KR102690439B1 - 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 에르고티오네인의 대량생산방법 - Google Patents
에르고티오네인 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 에르고티오네인의 대량생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 에르고티오네인의 대량생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰에, 시스테인 대사 경로 관련 유전자인 cysE(serine acetyltransferase), cysK(cysteine synthase) 및 cysR(transcription activator)가 도입되고, 오페론 형태의 오탄당-인산 관련 유전자의 프로모터가 고발현성 H36 합성 프로모터로 치환되고, 오페론 형태의 황동화 경로 관련 유전자의 프로모터가 고발현성 합성프로모터인 H36 합성 프로모터로 치환되고, 에르고티오네인 생합성 관련 유전자인 egt1(ergothioneine biosynthesis protein 1) 및 egt2(hercynylcysteine sulfoxide lyase)가 도입되고, 코리네박테리움 글루타미쿰 내의 sdaA(L-serine dehydratase) 유전자가 제거된, 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물 및 상기 본 발명에 따른 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 재조합 미생물로부터 생산된 에르고티오네인을 수득하는 단계를 포함하는 에르고티오네인의 대량 생산방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 에르고티오네인의 대량생산방법에 관한 것이다.
에르고티오네인(ergothioneine)은 항산화 기능물질로서 인체에서 발견되는 물질이나 인간, 동물 및 고등식물 내에서는 생합성되지 못하여 외부로부터 흡수, 공급되어야만 하는 물질이다.
이러한 에르고티오네인은 인체에서 항산화 기능으로서 생체 내에서 항염증 작용과 세포의 정상적인 대사기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 식품산업에서는 식품보존제로, 화장품 산업에서는 UV 차단제로서 사용되고 있을 뿐만 아니라 최근에는 알츠하이머병의 예방 효과도 있는 것으로 알려져 있다.
이렇게 다양한 활성을 갖는 에르고티오네인의 기능이 밝혀지면서 식품, 의약, 화장품 및 사료 산업 등 다양한 분야에서 에르고티오네인에 대한 수요가 급증하고 있다.
한편, 현재 에르고티오네인 생산은 대부분이 버섯 자실체로부터 생산되고 있으나 생산량이 매우 적어 경제성이 낮은 문제점이 있다.
그러므로 에르고티오네인을 대량생산할 수 있는 새로운 기술개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 에르고티오네인을 대량생산할 수 있는 기술을 개발하기 위해 연구하던 중, 안정성이 인증된 그라스(GRAS) 균주로 알려진 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물을 대상으로 코리네박테리움 글루타미쿰 내의 오탄당-인산 경로, 황동화 경로, 시스테인 생산 경로, 메티오닌생산 경로 강화 및 에르고티오네인 생산 경로 도입을 위한 재조합 과정을 통해 에르고티오네인을 대량생산할 수 있는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물을 제조하였고, 상기 재조합 미생물을 통해 에르고티오네인을 높은 수율로 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 코리네박테리움 글루타미쿰에, 시스테인 대사 경로 관련 유전자인 cysE(serine acetyltransferase), cysK(cysteine synthase) 및 cysR(transcription activator)가 도입되고, 오페론 형태의 오탄당-인산 관련 유전자의 프로모터가 고발현성 H36 합성 프로모터로 치환되고, 오페론 형태의 황동화 경로 관련 유전자의 프로모터가 고발현성 합성프로모터인 H36 합성 프로모터로 치환되고, 에르고티오네인 생합성 관련 유전자인 egt1(ergothioneine biosynthesis protein 1) 및 egt2(hercynylcysteine sulfoxide lyase)가 도입되고, 코리네박테리움 글루타미쿰 내의 sdaA(L-serine dehydratase) 유전자가 제거된, 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 재조합 미생물로부터 생산된 에르고티오네인을 수득하는 단계를 포함하는, 에르고티오네인의 대량 생산방법을 제공하는 것이다.
그러므로 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰에, 시스테인 대사 경로 관련 유전자인 cysE(serine acetyltransferase), cysK(cysteine synthase) 및 cysR(transcription activator)가 도입되고, 오페론 형태의 오탄당-인산 관련 유전자의 프로모터가 고발현성 H36 합성 프로모터로 치환되고, 오페론 형태의 황동화 경로 관련 유전자의 프로모터가 고발현성 합성프로모터인 H36 합성 프로모터로 치환되고, 에르고티오네인 생합성 관련 유전자인 egt1(ergothioneine biosynthesis protein 1) 및 egt2(hercynylcysteine sulfoxide lyase)가 도입되고, 코리네박테리움 글루타미쿰 내의 sdaA(L-serine dehydratase) 유전자가 제거된, 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 cysE(serine acetyltransferase) 유전자는 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 cysK(cysteine synthase) 유전자는 서열번호 36의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 cysR(transcription activator) 유전자는 서열번호 37의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 오탄당-인산 관련 유전자는 tkt(transaldolase), tal(transaldolase), zwf(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase), opcA(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase) 및 pgl(6-phosphogluconolactonase)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 고발현성 H36 합성 프로모터는 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 황동화 경로 관련 유전자는 cysZ(sulfate transporter), cysDN(sulfate adenylyltransferase subunit 1,2), cysH(phosphoadenosine 5'-phosphosulfate reductase) 및 cysI(sulfite reductase [NADPH] hemoprotein beta-component)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 egt1(ergothioneine biosynthesis protein 1) 유전자는 서열번호 42의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 egt2(hercynylcysteine sulfoxide lyase) 유전자는 서열번호 43의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 egt1 및 egt2 유전자는 S.pombe(Schizosaccharomyces pombe) 유래인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 오페론 형태의 오탄당-인산 관련 유전자의 프로모터는 자연상태의 tkt 프로모터일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 오페론 형태의 황동화 경로 관련 유전자의 프로모터는 자연상태의 cys 프로모터일 수 있다.
또한 본 발명은, (1) 본 발명에 따른 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 (2) 상기 재조합 미생물로부터 생산된 에르고티오네인을 수득하는 단계를 포함하는, 에르고티오네인의 대량 생산방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에르고티오네인을 수득하는 것은 상기 재조합 미생물 또는 상기 재조합 미생물의 배양배지로부터 수득하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물은, 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물에 시스테인 대사 경로 관련 유전자인 cysE, cysK 및 cysR을 도입하고, 오페론 형태의 오탄당-인산 관련 유전자의 프로모터 및 오페론 형태의 황동화 경로 관련 유전자의 프로모터를 고발현성 H36 합성 프로모터로 치환시키고, 에르고티오네인 생합성 관련 유전자인 egt1 및 egt2를 도입하고 및 코리네박테리움 글루타미쿰 내의 sdaA(L-serine dehydratase) 유전자를 제거시켜 제조된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물로서, 상기 본 발명의 재조합 미생물은 황동화 경로, 시스테인 대사 경로 및 오탄당 인산 경로가 강화되어 종래 버섯 자실체로부터 소량 생산할 수 밖에 없었던 에르고티오네인을 고효율로 대량생산할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 DNA의 sdaA 유전자 제거를 위한 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 DNA의 cys 프로모터의 교체를 위한 CRISPR 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 DNA의 tkt 프로모터의 교체를 위한 CRISPR 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 코리네박테리움 글루타미쿰 내에 에르고티오네인 생산경로 도입을 위한 pEKEx2::egt1::egt2 과발현 재조합 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 코리네박테리움 글루타미쿰의 시스테인 생산경로 강화를 위한 pMT-c::cysEKR 과발현 재조합 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 6은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 지속 가능한 에르고티오네인의 생산을 위한 생합성 경로를 나타낸 것이다.
도 7은 코리네박테리움 글루타미쿰의 황동화 경로 및 시스테인 경로를 강화시킨 재조합 균주로부터 에르고티오네인의 생산능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 코리네박테리움 글루타미쿰의 오탄당 인산경로를 강화시킨 재조합 균주로부터 에르고티오네인의 생산능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 코리네박테리움 글루타미쿰의 황동화 경로, 시스테인 경로, 오탄당 인산 경로를 강화시킨 재조합 균주로부터 에르고티오네인의 생산능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 코리네박테리움 글루타미쿰의 황동화 경로, 시스테인 경로, 오탄당 인산 경로를 강화시킨 재조합 균주로부터 유가식 발효공정으로 배양하면서 세포성장 및 에르고티오네인의 생산능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 DNA의 cys 프로모터의 교체를 위한 CRISPR 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 DNA의 tkt 프로모터의 교체를 위한 CRISPR 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 코리네박테리움 글루타미쿰 내에 에르고티오네인 생산경로 도입을 위한 pEKEx2::egt1::egt2 과발현 재조합 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 코리네박테리움 글루타미쿰의 시스테인 생산경로 강화를 위한 pMT-c::cysEKR 과발현 재조합 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 6은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 지속 가능한 에르고티오네인의 생산을 위한 생합성 경로를 나타낸 것이다.
