CN110724655B - 一株乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌 - Google Patents
一株乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110724655B CN110724655B CN201911198568.8A CN201911198568A CN110724655B CN 110724655 B CN110724655 B CN 110724655B CN 201911198568 A CN201911198568 A CN 201911198568A CN 110724655 B CN110724655 B CN 110724655B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- coli
- escherichia coli
- lactic acid
- strain
- stress resistance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一株乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌,属于微生物工程技术领域。本发明以提高大肠杆菌对D‑乳酸胁迫抗性为目的,以适应性进化为方法,筛选得到了一株可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品发酵生产的大肠杆菌,筛选得到的菌株Escherichia coli DLA3胁迫4h后,存活率较出发菌株提高了249.0倍。
Description
技术领域
本发明涉及一株乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌,属于微生物工程技术领域。
背景技术
大肠杆菌是原核生物中一种重要的宿主菌。这类细菌在自然界分布极为广泛,具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料,在理论上具有重要的学术价值,而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。
目前,已有多种高价值的有机酸生物发酵方法成功应用,其中也有人尝试以大肠杆菌为宿主来表达,但是常常存在酸胁迫的问题。
乳酸的学名为α-羟基丙酸,分子式为C2H5OCOOH,是一种天然存在的有机酸。D-乳酸主要应用于聚乳酸材料的加工制造以及手性药物和农药中间体的合成。高光学纯度D-乳酸(97%以上)作为一个手性中心是多种手性物质的前体,是重要的手性中间体与有机合成原料,广泛应用于制药、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成。同时其最主要应用于生物塑料聚乳酸的原料。在大肠杆菌中,D-乳酸通过丙酮酸代谢途径产生,野生型大肠杆菌菌株就具有固有的乳酸生成途径,可通过乳酸脱氢酶(LdhA)将丙酮酸转化为乳酸,不需要额外引入异源LdhA来产生乳酸。但是大肠杆菌本身存在对有机酸耐受性不高的限制发展因素,大肠杆菌适应生长环境为中性,可乳酸生产环境的pH值适宜在pH 5.5以上,但约50g·L-1的有机酸即会使环境pH降低至pH 2.0左右,这对大肠杆菌的生长是一种考验。
对于酸胁迫,为维持大肠杆菌发酵生产目的蛋白的稳定性并提高生产效率,过去,工业上常常通过在大肠杆菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围,例如,通过添加碱性物质(碳酸钙)来控制发酵环境的pH值。然而,碱性物质的添加往往会导致副产物的积累,而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境,从而造成渗透压胁迫的产生,再次影响菌体的生长与代谢。
目前,提高大肠杆菌的乳酸、乙酸等酸胁迫抗性的方法则主要有:(1)诱变育种,该方法具有简便、类型繁多等特点,但工作量大、效率低是其主要缺点,且诱变后的菌种容易退化;(2)代谢工程策略,目前利用代谢工程策略提高大肠杆菌环境胁迫的方法主要包括构建新的代谢途径、拓展已有代谢途径和削弱已有代谢途径,但是,此方法存在成本高、成功率低的问题。
因此,急需找到一种新的效果优异、遗传稳定性好、成本低、成功率高、操作简单的可提高大肠杆菌酸胁迫性的方法。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株大肠杆菌(Escherichia coli),已于2019年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2019676,保藏地址为中国武汉,武汉大学。
本发明的第二个目的是提供含有上述大肠杆菌的微生物制剂。
在本发明的一种实施方式中,所述微生物制剂中含有活菌数≥106CFU/g的大肠杆菌干菌体。
在本发明的一种实施方式中,所述微生物制剂中含有活菌数≥106CFU/mL的大肠杆菌湿菌体。
本发明的第三个目的是提供一种增强大肠杆菌酸胁迫抗性的方法,是以上述大肠杆菌为宿主。
在本发明的一种实施方式中,所述酸胁迫是乳酸胁迫。
本发明的第四个目的是提供上述大肠杆菌在食品领域中的应用。
本发明的第五个目的是提供上述大肠杆菌在制药领域中的应用。
本发明的第六个目的是提供上述大肠杆菌在化妆品领域中的应用。
本发明的第七个目的是提供上述大肠杆菌在生产生物塑料领域中的应用。
有益效果:
本发明提供了一株D-乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌及其筛选方法。本发明成功筛选到了一株可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的大肠杆菌,筛选得到的菌株Escherichia coli DLA3胁迫4h后,存活率较出发菌株提高了249.0倍。
