KR102633804B1

KR102633804B1 - 재조합 바실러스 속 미생물 및 이를 이용한 모유올리고당 제조방법

Info

Publication number: KR102633804B1
Application number: KR1020200189491A
Authority: KR
Inventors: 홍은영; 박부수; 이상희; 권순규; 최은수
Original assignee: 주식회사 삼양사
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2024-02-05
Also published as: JP2024502061A; CN116761890A; WO2022145944A1; KR20220096753A; EP4273251A1

Abstract

본 발명은 재조합 바실러스 속 미생물 및 이를 이용한 모유올리고당 제조방법에 관한 것이다.

Description

재조합 바실러스 속 미생물 및 이를 이용한 모유올리고당 제조방법{Recombinant Bacillus genus microorganism and Method for producing human milk oligosaccharides using the same}

모유 중 함량이 가장 높은 올리고당 3가지를 포함하여 137종이 푸코실화 되어 그 비율이 약 77%이고, 남은 올리고당은 대부분 시알화 된 것(39개)으로 약 28%에 해당한다. 이 중, 특히 2’-푸코실락토오스와 3’-푸코실락토오스는 프리바이오틱 (prebiotic) 효과, 병원균 장내 부착 억제 효과 그리고 면역조절시스템 조절 효과 등을 가진다. Prebiotic 효과는 지금까지 가장 많은 연구가 진행되었는데, 모유의 모유올리고당은 유아의 장에서 초기에 우점종으로 자라는 Bifidobacterium bifidum의 생육을 선택적으로 증진시키는 반면 유해균에 의해서는 이용되지 못한다. 또한, 모유올리고당은 병원균의 장내 부착을 억제하는 것으로 알려져 있는데, 이는 장재 lectin과 결합하는 병원균의 세포벽 다당체 구조가 종종 모유올리고당의 일부 구조와 유사하기 때문이다. 따라서, 모유올리고당이 수용성 리간드 유사체를 제공하여 모유 수유 유아들이 병원균에 의한 감염에 내성을 갖는 것으로 보인다. 하지만, 여성의 약 20%는 2’-푸코실락토오스을 합성하는 푸코오스 전이효소의 변이로 인해 체내에서 이들을 제대로 합성하지 못하는 것으로 알려졌다. 이로 인하여 2’-푸코실락토오스의 산업적 생산이 필요한 실정이다.

모유올리고당의 일부는 대부분 포유동물 (영장류, 소, 돼지, 염소, 양 코끼리)의 젖에서도 소량 발견된다. 이 중 염소의 젖이 모유올리고당 조성과 가장 유사한데, 이로 인해 염소 젖 치즈 생산공정의 유청 부산물로부터 대규모 막 이용 분리 기술이 제시되었다. 또한, 최근 개발된 고체상 화학 합성법 (solid-phase synthesis)을 이용하면 하루 안에 Lewis X-Lewis Y 당을 생산할 수 있고, crystalline intermediate technology를 이용하면 2’-푸코실락토오스의 빠른 합성이 가능하게 되었다. 하지만, 위의 분리법이나 화학적 합성법의 개발에도 불구하고 모유올리고당의 산업화를 위한 대량생산에는 몇 가지 장애물이 남아있는데, 이는 본 기술들의 낮은 입체 선택성, 낮은 총 수득율과 독성 시약의 사용 등이 식품 또는 약품 산업에 적합하지 않기 때문이다. 따라서 보다 친환경적이고 수득율이 높은 생산법이 필요하게 되며 최근 미생물에 의한 고농도의 2’-FL 생산 방법이 보고 되는 추세이다. 그러나 2’-푸코실락토오스 생합성 유전자는 Bio Safety Level 2 균주 Helicobacter pylori에서 확보된 2’-푸코실락토오스를 사용하여 주로 모유 수유 대체용 분유 및 유아용 식품에 적용 시 소비자의 인식에 부정적인 요소로 작용할 수 있으며, 국내 생산 판매 허가에 적합하지 못하다. 따라서 식품 첨가물로서 보다 안정성이 높은 유전자를 적용하여 Bio Safety Level 1 균주 개발을 통한 2’-푸코실락토오스 생산이 필요하다.

본 발명의 일 예는 α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산 서열과, 이와 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는, 바실러스 속 (Bacillus sp.) 미생물에서 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 유전자 발현 카세트 (gene expression cassette)를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터 (vector)를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 유전자 발현 카세트를 포함하며, α-1,2-푸코오스 전이효소를 생산하는 재조합 바실러스 속 (Bacillus sp.) 미생물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 재조합 바실러스 속 미생물을 이용하여 얻어진 α-1,2-푸코오스 전이효소, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 2'-푸코실락토오스 생산용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 바실러스 속 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 2’-푸코실락토오스 (2’-fucolsylactose)의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산 서열과, 이와 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 바실러스 속 (Bacillus sp.) 미생물에서 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 유전자 발현 카세트, 상기 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 바실러스 속 미생물 및 이를 이용하여 모유 올리고당 중 2'-푸코실락토오스를 생산하는 방법에 관한 것으로, 다양한 유전자 변이를 도입하는 하여 재조합 바실러스 속 미생물을 제조하고, 상기 미생물의 2'-푸코실락토오스 생산량을 최적화하는 방법에 것이다. 구체적으로, 본 발명은 2'-푸코실락토오스를 합성에 관여하는 효소 ManB, ManC, WcaG, Gmd 의 선별, 기질인 lactose를 균주가 잘 이용할 수 있도록 분해 경로 차단 및 막 수송 단백질 (lacY) 과발현, 신규 항시 발현 프로모터의 선별 및 바실러스 속 미생물에 도입하여 2'-푸코실락토오스를 생산 하는 것에 관한 것이다.

본 명세에서 “발현 카세트”는 발현대상 핵산서열의 합성에 관여하는 유전자를 포함하는 것으로, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 유전자 발현 카세트는 α-1,2-푸코오스 전이효소의 합성에 관여하는 유전자를 포함하고, 구체적으로 α-1,2-푸코오스 전이효소의 코딩 핵산서열에 기능적으로 연결된 조절 서열을 포함한다. 따라서, 발현 유닛과 달리, 발현 카세트는 전사 및 번역을 조절하는 핵산 서열뿐만 아니라, 전사 및 번역의 결과로서 단백질로서 발현되는 핵산 서열을 포함한다.

본 명세에서 “조절 서열”은 프로모터를 포함하고 발현대상 핵산서열 또는 유전자에 기능적으로 연결된 후에 상기 핵산 또는 상기 유전자의 발현, 즉 전사 및 번역을 조절하는 발현 활성을 갖는 핵산을 의미한다.

본 명세서에서 “프로모터”, “프로모터 활성을 갖는 핵산분자” 또는 “프로모터 서열”은 전사대상의 목적 핵산서열에 기능적으로 연결되어 상기 목적 핵산서열의 전사를 조절하는 핵산을 의미한다.