도 7은 코리네박테리움 글루타미쿰의 황동화 경로 및 시스테인 경로를 강화시킨 재조합 균주로부터 에르고티오네인의 생산능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 코리네박테리움 글루타미쿰의 오탄당 인산경로를 강화시킨 재조합 균주로부터 에르고티오네인의 생산능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 코리네박테리움 글루타미쿰의 황동화 경로, 시스테인 경로, 오탄당 인산 경로를 강화시킨 재조합 균주로부터 에르고티오네인의 생산능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 코리네박테리움 글루타미쿰의 황동화 경로, 시스테인 경로, 오탄당 인산 경로를 강화시킨 재조합 균주로부터 유가식 발효공정으로 배양하면서 세포성장 및 에르고티오네인의 생산능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 에르고티오네인을 고효율로 대량 생산할 수 있는 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물을 제공함에 특징이 있다.
앞서 종래기술에서도 언급한 바와 같이, 항산화, 항염 및 세포 내 다양한 대사기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 에르고티오네인은 현재 버섯 자실체로부터 생산되고 있으나 생산성이 매우 낮다는 한계가 있다.
이에 본 발명자들은 에르고티오네인을 대량 생산할 수 있는 방법을 연구하던 중, 에르고티오네인을 대량 생산할 수 있는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물을 제조하였으며, 상기 미생물의 배양을 통해 에르고티오네인을 대량 생산할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로 본 발명에서 제공하는 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물은, 코리네박테리움 글루타미쿰에, 시스테인 대사 경로 관련 유전자인 cysE(serine acetyltransferase), cysK(cysteine synthase) 및 cysR(transcription activator)가 도입되고, 오페론 형태의 오탄당-인산 관련 유전자의 프로모터가 고발현성 H36 합성 프로모터로 치환되고, 오페론 형태의 황동화 경로 관련 유전자의 프로모터가 고발현성 합성프로모터인 H36 합성 프로모터로 치환되고, 에르고티오네인 생합성 관련 유전자인 egt1(ergothioneine biosynthesis protein 1) 및 egt2(hercynylcysteine sulfoxide lyase)가 도입되고, 코리네박테리움 글루타미쿰 내의 sdaA(L-serine dehydratase) 유전자가 제거되어 있는 특징을 갖는다.
본 발명에 따른 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 미생물을 이용하였는데, 코리네박테리움 글루타미쿰은 안정성을 인정받은 그라스(GRAS) 균주이며 히스티딘, 시스테인, 메티오닌을 생산할 수 있는 균주이므로 본 발명자들은 재조합 미생물의 대상으로 코리네박테리움 글루타미쿰을 선택하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰을 이용하여 에르고티오네인을 대량 생산할 수 있기 위해, 본 발명자들은 상기 코리네박테리움 글루타미쿰에 내재되어 있는 sdaA 유전자를 제거하여 시스테인 경로를 강화시켰고, sdaA 유전자가 제거된 균주를 기반으로 황동화 경로 강화를 위해 상기 황동화 경로 관련 유전자들의 자연상태의 프로모터, 즉 cys 프로모터를 고발현성 H36 합성 프로모터로 치환시켰다.
본 발명에서 상기 자연상태의 cys 프로모터는 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 cys 프로모터의 고발현성 H36 합성 프로모터로의 치환을 통해 오페론 형태의 황동화 경로 관련 유전자인 cysZ(sulfate transporter), cysDN(sulfate adenylyltransferase subunit 1,2), cysH(phosphoadenosine 5'-phosphosulfate reductase) 및 cysI(sulfite reductase [NADPH] hemoprotein beta-component)의 발현 증가를 유도하여 재조합 미생물 내에서 시스테인의 경로를 강화시킴으로서 에르고티오네인의 전구체인 시스테인의 생산을 증가시킬 수 있다.
또한, 오탄당-인산 경로의 추가적인 강화를 위해 오페론 형태의 오탄당-인산 관련 유전자들의 자연상태의 프로모터, 즉 tkt 프로모터를 고발현성 H36 합성 프로모터로 치환시켰다.
상기 tkt 프로모터의 고발현성 H36 합성 프로모터로의 치환을 통해 오페론 형태의 오탄당-인산 경로 관련 유전자인 tkt(transaldolase), tal(transaldolase), zwf(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase), opcA(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase) 및 pgl(6-phosphogluconolactonase)의 발현 증가를 유도하여 재조합 미생물 내에서 오탄당-인산 경로를 강화시킴으로서 에르고티오네인의 전구체인 히스티딘의 생산을 증가시킬 수 있었다.
본 발명에서 상기 자연상태의 tkt 프로모터는 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한 상기 고발현성 H36 합성 프로모터는 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물은 L-시스테인 대사경로 관련 효소를 코딩하는 유전자인 cysE(serine acetyltransferase), cysK(cysteine synthase) 및 cysR(transcription activator) 유전자가 삽입되어 있는 특징이 있다.
상기 시스테인 대사 경로 관련 유전자의 코리네박테리움 글루타미쿰 내로의 도입은 상기 유전자를 포함하는 벡터, 즉, 재조합 벡터를 이용하여 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 내로 형질전환시켜, 재조합 균주에서 CysE, CysK 및 CysR 효소의 과발현을 유도시켰다. 과발현된 CysR는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 세포 외부의 황원을 세포 내부로 유입하고 유입된 황원을 설파이드로 전환하였으며, 이후, 높은 수준으로 과발현된 CysE는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주가 생산한 세포내 세린으로부터 아세틸세린으로 전환하고, 이후, 높은 수준으로 과발현된 CysK에 의해 생합성된 아세틸세린을 L-시스테인으로 전환하게 되어 에르고티오네인의 또 다른 전구체인 시스테인의 생산을 증가시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 cysE(serine acetyltransferase) 유전자는 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 cysK(cysteine synthase) 유전자는 서열번호 36의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 cysR(transcription activator) 유전자는 서열번호 37의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물은 에르고티오네인 생합성 관련 유전자인 egt1(ergothioneine biosynthesis protein 1) 및 egt2(hercynylcysteine sulfoxide lyase)가 삽입되어 있는 특징이 있다.
상기 에르고티오네인 생합성 관련 유전자인 egt1 및 egt2의 코리네박테리움 글루타미쿰 내로의 도입은 상기 유전자를 포함하는 벡터, 즉, 재조합 벡터를 이용하여 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 내로 형질전환시켜, 재조합 균주에서 egt1 및 egt2의 과발현을 유도할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 egt1 및 egt2의 유전자는 S. pombe(Schizosaccharomyces pombe) 유래의 것을 사용하였으며, 바람직하게, 상기 egt1(ergothioneine biosynthesis protein 1) 유전자는 서열번호 42의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 egt2(hercynylcysteine sulfoxide lyase) 유전자는 서열번호 43의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기와 같이 egt1 및 egt2 유전자의 도입은 재조합 미생물 내에서 egt1 및 egt2의 과발현을 유도하여 에르고티오네인 생합성 경로를 활성화시킴으로서 L-에르고티오네인의 생산을 증진시킬 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물은 시스테인 대사 경로 관련 유전자인 cysE(serine acetyltransferase), cysK(cysteine synthase) 및 cysR(transcription activator)가 도입되고, 오페론 형태의 오탄당-인산 관련 유전자의 프로모터가 고발현성 H36 합성 프로모터로 치환되고, 오페론 형태의 황동화 경로 관련 유전자의 프로모터가 고발현성 합성프로모터인 H36 합성 프로모터로 치환되고, 에르고티오네인 생합성 관련 유전자인 egt1(ergothioneine biosynthesis protein 1) 및 egt2(hercynylcysteine sulfoxide lyase)가 도입되고, 코리네박테리움 글루타미쿰 내의 sdaA(L-serine dehydratase) 유전자가 제거된, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
상기 본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물은 상기 미생물 내에서 오탄당-인산 경로(히스티딘 생산경로), 황동화 경로, 시스테인 생산경로 및 에르고티오네인 생합성 경로가 모두 강화되어 있는 특징을 가지며, 따라서 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰에 비해 에르고티오네인을 월등하게 우수한 효율로 대량생산할 수 있다.
