KR20130098603A - Ｄ―형 젖산 생성 변이균주 및 이를 이용한 광학 순도가 높은 ｄ―형 젖산 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생성 재조합 미생물 및 이를 이용하여 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 L-형 및 D-형 젖산 모두를 생산하는 미생물에서 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(L-lactic acid dehydrogenase gene; L- ldh)를 결실시킨 재조합 균주, 및 상기 L-젖산 탈수소화 효소가 결실시킨 균주에 활성 D-형 젖산 탈수소화 효소의 아미노산을 암호화하는 유전자 도입하여 D-형 젖산 탈수소화 효소를 과발현하는 재조합 균주를 제공하고, 또한 상기 두 가지 재조합 균주를 이용하여 광학 순도가 높은 D-형 젖산을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 광학 순도가 높은 D-형 젖산을 대량 생산할 수 있으므로 D-형 젖산 PLA 생산에 유용하게 이용될 수 있다. 따라서, 기존 PLA의 단점이었던 낮은 열 안정성을 극복하고 PLA의 생산 단가를 낮추어 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

Ｄ―형 젖산 생성 변이균주 및 이를 이용한 광학 순도가 높은 Ｄ―형 젖산 생산 방법{Genetically modified D―lactic acid―producing microorganisms and the method for preparing D―lactic acid using the same}

본 발명은 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 젖산 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, L-형 및 D-형 젖산을 동시에 생산하는 균주로부터 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(L-lactic acid dehydrogenase gene; L-ldh)를 결실시킨 변이 균주, 및 상기 변이 균주를 이용한 광학 순도가 높은 D-형 젖산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

합성 섬유, 플라스틱의 제조 등 다양한 분야에서 합성 고분자들이 사용되고 있는데, 이들은 대부분은 석유를 원료로 사용하여 만들어지며, 자연환경에서 잘 분해되지 않고, 제조과정에서도 여러 유해 물질이 배출된다. 따라서, 최근에는 합성 고분자 대신 재생 가능한 원료를 사용하고, 제조과정에서　해로운 유기용매를 사용하지 않으며, 재활용이 가능한 물질을 사용하려는 '녹색환경 기술'이 각광받고 있다. 상기 녹색환경 기술에서는 생물에서 합성되는 여러 가지 고분자인 바이오폴리머(biopolymer)를 사용한다. 바이오폴리머의 합성은 모두 생체 촉매를 담당하는 효소의 작용으로 이루어지기 때문에, 이를 이용하여 생명계에서 일어나는 화학을 흉내 내어 원하는 성능의 화학물질을 얻는다.

바이오폴리머의 대표적인 물질 중 하나인 폴리젖산(Polylactic acid; PLA)은 생체분해가능 플라스틱(biodegradable plastic)으로 이미 다양한 분야에서 널리 사용되고 있다. PLA는 지방족 폴리에스테르(aliphatic polyester)로서, 일부 유통 업체에서는 식품 포장, 전자렌지용 그릇 제조 등에서 사용될 뿐만 아니라, 의학분야에서도 봉합실(suture), 약물 전달 장치(drug delivery device)로서 다양하게 사용되고 있다. PLA는 L-형 또는 D-형의 두 가지 이성질체를 갖는데, 현재 산업적으로는 L-형 락티드(lactide) PLA 및 L-형/D-형 락티드 PLA가 널리 사용된다. 이에 있어서, L-형/D-형 락티드의 고분자는 상당히 무정형이고, 이에 상당하는 낮은 용융점을 갖는다. 저분자량의 PLA는 락티드(lactide)의 축합 중합에 의해 합성되며, 이 PLA는 커플링제(coupling agent)에 의해 연결되어 고분자량의 PLA로 합성되는데, 상기 고분자 PLA의 특성은 좋은 기계적 물성을 갖는데 필수적인 요소가 된다. 또한, PLA는 수많은 생분해성 플라스틱 중에서도 강도와 강성 같은 기계적 성질, 광택과 투명성 같은 물리적 성질, 내수와 내유성 같은 화학적 성질 및 안전과 위생성 같은 생물학적 성질이 뛰어나다는 것이 알려졌다. 하지만, PLA는 결정성 고분자임에도 불구하고 열 안정성은 현저히 낮기 때문에, 실제 산업이용성에 한계를 보여왔다.

최근 L-형의 단량체로 이루어진 PLA와 D-형의 단량체로 이루어진 PLA를 블렌딩하여 구조 복합체(stereo complex)라는 라세믹 크리스탈(racemic crystal)이 보고되었는데, 이 고분자는 기존의 PLA에 비해 50% 높은 녹는점(melting temperature)을 보임으로써 기존의 PLA 한계로 알려진 열에 대한 안정성을 극복하려는데 새로운 대안을 제시하였다(Ishida et al, 2006, J Biosci Bioeng, 101, 172-177; Ikada et al, 1987, Macromolecules 20,904-906; Tsuji et al, 1991, Macromolecules, 24,5651-5656). 따라서, L-형 또는 D-형의 단량체로 이루어진 PLA를 제조하기 위해 광학 순도가 높은 젖산의 생산이 요구되고 있다.