전사대상 핵산서열은 화학적 의미에서 반드시 프로모터에 직접 연결을 필요로 하는 것은 아니며, 추가적인 유전자 조절 서열 및/또는 링커 핵산서열 등을 포함할 수 있다. 전사대상 목적 핵산서열이 프로모터 서열의 하부에 (즉, 프로모터 서열의 3' 말단에) 위치하는 배열이 바람직하다. 프로모터 서열과 전사대상 핵산서열 사이의 거리는 예를 들어 200개 염기 미만, 또는 100개 염기 미만일 수 있다.

본 명세서에서 “리보좀 결합 부위 (RBS)”의 서열 (또는 샤인-달가노 서열로도 칭함)은 A/G 풍부 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.

본 명세서에서 “작동 가능하게 연결된 (operably linked)”은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어, 프로모터와 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 해당 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위 특이적 DNA 절단 및 연결은 해당 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 모든 핵산 분자는 바람직하게는 자연에 존재하지 않는 형태이며(non-naturally occurring), 단리된 핵산 분자의 형태 또는 합성된 또는 재조합 방법에 의해서 제조되는 핵산분자이다. "단리된" 핵산 분자는 상기 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 제거되고, 추가로, 재조합 기술에 의해 제조될 경우 본질적으로 다른 세포성 물질 또는 배양 배지가 존재하지 않거나, 화학적으로 합성될 경우에는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 존재하지 않을 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산 서열과, 이와 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는, 바실러스 속 (Bacillus sp.) 미생물에서 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 유전자 발현 카세트 (gene expression cassette)에 관한 것이다.

본 발명의 일 예에 따른 α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된 조절 서열은, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산 서열의 상류(upstream)에 작동 가능하도록 연결되며, 전사 프로모터를 포함하며, 추가적으로 리보좀 결합 영역 (Ribosome Binding Site, RBS)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된 조절 서열은 p3610, p12455, p24930, pTu (바실러스 메가테리움 14581 genome 상의 elongation factor Tu 프로모터), 및 pPDC (pyruvate decarboxylase 프로모터)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 항시 발현 프로모터를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 프로모터는 하기 표 1에 예시적으로 기재한다. 상기 프로모터는 서열번호 11 내지 15로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 핵산서열을 포함하는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 프로모터는 p12455 및/또는 pTu 프로모터를 포함하는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 프로모터는 서열번호 12 및/또는 서열번호 14의 핵산서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 것일 수 있다.

명명	서열 (5’ 에서 3’ 방향)	서열번호
p3610	CAAATCTTCCTTTCATCTGCTCATATATGATGCTAATTTACGGATACAACATAAAAAGGCCCATCCGCTCCTAGCATAAGCTAGGGGCGAATGGACCGCGTTGCCACCCTAATTAGTACACATAATTGTGAACTATCTTTATTCATGTAACGTTGAGGTCAACGTTCAAGCTTTGCACTTGAAAGCTCCAAAGTCCATTCTGCAGGTTTCAATGTTTGTTCTCACCAGCCACAAACTCTCTGAAAATGAAAATTCTGCATACTACTCTTTTTCACAGCTTTAATTATATAGTTATTCGTTATTATAACGCGAAAAAGCAGGAATTTAAACATCTTATCACTAAAAAGTTTTATAAGACAATTTACTGGGATTTTTCAGCGGCAAAAAAAGACAAGAACCTTTTAATTAAAGCATTTCTTGATGAAAATTTGGTGGAGGATTTGGTAAAAATCTTTTATTTAATATTTCTAATGGCTTTGTAATACTATCGTAATACCTATACTACAAAAAAGATTTTAGAAGTCTGACAAGTAGGCACAATCCTTATAAGATAAGGTTTTTTCCCCCATGACAAAAAAATACCATTAAATAATAGTATTGCAATAAATTTTTAAAATATTTATAATAGGCGTAACAAACATATTTTTTACAAAGGTATTACAATTTCTTAATTTTTCAGAAAACACAAAATAGACAATGTTTTGTTTCAATTAGCGAATTTTGTAATGAATGAGTCTTCTACATATTAAGCGCATACATTGGATTTACAGCATGTAAACAATTGATGACAGTTTCATAGAGTAGAAGAATAATTTTGCAGTGAGGTCTTTAATGCTCTACTACATGAAAAAATAACTGATTATTTTGTATTGAAAGAGGATTAAGAAATTAGTGCATATCAAAAAAATATGGTTGCCACACAAACAAAATTTAATAGGGGGTAACACGCA	11
p12455	AGAAGTTCTCCTTTCCAAATAGGGCTTATAAAATAATTAGCACTTGAGTTGATAGAGTGCTAATTACTCTTCTTATTTAACATGTATTGGGGTATTTGTCAATATATTAGGAGATTCACCAAAGAGATTAAAAATTAGACTGAAAAAAGCAAACTTTTAAAAAAAGGTTGAACGTTCTGAAAGAGTTTGCTAGAATATACTTAATTTCAAAGACTATATGTGACTGGCGAAACGCGGATAACCGTGAGGAAGCATATAGTGACGTAGCCGTTCGCCTGGGCAGAGGTAAGGGATTAATACATATCTCTTACCTCTTTCTGTTTAGGGGGAGAGGATATAGAAGTTATCAGACATGTAGGCTGAAAAACCAGACTTTTAAAAAAATTAAAAATGAAGTTCCTTTATCCAAAGGTAAAAACATGTAAAACTACGATGATAATCAGAGGAGAGTACAAA	12
p24930	AAATCTCCACTCCTTTACAGAAAAAATTCCCCATACCTTTCTGTGTAAAACGTGAAAAACAAAATTGAGCCTCTGCTCAACTAGACATTAAATGATATACGAAGCGCCTCTTTTGAATATATATCTTGGAAGAACATTCCTTCACCCCACGTAAAGAAAATGCTTACATTTCCATTTGTTTCAATAACACACAAAATCAAAACATCTGCATGTGTCATTGCTTTGTTACAGCCCTATAGGTAAAACATACAATTGTATGTAAAAAGATGCGGCCTCAAAATATATTATAAACAATTATCTGACTTTTGTGAATCAAAAGAGAGAAGAAATTTTAAAAAAATTATTATTATACAAAAATTTCTACGAAAAAAGTTCGGTTAATTTCATAAATAAATAAG	13
pTu	aatgatgaaggttgaagttgttatccctgacgaatacttaggagatatcatgggtgacattacgtctcgtcgtggacgtgtagaaggtatggaagcacgcggtaacgctcaagttgtacgtgcattcgttccactttctgaaatgtttggttatgcaactgcattacgttcaaacactcaaggtcgcggaacatattctatgcacttcgatcactacgaagaagttcctaaatcaatttcagaagaaattattaaaaaaaataaaggtgaataattgattttcactctttattgaagtataactacttatgtacgctgtgaaagtggagttcattccctttcacggcctcataaaacataaactacatgaattttaaggaggattttcga	14
pPDC	aggagttaattcatgaaagtggcgatatcactattgtagcaggagctgattatgagttaaaagggaatcaaacatcttatgtaactgctaaacttccctattccaagcagctgtattccaaaacagtagacttgattcaaatgtcgcgcaatccaaactctaacaacattcacggtgaattcattggtctttggaaagtttccgcaaaaggcactgaggttgtaaaaaaagctttggaagaactggcgcaaagaaaagattttgctcagctcacgttttctgatttctttaattatgttaatctaattcacccggttgctgttaaatatacaatggggtcatggatagataccgaaacgtatacaaagattcaaaaagatggtgggaaaa	15