나아가 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 미생물을 이용한 에르고티오네인의 대량 생산방법을 제공할 수 있다.
상기 방법은 바람직하게, (1) 본 발명의 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계 및 (2) 상기 재조합 미생물로부터 생산된 에르고티오네인을 수득하는 단계를 포함한다.
상기 (1) 단계의 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물은 앞서 기술한 오탄당-인산 경로(히스티딘 생산경로), 황동화 경로, 시스테인 생산경로 및 에르고티오네인 생합성 경로가 모두 강화된 본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
상기 (2) 단계에서 에르고티오네인의 수득은 상기 재조합 미생물 자체 또는 상기 재조합 미생물의 배양배지로부터 회수하여 얻을 수 있다.
본 발명에서, 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B(WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.
본 발명에서 "증폭"이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 동일한 효소를 코딩하는 다른 미생물 유래의 유전자를 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 증가시키는 것을 포괄하는 개념이다.
본 발명에서 “발현 조절 서열 (expression control sequence)”이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열로는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결 (operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 “발현 벡터”는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질감염”은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 이 숙주 세포의 예이다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성이 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
에르고티오네인 생산용 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물의 제조
본 발명자들은 에르고티오네인을 대량생산할 수 있는 재조합 미생물의 제조를 위해 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용하여 다음과 같은 방법으로 재조합 미생물을 제조하였다.
<1-1> 시스테인 경로강화를 위한
sdaA
유전자가 제거된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 제조
도 1에 나타낸 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 시스테인경로 강화를 위해 sdaA 유전자 제거 벡터를 제작하였다. sdaA 유전자의 제거를 위해 pK18mobsacB 벡터에 sdaA 유전자 기준 left arm과 right arm을 제작하여 pK18mobsacB-△sdaA 벡터를 제작하였다. 벡터의 제작을 위해 left arm은 코리네박테리움 글루타미쿰 atcc13032의 게놈 DNA로부터 제한효소서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머(△sdaA F(서열번호 1), △sdaA MR(서열번호 2))를 이용하여 PCR을 통해 증폭되었으며 1407bp의 left arm 서열(서열번호 5)을 확보하였다. right arm은 left arm으로부터 정방향 및 역방향 프라이머(△sdaA MF(서열번호 3), △sdaA R(서열번호 4))를 이용하여 OVERLAP-PCR을 통해 증폭되었으며 추가적으로 491bp의 right arm 서열(서열번호 6)을 확보하였다.
| 프라이머명 | 서열(5‘->3’) | 서열번호 |
| △sdaA F(EcoR1) | AAGAATTCCAACCCTGGTCAGCCAACTGAGTAG | 1 |
| △sdaA MR | AAACGTCAGGGAATACGACACCGTTCCCT | 2 |
| △sdaA MF | TATTCCCTGACGTTTGCTATTGCTGCCATGAAGT | 3 |
| △sdaA R | GGGTCTAGAGATCTCGTCGCAAAGCAAC | 4 |
이렇게 PCR 증폭으로 확보된 유전자(left arm 및 right arm)와 pK18mobsacB벡터는 pK18mobsacB-△sdaA 벡터의 제작을 위해 제한효소를 처리한 후 라이게이션 반응을 진행하였고, 이후 대장균 DH5a 균주와 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로 형질전환을 수행하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰으로 형질전환된 균주는 카나마이신이 포함된 BHI 플레이트에서 밤새도록 배양한 후, 1차 재조합 확인을 위해 콜로니 PCR을 진행하였다. 1차 재조합이 확인된 2차 재조합 진행을 위해 10% 수크로오즈가 포함된 LB 플레이트에서 30 ℃의 온도로 배양하였고, 이후 형성된 콜로니들은 카나마이신이 포함된 LB 플레이트와 10% 수크로오즈가 포함된 플레이트에서 각각 배양하였다. 이후 10% 수크로오즈 배지에서만 성장하는 콜로니를 선택하였고, sdaA 유전자의 제거를 확인함으로써 sdaA 유전자가 제거된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 확보하였다.
<1-2> 황동화 경로가 강화된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 제조
상기 실시예 <1-1>에서 제조된 sdaA 유전자가 제거된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 기반으로 다음으로 황동화 경로 강화를 위해 오페론으로 구성된 관련 유전자들의 자연상태의 프로모터를 고발현성 합성프로모터인 H36 프로모터로 교체를 위한 통합벡터(Integration vector)를 구축하였다. 이를 위해, left arm은 코리네박테리움 글루타미쿰 atcc13032의 게놈 DNA로부터 제한효소서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머(cys LA F(서열번호 7), cys LA R(서열번호 8))를 이용하여 PCR로 증폭되었고, 그 결과 서열번호 15의 600bp의 left arm 서열을 확보하였다. 또한 right arm은 left arm으로부터 정방향 및 역방향 프라이머(cys RA F(서열번호 9), cys RA R(서열번호 10))를 이용하여 PCR을 통해 증폭되었고, 그 결과 서열번호 16의 600bp에 해당하는 right arm 서열을 확보하였다. 이후, crRNA의 도입을 위해 정방향 및 역방향 프라이머 (GA_cys_crRNA_F(서열번호 11), GA_cys_crRNA_R(서열번호 12))를 이용하여 증폭하였으며, 그 결과 서열번호 17의 77 bp에 해당하는 crRNA 서열을 확보하였다. 또한, 자연상태 프로모터의 교체를 위해 H36 프로모터는 제한효소서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머(H36 BamH1 F(서열번호 13), H36 Xba1 R(서열번호 14))를 이용한 PCR을 통해 증폭되었고, 그 결과 서열번호 18의 74bp에 해당하는 H36 프로모터 서열을 확보하였다.
| 프라이머명 | 서열(5‘->3’) | 서열번호 |
| cysLA F(EcoR1) | ATAGAATTCGCCGGTGGAGAACACGACT | 7 |
| cysLA R(BamH1) | ATAGGATCCACCATTAGATTCATGAGACTGAAAGC | 8 |
| cysRA F(Xba1) | ATATCTAGAATGACAACAACCACCGGAAG | 9 |
| cysRA R(Sal1) | ATAGTCGACACGAATCGCATCGATAGCC | 10 |
| GA_cys_crRNA_F | AAGCTTGCATGGCGGCCGAATTTCTACTGTTGTAGATCGGATAGATCAAACCG | 11 |
| GA_cys_crRNA_R | TAAATGGATCTGCGGCCTGTCACTCGGTTTGATCTATCCGATCTAC | 12 |
| H36 F (BamH1) | ATAGGATCCTCTATCTGGTGCCCTAAACG | 13 |
| H36 R (Xba1) | ATATCTAGACATGCTACTCCTACCAACCA | 14 |
상기 과정으로 확보된 유전자(left arm-H36 프로모터-right arm)와 pJYS2_MCS 벡터는 pJYS2_LA_H36_RA 벡터의 제작을 위해 제한효소를 처리한 후 라이게이션 반응을 진행하였고, 이후 대장균 DH5a 균주에 도입한 후, 재조합 벡터를 수득하였다. 그런 뒤 CRISPR을 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 Cas12a가 포함된 pJYS1 벡터를 형질전환을 통에 도입하여 컴피턴트 세포주(Competent cell)로 제작하였고 이후 pJYS2_LA_H36_RA_crRNA 벡터를 형질전환을 통해 도입하여 CRISPR을 진행하였다. 여기서 상기 pJYS2_LA_H36_RA_crRNA 벡터의 구조는 도 2에 나타내었다. BHISG 배지에서 형성된 콜로니를 이용하여 콜로니 PCR을 진행한 후 시퀀싱을 통해 염기서열의 변화를 확인한 뒤, Curing을 통해 CRISPR 벡터를 제거하여 황동화 경로가 강화된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 확보하였다.