젖산은 폴리젖산(polylactic acid; PLA)의 단량체로서, 자연계에서 흔히 볼 수 있는 하이드록시카르복실산(hydroxycarboxylic acid)이다. 젖산의 종래 생산방법으로는 화학적으로 합성하는 화학적 합성법 및 생물을 이용하여 생산하는 생물학적 합성법이 있다. 화학적 합성법은 락토니트릴(lactonitrile)을 강산으로 가수분해(hydrolysis)하는 방법이 주로 사용되나, 이를 이용하여 생산된 젖산은 혼합된 L-형/D-형 젖산의 라세믹 형태로 생산된다(Datta et al, 1995, FEMS Microbiol Rev 16,221-231). 반면, 생물학적 합성법은 다양한 생물체를 이용하여 젖산을 생산하는 방법으로, 특히 미생물을 이용하여 발효를 통해 젖산을 생산하는 방법이 각광을 받고 있다. 광학 순도가 높은 L-형 젖산을 생산하기 위해 다양한 연구들이 진행되었는데, D-형 젖산을 생산하는 유산균의 발효를 통하여 생산하는 경우 광학 순도가 높은 젖산을 생산하기가 어렵고 유전자 조작이 힘든 단점이 있다(Okano et al, 2009, Appl Environ Microbiol, 75, 5175-5178). 또한, 최근에는 비교적 유전자 조작이 쉬운 대장균을 이용하여 순수한 젖산을 생산하는 다양한 방법들이 발표되었다. 하지만 대장균은 낮은 내산성 및 높은 당 농도에서 당을 완벽하게 대사하지 못한다는 단점이 있기 때문에(Volker et al, 2006, Curr Opin Microbiol, 9,268-274), 다른 대안적 순수 젖산을 얻기 위한 다른 방법이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 광학 순도가 높은 D-형 젖산을 생산하는 방법을 연구 노력한 결과, L-형 및 D-형 젖산을 동시에 생산하는 미생물로부터 서열 번호 1의 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(L-lactic acid dehydrogenase gene; L- ldh)의 녹아웃 벡터(knock-out vector)를 이용하여 상동성 재조합(homologous recombination)을 통한 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자를 결실시킨 변이 균주, 및 활성 D-형 젖산 탈수소화효소의 아미노산을 암호화하는 유전자를 상기 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자를 결실시킨 변이 균주로 도입하여 D-형 젖산 탈수소화 효소를 과발현시킨 균주를 제조하였다. 상기 두 가지 재조합 균주를 사용하여 광학적으로 순수한 D-형 젖산이 생산되는지 확인한 결과, 광학 순도 99% 이상의 D-형 젖산이 생산되는 것을 확인하였다. 또한, 상기 두 가지 재조합 균주를 사용하여 혐기성 및 약호기성(microaerobic) 및 pH 5.5 내지 pH 7의 조건에서 효율적으로 광학 순도가 높은 D-형 젖산을 생산할 수 있음을 보임으로써 광학적으로 순수한 D-형 젖산 대량 생산 방법을 제공하였다. 이에 따라 생산된 높은 광학 순도를 가진 D-형 젖산은 PLA 합성에 이용될 수 있으며, 이런 PLA는 기존의 PLA의 약점인 열에 대한 불안정성을 극복할 뿐만 아니라 PLA의 생산 단가를 절감시킴으로써 본 기술이 D-형 젖산 및 PLA의 상업화 기술에 유용하게 이용될 수 있음을 제시함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 광학적으로 순수한 D-형 젖산을 생산하기 위해, L-형/D-형 젖산을 동시에 생산하는 미생물을 유전적으로 조작하여 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(L-lactic acid dehydrogenase gene; L- ldh)를 결실시키거나, 또는 상기 L-ldh를 결실과 동시에 활성 D-형 젖산 탈수소화 효소를 암호화하는 유전자 도입하여D-형 젖산 탈수소화 효소를 과발현시킴으로써 제조된, 광학 순도가 높은 D-형 젖산을 생산하는 균주를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 재조합 미생물을 이용하여 광학 순도가 높은 D-형 젖산을 대량 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 L-형 및 D-형 젖산을 생산하는 미생물로부터 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(L-lactic acid dehydrogenase gene; L-ldh) 제거를 통해 제조된 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 재조합 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 활성 D-형 젖산 탈수소화 효소를 암호화하는 유전자를 포함한 발현벡터를 상기 L- ldh를 결실시킨 재조합 미생물로 도입시킴으로써 D-형 젖산 탈수소화 효소를 과발현하는 광학 순도가 높은 D-형 젖산을 생산하는 재조합 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) L-형 및 D-형 젖산을 동시에 생산하는 미생물을 준비하는 단계; 및

2) 단계 1)의 미생물에 대해 L-형 젖산 탈수소화 효소(L-lactic acid dehydrogenase gene; L- ldh) 유전자를 녹아웃(knock-out)시키는 단계를 포함하는, 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) L-형 및 D-형 젖산을 동시에 생산하는 미생물을 준비하는 단계;

2) 단계 1)의 미생물에 대해 L-형 젖산 탈수소화 효소(L-lactic acid dehydrogenase gene; L-ldh) 유전자를 녹아웃(knock-out)시키는 단계; 및

3) 단계 2)의 미생물에 활성 D-형 젖산 탈수소화 효소(D-lactic acid dehydrogenase; D-ldh)의 아미노산을 암호화하는 유전자를 도입하여 활성화된 D-형 젖산 탈수소화 효소를 과발현시키는 단계를 포함하는, 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 상기 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 재조합 미생물을 종배양하는 단계;

2) 단계 1)에서 종배양된 종배양액을 본배양에 접종시키는 단계;

3) 단계 2)에서 접종된 접종액을 혐기성 또는 약호기조건(microaerobic condition)에서 본배양하는 단계; 및

4) 단계 3)에서 본배양된 본배양액에서 D-형 젖산을 회수하는 단계를 포함하는 D-형 젖산 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 의해 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산이 가능하고, 상기 균주를 배양하여 간단하고 신속한, 광학 순도가 높은 D-형 젖산의 대량 생산이 가능하다. 나아가, 본 발명에 따라 제조된 광학 순도가 높은 D-형 젖산을 생산하는 재조합 미생물을 사용하여 합성한 PLA는 기존 PLA의 약점인 열에 대한 불안정성을 극복할 뿐만 아니라 PLA의 생산 단가를 절감시킴으로써 PLA 상업화 기술에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 L-형 젖산 탈수소화 효소를 녹아웃시키기 위한 녹아웃 벡터(knock out vector)의 지도를 나타낸 그림이다.
도 2는 3510 L-Ldh 넉아웃(knock out, KO) 벡터(vector)의 전기영동 결과를 나타낸 도이다:
프라이머(primer) Erm(F): 서열 번호 4;
Erm(R): 서열 번호 5;
LLDH(F): 서열 번호 6;및
LLDH(R): 서열 번호 7.
도 3은 13169 L-Ldh KO 벡터의 전기영동 결과를 나타낸 도이다:
primer Erm(F): 서열번호 4;
Erm(R): 서열번호 5;
LLDH(F): 서열번호 6;및
LLDH(R): 서열번호 7.
도 4는 활성 D-형 젖산 탈수소화 효소를 과발현시키기 위한 발현벡터의 지도를 나타낸 그림이다.
도 5는 하기 <실시예 2>에서 만들어진 L-ldh가 결실된 락토바실러스 균주 KCTC13169(pKBE67LJLDH)를 하기 <실시예 4>에서 최적화한 배양조건(온도: 37℃, pH: 5.5, 효모추출물 농도: 20 g/L)에서 배양한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 L-형 및 D-형 젖산 모두를 생산할 수 있는 미생물에서 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(L-lactic acid dehydrogenase gene; L- ldh)(서열 번호 1)을 결실시킨 광학 순도가 높은 D-형 젖산을 생산하는 재조합 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 활성 D-형 젖산 탈수소화 효소를 암호화하는 유전자(서열 번호 2 또는 3)를 포함한 발현벡터를 상기 L- ldh를 결실시킨 재조합 미생물로 도입시킴으로써 D-형 젖산 탈수소화 효소를 과발현하는 광학 순도가 높은 D-형 젖산을 생산하는 재조합 미생물을 제공한다.