상기 항시 발현 프로모터는 그 하부에 위치하는 α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산 서열의 전사를 조절하여 2’-푸코실락토오스 생산능을 개선하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 프로모터는 2’-푸코실락토오스 생산능을 자일로스 유도 프로모터 (pxyl 프로모터) 대비 1.05배 이상, 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상, 1.45배 이상, 1.5배 이상, 1.55배 이상, 또는 1.6배 이상 증가시키는 것일 수 있다. 상기 2’-푸코실락토오스 생산능은 30℃ 온도, pH 7.0 조건에서 측정된 것일 수 있다.

상기 항시 발현 프로모터는 2’-푸코실락토오스 생산능을 개선하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조절 서열은 2’-푸코실락토오스 생산능을 자일로스 유도 프로모터 (pxyl 프로모터) 대비 1.05배 이상, 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상, 1.5배 이상, 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 2배 이상, 2.4배 이상, 3배 이상, 3.4배 이상, 또는 3.9배 이상 증가시키는 것일 수 있다. 상기 2’-푸코실락토오스 생산능은 18℃ 온도, pH 7.0 조건에서 측정된 것일 수 있다.

상기 항시 발현 프로모터는 저온에서의 2’-푸코실락토오스 생산능을 개선하는 것일 수 있다. 상기 저온은 예를 들어 10 내지 30℃ 미만, 10 내지 29℃, 10 내지 28℃, 10 내지 27℃, 10 내지 26℃, 10 내지 25℃, 10 내지 24℃, 10 내지 23℃, 10 내지 22℃, 10 내지 21℃, 10 내지 20℃, 15 내지 30℃ 미만, 15 내지 29℃, 15 내지 28℃, 15 내지 27℃, 15 내지 26℃, 15 내지 25℃, 15 내지 24℃, 15 내지 23℃, 15 내지 22℃, 15 내지 21℃, 15 내지 20℃, 예를 들어 18℃ 온도인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조절 서열은 18℃ 온도에서의 2’-푸코실락토오스 생산능을 30℃ 온도에서의 2’-푸코실락토오스 생산능 대비 1배 초과, 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상, 1.5배 이상, 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.75배 이상, 1.8배 이상, 또는 1.85배 이상 증가시키는 것일 수 있다. 상기 저온에서의 2’-푸코실락토오스 생산능을 개선하는 항시 발현 프로모터의 구체적 일 예는 p12455일 수 있으며, 일 예로 서열번호 12의 핵산 서열을 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된 조절 서열은 리보좀 결합 영역 (Ribosome Binding Site, RBS) 을 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 21의 핵산 서열을 포함하는 RBS 서열을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 발현 카세트는 바실러스 속 (Bacillus sp.) 미생물에서 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 것으로서, α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산서열은 특별히 한정되지 아니하며, 예를 들면 아커만시아 무시니필라 (Akkermansia muciniphila) 또는 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium)에서 유래한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소는 서열번호 1 내지 5로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 예에 따른 α-1,2-푸코오스 전이효소를 하기 표 2에 예시적으로 기재한다. 이에, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산서열은 서열번호 1 내지 5로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.

명명	서열	서열번호
Am2FT_2	MNMERKTGLMNKKYVSPCFLPGMRLGNIMFTLAAACAHARTVGVECRVPWAYNDASLMLRSRLGGWVLPSTPCGTNEPPSWQEPSFAYCPVPSRIRTGGLRGYFQSARYFEGQEAFIRALFAPLTAEKEPGAVGIHIRLGDYRRLRDKHRILDPGFLRRAAGHLSSGKNRLVLFSDEPDEAAEMLARVPAFGRFALEIDRGAPCESLRRMTAMEELVMSCSSFSWWGAWLGNTRKVIVPRDWFVGGVEDYRDIYLPHWVTL	1
Bm2FT	MKIVQISSGLGNQLFQYALYKRLSMNNNDVFLDVETSYQLNKNQHNGYEIERIFSIQPSHATKGMIDELADVDNRLINRLRRKLFGPKNSMYTETKEFSYDCEVFTKDGIYIKGYWQNYNYFKEIEDDLKNELVFKKALDLKNSHLINQMNKEISVSIHVRRGDYYLNKEYENKFGNIADLDYYLKAINFIKKEVDDPKFYVFSDDIKWAKENLNLTDNVTYVEHNKGSDSYKDMRLMTCCKHNIIANSTFSWWGAFLNENKNKIVIAPGKWINVEGVGGINLFPEGWIVY	2
Bm2FT_2	MGCIKRLFLYEYGGRCFLVIVKIKGGFGNQLFTYASAYAISQELQQNLIMDKVIYDLDYFRKFELPSLSLKYDQMLISKFVPNTKVKTLIYKVLRRLKLKGFTEVHEKKEFSFDENIYNLSGDIYLDGYWQNYRYFHKYYKDLSEMFVPRETPRKEVTDYITSLRGVNSVAMHVRRGDYKTFNGGKCLSLDYYIKAMEYFNSNDVQFYVFTDDIDFCEKNLPNSENINYVSRSEKLTDIEEFFIMKECKNFIIANSSFSWWAAYLSEQKADSLIVAPVVDMWKRDFYPDEWVALNTHLE	3
Bm2FT_3	MIIVQIKGGLGNQLFSYASAYGIARENETELIIDRYIYDTSYSLRKYMLDFFPEIDEALLLKYIPKKNKISQIMYKLIRKSKLKYKYKAQLFLEEEEFKFTRISTQNENLYLNGYWQSYVYFDKYRNDIIKKFTPLVSFNQDGNQLLNEIKSYNSVAIHVRRGDYINFKGGKCLDSSYYIKAMKHLYNLKGKNLFFYIFTDDVEYCKRIFKNVANVKFIGEEAKLSDFEEFTLMTHCKNLIIGNSSFSWWAAYLASCKDKAVIAPVVDMWTEDFYLPEWIKIKADLQ	4
Bs2FT	MKIVHISSGLGNQMFQYALYKKLSLIQDNVFLDTITSYQLYPNQHNGYELEKVFTIKPRHASKELTYNLSDLDNSVTSRIRRKLIGSKKSMYIEHKEFEYDPNLFYQENIYIKGYWQNYDYFKDIENELKNDFTFQRALDEKNNNLAIKINNENSISIHVRRGDYYLNRKNQEKFGDIANLEYYSKAISYIKERIDNPKFYIFSDNVEWVKQNLNSLEEAVYIDYNVGNDSYKDMQLMSLCKHNIIANSSFSWWGAFLNKNMEKIVIAPGKWINMKGVKKVNLFPKDWIIY	5

예를 들어, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 6 내지 10으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 예에 따른 α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산 서열을 하기 표 3에 예시적으로 기재한다.