<1-3> 오탄당-인산 경로가 강화된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 제조
다음으로, 오탄당-인산 경로(pentose phosphate pathway)의 강화를 위해 오페론으로 구성된 관련 유전자들의 자연상태의 프로모터를 고발현성 합성프로모터인 H36 프로모터로 교체하기 위한 통합벡터(Integration vector)를 구축하였다. 이를 위해 left arm은 코리네박테리움 글루타미쿰 atcc13032의 게놈 DNA로부터 제한효소서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머(tkt LA F(서열번호 19), tkt LA R(서열번호 20))를 이용하여 PCR을 통해 증폭되었으며, 그 결과, 서열번호 25의 587bp의 left arm 서열을 확보하였다. right arm은 left arm으로부터 정방향 및 역방향 프라이머(tkt RA F(서열번호 21), tkt RA R(서열번호 22))를 이용하여 PCR을 통해 증폭되었으며, 그 결과, 서열번호 26의 600bp에 해당하는 right arm 서열을 확보하였다. 또한 crRNA의 도입을 위해 정방향 및 역방향 프라이머 (GA_cys_crRNA_F(서열번호 11), GA_cys_crRNA_R(서열번호 12))를 이용하여 서열번호 27의 79bp crRNA 서열을 확보하였다. 또한 자연상태의 프로모터의 교체를 위해 H36 프로모터는 제한효소서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머(H36 BamH1 F(서열번호 23), H36 Xba1 R(서열번호 24))를 이용하여 PCR을 통해 증폭되었으며, 그 결과, 서열번호 28의 74bp에 해당하는 H36 프로모터 서열을 확보하였다.
| 프라이머명 | 서열(5‘->3’) | 서열번호 |
| tkt LA F(EcoR1) | ATATGAATTCTTAAGTTGTGAGTCCTTAT | 19 |
| tkt LA R(Xma1) | ATACCCGGGCAATCTTAAGTCTGGGA | 20 |
| tkt RA F(Xba1) | ATATCTAGATTGACCACCTTGACGCTGTCACCTG | 21 |
| tkt RA R(Sal1) | ATAGTCGACCAGCTGCTGGGTGCCAGCGA | 22 |
| H36 F (BamH1) | ATAGGATCCTCTATCTGGTGCCCTAAACG | 23 |
| H36 R (Xba1) | ATATCTAGACATGCTACTCCTACCAACCA | 24 |
확보된 유전자(left arm-H36 promoter-right arm)와 pJYS2_MCS 벡터는 pJYS2_LA_H36_RA 벡터의 제작을 위해 제한효소를 처리한 후 라이게이션 반응을 진행하였고, 이후 대장균(Escherichia coli) DH5a 균주에 도입한 다음, 재조합 벡터를 수득하였다. 이후 CRISPR을 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 Cas12a가 포함된 pJYS1 벡터를 형질전환을 통에 도입하여 컴피턴트 세포주로 제작하였고 이후 pJYS2_LA_H36_RA 벡터를 형질전환을 통해 도입하여 CRISPR을 진행하였다. BHISG 배지에서 형성된 콜로니를 이용하여 콜로니 PCR을 진행한 후 시퀀싱을 통해 염기서열의 변화를 확인한뒤 Curing을 통해 CRISPR 벡터를 제거하여 오탄당 인산 경로가 강화된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 확보하였다. 상기와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 DNA의 tkt 프로모터의 교체를 위한 CRISPR 벡터는 도 3에 나타내었다.
<1-4> 시스테인 대사경로가 강화된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 제조
상기 <1-3>을 통해 제조된 오탄당-인산경로, 황동화 경로 및 세린-시스테인 경로가 강화된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 대상으로 추가적으로 시스테인 대사경로 강화를 위한 유전자의 도입을 위해, cysEKR 과발현 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환용 재조합 벡터인 pMT_c::cysEKR을 제작하였다. pMT_c::cysEKR의 제작을 위해 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 DNA로부터 cysE, cysK, cysR를 증폭하였는데, cysE의 증폭은 pMT_c 벡터로의 클로닝을 위해 벡터의 해당 제한효소 서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머(cysE F(서열번호 29), cysE R(서열번호 30))를 이용하여 PCR을 수행하였고 그 결과 서열번호 35의 549bp의 cysE 유전자를 확보하였다. pMT_C::cysEK의 개발을 위해 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 DNA로부터 cysK를 증폭하였는데, cysK의 증폭은 pMT_c::cysE 벡터로의 클로닝을 위해 벡터의 해당 제한효소 서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머(cysK F(서열번호 31), cysK R(서열번호 32))를 이용하여 PCR을 수행하였고, 그 결과 서열번호 36의 957bp의 cysK 유전자를 확보하였다. pMT_C::cysEKR의 개발을 위해 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 DNA로부터 cysR를 증폭하였는데, cysR의 증폭은 pMT_c::cysEK 벡터로의 클로닝을 위해 벡터의 해당 제한효소 서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머(cysR F(서열번호 33), cysR R(서열번호 34))를 이용하여 PCR을 수행하였고, 그 결과 서열번호 37의 1167bp의 cysR 유전자를 확보하였다.
| 프라이머명 | 서열(5‘->3’) | 서열번호 |
| cysE F (BamH1) | ATAGGATCCATGATCCGTGAAGATCTCGC | 29 |
| cysE R (Xma1) | ATACCCGGGTTAAATGTAATAGTCCGGATCGACG | 30 |
| cysK F (Xma1) | ATACCCGGGAAGGAGATATAGATGATTGGAGCACCACCC | 31 |
| cysK R (Kpn1) | ATAGGTACCTTAGTCGCGGATGTCTTCG | 32 |
| cysR F (Kpn1) | ATAGGTACCAAGGAGATATAGATGATTGGCTATGGTTTACCT | 33 |
| cysR F (Not1) | ATAGCGGCCGCTTAGGGTACGAGAGTAAGTGGC | 34 |
각각의 유전자를 발현하는 제조합 벡터를 구축하기 위해 PCR을 통해 증폭된 유전자들과 pMT-tac 벡터를 제한효소 처리한 후, 라이게이션 반응을 진행하여 도 5의 벡터를 제조한 후, 대장균 DH5a 균주와 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로 형질전환을 진행하여 시스테인 대사경로가 강화된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 확보하였다.
<1-5> 에르고티오네인 생합성 경로가 도입된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 제조
마지막으로 상기 실시예 <1-4>에서 재조된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 대상으로 시스테인/메티오닌 대사경로 강화를 통한 에르고티오네인 생합성 경로 도입을 위해, S. pombe 유래의 에르고티오네인 생합성 유전자인 egt1과 egt2를 증폭하여 사용하였다. 먼저 egt1 유전자는 S. pombe의 게놈 DNA를 주형으로 하고 정방향 및 역방향(egt1 F(서열번호 38), egt1 R(서열번호 39))프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭하여 서열번호 42의 egt1 유전자를 수득하였고, egt2 유전자는 S. pombe의 게놈 DNA를 주형으로 하고 정방향 및 역방향 (egt2 F(서열번호 40), egt2 R(서열번호 41))프라이머를 이용한 PCR 증폭으로 서열번호 43의 egt2 유전자를 수득하였다.
| 프라이머명 | 서열(5‘->3’) | 서열번호 |
| egt1_F(Sal1) | GTGGTCGACATGACAGAAATAGAAAACATTGGC | 38 |
| egt1_R (BamH1) | GTGGGATCCTTAGTTTTTGACTAGTCTAGCTCC | 39 |
| egt2_F (BamH1) | GTGGGATCCAAGGAGATATAGATGGCTGAAAACAACGTCTAC | 40 |
| egt2_R (Kpn1) | ATAGGTACCTCAAAGAGAGCAGAAGTCTTTAAT | 41 |
상기 과정으로 증폭된 egt1 및 egt2 유전자의 과발현 재조합 벡터의 제조를 위해 pEKEx2 벡터에 제한효소를 처리한 후, 라이게이션 반응을 진행하여 도 4의 재조합 벡터를 제조하였고, 이후 대장균 DH5a 균주와 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로 형질전환을 수행하여, 최종적으로 오탄당-인산경로, 황동화 경로, 시스테인 생산경로, 메티오닌 생산경로 및 에르고티오네인 생산 경로까지 도입된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 확보하였다.