상기 사용되는 L-형 및 D-형 젖산 모두를 생산할 수 있는 미생물은 동종 발효할 수 있는 것이다. 보다 구체적으로, 이러한 미생물은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주로부터 선택될 수 있고, 보다 구체적으로는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 또는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii)일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei) KCTC 3510(ATCC 25302) 및 KCTC 13169일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 L-형 젖산 탈수소화 효소는 L-형 젖산의 생산에 필수적인 효소로서, 구체적으로는 L-형 젖산 탈수소화 효소, 보다 구체적으로는 서열 번호 1로 기재되는 것을 포함하는 L-형 젖산 탈수소화 효소일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(L-lactic acid dehydrogenase gene; L-ldh)를 녹아웃(knock-out)시키기 위해, 녹아웃 벡터(knock-out vector)를 미생물로 도입한 후 상동성 재조합(homologous recombination)에 의한 유전자 결실을 이용할 수 있지만, 이에 한정하지 않는다.

상기 녹아웃 벡터는 pTOPOdelAP인 것을 특징으로 하는 녹아웃 벡터를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 활성 D-형 젖산 탈수소화 효소의 아미노산을 암호화하는 서열은 대장균, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 루코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 사케(Lactobacillus sake), 락토바실러스 코리니포르미스(Lactobacillus coryniformis)로부터 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로부터 유래될 수 있으며, 보다 구체적으로는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii)로부터 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로부터 유래될 수 있다.

상기 L-형 및 D-형 젖산 모두를 생산할 수 있는 미생물은 구체적으로는 조건 혐기성 균주(facultative anaerobic organisms)일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 일반적으로 많은 균주 및 동물세포에서는 산소가 있을 때 발효 대신에 세포 호흡을 거치고, 산소가 없거나 부족할 때만 발효과정이 일어난다. 반면, 조건 혐기성 균주는 산소가 있을 때조차도 발효 및 호흡 과정을 모두 거치게 된다.

상기 L-형 및 D-형 젖산 모두를 생산할 수 있는 미생물은 젖산 발효, 구체적으로는 동종젖산 발효를 하는 미생물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 여기서 상기 젖산 발효(lactic acid fermentation)는 포도당(glucose), 과당(fructose), 및 자당(sucrose)과 같은 당류(sugars)가 세포 에너지 및 대사 부산물인 젖산을 만들어내는 생물학적 과정을 의미한다. 상기 젖산 탈수소화 효소(lactate dehydrogenase)는 NADH 및 NAD⁺의 상호전환(interconversion)을 매개하여, 이와 동시에 피루브산(pyruvate) 및 젖산(lactate)의 상호전환을 촉매하는 것이다. 상기 젖산 발효는 동종젖산 발효 및 이종젖산 발효의 두 가지 종류가 있다. 동종젖산 발효(homolactic fermentation)는 피루브산의 두 분자 모두를 젖산으로 전환하여, 결국 두 개의 젖산을 생성하는 반면, 이종젖산 발효(heterolactic fermentation)는 피루브산의 한 분자는 젖산으로 전환시키고 다른 피루브산의 한 분자는 에탄올 및 이산화탄소로 전환시켜 결국 한 개의 젖산이 생성된다. 따라서, 동종젖산 발효는 부산물(byproduct)로서 가스가 생성되지 않는 유일한 호흡 과정 중 하나로 매우 특별한 것이다.

또한, 본 발명은

1) L-형 및 D-형 젖산을 동시에 생산하는 미생물을 준비하는 단계;

2) 단계 1)의 미생물에 대해 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(L-lactic acid dehydrogenase gene; L- ldh)를 녹아웃(knock-out)시키는 단계를 포함하는, 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) L-형 및 D-형 젖산을 동시에 생산하는 미생물을 준비하는 단계;

2) 단계 1)의 미생물에 대해 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(L-lactic acid dehydrogenase gene; L- ldh)(서열 번호 1)를 녹아웃(knock-out)시키는 단계; 및

3) 단계 2)의 미생물에 활성 D-형 젖산 탈수소화 효소(D-lactic acid dehydrogenase; D-ldh)를 암호화하는 유전자(서열 번호 2 또는 서열 번호 3)를 도입하여 활성화된 D-형 젖산 탈수소화 효소를 과발현시키는 단계를 포함하는, 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법을 제공한다.

상기 두 가지 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 L-형 젖산 및 D-형 젖산 모두를 생산할 수 있는 미생물은 구체적으로 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주일 수 있고, 보다 구체적으로는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii)일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei) KCTC 3510(ATCC 25302) 및 KCTC 13169 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 두 가지 제조 방법에 있어서, 젖산 탈수소화 효소는 M 및 H 아단위 단백질(subunit protein)의 4분자체(tetramer)로 구성되어 있으며, 그것을 구성하고 있는 4개의 아단위(subunit)에 따라 5가지로 아형(isoform)이 나뉜다. 인간에서, LDH(lactate dehydrogenase) 1은 심장 및 적혈구(red blood cell; RBC)에 주로 있으며, LDH 2는 세망내피계(reticuloendothelial system)에, LDH 3은 폐에, LDH 4는 신장, 태반, 및 췌장에, 및 LDH 5는 간 및 가로무늬근(striated muscle)에 주로 분포한다.

상기 두 가지 제조 방법에 있어서, 단계 2)는 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(L-lactic acid dehydrogenase gene; L- ldh)를 녹아웃(knock-out)시키기 위해, 녹아웃 벡터(knock-out vector)를 미생물로 도입한 후 상동성 재조합(homologous recombination)에 의한 유전자 결실을 이용할 수 있지만, 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 벡터는 pTOPOdelAP인 것을 특징으로 하는 녹아웃 벡터를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 제조 방법에 있어서, 단계 3)의 활성 D-형 젖산 탈수소화 효소의 아미노산을 암호화하는 서열은 대장균, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 루코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 사케(Lactobacillus sake), 락토바실러스 코리니포르미스(Lactobacillus coryniformis)로부터 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로부터 유래될 수 있으며, 보다 구체적으로는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii)로부터 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로부터 유래될 수 있다.