명명	서열	서열번호
Am2FT_2 핵산서열	ATGAACATGGAACGGAAAACCGGCCTTATGAATAAAAAATATGTTTCCCCGTGTTTCCTGCCCGGCATGCGGCTGGGCAACATCATGTTCACGCTGGCGGCCGCCTGTGCCCACGCCCGTACCGTAGGGGTGGAGTGCCGGGTGCCCTGGGCTTACAATGACGCTTCCCTGATGCTGCGCTCCCGGCTCGGCGGCTGGGTGCTCCCTTCTACGCCGTGCGGCACCAATGAACCTCCATCCTGGCAGGAACCTTCCTTTGCCTATTGTCCGGTTCCCTCCCGCATCCGGACGGGCGGGCTTCGCGGCTACTTCCAGAGCGCACGGTATTTTGAAGGGCAGGAAGCGTTCATCCGGGCGCTTTTCGCGCCTCTCACCGCGGAGAAGGAGCCCGGCGCCGTTGGCATTCACATCCGGCTTGGGGACTACAGGCGCCTCCGTGACAAGCACCGCATTCTGGACCCTGGTTTCCTGCGGAGGGCCGCAGGGCATTTATCATCCGGGAAGAACCGTCTGGTGCTGTTCAGCGATGAGCCGGACGAGGCGGCGGAGATGCTTGCGCGCGTGCCGGCATTCGGACGCTTTGCGCTGGAAATCGACCGCGGCGCTCCGTGCGAATCCCTCCGCCGCATGACGGCGATGGAGGAACTCGTCATGTCGTGTTCTTCCTTTTCCTGGTGGGGCGCGTGGCTGGGAAATACCCGGAAGGTCATCGTTCCGCGCGACTGGTTTGTCGGCGGTGTGGAAGACTACCGGGATATTTACCTGCCCCATTGGGTAACACTGTAA	6
Bm2FT 핵산서열	ATGAAAATTGTTCAGATTTCTTCTGGTCTGGGTAACCAGCTGTTCCAGTACGCCCTGTACAAACGTCTGTCTATGAACAACAACGATGTGTTCCTGGATGTGGAGACGTCTTATCAACTGAACAAAAATCAGCACAATGGTTACGAAATTGAACGTATTTTTTCCATCCAGCCATCCCATGCTACCAAGGGTATGATCGATGAACTGGCCGATGTAGACAACCGTCTGATCAACCGCTTACGTCGTAAACTGTTTGGTCCGAAAAACTCTATGTATACCGAAACCAAAGAGTTCAGCTACGATTGTGAAGTTTTCACCAAAGATGGTATCTATATCAAGGGCTACTGGCAGAACTATAACTATTTTAAAGAGATTGAAGACGATCTGAAAAATGAACTGGTCTTTAAAAAAGCTCTGGATCTGAAAAATTCGCACCTGATCAATCAGATGAATAAAGAAATTAGCGTAAGCATCCACGTACGCCGCGGCGATTATTACCTGAACAAGGAGTACGAAAACAAATTTGGCAACATTGCGGATCTTGATTATTATCTGAAAGCGATTAACTTCATCAAAAAAGAAGTAGACGATCCCAAATTTTACGTTTTCTCCGACGATATTAAATGGGCTAAAGAAAATCTGAACCTGACGGATAACGTAACTTATGTTGAACACAACAAAGGGAGCGACTCTTACAAAGACATGCGTCTGATGACCTGCTGTAAACATAACATCATCGCCAACTCTACATTCTCTTGGTGGGGCGCGTTTCTTAACGAGAACAAGAACAAAATCGTAATCGCGCCGGGCAAATGGATCAACGTTGAAGGCGTCGGTGGCATCAACCTGTTCCCTGAAGGTTGGATCGTTTACTGA	7
Bm2FT_2 핵산서열	ATG GGT TGC ATA AAA AGA CTA TTC TTA TAT GAA TAC GGA GGA CGA TGT TTT TTG GTA ATT GTT AAA ATA AAA GGT GGA TTT GGT AAC CAA TTG TTT ACA TAC GCT AGT GCT TAT GCA ATA TCT CAA GAA CTG CAA CAA AAC TTA ATT ATG GAT AAG GTA ATA TAT GAT CTA GAT TAC TTT AGA AAA TTT GAA TTA CCT TCA TTA TCG TTG AAG TAT GAT CAA ATG TTA ATT AGT AAG TTT GTA CCT AAT ACT AAG GTT AAA ACT TTA ATT TAT AAA GTT TTA AGG AGG TTA AAA TTA AAA GGA TTT ACA GAG GTA CAT GAA AAA AAG GAA TTT TCT TTT GAT GAA AAT ATT TAC AAT TTG TCA GGT GAT ATT TAT TTA GAT GGT TAT TGG CAG AAT TAT AGA TAT TTC CAT AAA TAT TAT AAA GAT CTG TCG GAA ATG TTT GTA CCA AGA GAA ACT CCT AGA AAA GAA GTA ACT GAT TAT ATC ACG TCT TTA CGG GGA GTT AAT TCT GTT GCT ATG CAT GTT AGG AGA GGA GAT TAT AAA ACT TTT AAC GGA GGA AAA TGT TTG TCT TTA GAT TAT TAT ATT AAG GCT ATG GAA TAT TTC AAT TCA AAT GAT GTA CAA TTT TAT GTA TTT ACA GAT GAT ATT GAT TTT TGT GAG AAA AAC CTC CCG AAT AGT GAA AAT ATT AAT TAT GTG TCA AGA AGC GAG AAA CTT ACA GAT ATT GAA GAA TTC TTT ATT ATG AAA GAA TGT AAA AAT TTT ATA ATT GCT AAT AGT AGT TTT TCG TGG TGG GCT GCT TAT TTA AGT GAA CAG AAA GCA GAT AGT TTA ATT GTA GCC CCT GTT GTT GAC ATG TGG AAA AGA GAT TTT TAT CCA GAT GAG TGG GTG GCA TTG AAT ACA CAT TTA GAA TAG	8
Bm2FT_3 핵산서열	ATG ATA ATT GTT CAA ATC AAG GGC GGA TTA GGT AAT CAA CTT TTT TCG TAT GCT TCT GCT TAT GGA ATT GCA AGA GAG AAT GAA ACA GAA TTA ATT ATT GAT CGA TAT ATA TAT GAT ACA AGC TAC TCT TTA AGA AAA TAT ATG TTG GAT TTT TTC CCT GAG ATC GAT GAA GCA CTA CTT CTA AAG TAT ATA CCT AAA AAA AAT AAA ATT TCA CAA ATT ATG TAT AAA TTG ATT AGA AAA TCT AAG TTG AAA TAT AAG TAC AAA GCT CAA TTA TTT TTA GAA GAA GAG GAA TTT AAG TTT ACT AGA ATT AGT ACC CAG AAT GAA AAT TTG TAT TTA AAT GGT TAT TGG CAA AGT TAT GTG TAC TTT GAT AAA TAT CGT AAT GAC ATT ATT AAA AAA TTC ACC CCT TTA GTA AGC TTT AAT CAA GAT GGA AAT CAA CTT CTT AAC GAA ATT AAA AGT TAT AAT TCA GTG GCT ATC CAT GTC AGG AGA GGG GAT TAT ATT AAT TTT AAA GGT GGA AAG TGT TTA GAT AGT TCT TAT TAT ATA AAG GCA ATG AAG CAT TTA TAC AAT TTA AAA GGA AAA AAT TTG TTT TTT TAT ATT TTT ACA GAT GAT GTG GAA TAT TGT AAA AGA ATT TTT AAA AAC GTA GCT AAT GTT AAA TTT ATA GGT GAG GAA GCA AAA TTG AGT GAT TTT GAA GAG TTT ACT TTG ATG ACT CAT TGT AAA AAC CTC ATA ATA GGT AAC AGC TCA TTT TCT TGG TGG GCA GCT TAC TTA GCC TCT TGT AAA GAT AAA GCT GTA ATA GCT CCA GTG GTA GAT ATG TGG ACT GAA GAT TTC TAT CTA CCT GAA TGG ATA AAA ATT AAA GCG GAT TTA CAA TAG	9
Bs2FT 핵산서열	ATG AAA ATA GTA CAC ATA AGT AGC GGT TTA GGA AAT CAA ATG TTT CAA TAT GCT CTA TAT AAA AAA CTG TCC TTA ATT CAA GAT AAT GTT TTT TTG GAT ACA ATT ACC AGT TAT CAG TTG TAT CCT AAT CAA CAT AAT GGA TAT GAG TTA GAG AAG GTA TTT ACA ATT AAA CCA AGG CAT GCA AGT AAA GAA TTA ACA TAC AAT TTA TCA GAC TTA GAT AAT TCA GTA ACA TCT CGC ATT CGT AGG AAA TTA ATT GGA AGT AAA AAG AGC ATG TAT ATA GAA CAT AAA GAA TTT GAA TAC GAT CCT AAT TTA TTT TAT CAA GAA AAT ATA TAT ATA AAA GGT TAC TGG CAG AAT TAT GAT TAT TTT AAA GAT ATA GAA AAT GAA TTA AAG AAT GAT TTT ACT TTT CAA AGA GCT TTA GAT GAG AAA AAT AAT AAT TTA GCT ATT AAA ATT AAC AAT GAG AAT TCA ATA TCA ATT CAT GTA AGA CGT GGT GAT TAT TAC TTA AAC AGA AAG AAT CAA GAG AAG TTT GGA GAT ATC GCT AAT TTG GAA TAC TAT TCA AAG GCA ATT AGC TAT ATT AAA GAA AGA ATA GAC AAT CCA AAG TTT TAT ATC TTT TCA GAT AAT GTT GAG TGG GTA AAG CAA AAT CTT AAT TCG TTA GAG GAA GCT GTA TAT ATA GAT TAT AAC GTG GGA AAT GAT AGT TAC AAG GAT ATG CAA CTA ATG AGT CTT TGT AAA CAT AAT ATT ATT GCT AAT AGT TCT TTT AGT TGG TGG GGA GCA TTT TTG AAT AAG AAT ATG GAG AAA ATA GTT ATT GCA CCT GGG AAG TGG ATT AAT ATG AAA GGT GTA AAA AAA GTC AAT CTT TTC CCA AAG GAT TGG ATA ATT TAT TAA	10