附图说明
图1:驯化菌株和对照菌株在正常生长条件下的生长曲线图。
图2:驯化菌株和对照菌株在初始胁迫条件3.4g/L D-乳酸条件下的生长曲线图。
图3:驯化菌株和对照菌株在胁迫条件4.2g/L D-乳酸条件下的生长曲线图。
图4:驯化菌株和对照菌株在5.6g/L D-乳酸胁迫条件下的胞内ATP浓度的测定。
图5:驯化菌株和对照菌株在5.6g/L D-乳酸胁迫耐受性试验的存活率图。
生物材料保藏
一株大肠杆菌(Escherichia coli),分类命名为Escherichia coli DLA3,已于2019年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2019676,保藏地址为中国武汉,武汉大学。
具体实施方式
下述实施例中涉及的培养基如下:
LB平板:蛋白胨(英国Oxoid公司)1%(m/V)、酵母粉(Oxoid)0.5%(m/V)、氯化钠1%(m/V)及2%(m/V)琼脂条。
LB液体培养基:蛋白胨(英国Oxoid公司)1%(m/V)、酵母粉(Oxoid)0.5%(m/V)、氯化钠1%(m/V)。
5×M9盐溶液:七水合磷酸氢二钠6.4%(m/V)、磷酸二氢钾1.5%(m/V)、氯化钠0.25%(m/V)及氯化铵0.5%(m/V)。
M9液体培养基:1M的硫酸镁溶液0.2%(V/V)、1M的氯化钙溶液0.01%(V/V)、50%的葡萄糖0.8%(V/V)及5×M9盐溶液20%(V/V),用0.3M的氯化钠溶液定容至1000mL。
实施例1:耐受较高乳酸浓度大肠杆菌的适应性进化
以菌株E.coli K12 MG1655为出发菌株,同时做四个平行样,在M9培养基中37℃培养5小时至菌体生长对数中期;以4%(V/V)的接种比例将培养5h后的菌株转接至含3.4g/LD-乳酸的M9培养基中,放在37℃摇床中转速220rpm培养至OD为0.9-1.1,观察并记录到达该OD值的生长时间;再次以4%(V/V)的接种比例将培养至OD为0.9-1.1的菌株转接至同样乳酸浓度的M9培养基中,依次继续转接,直到在该D-乳酸浓度下的生长速率与在正常无乳酸的M9培养基条件下一致或相差不多,再转至下一浓度,以此类推至含D-乳酸浓度3.6g/L、3.8g/L、3.9g/L、4.0g/L、4.1g/L和4.2g/L培养基逐级转接。将最终筛选得到的菌株分别在LB平板上涂布分离单菌落,并将单菌落挑选至已添加含4.2g/L乳酸的M9培养基的96孔板中,并放入孔板摇床中37℃培养12-18h,选出生长速率最快的单菌落,分别标记为E.coliN-1、E.coli D-23、E.coli F-26及E.coli F-27。
实施例2:驯化菌株和出发菌株在正常条件下的生长情况
具体步骤如下:
(1)将菌株E.coli K12 MG1655(对照)和实施例1得到的菌株E.coli N-1、E.coliD-23、E.coli F-26及E.coli F-27分别接种于LB液体培养基中进行活化,放在37℃摇床中220rpm培养过夜;
(2)分别以2%(V/V)的接种量将上述(1)中得到的种子液转接至LB液体培养基中,放在37℃摇床中220rpm培养;
(3)在(2)的培养过程中,每隔2小时取样,测定600nm波长下的OD值,绘制生长曲线(绘制得到的生长曲线如图1)。
结果如图1所示,经生长性能试验分析,培养12h后,较对照菌株(OD600=4.19)而言,E.coli N-1生长速率增长42.2%,最终OD值增长2.2%;E.coli D-23生长速率增长30.9%,最终OD增长7.3%,E.coli F-26生长速率下降4.2%,最终OD下降11.4%;E.coliF-27生长速率增长49.2%,最终OD增长9.3%。
实施例3:驯化菌株和出发菌株在初始胁迫条件3.4g/L D-乳酸条件下的生长情况
具体步骤如下:
(1)将菌株E.coli K12 MG1655(对照)和实施例1得到的菌株E.coli N-1、E.coliD-23、E.coli F-26及E.coli F-27分别接种于M9液体培养基中进行活化,放在37℃摇床中220rpm培养过夜;
(2)分别以2%(V/V)的接种量将上述(1)中得到的种子液转接至含3.4g/L D-乳酸的M9液体培养基中,放在37℃摇床中220rpm培养;
(3)在(2)的培养过程中,每隔2小时取样,测定600nm波长下的OD值,绘制生长曲线(绘制得到的生长曲线如图2)。
结果如图2所示,经生长性能试验分析,培养16h后,较对照菌株(OD600=0.94),E.coli N-1、E.coli D-23、E.coli F-26及E.coli F-27可生长至OD值1.2-1.4之间,较对照菌株高了0.4-0.6。
实施例4:驯化菌株和出发菌株在最终胁迫条件4.2g/L D-乳酸条件下的生长情况
具体步骤如下:
(1)将菌株E.coli K12 MG1655(对照)和实施例1得到的菌株E.coli N-1、E.coliD-23、E.coli F-26及E.coli F-27分别接种于M9液体培养基中进行活化,放在37℃摇床中220rpm培养过夜;
(2)分别以2%(V/V)的接种量将上述(1)中得到的种子液转接至含4.2g/L D-乳酸的M9液体培养基中,放在37℃摇床中220rpm培养;
(3)在(2)的培养过程中,每隔2小时取样,测定600nm波长下的OD值,绘制生长曲线(绘制得到的生长曲线如图3)。
结果如图3所示,经生长性能试验分析,较对照而言,对照菌株在该培养条件下已不生长,E.coli N-1、E.coli D-23、E.coli F-26及E.coli F-27可生长至OD 0.8-1.3之间。
实施例5:驯化菌株在5.6g/L D-乳酸胁迫耐受性试验
具体步骤如下:
(1)将菌株E.coli K12 MG1655(对照)和实施例1得到的菌株E.coli N-1、E.coliD-23、E.coli F-26及E.coli F-27分别接种于M9液体培养基中进行活化,放在37℃摇床中220rpm培养过夜;