또한, 상기 벡터는 형질전환된 미생물 또는 재조합된 벡터(vector)의 선별을 위한 마커로서 항생제 내성 유전자, 보다 구체적으로는 각각 에리트로마이신(erythromycin resistance gene) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)을 사용할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 L-형 젖산 탈수소화 효소를 녹아웃(knock out)시키기 위한 녹아웃 벡터를 제작하였고, 이를 이용하여 L-형 및 D-형 젖산을 동시에 생산하는 미생물에서 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자를 녹아웃시켜 상기 재조합 균주로부터 광학적으로 순수한 D-형이 생산되는지 확인하였다. 그 결과, L-형 젖산 합성능이 현저하게 저하되는 것을 확인하였다(표 3 참조). 또한, 상기 L-형 젖산 탈수소화효소가 결실된 재조합 미생물에 활성 D-형 젖산 탈수소화 효소의 유전자를 도입시켜 D-형 젖산 탈수소화효소를 과발현시키는 균주를 제조하고, 그 균주가 광학적으로 순도가 높은 D-형 젖산을 생산하는지 확인한 결과, D-형 젖산 99.5% 이상의 D-형 젖산을 수득함으로써 광학 순도가 높은 D-형 젖산을 생산함을 확인하였다(표 4 참조).

또한, 본 발명에 따른 광학적으로 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 재조합 미생물을 이용하여 광학적으로 순도가 높은 D-형 젖산을 대량 생산하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기의 광학적으로 순도가 높은 D-형 젖산 대량 생산 방법은 하기의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:

1) L-형 젖산 탈수소화 효소를 결실시키거나, 또는 상기 L-형 젖산 탈수소화 효소를 결실과 동시에 D-형 젖산 탈수소화 효소 유전자를 도입하여 D-형 탈수소화 효소를 과발현시킨, 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 재조합 미생물을 종배양하는 단계;

2) 단계 1)의 종배양을 본배양에 접종시키는 단계;

3) 단계 2)의 접종액을 혐기성 또는 약호기조건(microaerobic condition)에서 본배양하는 단계; 및

4) 단계 3)의 본 배양액에서 D-형 젖산을 회수하는 단계.

상기 단계 1)의 미생물을 종배양 및 본배양하기 위한 배지는 미생물, 보다 구체적으로는 락토바실러스 균주의 배양에 이용되는 어떠한 배지도 사용가능하나, 구체적으로는 MRS(deMan Rogosa Sharpe) 배지, APT(All Purpose with Tween) 배지 또는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지이며, 보다 구체적으로는 MRS 배지이나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계의 배양은 30 내지 40℃에서 배양되는 것일 수 있으며, 구체적으로 34 내지 37℃에서 배양되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 37℃에서 배양되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계의 배양은 10 g/L이상의 효모 추출물을 포함하는 배양액에서 배양되는 것일 수 있고, 구체적으로 10 내지 50 g/L 이상의 효모 추출물을 포함하는 배양액에서 배양되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 10 내지 30 g/L 이상의 효모 추출물을 포함하는 배양액에서 배양되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계의 배양은 pH가 5.5 내지 10인 것일 수 있고, 구체적으로 pH가 5.0 내지 7.0일 수 있고, 보다 구체적으로 pH가 5.5 내지 6.5일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 pH가 5.5 내지 6.0일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 2)에 있어서, 종배양액의 접종은 종배양액이 600 nm에서의 흡광도가 0.5 내지 10, 구체적으로는 1 내지 7, 보다 더 구체적으로는 2 내지 5에 도달할 때 접종할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 단계 2)에 있어서, 종배양액의 1% 내지 30%, 구체적으로 5% 내지 20%, 보다 더 구체적으로 10% 내지 15%(v/v)를 본배양액에 접종시킬 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 L-ldh가 결실된 락토바실러스 균주 KCTC13169(pKBE67LJLDH)를 최적화 배양조건(온도: 37℃(표 5 참조), 효모추출물 농도: 20 g/L(표 6 참조), pH: 5.5(표 7 참조))에서 72시간 배양한 결과, 약 70.7 g/ℓ의 젖산을 생산하였고, D형 젖산의 이성질체 과잉률(enantiomeric excess)은 97.0% 이상을 유지하는 것을 확인하였다(도 5 참조).

따라서, 본 발명에 의해 제공되는 광학 순도가 높은 D-형 젖산을 생산하는 미생물을 이용하여 광학적으로 순수한 D-형 젖산을 생산하는 최적 조건을 확인하였으므로, 상기 방법을 광학적으로 순수한 D-형 젖산을 대량생산하는 방법에 이용할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 제한되지 않는다.

< 실시예 1> 균주의 준비 및 배양

젖산을 과생산하는 유산균을 확보하기 위하여 젖산을 과생산하는 것으로 알려져있는 유산균을 균주 수집(culture collection)을 통하여 입수하였다. 균주를 배양하여 젖산(lactic acid)을 생산하기 위해 사용된 기본 배지는 데 만-로고사-샤프(de Man-Rogosa-Sharpe; MRS) 액체 배지이고, 37℃에서 정치배양(standing culture)하여, 젖산 생산능을 분석하였다(표 1).

그 결과, 각 균주 중 Lactobacillus paracasei KCTC 13169 균주가 L형 젖산을 생산하는 균주 중에서 가장 높은 젖산 농도를 보였다.

< 실시예 2> 재조합 균주의 제조

<2-1> L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자 녹아웃 균주의 제조

D형 젖산 생산 균주를 제작하기 위하여, 젖산을 생산하는 균주 중에서 가장 높은 젖산 농도와 균주 생장 속도를 보인 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 13169와 전체 게놈 서열(whole genome sequence)이 알려진 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei) KCTC 3510 균주를 이용하였다. 또한, 플라스미드를 포함한 균주들을 배양하기 위해서 두 가지 항생제, 에리토마이신(erythomycin; Erm) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)을 각각 5 ㎍/ml, 10 ㎍/ml의 농도로 사용하였다.

균주가 가지고 있는 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(L-lactic acid dehydrogenase; L- ldh)를 제거하기 위하여 녹아웃 벡터(knock-out vector)를 이용하여 균주를 형질전환시켰다. L-ldh 유전자를 결실시키기 위한 녹아웃 벡터의 지도는 도 1에 나타내었다(도 1). 또한, 상기 L-ldh 유전자를 결실시킨 균주에 활성 D-형 젖산 탈수소화 효소를 암호화하는 유전자를 도입시켜 활성화된 D-형 젖산 탈수소화 효소를 과발현하는 균주를 제조하였다.