<실시예 2>
본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 이용한 에르고티오네인의 대량생산 확인
<2-1> 황동화 경로 및 시스테인 경로가 강화된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 이용한 에르고티오네인의 생산능 확인
상기 실시예들에서 제조된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주들에 대한 에르고티오네인 생산량을 분석하였다. 모든 재조합 균주들은 50ml의 CGAF 배지를 포함한 250ml 진탕 삼각 플라스크에서 30°C의 온도 및 200 rpm의 조건으로 48시간 배양하였고, 이후 배양 시간에 따른 O.D 값, cys 유전자들의 발현수준, 황산염(sulfate) 및 L-에르고티오네인의 생산량을 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 야생형 균주에 비해 재조합 균주에서 cysH 및 cysN 유전자 발현량이 증가된 것으로 나타났고(도 7b), 황산염의 양도 야생형 균주에서는 4.3mM인 것으로 나타난 반면 본 발명의 재조합 균주에서는 7.45mM로 나타나 황산염의 양도 증가된 것으로 나타났다(도 7c).
또한, 에르고티오네인 생산량을 분석한 결과, 황동화 경로가 강화된 균주에서는 약 44.99 mg/L의 에르고티오네딘이 생산된 것으로 나타났고, 오탄당 인산 경로, 황동화 경로, 시스테인 경로 및 에르고티오네인 생합성 경로가 모두 도입된 재조합 균주에서는 66.48 mg/L의 에르고티오네인을 생산할 수 있는 것으로 나타났다(도 7d).
<2-2> 오탄당 인산 경로가 강화된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 이용한 에르고티오네인의 생산능 확인
상기 실시예들에서 제조된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주들에 대한 에르고티오네인 생산량을 분석하였다. 구체적으로 오탄당 인산경로가 강화된 균주에 에르고티오네인 생합성 강화 경로의 추가에 따른 에르고티오네인 생산량을 분석하였다. 모든 재조합 균주들은 50ml의 CGAF 배지를 포함한 250ml 진탕 삼각 플라스크에서 30°C의 온도 및 200 rpm의 조건으로 48시간 배양하였고, 배양 시간에 따른 O.D 값 및 L-에르고티오네인의 생산량을 측정하였다.
분석 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 오탄당 인산경로 강화 균주에 에르고티오네인 경로가 도입된 재조합 균주에서 약 63.17 mg/L의 에르고티오네인이 생합성 됨을 확인하였고, 상기 균주에 시스테인 경로까지 추가 강화된 재조합 균주에서는 약 84.99 mg/L의 에르고티오네인이 생산됨을 확인할 수 있었다.
<2-3> 황동화 경로강화, 오탄당 인산 경로강화, 시스테인 경로강화 및 에르고티오네인 생산경로가 도입된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 이용한 에르고티오네인의 생산능 확인
실험에 사용된 모든 재조합 균주들은 50ml의 CGAF 배지를 포함한 250ml 진탕 삼각 플라스크에서 30°C의 온도 및 200 rpm의 조건으로 48시간 배양하였고, 배양 시간에 따른 O.D 값 및 L-에르고티오네인의 생산량을 측정하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 황동화 경로가 강화된 균주에 추가적으로 합성프로모터를 도입하여 오탄당 인산경로를 강화시킨 재조합 균주를 제조하였고, 상기 균주에 에르고티오네인 생산경로를 추가 도입하여 제조한 재조합 균주에서는 에르고티오네인 생산량이 약 66.38 mg/L인 것으로 나타났다.
한편, 상기 에르고티오네인 생산경로까지 추가된 균주에 추가적으로 시스테인 경로 강화를 유도한 재조합 균주에서는 가장 높은 수율의 132.80 mg/L에 해당하는 에르고티오네인을 생산할 수 있는 것으로 나타났다(도 9c). 최종적으로 상기 균주를 유가식 공정을 통해 배양하였을 때, 316.76 mg/L의 에르고티오네인이 생산됨을 확인하였다(도 10).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 황동화 경로강화, 오탄당 인산 경로강화, 시스테인 경로강화 및 에르고티오네인 생산경로를 모두 도입하여 제조된 본원발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 이용할 경우, 매우 높은 수율로 에르고티오네인을 대량 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Korea University
<120> Recombinant microorganism for producing ergothioneine and method
for preparing ergothioneine using thereof
<130> NPDC98379
<160> 45
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del sdaA F(EcoR1) primer
<400> 1
aagaattcca accctggtca gccaactgag tag 33
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del sdaA MR primer
<400> 2
aaacgtcagg gaatacgaca ccgttccct 29
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del sdaA MF primer
<400> 3
tattccctga cgtttgctat tgctgccatg aagt 34
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del sdaA R primer
<400> 4
gggtctagag atctcgtcgc aaagcaac 28
<210> 5
<211> 1407
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Left arm(del sdaA) DNA sequence
<400> 5
gaattccaac cctggtcagc caactgagta gtttttctga aactaaggag acacattatg 60
cgaaagctca ctgttgttac cgcaggcctt tctaacccgt ccaccactcg ctccgtggcg 120
gatcaactca ccaaggcagt ccaaaccgct gtttctgctc gtggcgaatc ctggatattg 180
aagtaattga aatccgagac ctgatctttg atctcgctac ctcattcaca agcgccggca 240
tgagctcccc agcacttgac gctgcaaaac agcgccttgc tgaatccgat ggcctgatcg 300
ctgttacccc agtatttacc gcgagctact ccggcatctt caagatgttc tttgatgtcc 360
tggaccccaa gaccattgtg ggtctgccca ccatcattgc ggcatctgct ggaacggcac 420
gccactcatt ggttctcgac cacgccatcc gaccactgtt tacctacttg cgagcagttg 480
tcgtacccac cggcgtgttc gcagccacgg aagatttcgg cactgaagct ggcgcagaca 540
ttgaacgtcg cgtgaaccgc gcagctggcg aattagcgac actcatgttg caggattact 600
ccagtgtgca aggccttggg ggcgcaaccg cgaaccaaga cgctgacctt tccttccgtc 660
gcaccactgg cgtgaccccg ggagagaact tcagcagctt tgccgatctt ctcaaaggac 720
acgacggaaa cggctaaatt cgcggatctc cgtttaaggc attgaagcat ttggaggccc 780
caagacatga cccagaccct gtaaagcgct taaacggcgt tttagagggt catagttttg 840
ggacaagtgg gacaagtgtg aatcctgaaa gcttccaggg caaggatcca ccacaaaccg 900
gccatcgccc tttggaatcg gtccgaaaat tgcaggtaca gagcctttta ccgagaaaat 960
ccaccacaga ttgctgaaat ttcgtgatct gtggtggatt cgtgcaactt cagactctta 1020
cggaggcgat ggaccaaaaa caactacaat caagcagatc accttgtaca ccaccataga 1080
aaaggcccac cctcagccat ggctatcagt gttgttgatc tatttagcat cggtatcgga 1140
ccatcatcct cacataccgt cggccccatg agagccgccc tcacgtatat ctctgaattt 1200
cccagctcgc atgtcgatat cacgttgcac ggatcccttg ccgccaccgg taaaggccac 1260
tgcactgacc gggcggtatt actgggtctg gtgggatggg aaccaacgat agttcccatt 1320
gatgctgcac cctcacccgg cgcgccgatt cctgcgaaag gttctgtgaa cgggccaaag 1380
ggaacggtgt cgtattccct gacgttt 1407
<210> 6
<211> 491
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Right arm(del sdaA) DNA sequence
<400> 6
gctattgctg ccatgaagtc catcaatgcg gcaaggcttg cccggattgg tgatggcaac 60
aatcgcgtga gtttggatga tgtggtggtc acgatggctg ccaccggccg ggacatgctg 120
accaaatata aggaaacgtc ccttggtggt ttggcaacca ccttgggctt cccggtgtcg 180
atgacggagt gttagcggta cggctttaac acggcttgga ttttgtcttg cttggcgagg 240
taggactggc actgggcgtc gataagctca gctgaccacc cggtgacctg cgccattgct 300
tcggccgtcg cacgcacggc agccggttgc acataaccca gcgtgccgag cacgatgcga 360
cgatccagca cgtccgccag gtcgacggcc gcctcctcgg cgacagcaaa aacggcctgc 420
gccgcgatat caaggttgtc tgggtcaagt cggcgcccca ggtcgggttg ctttgcgacg 480
agatctctag a 491
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cysLA F(EcoR1) primer
<400> 7
atagaattcg ccggtggaga acacgact 28
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cysLA R(BamH1) primer
<400> 8
ataggatcca ccattagatt catgagactg aaagc 35
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cysRA F(Xba1) primer
<400> 9
atatctagaa tgacaacaac caccggaag 29
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cysRA R(Sal1) primer
<400> 10
atagtcgaca cgaatcgcat cgatagcc 28
<210> 11
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GA_cys_crRNA_F primer
<400> 11