본 발명의 일 예에 따른 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 유전자 발현 카세트는 락토오스 막 수송 단백질 (lactose permease)을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 락토오스 막 수송 단백질은 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) 또는 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 유래인 것일 수 있다.

예를 들어, 상기 락토오스 막 수송 단백질은 Lac12 및/또는 LacY 인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 락토오스 막 수송 단백질은 서열번호 17 및/또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 Lac12는 서열번호 17을 가지는 것일 수 있으며, 상기 LacY는 서열번호 18을 갖는 것일 수 있다.

예를 들어, 상기 락토오스 막 수송 단백질을 암호화하는 핵산은 서열번호 19 및/또는 서열번호 20의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 Lac12를 암호화하는 핵산은 서열번호 19의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 LacY를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 20의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 락토오스 막 수송 단백질은 2’-푸코실락토오스 생산능을 개선하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 락토오스 막 수송 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 유전자 발현 카세트는, 락토오스 막 수송 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는 유전자 발현 카세트 대비 2’-푸코실락토오스 생산능을 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.25배 이상, 또는 1.3배 이상 증가시키는 것일 수 있다. 상기 2’-푸코실락토오스 생산능은 30℃ 온도, 7.0 pH 조건인 것일 수 있다.

구체적 일 예로서, 상기 락토오스 막 수송 단백질은 LacY이며, 2’-푸코실락토오스 생산능을 개선하는 것일 수 있다. 구체적으로, LacY를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트는, Lac12를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트 대비 2’-푸코실락토오스 생산능을 1.05배 이상, 1.1배 이상, 1.14배 이상, 또는 1.15배 이상 증가시키는 것일 수 있다. 상기 2’-푸코실락토오스 생산능은 30℃ 온도, 7.0 pH 조건인 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 유전자 발현 카세트는, 상기 락토오스 막 수송 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 조절 서열을 추가로 포함하며, 상기 락토오스 막 수송 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 조절 서열은 프로모터 및/또는 RBS 인 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 락토오스 막 수송 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 조절 서열은 서열번호 22의 핵산 서열을 포함하는 리보좀 결합 영역 (RBS)을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적 일 예에 따르면, 상기 바실러스 속 미생물은 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 및 바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 일 예로 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 예에 따른 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 유전자 발현 카세트는, 5’ 말단에서 3’ 말단 방향으로 순차적으로 위치하는, 전사 프로모터, RBS, 및 α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 일 예에 따른 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 유전자 발현 카세트는, 5’ 말단에서 3’ 말단 방향으로 순차적으로 위치하는, 프로모터, RBS, α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산분자, 및 락토오스 막 수송 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 일 예에 따른 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 유전자 발현 카세트는, 5’ 말단에서 3’ 말단 방향으로 순차적으로 위치하는, 프로모터, RBS, α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산분자, 락토오스 막 수송 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 조절 서열, 및 락토오스 막 수송 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 프로모터, 상기 RBS, 상기 락토오스 막 수송 단백질 등은 전술한 바와 같다.

본 발명의 일 예에서, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 발현 카세트는 발현을 위한 폴리뉴클레오티드 서열로서, 복제 기점, 리더(leader), 선택 가능한 마커, 클로닝 부위 및 제한효소 인식부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명에 따른 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터 (vector), 특히 셔틀 벡터 또는 플라스미드 벡터에 관한 것이다. 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 유전자 발현 카세트는 전술한 바와 같다.