녹아웃 벡터를 제작하기 위하여, pCR 2.1 TOPO(Invitrogen, USA)을 제한효소인 DraI으로 절단한 후, 3.2 kb의 절편을 자가 결합(self-ligation)하여, pTOPOdelAP 벡터를 수득하였다. 형질도입된 균주를 선별하기 위한 마커로서, 에리트로마이신 내성 유전자(Erythromycin resistance gene)를 pAMbeta 1(gene bank accession number GU128949)로부터 정방향 프라이머(forward primer): 5'-AAGCTTGCAAACTTAAGAGTGTGTT-3'(서열 번호 4) 및 역방향 프라이머(reverse primer): 5'-AAGCTTCCACCAATACCCAAAA-3'(서열 번호 5)를 이용하여 최종부피가 20㎕가 되도록 20 pmol 프라이머, 100 ng의 플라스미드 DNA를 혼합한 다음 상기 혼합액을 94℃에서 5분간 변성, 94℃에서 30초간 변성, 54℃에서 30초간 재결합, 72℃에서 90초간 신장 과정을 30회 반복하였다. 이어서 72℃에서 10분간 확장한 다음 반응을 종료하였다. 1.3 kb의 절편을 수득한 후, 제한효소인 HindIII로 절단하였다. HindIII로 절단한 단편을 pTOPOdelAP에 삽입하여, pTOPOdelAPErm 벡터를 수득하였다. L-LDH의 녹아웃을 위하여, 락토바실러스 파라카세이(L. paracasei) KCTC 13169와 락토바실러스 파라카세이(L. paracasei) KCTC 3510(ATCC25302) 균주의 L-ldh 유전자 절편을 획득하기 위하여, 정방향 프라이머(Forward Primer): 5'-GAATTCATGCACTAAGAAAGGATGATATC-3'(서열 번호 6)와 역방향 프라이머(Reverse Primer): 5'-GGTACCTTACTGACGAGTTTCGATGTCATTC-3'(서열 번호 7)를 이용하여 최종부피가 20 ㎕가 되도록 20 pmol 프라이머, 100 ng의 플라스미드 DNA를 혼합한 다음 상기 혼합액을 94℃에서 5분간 변성, 94℃에서 30초간 변성, 54℃에서 60초간 재결합, 72℃에서 90초간 신장 과정을 30회 반복하였다. 이어서 72℃에서 10분간 확장한 다음 반응을 종료하였다. 얻어진 L-ldh를 pCR2.1TOPO(Invitrogen)에 클로닝(cloning) 한 후, 상기 벡터를 EcoRV/XmnI의 제한효소로 절단하여, 600 bp의 단편을 얻은 후, EcoRV로 절단한 pTOPOdelAPErm에 삽입하여 재조합 플라스미드를 만들었다. 상기 재조합 플라스미드를 모 균주에 도입하여 단일 교차 상동 재조합(single cross-over homologous recombination)에 의한 녹아웃 돌연변이(knock-out mutant)를 만들었다.

그 후, 상기 수득한 플라스미드를 균주에 도입시키기 위해, 테레사(Teresa) 방법을 사용하여(M. Teresa Alegre, M. Carmen Rodriguez, Juan M. Mesas. 2004. Transformation of Lactobacillus plantarum by electroporation with in vitro modified plasmid DNA. FEMS Microbiology.241:73-77) 락토바실러스 파라카세이(L. paracasei) 컴피턴트 세포(competent cell)를 제조하였다. 형질전환은 전기침공(electroporation)으로 Gene PulserII(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)장치를 사용하여, 2.0 kV, 200Ω, 25 μF의 전기 충격을 주었다. 그 후 500 ㎕의 MRS를 첨가하여 3시간 배양한 후, 항생제인 Erm을 첨가한 MRS 한천배지에 도말하였다. 37℃에서 3일간 배양 후 분리된 균을 얻어서 MRS 액체 배지에 접종, 배양한 후 플라스미드를 추출하고 PCR을 한 후 전기영동으로 그 크기를 확인하여 해당 플라스미드의 형질도입을 확인하였다(도 2 및 도 3).

<2-2> 상기 <2-1>에서 제조된 L-탈수소화 효소 결실 균주에 추가적으로 활성 D-탈수소화 효소를 과발현시킨 균주의 제조

발현벡터 pKBE67-MCS는 pKE12-MCS(Park et al. Appl . Microbiol . Biotechnol. 93, 273-283, 2012)을 주형벡터로 사용하여 제작하였다(도 4). pAMB origin을 얻기위하여, pMTL-500E(Outtram et al. FEMS Microbiol . lett . 56, 83-88, 1988)를 주형 DNA로 사용하였고, 정방향 프라이머(Forward Primer): 5'-ctcgag TA TTT AAT CAC TTT GAC TAG CAA ATA CTA AC-3'(서열 번호 8)와 역방향 프라이머(Reverse Primer): 5'-gacgtc CC AAC TAA CTC AAC GCT AGT AGT GG-3'(서열 번호 9)를 이용하여 최종부피가 20 ㎕가 되도록 20 pmol 프라이머, 100 ng의 플라스미드 DNA를 혼합한 다음 상기 혼합액을 94℃에서 5분간 변성, 94℃에서 30초간 변성, 54℃에서 60초간 재결합, 72℃에서 90초간 신장 과정을 30회 반복하였다. 이어서 72℃에서 10분간 확장한 다음 반응을 종료하였다. 수득한 pAMB origin을 XhoI/AatII site에 삽입하였고, CatP유전자를 얻기 위하여, pJIR750(Bannam and Rood, Plasmid 29, 223-235, 1993)을 주형으로 하고, 정방향 프라이머(Forward Primer): 5'-gacgtc ttgcttttcccatcgcccgg-3'(서열 번호 10)와 역방향 프라이머(Reverse Primer): 5'-actagt caaattcccactaagcgctcgg-3'(서열 번호 11)를 이용하여 최종부피가 20 ㎕가 되도록 20 pmol 프라이머, 100 ng의 플라스미드 DNA를 혼합한 다음 상기 혼합액을 94℃에서 5분간 변성, 94℃에서 30초간 변성, 54℃에서 60초간 재결합, 72℃에서 90초간 신장 과정을 30회 반복하였다. 이어서 72℃에서 10분간 확장한 다음 반응을 종료하였다. 얻어진 CatP 유전자를 이용하여, pKE12-MCS의 암피실린 저항성 (Ampicillin resistance) 유전자를 치환하였다. 또한 합성된 p170 프로모터(promoter)(ctcgagaatatgcgaaaagaactatgaatatccactccatttttggttgccatttgttaacgctgcctcctctccctagtgctataataaaaatggccaaaaaaaaaccattttattgactatatttgcaatttatttacacattatcttttcagaaccaaaatctggcccattttggaacagacttctactattttgttgtctagtataaaaaatgaattggaggaaagaattc)(서열 번호 12, Bioneer, Daejeon)로 XhoI/EcoRI site를 이용하여 pKE12-MCS의 P_{LlacO - 1}를 치환하여, pKBE67-MCS vector를 완성하였다.