aagcttgcat ggcggccgaa tttctactgt tgtagatcgg atagatcaaa ccg 53
<210> 12
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GA_cys_crRNA_R primer
<400> 12
taaatggatc tgcggcctgt cactcggttt gatctatccg atctac 46
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H36 F (BamH1) primer
<400> 13
ataggatcct ctatctggtg ccctaaacg 29
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H36 R (Xba1) primer
<400> 14
atatctagac atgctactcc taccaacca 29
<210> 15
<211> 600
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cys left arm sequence
<400> 15
gccggtggag aacacgactg catcgtagta gtcgcggagt tcttcgacgg tgatgtcttt 60
gccgatttca atgttaccga gcaggcgcag gcgtggcttg tccaacacgt tgtgcaggga 120
cttaacgatg cccttgatgc gtgggtggtc tggagcaacg ccgtaacgga tgagtccgaa 180
cggtgcaggc atttgctcga aaaggtcaac gaacacttcg cgctcttcat tgcggatgag 240
gaggtcggat gcgtaaatgc cagcagggcc agctccgatg acggctacgc gcaggggagt 300
tgtcatgtgt ttgaagttgc ctttcgtgag cccttttatg gaaacaaggg tgtgaaaatc 360
aagtagttaa aggtgtttca agtccaggct gtttaacact cctagaccgc ttggtctgta 420
aacgtagcag cgaaatgcga caatgcgaag acttttgctt aattaaattc aaactccatg 480
aaaaaactag acagatcggt ctattatatt cacggtgaac ctaacctaat atccccaggt 540
taattcattt aaacgggcat taggtgactc cattgctttc agtctcatga atctaatggt 600
600
<210> 16
<211> 600
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cys right arm sequence
<400> 16
atgacaacaa ccaccggaag tgcccggcca gcacgtgccg ccaggaagcc taagcccgaa 60
ggccaatgga aaatcgacgg caccgagccg cttaaccatg ccgaggaaat taagcaagaa 120
gaacccgctt ttgctgtcaa gcagcgggtc attgatattt actccaagca gggtttttct 180
tccattgcac cggatgacat tgccccacgc tttaagtggt tgggcattta cacccagcgt 240
aagcaggatc tgggcggtga actgaccggt cagcttcctg atgatgagct gcaggatgag 300
tacttcatga tgcgtgtgcg ttttgatggc ggactggctt cccctgagcg cctgcgtgcc 360
gtgggtgaaa tttctaggga ttatgctcgt tccaccgcgg acttcaccga ccgccagaac 420
attcagctgc actggattcg tattgaagat gtgcctgcga tctgggagaa gctagaaacc 480
gtcggactgt ccaccatgct tggttgcggt gacgttccac gtgttatctt gggctcccca 540
gtttctggcg tagctgctga agagctgatc gatgccaccc cggctatcga tgcgattcgt 600
600
<210> 17
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> crRNA sequence
<400> 17
aagcttgcat ggcggccgaa tttctactgt tgtagatcgg atagatcaaa ccgagtgaca 60
ggccgcagat ccattta 77
<210> 18
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H36 promoter sequence
<400> 18
tctatctggt gccctaaacg ggggaatatt aacgggccca gggtggtcgc accttggttg 60
gtaggagtag catg 74
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt LA F(EcoR1) primer
<400> 19
atatgaattc ttaagttgtg agtccttat 29
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt LA R(Xma1) primer
<400> 20
atacccgggc aatcttaagt ctggga 26
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt RA F(Xba1) primer
<400> 21
atatctagat tgaccacctt gacgctgtca cctg 34
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt RA R(Sal1) primer
<400> 22
atagtcgacc agctgctggg tgccagcga 29
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H36 F (BamH1) primer
<400> 23
ataggatcct ctatctggtg ccctaaacg 29
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H36 R (Xba1) primer
<400> 24
atatctagac atgctactcc taccaacca 29
<210> 25
<211> 587
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt left arm sequence
<400> 25
ttaagttgtg agtccttatt atttaaatat ccctgcggtg agtgtgcacc ttgcgttgaa 60
ggcccagact ctgacagaag cgtcagagtg tttactcaag acattttcta agacacacgg 120
caaattagtc ggatgaagtt aattaaaagt tcccgaatca atctttttaa tgttttcaaa 180
ccatttgaag gtgtgctgac ccaggtggac gccaaccttt aaaaagcttc agacttttat 240
ttccacttca taaaaactgc ctgtgacgat tccgttaaag attgtgccaa atcactgcgc 300
aaaactcgcg cggaaccaga ccttgccatg ctatcgccta ttcacactat ttgagtaatc 360
ggaaatagat gggtgtagac gcttgattgg cggacggttc acagcggacg atttcaggcc 420
ctcgtagctc gagagtttga aggggtccga ttcgttccgt tcgtgacgct ttgtgaggtt 480
ttttgacgtt gcaccgtatt gcttgccgaa catttttctt ttcctttcgg tttttcgaga 540
attttcacct acaaaagccc acgtcacagc tcccagactt aagattg 587
<210> 26
<211> 600
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt right arm sequence
<400> 26
ttgaccacct tgacgctgtc acctgaactt caggcgctca ctgtacgcaa ttacccctct 60
gattggtccg atgtggacac caaggctgta gacactgttc gtgtcctcgc tgcagacgct 120
gtagaaaact gtggctccgg ccacccaggc accgcaatga gcctggctcc ccttgcatac 180
accttgtacc agcgggttat gaacgtagat ccacaggaca ccaactgggc aggccgtgac 240
cgcttcgttc tttcttgtgg ccactcctct ttgacccagt acatccagct ttacttgggt 300
ggattcggcc ttgagatgga tgacctgaag gctctgcgca cctgggattc cttgacccca 360
ggacaccctg agtaccgcca caccaagggc gttgagatca ccactggccc tcttggccag 420
ggtcttgcat ctgcagttgg tatggccatg gctgctcgtc gtgagcgtgg cctattcgac 480
ccaaccgctg ctgagggcga atccccattc gaccaccaca tctacgtcat tgcttctgat 540
ggtgacctgc aggaaggtgt cacctctgag gcatcctcca tcgctggcac ccagcagctg 600
600
<210> 27
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> crRNA sequence
<400> 27
aagcttgcat ggcggccgga atttctactg ttgtagatac acatttgaac cacagttggt 60
tcggccgcag atccattta 79
<210> 28
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H36 promoter sequence
<400> 28
tctatctggt gccctaaacg ggggaatatt aacgggccca gggtggtcgc accttggttg 60
gtaggagtag catg 74
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cysE F (BamH1) primer
<400> 29
ataggatcca tgatccgtga agatctcgc 29
<210> 30
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cysE R (Xma1) primer
<400> 30
atacccgggt taaatgtaat agtccggatc gacg 34
<210> 31
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cysK F (Xma1) primer
<400> 31
atacccggga aggagatata gatgattgga gcaccaccc 39
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cysK R (Kpn1) primer
<400> 32
ataggtacct tagtcgcgga tgtcttcg 28
<210> 33
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cysR F (Kpn1) primer
<400> 33
ataggtacca aggagatata gatgattggc tatggtttac ct 42
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cysR F (Not1) primer
<400> 34
atagcggccg cttagggtac gagagtaagt ggc 33
<210> 35
<211> 549
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cysE DNA sequence
<400> 35
atgatccgtg aagatctcgc aaacgctcgt gaacacgatc cagcagcccg aggcgattta 60