본 발명의 일 예에 따른 재조합 벡터는 해당 기술분야에 널리 알려진 방법을 통해 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 재조합 벡터는 유전자 재조합에 이용되는 벡터라면 모두 사용 가능하며, 예컨대, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 (예, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예컨대, 상기 재조합 벡터는 pMM1525, pHIS1525, pSTOP1622, 및 pMGBm19 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것으로부터 제작된 것일 수 있으며, 예를 들어 P3stop1623 2RBS 벡터일 수 있다.

상기 유전자 발현 카세트의 폴리뉴클레오타이드는 그 자체로, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다. 상기 재조합 벡터란 작동 가능하도록 연결된 목적 폴리뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 목적 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 및 전사 종결인자 등으로 이루어지는 하나 이상의 전사 조절 요소와 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다.

일 예로, 상기 벡터는 도 1a의 개열지도를 가지는 재조합 벡터인 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면, 상기 벡터는 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 발현 카세트에 더하여 푸코오스 합성 유전자 발현 카세트를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 푸코오스 합성 유전자 발현 카세트는, 푸코오스 합성 유전자를 암호화하는 핵산 서열과, 이와 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 푸코오스 합성 유전자 발현 카세트는, GTP 만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (ManC)를 암호화하는 핵산 서열, 포스포만노뮤타아제 (Hypo 또는 MnB)를 암호화하는 핵산 서열, GDP-L-푸코오스 신타아제 (WcaG)를 암호화하는 핵산 서열, 및 GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (Gmd)를 암호화하는 핵산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과, 이와 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 푸코오스 합성 유전자 발현 카세트는 GTP 만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (ManC)를 포함하는 것일 수 있다.

예를 들어, 상기 푸코오스 합성 유전자 발현 카세트는 서열번호 23 내지 26으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

예를 들어, 상기 푸코오스 합성 유전자 발현 카세트는 서열번호 27 내지 30으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 푸코오스 합성 유전자를 암호화하는 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된 조절 서열은, 상기 푸코오스 합성 유전자의 상류 (upstream)에 작동 가능하도록 연결되며, 전사 프로모터를 포함하며, 추가적으로 리보좀 결합 영역 (Ribosome Binding Site, RBS)를 포함할 수 있다.

예를 들면, 상기 푸코오스 합성 유전자를 암호화하는 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된 조절 서열은, p3610, p12455, p24930, p0706, pTu, 및 pPDC 로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 상시 발현 프로모터를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 조절 서열은 서열번호 11 내지 16으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 조절 서열은 p12455 및/또는 p0706 프로모터를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조절 서열은 서열번호 12 및/또는 서열번호 16의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 것일 수 있다.

상기 푸코오스 합성 유전자를 암호화하는 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된 조절 서열은, 서열번호 31의 핵산 서열을 포함하는 리보좀 결합 영역 (Ribosome Binding Site, RBS) 을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명에 따른 적어도 하나의 유전자 발현 카세트를 운반하는 벡터, 특히 셔틀 벡터 또는 플라스미드 벡터를 포함하는 재조합 미생물, 특히 바실러스 속 미생물에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명에 따른 유전자 발현 카세트를 포함하거나, 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 바실러스 속 미생물에 관한 것이다

상기 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 방법은 당업계에 공지된 모든 형질전환 방법 특별한 제한 없이 선택하여 사용할 수 있으며, 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기 천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 등으로부터 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 재조합 바실러스 속 미생물은 도입된 α-1,2-푸코오스 전이효소를 과발현할 수 있으며, 따라서 장기간 안정적으로 높은 α-1,2-푸코오스 전환능을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 재조합 바실러스 속 미생물은 α-1,2-푸코오스 제조에 유용하게 사용될 수 있으며, α-1,2-푸코오스 생산 수율을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 재조합 바실러스 속 미생물은 푸코오스 합성능을 가지거나, 푸코오스 합성능이 개선된 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 예에 따른 재조합 미생물은 푸코오스 합성 효소, 예를 들어 GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase), GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase, WcaG), 포스포만노뮤타아제 (phosphomannomurase), 및 GTP 만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 보유하고 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

구체적인 일 예로서, 상기 푸코오스 합성능이 개선된 재조합 바실러스 속 미생물은, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase), GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase, WcaG), 포스포만노뮤타아제 (phosphomannomurase), 및 GTP 만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)가 도입된 것일 수 있다.

구체적 일 예로서, 상기 푸코오스 합성능이 개선된 재조합 바실러스 속 미생물은, GTP 만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (ManC)가 도입되며, 포스포만노뮤타아제 (Hypo)는 도입되지 않은 것일 수 있다.

구체적 일 예로서, 상기 푸코오스 합성능이 개선된 재조합 바실러스 속 미생물은, 포스포만노뮤타아제 (Hypo)가 도입되며, GTP 만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (ManC)가 도입되지 않은 것일 수 있다.

구체적 일 예로서, 상기 푸코오스 합성능이 개선된 재조합 바실러스 속 미생물은, GDP-L-푸코오스 신타아제 (WcaG)가 도입되며, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (Gmd)가 도입되지 않은 것일 수 있다.

구체적 일 예로서, 상기 푸코오스 합성능이 개선된 재조합 바실러스 속 미생물은, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (Gmd)가 도입되고, 포스포만노뮤타아제 (phosphomannomurase), 및/또는 GTP 만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)가 추가로 도입된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 재조합 바실러스 속 미생물은, 상기 재조합 바실러스 속 미생물에 도입되는 벡터가 푸코오스 합성 유전자 발현 카세트를 포함하여 푸코오스 합성능이 개선된 것이거나, 상기 재조합 바실러스 속 미생물이 푸코오스 합성 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터를 추가로 포함하여, 푸코오스 합성능이 개선된 것일 수 있다. 즉, 본 발명의 일 예에 따른 재조합 바실러스 속 미생물은, 본 발명에 따른 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터와 더불어, 푸코오스 합성 유전자를 발현하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 별도의 벡터를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 푸코오스 합성 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터는 도 1b의 개열지도를 가지는 재조합 벡터인 것일 수 있다.

이에, 본 발명의 일 예에 따른 재조합 바실러스 속 미생물은, α-1,2-푸코오스 전이효소의 과발현 특성과 더불어, 푸코오스 합성능이 개선되어 α-1,2-푸코오스 생산 수율이 더욱 향상될 수 있다.

구체적으로, 상기 푸코오스 합성능을 가지거나, 푸코오스 합성능이 개선된 재조합 바실러스 속 미생물은, 푸코오스 합성능을 가지지 않는 대조군 대비 2’-푸코실락토오스 생산능이 1.05배 이상, 1.1배 이상, 1.15배 이상, 또는 1.18배 이상 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 재조합 바실러스 속 미생물은 락토오스 분해 효소의 활성이 감소되거나 제거된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 미생물은 LacZ 유전자가 제거된 것일 수 있다.