D형 LDH를 과발현하는 벡터를 제작하기 위하여 L. plantarum(lab stock) 균주의 염색체(chromosome)로부터 정방향 프라이머(forward primer): 5'-gaattcatgaaaattattgcatatgc-3'(서열 번호 13) 및 역방향 프라이머(reverse primer): 5'-ggatccttagtcaaac ttaacttgcg-3'(서열 번호 14), E. coli W3110 균주의 염색체로부터 정방향 프라이머(forward primer): 5'- GAATTCATGAAACTCGCCGTTTATAGCACA-3'(서열 번호 15) 및 역방향 프라이머(reverse primer): 5'- GGATCCTTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGGT-3'(서열 번호 16)를 이용하여 각각, 최종부피가 20 ㎕가 되도록 20 pmol 프라이머, 100 ng의 플라스미드 DNA를 혼합한 다음 상기 혼합액을 30회 반복하였다. 이어서 72℃에서 10분간 확장한 다음 반응을 종료하였다. 각 절편을 수득한 후, 제한효소인 EcoRI/BamHI으로 절단하였다. EcoRI/BamHI으로 절단한 단편을 pKBE67-MCS에 삽입하여, pKBE67LPLdhD와 pKBE67ECLdhA벡터를 수득하였다.

L. johnsonii KCTC3801의 D-ldh를 과발현하기 위하여, L. johnsonii KCTC3801균주의 염색체로부터 정방향 프라이머(forward primer): 5'- GAGCTCATGACAAAGATTTTTGCTTA-3'(서열 번호 17) 및 역방향 프라이머(reverse primer): 5'- GGATCCTTAGAACTTGTTCTTGTCCA-3'(서열 번호 18)를 이용하여 최종부피가 20 ㎕가 되도록 20 pmol 프라이머, 100 ng의 플라스미드 DNA를 혼합한 다음 상기 혼합액을 30회 반복하였다. 이어서 72℃에서 10분간 확장한 다음 반응을 종료하였다. 1 kb의 절편을 수득한 후, 제한효소인 SacI/BamHI으로 절단하였다. SacI/BamHI으로 절단한 단편을 pKBE67-MCS에 삽입하여, pKBE67LJLdhA벡터를 수득하였다. L-ldh 녹아웃 벡터를 L. paracasei KCTC 13169로 형질 전환 시킨 후 pKBE67LJLdhA벡터를 도입하여 D-형 젖산 생산용 미생물을 제작하였다. 상기 D-형 젖산 생산용 미생물을 2012년 1월 27일자에 한국생명공학연구소 유전자 은행에 수탁번호 KCTC12126BP로 기탁하였다. 아울러, L-ldh 녹아웃 벡터를 L. paracasei KCTC 3510으로 형질 전환 시킨 후 pKBE67LJLdhA벡터를 도입하여 D-형 젖산 생산용 미생물을 제작하였다. 상기 D-형 젖산 생산용 미생물을 2012년 1월 27일자에 한국생명공학연구소 유전자 은행에 수탁번호 KCTC12125BP로 기탁하였다.

< 실시예 3> 상기 재조합 균주를 이용하여 광학 순도가 높은 D-형 젖산의 생산

상기 <실시예 2>에서 만들어진 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(L-lactic acid dehydrogenase gene; L- ldh)가 결실된 균주, 및 상기 L-ldh가 녹아웃된 균주로 활성 D-형 젖산 탈수소화 효소를 암호화하는 유전자를 도입하여 형질전환시킨 균주가 L-형 젖산 생산능력이 감소하고 광학 순도가 높은 D-형 젖산의 생산이 가능한지 알아보고자 본 실시예를 수행하였다.

상기 <실시예 2>에서 제조된 재조합 균주에 따른 L-형 또는 D-형 젖산 발현 능력을 비교하기 위하여, 상기 <실시예 2>에서 준비된 L-ldh 녹아웃 벡터 또는 D-ldh 과발현 벡터를 이용하여, 표 2에서 나타난 것과 같이 다양한 조건에서 젖산 탈수소화 효소(lactic acid dehydrogenase; ldh)를 결실 또는 과발현시킨 균주를 생산하였다(균주로의 형질도입은 실시예 2에 나타난 것과 동일)(표 2). 그 후, L-형 젖산 테스트 키트 및 D-형 젖산 테스트 키트(Megazyme, Ireland)를 사용하여 L-형 젖산 및 D-형 젖산 능력을 측정하였다. 상기 키트 제조사에서 제공하는 실험방법에 따라 실험을 수행하였고, 그 후 340nm에서 흡광도를 측정하였다(SHIMADZU UV-1700).

플라스미드	벡터에 포함된 유전자 및 용도	숙주 세포
L-LDH-KO	L-LDH 녹아웃(knock-out)	L. paracasei
pKBE67LPLdhD	L. plantanum의 D-ldh 과발현	L. paracasei L-LDH KO mutant
pKBE67ECLdhA	E. coli 의 D-ldh 과발현	L. paracasei L-LDH KO mutant
pKBE67LJLdhA	L. johnsonii의 D-ldh 과발현	L. paracasei L-LDH KO mutant

그 결과, 표 3과 같이 상기 <실시예 2>에서 제조한 L-ldh 녹아웃 벡터를 L.paracasei KCTC 13169로 형질 전환 시킨 경우 젖산의 생산 능력이 측정되었고, 표 4와 같이 상기 <실시예 2>에서 제조한 L-ldh 녹아웃 벡터를 L. paracasei KCTC 3510으로 형질 전환 시킨 경우 젖산의 생산 능력이 측정되었다.