(2)分别以2%(V/V)的接种量将上述(1)中得到的种子液转接至新鲜的M9液体培养基中,37℃摇床中220rpm培养;
(3)收集(2)中培养至对数生长中期的菌体,离心(6000×g)5min,经0.85%的PBS缓冲液洗涤两次后重悬于等体积的新鲜的含5.6g/L D-乳酸的M9液体培养基中,胁迫不同时间。胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中,取10μL重悬液,稀释不同梯度点种于LB平板上测定活菌数和存活率。
结果如图4和表1所示,经耐受性实验分析,胁迫4h后,菌株E.coli N-1、E.coli D-23、E.coli F-26及E.coli F-27存活率为对照的53.3、249.0、1.75、4.63倍,驯化菌株对酸胁迫的耐受性提高。以效果最好的驯化株E.coli D-23进行菌株保藏,保藏编号为大肠杆菌CCTCC NO:M 2019676。
表1驯化菌株和对照菌株在5.6g/L乳酸胁迫耐受性试验的存活率
实施例6:驯化菌株在5.6g/L D-乳酸胁迫条件下的胞内ATP浓度的测定
具体步骤如下:
取对数生长中期的细胞按照实施例5步骤(3)的方法(5.6g/L D-乳酸)胁迫不同的时间取样,迅速转移到液氮中阻止代谢(5min),取出后离心(10000×g,4℃)10min并收集菌体。胞内ATP含量的测定使用碧云天的ATP测定试剂盒进行测定。ATP含量表示为nmol/mg胞内蛋白。
经胞内ATP浓度的分析,由于多数酸胁迫过程需要消耗能量,如H+-ATPase可通过消耗胞内的ATP将质子泵出胞外,从而维持胞内pH的动态平衡。因此实验进一步研究了过表达ABC转运蛋白对胞内ATP水平的影响。
如图5所示,驯化株在初始状态的ATP值均高于对照菌株,随着胁迫时间的延长,除菌株E.coli F-26外,其余3株驯化株可以保持比对照菌株更高的胞内ATP浓度,如胁迫3h后,菌株E.coli N-1、E.coli D-23、E.coli F-26及E.coli F-27的ATP浓度为对照的2.12、1.69、0.22、1.33倍,以维持细胞的生理活性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一株大肠杆菌(Escherichia coli),已于2019年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2019676。
2.含有权利要求1所述大肠杆菌的微生物制剂。
3.如权利要求2所述的微生物制剂,其特征在于,含有活菌数≥106 CFU/g的大肠杆菌干菌体。
4.如权利要求2所述的微生物制剂,其特征在于,含有活菌数≥106 CFU/mL的大肠杆菌湿菌体。
5.权利要求1所述大肠杆菌在食品领域中的应用。
6.权利要求1所述大肠杆菌在制药领域中的应用。
7.权利要求1所述大肠杆菌在化妆品领域中的应用。
8.权利要求1所述大肠杆菌在生产生物塑料领域中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911198568.8A CN110724655B (zh) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 一株乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911198568.8A CN110724655B (zh) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 一株乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110724655A CN110724655A (zh) | 2020-01-24 |
CN110724655B true CN110724655B (zh) | 2022-04-15 |
Family
ID=69225825
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201911198568.8A Active CN110724655B (zh) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 一株乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110724655B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112359005B (zh) * | 2020-11-12 | 2022-03-25 | 江南大学 | 一种酸胁迫能力得到提高的大肠杆菌工程菌及应用 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100593571C (zh) * | 2005-04-26 | 2010-03-10 | 清华大学 | 一种提高微生物抗逆性的方法 |
MX2009008453A (es) * | 2009-08-07 | 2011-02-16 | Univ Nac Auta Noma De Ma Xico | Cepas de escherichia coli modificadas por ingenieria metabolica para la produccion de compuestos quimicos a partir de lignocelulosa hidrolizada, pentosas, hexosas u otras fuentes de carbono. |
CN105647912A (zh) * | 2014-12-01 | 2016-06-08 | 清华大学 | 抗酸表达盒及其筛选方法 |
TW201802239A (zh) * | 2016-07-14 | 2018-01-16 | 國立中正大學 | 生產乳酸菌與丁二酸之大腸桿菌 |