본 발명의 구체적 일 예에 따르면, 상기 바실러스 속 미생물은 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 및 바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 일 예로 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명에 따른 재조합 바실러스 속 미생물을 이용하여 얻어진 α-1,2-푸코오스 전이효소, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 2'-푸코실락토오스 생산용 조성물에 관한 것이다. 상기 재조합 바실러스 속 미생물, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소, 상기 2'-푸코실락토오스 등은 전술한 바와 같다.

상기 배양물은 상기 바실러스 속 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 미생물을 포함하거나, 상기 미생물을 포함하지 않는 무세포(cell-free) 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 상기 바실러스 속 미생물을 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 바실러스 속 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 2'-푸코실락토오스 제조에 사용되는 바실러스 속 미생물은 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 배양물 및 상기 미생물의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 본 발명에 따른 유전자 발현 카세트를 포함하거나, 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 바실러스 속 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 2’-푸코실락토오스 (2’-fucolsylactose)의 제조방법에 관한 것이다. 상기 유전자 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터, 상기 재조합 바실러스 속 숙주세포 등은 전술한 바와 같다.

구체적 일 예로서, 상기 유전자 발현 카세트는 조절 서열로서 p12455 의 항시 발현 프로모터를 포함하고, 저온에서 2’-푸코실락토오스 생산능이 개선되는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 조절 서열은 p12455의 항시 발현 프로모터를 포함하고, 상기 배양하는 단계는 10 내지 25℃ 온도에서 배양하는 것일 수 있다.

상기 제조방법은 배양물에서 얻어진 α-1,2-푸코오스 전이효소, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 락토오스 함유 원료와 반응하여 2'-푸코실락토오스를 생산하는 것일 수 있다.

본 발명은 바이오 세이프 레벨 1 (biosafety level 1)인 GRAS (Generally Recognized As Safe) 균주를 이용하여 2’-푸코실락토오스를 생산할 수 있으며, 안정성 측면에서 소비자의 우려가 없고, 2’-푸코실락토오스 생산능이 우수한 재조합 바실러스 속 미생물 및 이를 이용한 2’-푸코실락토오스 생산방법을 제공할 수 있다.

도 1a 및 도 1b는 본 발명의 일 예에 따른 벡터 개열지도 (cleavage map)이다.
도 1c는 본 발명의 일 예에 따른 재조합 미생물의 2'-푸코실락토오스 생합성 경로를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따라 X-gal 실험을 통한 야생형과 △LacZ 변이주의 표현형 비교 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따라 시간에 따른 △LacZ 변이주와 야생형 내의 락토오스 잔존량 비교 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 예에 따라 △LacZ 변이주에 항시 발현 프로모터의 도입에 따른 2'-푸코실락토오스 생산성 효과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 예에 따라 △LacZ 변이주에 Lac12 도입에 따른 2'-푸코실락토오스의 생산 효과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 예에 따라 △LacZ 변이주에 LacY 도입에 따른 2'-푸코실락토오스의 생산 효과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 예에 따라 △LacZ 변이주에 다양한 GDP-fuc 합성 효소 조합을 통한 생산성 비교 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 예에 따라 △LacZ 변이주에 다양한 GDP-fuc 효소와 항시발현 프로모터의 조합 균주별 2'-푸코실락토오스의 생산 비교 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. lactose 분해 효소가 제거된 바실러스 속 미생물 제조

1-1: △LacZ 변이주 제조

본 발명에서 미생물 개발에 선정한 바실러스 메가테리움 (bacillus megaterium) 14581은 한국 미생물 보존 센터 (KCCM) 에서 기탁번호 40441로 입수 하였다.

Bacillus megaterium 14581 유전자 내에 b-galactosidase (이하 LacZ)를 homologous recombination 방법을 통해 제거하였고, 유전자가 제거 되었는지의 여부는 genome sequencing 을 통해 다시 한번 확인하였다.

1-2: 표현형을 통한 LacZ 결실 확인

확보한 △LacZ bacillus megaterium 14581 균주의 표현형이 변화되었는지 확인하기 위해 x-gal 실험을 수행하였다. 도 2와 같이 야생형의 경우 LacZ 유전자를 보유하기 때문에 x-gal를 분해하여 푸른색을 띠는 반면, 본 실시예에서 제조된 △LacZ bacillus megaterium 14581 변이주의 경우 x-gal을 분해하지 않아 균주 본연의 흰색을 유지하는 것을 확인하였다.

1-3: 락토오스 분해능을 통한 LacZ 결실 확인

변이주의 락토오스 분해 정도를 관측하기 위해, 상기 제조된 △LacZ 변이주에 락토오스를 넣어주어 시간에 따른 락토오스 양의 변화를 HPLC 분석을 통해 확인하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 제조된 △LacZ 변이주는 야생형과 달리 락토오스의 잔존량이 유지됨을 확인하였다.

실시예 2. △LacZ_변이주에서 항시 발현 프로모터 탐색 및 온도 특성 확인

2-1: 푸코오스 전이효소 스크리닝

생산하고자 하는 바실러스 메가테리움 (bacillus megaterium) 14581는 푸코오스 전이효소를 보유 하고 있지 않아, 2’-푸코실락토오스의 생산이 불가능 하다. 따라서 푸코오스 전이효소를 인위적으로 도입하고자 하였고, 효소로는 Biosafety level 1 균주에서 유래한 α-1,2-푸코오스 전이효소 5종을 선별하였다. 선별된 푸코오스 전이효소를 표 2에 나타냈다. 표 2에서 서열번호 1의 푸코오스 전이효소는 아커만시아 무시니필라 유래이며, Am2FT_2로 명명하였다. 서열번호 2 내지 4의 푸코오스 전이효소는 바실러스 메가테리움 유래이며, 각각 Bm2FT, Bm2FT_2, 및 Bm2FT_3로 명명하였다. 서열번호 5의 푸코오스 전이효소는 바실러스 속 유래이며, Bs2FT로 명명하였다.

선별된 5종 효소의 2’- 푸코실락토오스 생산 활성을 확인하기 위해, 5종의 효소 플라스미드를 각각 바실러스 메가테리움에 transformation 후 37℃에서 키웠다. 각각의 plate 에서 2개의 colony를 접종하여 overnight seed culture를 진행하였다. seed 200 uL를 22mM lactose가 첨가된 4mL 배지에 첨가하여 30℃에서 반응을 진행하였다. 20h 후 HPLC 로 분석하였다 2’- 푸코실락토오스 생산 활성을 확인한 결과, Am2FT_2는 약 5 (mg/L), Bm2FT는 약 15 (mg/L), Bm2FT_2는 약 3 (mg/L), Bm2FT_3는 약4 (mg/L), 및 Bs2FT는 약 1 (mg/L)의 2’- 푸코실락토오스를 생성하였으며, 5종 효소 모두 2FL 생산 활성을 가지는 것을 확인하였다. 이 중 Bm2FT 효소를 대표적으로 선정하여 이후 실험에 사용하였다.