	L-형 젖산 (g/L)	D-형 젖산 (g/L)	총 생성된 젖산량 (g/L)	L-형 %	D-형 %
KCTC13169	28.00	1.99	29.99	93.38	6.62
13169 LLDH-KO	2.03	6.78	8.81	23.09	76.91
ECLdhA	2.88	9.48	12.37	23.32	76.68
LJLdhA	0.54	12.91	13.46	4.05	95.95
LPLdhD	0.23	16.76	16.99	1.38	98.62

	L-형 젖산	D-형 젖산	총 생성된 젖산량	L-형 %	D-형 %
KCTC3510	20.38	1.11	21.49	94.84	5.16
3510 LLDH-KO	0.95	1.57	2.53	37.77	62.23
ECLdhA	3.30	7.11	10.41	31.69	68.31
LPLdhD	0.18	17.46	17.64	1.00	99.00
LJLdhA	0.21	19.38	19.60	1.08	98.92

< 실시예 4> 재조합 균주를 이용한 D-형 젖산 생산의 최적화된 배양조건 확인

상기 <실시예 2 및 3>을 통하여, L-형 및 D-형 젖산 모두 합성할 수 있는 능력을 가진 락토바실러스 파라카세이 균주에서 L- ldh를 결실시켰을 때 L-형 젖산을 생산할 수 있는 능력이 현저히 저하됨과 동시에 광학적으로 순수한 D-형 젖산을 생산한다는 것을 알 수 있었다. 따라서, D-형 젖산을 대량 생산하여 이를 산업화시키기 위해, D-형 젖산의 생산능력이 최대가 되는 조건을 알아보기 위해 본 실험을 수행하였다.

<4-1> 30-40℃에서 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자( L- ldh )가 결실된 균주 또는 L-ldh 가 결실되고 D-형 젖산 탈수소화 효소(D - ldh )가 과발현된 락토바실러스를 이용하여 광학적으로 순수한 D-형 젖산 생산능력의 확인

광학 순도가 높은 D-형의 대량 생산이 수월한 온도 조건을 알아보기 위해, 실시예 2에서 만들어진 L- ldh가 결실된 락토바실러스 균주 KCTC 13169 (pKBE67LJLDH)를 다양한 온도에서 배양하였다(배지: 포도당(Glucose) 150 g/L, 폴리펩티온(polypeptione) 5 g/L, 효모추출물(yeast extract, Y.E) 5 g/L, NaCl 0.1g/L, K₂HPO₄ 2g/L, MgSO₄·7H₂O 0.5g/L, 비타민 B12(Vitamin B12) 0.02 mg/L).

온도	젖산 최고농도(g/ℓ)	도달 시간(hr)
30	21.0	72
34	59.7	72
37	61.1	72
40	36.1	72

그 결과, 37℃가 최적온도로 나타났으며, 72시간 배양시 61 g/L의 젖산을 생산하는 것으로 나타났다.

<4-2> 효모추출물을 첨가한 배지에서 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자( L- ldh )가 결실된 균주 또는 L- ldh 가 결실되고 D-형 젖산 탈수소화 효소(D - ldh )가 과발현된 균주를 이용하여 광학적으로 순수한 D-형 젖산 생산능력의 확인

광학 순도가 높은 D-형의 대량 생산이 수월한 조건을 알아보기 위해, 실시예 2에서 만들어진 L- ldh가 결실된 락토바실러스 균주 KCTC 13169 (pKBE67LJLDH)를 37℃에서 다양한 효모추출물 농도에서 배양하였다(배지: 포도당(Glucose) 150 g/L, 폴리펩티온(polypeptione) 5 g/L, NaCl 0.1g/L, K₂HPO₄ 2g/L, MgSO₄·7H₂O 0.5g/L, 비타민 B12(Vitamin B12) 0.02 mg/L).

효모추출물농도 (g/L)	젖산 최고농도(g/ℓ)	도달 시간(hr)
5	33.0	72
10	61.0	72
20	65.1	72
30	63.8	72

그 결과, 상기 형질전환된 균주는 10 g/L 이상의 효모 추출물을 첨가해주었을 때, 비교적 높은 D-형 젖산 생산능력을 보였다.

<4-3> pH 6-7에서 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자( L- ldh )가 결실된 균주 또는 L-ldh 가 결실되고 D-형 젖산 탈수소화 효소(D - ldh )가 과발현된 균주를 이용하여 광학적으로 순수한 D-형 젖산 생산능력의 확인

광학 순도가 높은 D-형의 대량 생산이 수월한 조건을 알아보기 위해, 실시예 2에서 만들어진 L- ldh가 결실된 락토바실러스 균주 KCTC 13169(pKBE67LJLDH)를 37℃에서 다양한 pH에서 배양하였다(배지: 포도당(Glucose) 150 g/L, 폴리펩티온(polypeptione) 5 g/L, Y.E 5 g/L, NaCl 0.1g/L, K₂HPO₄ 2g/L, MgSO₄·7H₂O 0.5g/L, 비타민 B12(Vitamin B12) 0.02 mg/L).

pH	젖산 최고농도(g/ℓ)	도달 시간(hr)
5.0	47.1	72
5.5	67.0	72
6.0	61.9	72
6.5	59.0	72

그 결과, 상기 형질전환된 균주는 pH 5.5에서 배양될 때, 비교적 높은 D-형 젖산 생산능력을 보였다(표 7).

< 실시예 5> 배양조건 최적화 검증

상기 <실시예 2>에서 만들어진 L- ldh가 결실된 락토바실러스 균주 KCTC13169 (pKBE67LJLDH)를 상기 <실시예 4>에서 최적화한 배양조건(온도: 37℃, pH: 5.5, YE 농도: 20 g/L)에서 배양하였다(배지: 포도당(Glucose) 150 g/L, 폴리펩티온(polypeptione) 5 g/L, Y.E 20 g/L, NaCl 0.1g/L, K₂HPO₄ 2g/L, MgSO₄·7H₂O 0.5g/L, 비타민 B12(Vitamin B12) 0.02 mg/L).

72시간 배양한 결과, 약 70.7 g/ℓ의 젖산을 생산하였고, D형 젖산의 이성질체 과잉률(enantiomeric excess)은 97.0% 이상을 유지하였다(도 5).