gaaaacgcag tggtttactc cggactccac gccatctggg cacatcgagt tgccaacagc 120
tggtggaaat ccggtttccg cggccccgcc cgcgtattag cccaattcac ccgattcctc 180
accggcattg aaattcaccc cggtgccacc attggtcgtc gcttttttat tgaccacgga 240
atgggaatcg tcatcggcga aaccgctgaa atcggcgaag gcgtcatgct ctaccacggc 300
gtcaccctcg gcggacaggt tctcacccaa accaagcgcc accccacgct ctgcgacaac 360
gtgacagtcg gcgcgggcgc aaaaatctta ggtcccatca ccatcggcga aggctccgca 420
attggcgcca atgcagttgt caccaaagac gtgccggcag aacacatcgc agtcggaatt 480
cctgcggtag cacgcccacg tggcaagaca gagaagatca agctcgtcga tccggactat 540
tacatttaa 549
<210> 36
<211> 957
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cysK DNA sequence
<400> 36
atgattggag caccacccga catgggcaat gtgtacaaca acatcaccga aaccatcggc 60
cacaccccac tggtaaagct gaacaagctc accgaaggcc tcgacgcaac tgtcctggtc 120
aagcttgagt cattcaaccc agcaaactcc gtcaaggacc gtatcggtct ggccatcgtt 180
gaagatgcag agaagtccgg tgcactgaag ccaggcggca ccatcgttga agcaacctcc 240
ggcaacaccg gtatcgcact ggcaatggtc ggcgctgcac gcggatacaa cgttgttctc 300
accatgccgg agaccatgtc caacgagcgt cgcgttctcc tccgcgctta cggtgcagag 360
atcgttctta ccccaggtgc agcaggcatg cagggtgcaa aggacaaggc agacgaaatc 420
gtcgctgaac gcgaaaacgc agtccttgct cgccagttcg agaacgaggc aaacccacgc 480
gtccaccgcg acaccaccgc gaaggaaatc ctcgaagaca ccgacggcaa cgttgatatc 540
ttcgttgcaa gcttcggcac cggcggaacc gtcaccggcg ttggccaggt cctgaaggaa 600
aacaacgcag acgtacaggt ctacaccgtc gagccagaag cgtccccact tctgaccgct 660
ggcaaggctg gtccacacaa gatccagggc atcggcgcaa acttcatccc cgaggtcctg 720
gaccgcaagg ttctcgacga cgtgctgacc gtctccaacg aagacgcaat cgcattctcc 780
cgcaagctcg ctaccgaaga gggcatcctc ggcggtatct ccaccggcgc aaacatcaag 840
gcagctcttg accttgcagc aaagccagag aacgctggca aaaccatcgt caccgttgtc 900
accgacttcg gcgagcgcta cgtctccacc gttctttacg aagacatccg cgactaa 957
<210> 37
<211> 1167
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cysR DNA sequence
<400> 37
atgattggct atggtttacc tatgcccaat caggcccact tctctgcgtc ctttgcccgc 60
ccctctaccc cggctgcaaa gtgcatgcac catatccgcc tcggccagca actcattaga 120
aatgagctgg tcgaggccac aggtctgtcc caaccgactg tcacccgcgc agtcaccgct 180
ttaatgcagg caggtttggt tcgtgaacgc cctgatctca cactctcatc gggccctggt 240
cgtcccaata ttcctctaga actcgctcca agtccatgga ttcatgcagg cgtggcaatc 300
ggcaccaagt cttcctacgt cgctttgttt gataccaagg gtcgcaccct tcgtgatgcc 360
atgctggaaa tctcagcagc tgatttagat ccagacactt tcatcgaaca cctcattgct 420
ggtgtcaacc gcctcaccac tggtcttgat ctaccactgg taggtattgg tgttgccacc 480
tcaggaaaag tcaccaacgc aggcgttgtc accgcaagca acttgggctg ggatggcgtt 540
gatatcgctg gccgcctgaa ctaccaattc agcgttccag caaccgtggc atcagcaatt 600
cctgccatcg cagcttctga actgcaggct tccccacttc cccaccctga gcagccaact 660
cccatcacct tgaccttcta cgccgatgac tctgtgggcg cggcctacag caatgatttg 720
ggagtacatg tcattggacc actggctaca actcgtggat caggtttgga tactttgggc 780
atggctgccg aagatgcgct gagcacccaa ggtttcttaa gcagggtttc tgatcagggt 840
atctttgcca acagccttgg tgagctagtc accattgcta aagacaatga aaccgcacgg 900
gaattcctca acgatcgcgc gaccctgctg gctcacactg ccgcagaagc tgccgaaaca 960
gttaagccat ccaccctggt tctctcggga tcggcgtttt ccgaagatcc acaaggtcgg 1020
tcggtgttcg cttcccaatt gaagaaggaa tacgacgcag acattgagct ccggttgatc 1080
cccacccacc gggaaaacgt ccgcgcagca gctcgagcag tcgcacttga tcgactactc 1140
aacgagccac ttactctcgt accctaa 1167
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> egt1_F(Sal1) primer
<400> 38
gtggtcgaca tgacagaaat agaaaacatt ggc 33
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> egt1_R (BamH1) primer
<400> 39
gtgggatcct tagtttttga ctagtctagc tcc 33
<210> 40
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> egt2_F (BamH1) primer
<400> 40
gtgggatcca aggagatata gatggctgaa aacaacgtct ac 42
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> egt2_R (Kpn1) primer
<400> 41
ataggtacct caaagagagc agaagtcttt aat 33
<210> 42
<211> 2322
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> egt1 DNA sequence
<400> 42
atgacagaaa tagaaaacat tggcgcatta gaagttctct tctctcctga atccatcgag 60
cagagcctca aacggtgtca actcccctcc actttattat acgatgaaaa aggtttacga 120
ctgtttgatg agattacgaa tttaaaagaa tactacctgt atgaaagtga gcttgatatt 180
ctgaagaagt tcagcgattc cattgccaac cagttactgt ctccagatct tcctaacacg 240
gttatagaat tagggtgtgg aaatatgcgc aaaacaaaac ttcttttaga tgcgtttgaa 300
aagaagggct gtgatgtgca tttttacgcc cttgacctta atgaagccga gttgcaaaaa 360
ggactgcagg agcttcgtca aactaccaat tatcagcatg ttaaggtgtc tggtatttgc 420
ggttgctttg aaagattgct acaatgtttg gacaggtttc gtagtgagcc caatagtcga 480
attagcatgt tgtacttggg tgcttcgatt ggtaattttg ataggaaatc cgcagcatca 540
tttttacgtt cgtttgccag tcgtttgaat attcatgaca accttttaat ctccttcgat 600
catagaaaca aggctgagct agtccaacta gcttacgatg atccttatcg tattactgaa 660
aagtttgaaa agaatatttt ggctagtgtc aatgcggttt ttggtgaaaa ccttttcgac 720
gaaaatgatt gggaatataa aagtgtctac gatgaagatc tcggtgttca tagggcctac 780
ttacaagcca aaaatgaagt tactgttatt aagggtccaa tgttttttca atttaaacct 840
agtcatttaa ttttgatcga agaaagttgg aagaatagcg atcaagaatg tcgtcaaatc 900
attgagaaag gtgattttaa attagtctct aagtatgaaa gtacgattgc agattactcg 960
acctatgtta ttaccaaaca atttcctgct atgcttcaac tccctcttca gccttgtcct 1020
tcgttagcag aatgggatgc tctacgcaaa gtatggcttt ttattacaaa taaattgctt 1080
aacaaagata acatgtacac cgcatggatt cctttgagac atcctccaat tttttacatc 1140
ggacatgtcc ctgtttttaa tgatatttat ctcacaaaga ttgtcaaaaa caaagcaact 1200
gctaacaaaa aacatttttg ggaatggttt caacgtggta tagatccgga cattgaagat 1260
ccctccaagt gccattggca ttctgaagtt cctgaaagct ggccttctcc tgaccaactt 1320
cgtgaatatg agaaagagtc ttgggaatat catattgtaa agttgtgcaa agcaatggat 1380
gaattgtcta cttctgaaaa gagaattctc tggctttgtt acgaacatgt agccatgcat 1440
gtggagacaa ctctttacat ctacgtacag tcatttcaaa atgcaaacca gactgtatca 1500
atttgcggat cacttcctga accagctgaa aaacttacga aagctccgtt atgggtgaat 1560
gtacctgaaa cggaaattgc agttggtatg cccttgacaa cacaatacac gagtgttgga 1620
tcaaatttgc aatcatccga tcttagtgcc catgaaaata cagatgaact tttttatttt 1680
gcgtgggata atgagaaacc aatgaggaag aaactggttt ctagcttttc tattgccaat 1740
cgtccaattt ctaacggtga atatttagat tttatcaata aaaagtcaaa aacagaaagg 1800