KR101844157B1 (ko) * | 2016-09-28 | 2018-03-30 | 롯데케미칼 주식회사 | D형 젖산 생산방법 |
CN107227285B (zh) * | 2017-06-07 | 2019-11-08 | 江南大学 | 一种抗酸胁迫元器件及其应用 |
-
2019
- 2019-11-29 CN CN201911198568.8A patent/CN110724655B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110724655A (zh) | 2020-01-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110747147B (zh) | 一株衣康酸胁迫抗性提高的大肠杆菌 | |
Liang et al. | Insect symbionts as valuable grist for the biotechnological mill: an alkaliphilic silkworm gut bacterium for efficient lactic acid production | |
CN112359005B (zh) | 一种酸胁迫能力得到提高的大肠杆菌工程菌及应用 | |
CN108441436B (zh) | 一种副干酪乳杆菌及其应用 | |
JP2012514991A (ja) | 細菌を単離するための方法 | |
CN110724655B (zh) | 一株乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌 | |
Li et al. | Enhancement of ε-poly-L-lysine production in Streptomyces griseofuscus by addition of exogenous astaxanthin | |
Kuppusamy et al. | Low-carbohydrate tolerant LAB strains identified from rumen fluid: Investigation of probiotic activity and legume silage fermentation | |
CN112442471B (zh) | 一种抗酸胁迫能力强的大肠杆菌工程菌及应用 | |
CN113980876B (zh) | 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用 | |
CN112391329B (zh) | 一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌及其应用 | |
CN108277186B (zh) | 一种作为农药表面活性剂的地衣芽孢杆菌及其应用 | |
CN109536427A (zh) | 一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌 | |
Josic et al. | Application of proteomics in biotechnology–microbial proteomics | |
Lee et al. | Isolation and identification of Burkholderia pyrrocinia CH-67 to control tomato leaf mold and damping-off on crisphead lettuce and tomato | |
CN109628366B (zh) | 一种提高乳酸菌抗酸胁迫能力的方法 | |
Dong et al. | Screening and identification of biosurfactant-producing lactic acid bacteria | |
CN108949664B (zh) | 一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用 | |
CN114231476B (zh) | 一种d-乳酸胁迫抗性提高的大肠杆菌工程菌及其应用 | |
Kalathera et al. | Differential evolution of cooperative traits in aggregative multicellular bacterium Myxococcus xanthus driven by varied population bottleneck sizes | |
KR100901190B1 (ko) | 항균활성을 갖는 락토코쿠스 락티스 젠64 및 이를 포함하는미생물제제 | |
RU2804275C1 (ru) | Штамм бактерий Bacillus mojavensis RCAM05965, обладающий антагонистической активностью по отношению к Candida albicans, Serratia marcescens, Escherichia coli и перспективный для производства пробиотика для человека и/или животных | |
CN116478879B (zh) | 一种用于降解除虫脲的菌株及其应用 | |
CN114672437B (zh) | 一株产有机酸的枯草芽孢杆菌g-1及其应用 | |
Gu et al. | Intestinal commensal bacteria promote Bactrocera dorsalis larval development through vitamin B6 synthesis pathway |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |