的pflB，adhE和frdA基因的工程菌株为表达宿主。

2.如权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，以pTrc99a为表达载体。

3.一种组合蛋白在提高大肠杆菌的乳酸胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述应用为，在大肠杆菌中过表达所述组合蛋白，所述组合蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的氢化酶镍掺入蛋白HypB和氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的氢化酶表达/形成蛋白HypC；所述大肠杆菌为大肠杆菌E. coli K12 MG1655或敲除了E. coli K12 MG1655基因组中的pflB，adhE和frdA基因的工程菌株。

4.一种乳酸的制备方法，其特征在于，所述方法为，采用重组大肠杆菌发酵制备得到，所述重组大肠杆菌为：以敲除了E. coli K12 MG1655基因组中的pflB，adhE和frdA基因的工程菌株为表达宿主，同时过表达了氢化酶镍掺入蛋白HypB和氢化酶表达/形成蛋白HypC；所述氢化酶镍掺入蛋白HypB的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述氢化酶表达/形成蛋白HypC的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

5.权利要求1或2所述的大肠杆菌工程菌在发酵生产代谢产物中的应用，其特征在于，所述代谢产物是参与有机酸代谢的物质。

6.氨基酸序列如SEQ ID NO.9的氢化酶镍掺入蛋白HypB和氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示氢化酶表达/形成蛋白HypC在提高大肠杆菌制备乳酸产量中的应用，其特征在于，所述大肠杆菌为，敲除了E. coli K12 MG1655基因组中的pflB，adhE和frdA基因的工程菌株。