gtgtatccaa agcaatgggc ggagattgat ggaacgcttt acatacgaac catgtacggc 1860
ttattacccc ttgacgacta cttgggttgg cctgttatga cttcatacga cgatctaaac 1920
aattatgcga gctcccaagg atgcagacta ccaactgagg atgaactgaa ctgtttttac 1980
gatcgggttc tcgagagaac tgatgagcct tatgttagta ccgaaggaaa ggcaactggt 2040
tttcaacaat tgcacccttt agccctaagt gataattcaa gtaatcaaat attcacagga 2100
gcatgggaat ggacaagtac agttctggag aagcacgagg attttgaacc tgaagagctt 2160
tatccagatt atacacgaga tttctttgat ggaaagcata atgtcgtttt gggtggtagc 2220
tttgctacgg ctacgcgcat ttcaaataga agaagcttca ggaactttta ccaagctggc 2280
tataaatatg catggattgg agctagacta gtcaaaaact aa 2322
<210> 43
<211> 1179
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> egt2 DNA sequence
<400> 43
atggctgaaa acaacgtcta cggccatgaa atgaaaaagc attttatgct tgatcccgat 60
tacgtgaatg taaataacgg aagttgtgga acagaatctc ttgctgttta caataaacat 120
gtccaacttt taaaggaagc tcagagcaag ccagatttta tgtgcaatgc ctatatgccg 180
atgtacatgg aggctactcg aaatgaagtt gccaagctga taggcgcgga ttcaagtaat 240
atagtttttt gcaattccgc tacagatggg attagtacgg ttttgttgac atttccgtgg 300
gaacagaatg atgagatatt gatgctaaat gttgcctatc ctacttgtac atatgccgct 360
gattttgcaa agaatcagca taatttacga ttagacgtta tcgatgttgg ggtggaaatt 420
gatgaagatc tattccttaa agaagtagaa cagcgttttt tgcagtccaa gccgagagca 480
tttatctgtg atattttaag ttctatgccc gttatcttgt ttccttggga aaaagtcgta 540
aagctttgta aaaagtataa tattgttagc attattgatg gtgctcatgc cataggtcat 600
attcctatga atttggctaa tgttgatcct gattttttgt ttaccaatgc tcataaatgg 660
ttaaactcac cagctgcatg cactgtactc tatgtctcag ctaaaaatca caatctcatc 720
gaagcacttc ctctctcata cggttatgga ttaagagaaa aggaatcaat tgccgtagat 780
actcttacca atcggtttgt caattctttc aagcaagatt tacctaagtt tatagctgtt 840
ggtgaggcta ttaagtttcg aaaatccatt ggaggggaag aaaagattca acaatattgt 900
catgaaatag ctttaaaggg agccgaaatt atttctaaag aactgggcac ttcctttatc 960
aaacctccat acccagttgc aatggtaaac gtcgaagttc ccttacgcaa cattccctcc 1020
atagaaacac agaaagtatt ttggcctaaa tataatacat tccttcgatt tatggaattt 1080
aaaggaaaat tttacactag acttagcggt gcggtgtatt tagaagaatc agatttctat 1140
tatattgcta aagttattaa agacttctgc tctctttga 1179
<210> 44
<211> 213
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tkt promoter sequence
<400> 44
atcacacctt tgacacattt gaaccacagt tggttataaa atgggttcaa catcactatg 60
gttagaggtg ttgacgggtc agattaagca aagactactt tcggggtaga tcacctttgc 120
caaatttgaa ccaattaacc taagtcgtag atctgatcat cggatctaac gaaaacgaac 180
caaaactttg gtcccggttt aacccaggaa gga 213
<210> 45
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cys promoter sequence
<400> 45
ggggagttaa tccttaaaga gctagtgaag tacatgtcac tcggtttgat ctatccgcaa 60
acttagacgt accgctctgt ctagacca 88
Claims (12)
- 코리네박테리움 글루타미쿰에,
시스테인 대사 경로 관련 유전자인 cysE(serine acetyltransferase), cysK(cysteine synthase) 및 cysR(transcription activator)가 도입되고,
오페론 형태의 오탄당-인산 관련 유전자인 tkt(transaldolase), tal(transaldolase), zwf(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase), opcA(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase) 및 pgl(6-phosphogluconolactonase)의 프로모터가 고발현성 H36 합성 프로모터로 치환되고,
오페론 형태의 황동화 경로 관련 유전자인 cysZ(sulfate transporter), cysDN(sulfate adenylyltransferase subunit 1,2), cysH(phosphoadenosine 5'-phosphosulfate reductase) 및 cysI(sulfite reductase [NADPH] hemoprotein beta-component)의 프로모터가 고발현성 합성프로모터인 H36 합성 프로모터로 치환되고,
에르고티오네인 생합성 관련 유전자인 egt1(ergothioneine biosynthesis protein 1) 및 egt2(hercynylcysteine sulfoxide lyase)가 도입되고, 및
코리네박테리움 글루타미쿰 내의 sdaA(L-serine dehydratase) 유전자가 제거되어,
황동화 경로, 오탄당 인산화 경로, 시스테인 경로 및 에르고티오네인 생산 경로가 모두 강화된 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물. - 제1항에 있어서,
상기 cysE(serine acetyltransferase) 유전자는 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 것이고,
상기 cysK(cysteine synthase) 유전자는 서열번호 36의 염기서열로 이루어진 것이고,
상기 cysR(transcription activator) 유전자는 서열번호 37의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는,
황동화 경로, 오탄당 인산화 경로, 시스테인 경로 및 에르고티오네인 생산 경로가 모두 강화된 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 고발현성 H36 합성 프로모터는 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는,
황동화 경로, 오탄당 인산화 경로, 시스테인 경로 및 에르고티오네인 생산 경로가 모두 강화된 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 egt1(ergothioneine biosynthesis protein 1) 유전자는 서열번호 42의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는,
황동화 경로, 오탄당 인산화 경로, 시스테인 경로 및 에르고티오네인 생산 경로가 모두 강화된 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물. - 제1항에 있어서,
상기 egt2(hercynylcysteine sulfoxide lyase) 유전자는 서열번호 43의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는,
황동화 경로, 오탄당 인산화 경로, 시스테인 경로 및 에르고티오네인 생산 경로가 모두 강화된 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물. - 제1항에 있어서,
상기 egt1 및 egt2 유전자는 S.pombe(Schizosaccharomyces pombe) 유래인 것을 특징으로 하는,
황동화 경로, 오탄당 인산화 경로, 시스테인 경로 및 에르고티오네인 생산 경로가 모두 강화된 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물. - 제1항에 있어서,
상기 오페론 형태의 오탄당-인산 관련 유전자의 프로모터는 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 자연상태의 tkt 프로모터인 것을 특징으로 하는,
황동화 경로, 오탄당 인산화 경로, 시스테인 경로 및 에르고티오네인 생산 경로가 모두 강화된 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물. - 제1항에 있어서,
상기 오페론 형태의 황동화 경로 관련 유전자의 프로모터는 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 자연상태의 cys 프로모터인 것을 특징으로 하는,
황동화 경로, 오탄당 인산화 경로, 시스테인 경로 및 에르고티오네인 생산 경로가 모두 강화된 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물. - (1) 제1항의 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물을 유가식 공정으로 배양하는 단계; 및
(2) 상기 재조합 미생물로부터 생산된 에르고티오네인을 수득하는 단계를 포함하는,
에르고티오네인의 대량 생산방법. - 삭제
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| KR1020210139243A KR102690439B1 (ko) | 2021-10-19 | 2021-10-19 | 에르고티오네인 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 에르고티오네인의 대량생산방법 |
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2021
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Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Becker 등, MetabolicEngineering, Vol. 13, 페이지 159-168 (2011.01.15.)* |
| Wei 등, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 103, 페이지 1325-1338 (2018.12.18.)* |
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