한국생명공학연구원 KCTC12126BP 20120127 한국생명공학연구원 KCTC12125BP 20120127

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> Genetically modified D-lactic acid-producing microorganisms and the method for preparing D-lactic acid using the same <130> 11p-8-15 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1005 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei <400> 1 ctgacgagtt tcgatgtcat tcttagcgaa agcatcggtc agaaccttct tcaattgaga 60 agcagatttc tgcatggatt cttcttcgtg atcggtcaat gggatttcca ggatgttctg 120 gataccatta cggttgatca cagctggggt accgatgtag atgtcgttca agccatattg 180 accatccatg taaacggaaa gtggcagaac cgcattttcg tcgttaagga ttgcctttga 240 aatccgggca agggcagttg cgataccata gaaggtcgca cccttgagtt tgatgatttc 300 ataagcggcg tcacgaacgt cttcaaacat cttaacaagc ttgtcttcct tgatttctgg 360 atgagcctta acccattcag cgatggtaac gccaccaatg ttagcgtggg accatacagg 420 gaattcagtg tcaccatgtt cgcccatgat gtaagcgtgg accgaacgag cgtcaacatt 480 aaccatttca gcaatggact gacggaagcg ggcggtgtcc agtgaagtac cggaaccaac 540 aacccggttc ttcgggaagc cagaaagttt ccaagttgca taggtcaaaa tgtcaactgg 600 gttggcagca actaagaaaa taccgttaaa gccggaatca acgattgggt caacaatgga 660 cttcaagatc ttcaagttct tgttaaccaa gtccaaacga gtttcgccag gcttctgagg 720 agcgccagct gtgataacaa ccagatcagc atccttagca tcgctgtatt cagctgaata 780 aatcttctta ggacttgtga atgggagcgc gttgctcaag tcaatcgcgt caccctttgt 840 cttgtccttg aaaatgtcaa cgattccgat ttcctgagcg ataccttgca aaaccattgc 900 gtaggcataa cttgaaccaa cggcgccgtc accaacgaga ataacttttt ggtgatcctt 960 atccgtaata cttgccacgg tgatatcatc ctttcttatg tgcat 1005 <210> 2 <211> 1014 <212> DNA <213> Lactobacillus johnsonii <400> 2 atgacaaaga tttttgctta cgctattcgt aaagatgaag aacctttctt aaacgaatgg 60 aaagatgcac acaaggatat tgaagttgaa tacactgatc aacttttaac tcctgaaact 120 gctaaattag ctaagggtgc tgatggtgtt gttgtttacc aacaattaga ctacactcca 180 gaaactcttc aagctttagc tgatgctggc gtaactaaga tgtcattacg taacgttggt 240 gttgataaca tcgacatgga caaagctaag gaattaggct ttgaaatcac taacgttcct 300 gtatactctc ctgacgcaat tgctgaacat gctgcaattc aagctgctcg cgtactacgt 360 caagataagc gtatggatga aaagatggct aagcgtgact 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Sequence <220> <223> Erythromycin resistance gene forward primer <400> 4 aagcttgcaa acttaagagt gtgtt 25 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Erythromycin resistance gene reverse primer <400> 5 aagcttccac caatacccaa aa 22 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 6 gaattcatgc actaagaaag gatgatatc 29 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 7 ggtaccttac tgacgagttt cgatgtcatt c 31 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 8 ctcgagtatt taatcacttt gactagcaaa tactaac 37 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 9 gacgtcccaa ctaactcaac gctagtagtg g 31 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 10 gacgtcttgc ttttcccatc gcccgg 26 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 11 actagtcaaa ttcccactaa gcgctcgg 28 <210> 12 <211> 235 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p170 promoter <400> 12 ctcgagaata tgcgaaaaga actatgaata tccactccat ttttggttgc catttgttaa 60 cgctgcctcc tctccctagt gctataataa aaatggccaa aaaaaaacca ttttattgac 120 tatatttgca atttatttac acattatctt ttcagaacca aaatctggcc cattttggaa 180 cagacttcta ctattttgtt gtctagtata aaaaatgaat tggaggaaag aattc 235 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 13 gaattcatga aaattattgc atatgc 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 14 ggatccttag tcaaacttaa cttgcg 26 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 15 gaattcatga aactcgccgt ttatagcaca 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 16 ggatccttaa accagttcgt tcgggcaggt 30 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 17 gagctcatga caaagatttt tgctta 26 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 18 ggatccttag aacttgttct tgtcca 26

Claims (10)

1) L-형 및 D-형 젖산을 동시에 생산하는 미생물을 준비하는 단계; 및
2) 단계 1)의 미생물에 대해 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(L-lactic acid dehydrogenase gene; L- ldh)를 녹아웃(knock-out)시키는 단계를 포함하는 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법.

1) L-형 및 D-형 젖산을 동시에 생산하는 미생물을 준비하는 단계;
2) 단계 1)의 미생물에 대해 L-형 젖산 탈수소화 효소 유전자(L-lactic acid dehydrogenase gene; L- ldh)를 녹아웃(knock-out)시키는 단계; 및
3) 단계 2)의 L-ldh가 녹아웃된 미생물에 활성 D-형 젖산 탈수소화 효소(D-lactic acid dehydrogenase; D-ldh)를 암호화하는 유전자를 도입하여 활성화된 D-형 젖산 탈수소화 효소를 과발현시키는 단계를 포함하는, 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법.

제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 1)의 미생물은 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 또는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii)인 것을 특징으로 하는, 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법.

제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 2)의 L-형 젖산 탈수소화 효소의 유전자는 서열 번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법.

제 2항에 있어서, 단계 3)의 활성 D-형 젖산 탈수소화 효소는 서열 번호 2 또는 3으로 기재되는 것을 특징으로 하는 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 미생물의 제조 방법.

제 1항의 제조 방법에 의해서 제조된, 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 재조합 미생물.

제 2항의 제조 방법에 의해서 제조된, 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 재조합 미생물.

제 7항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 수탁번호 KCTC 12126BP 또는 KCTC 12125BP로 기탁된 것을 특징으로 하는 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산용 재조합 미생물.

1) 제 6항 또는 제 7항에 기재된 재조합 미생물을 종배양하는 단계;
2) 단계 1)에서 종배양된 종배양액을 본배양에 접종시키는 단계;
3) 단계 2)에서 접종된 접종액을 본배양하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 본배양된 본배양액에서 D-형 젖산을 회수하는 단계를 포함하는, 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산 방법.

제 9항에 있어서, 단계 2)의 접종은 종배양액이 600 nm에서 흡광도가 1 내지 5에 도달하는 경우, 10% 내지 20%(v/v)를 본배양액에 접종시키는 것을 특징으로 하는, 광학 순도가 높은 D-형 젖산 생산 방법.

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