2-2: 항시 발현 프로모터의 탐색

바실러스 메가테리움 내 재조합 단백질을 과발현하기 위하여 종래에 주로 사용되는 프로모터는 자일로스 유도 프로모터 (이하 pXyl)이다. 자일로스의 첨가 없이도 단백질을 과발현하기 위해 항시 발현 프로모터를 바실러스 메가테리움 14581 genome 상에서 탐색하였다. 벡터 형태로 Bm2FT 유전자를 과발현 하고자 자일로스 유도 프로모터를 대체하는 p3610, p12455, p24930 항시 발현 프로모터를 최종적으로 선택하여 Bm2FT를 발현하도록 플라스미드를 제작하였고, 이를 실시예 1에서 제조한 LacZ 결실 균주에 형질 전환하여 최종 2'-푸코실락토오스의 생산을 HPLC 분석을 통해 확인하였다.

구체적으로, OD₆₀₀ 이 ~0.8 정도가 될 때 22mM lactose를 넣어 준 후 20h 후 HPLC 로 분석하였다. 5 test tube 반응의 경우, seed 200 uL를 22mM lactose가 첨가된 4mL 배지에 첨가 후 HPLC 로 분석하였다.

항시 발현 프로모터의 도입에 따른 2'-푸코실락토오스 생산성 효과를 표 4 및 도 4에 나타냈다. 3종 항시발현 프로모터를 도입시 pH 7.0 및 30℃ 온도에서 기존 pxyl 대비하여 모두 증대된 2'-푸코실락토오스의 생산성을 보였고, 특히 p12455 의 경우 pXyl 대비 하여서 생산성이 60% 이상 증대하였다.

구분	2FL (mg/L), 30℃
△LacZ	0
△LacZ_pxyl_bm2FT	35.4
△LacZ_p3610_bm2FT	51.8
△LacZ_p12455_bm2FT	57.6
△LacZ_p24930_bm2FT	53.5

2-3: 저온에서의 생산성 평가

각각의 프로모터의 저온에서의 생산성의 변화를 확인하기 위해 Bm2FT에 항시 발현 프로모터를 도입한 균주 5종을 각각 18℃ 온도에서 65시간 배양 후, 시간에 따른 2'-푸코실락토오스의 생산을 HPLC 분석을 통해 확인하였으며, 2FL 생산량 (mg/L)를 표 5에 나타냈다. 표 5에 나타난 바와 같이, p12455의 경우 저온에서 생산성이 약 1.8배 이상 향상되는 것을 알 수 있었다.

구분	2FL (mg/L), 18℃
△LacZ	0
△LacZ_pxyl_bm2FT	30.7
△LacZ_p3610_bm2FT	34.4
△LacZ_p12455_bm2FT	107
△LacZ_p24930_bm2FT	38.3

실시예 3. 락토오스 막 수송 단백질을 발현하는 △LacZ 변이주에서 항시 발현 프로모터 탐색

3-1: Lac12 도입

Lactose를 세포 내에 더 많이 도입하기 위하여 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) 유래의 락토오스 막 수송 단백질 (이하 Lac12)을 실시예 2에서 제조한 항시 발현 프로모터 p12455가 도입된 △LacZ 바실러스 메가테리움에 도입하여 그 효과를 확인하였다. 플라스미드 형태로 Lac12와 Bm2FT polycistronic 하게 도입하여 30℃ 온도, pH 7에서 배양 후, 65시간 이후의 그 생산량을 Bm2FT만 도입된 균주와 비교 분석하여 표 6 및 도 5에 나타냈다. 표 6 및 도 5에 나타난 바와 같이, Bm2FT만을 도입하였을 때 대비하여 Lac12를 함께 도입한 경우 그 생산량이 30% 이상 증대되는 것을 확인하였다.

구분	2FL (mg/L), 30℃, 65h
△LacZ_p12455_bm2FT	51.3
△LacZ_p12455_bm2FT_Lac12	67.6

3-2: LacY 도입

바실러스 메가테리움 유래의 락토오스 막 수송 단백질 (이하 LacY)을 플라스미드 형태로 균주에 도입하여 그 효과를 30℃ 온도, pH 7에서 배양 후 확인하여 실시예 3-1에서 Lac12를 도입한 변이주의 활성 100%를 기준으로 나타내었다. 표 7 및 도 6에 나타난 바와 같이, lac12 대비하여 2'-푸코실락토오스의 생산이 약 15% 이상 증대되는 것을 확인하였다.

구분	2FL (%)
△LacZ_p12455_bm2FT_Lac12	100
△LacZ_p12455_bm2FT_LacY	115

실시예 4. 주요 GDP-fuc 합성 유전자 선별

바실러스 메가테리움 14581 균주의 GDP-fuc 합성 효소 4종인 GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (이하 Gmd), GDP-L-푸코오스 신타아제 (이하 WcaG), 포스포만노뮤타아제 (이하 Hypo 또는 ManB) 및 GTP 만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (이하 ManC) 4종 효소를 항시발현 프로모터를 사용하여 과발현 되도록 플라스미드 형태로 형질전환하여 생산성을 향상시키고자 하였다. 구체적으로, 50ul 플라스미드를 lysozme을 처리한 500ml b.megaterium protoplast와 섞었다. PEG-P 1.5mL이 들어있는 15mL 팔콘에 5mL SMMP 를 첨가하고 조심히 팔콘을 굴려 섞었다. 1300g에서 10분 원심 분리하여 세포 수거 후 SMMP에 세포를 풀어주어 1.5mL 37C에서 250rpm shaking 하여 형질전환을 완료하였다.

제작이 완료된 균주를 사용하여 30℃ 온도, pH 7에서 80시간 반응을 진행 하였고, 표 8 및 도 7에 나타난 바와 같이, 제작하여 생산성을 확인한 다양한 조합 중 ManC, Hypo, WcaG, Gmd 가 동시 발현되었을 때의 생산성이 GDP-fuc 합성 효소를 과발현 하지 않은 대조군 △LacZ_p12455_Bm2FT_Lac12 대비하여 약 15% 이상 증대되는 것을 확인하였다. 이러한 경향성은 ManC 만을 재조합 단백질 형태로 발현할 경우에도 나타났으며, ManC를 플라스미드 형태로 도입하지 않은 대조군 △LacZ_p12455_Bm2FT_Lac12 대비하여 약 15% 이상 증대되는 2'-푸코실락토오스 생산성을 확인하였다.

구분	2FL (mg/L), 30℃, 80h
ΔLacZ_p12455_bm2FT_Lac12	74.6
ΔLacZ_p12455_bm2FT_Lac12/p0706_ManC_Hypo	66.5
ΔLacZ_p12455_bm2FT_Lac12/p0706_WcaG_Gmd	73.3
ΔLacZ_p12455_bm2FT_Lac12/p0706_ManC_Hypo_WcaG_Gmd	88.3
ΔLacZ_p12455_bm2FT_Lac12/p0706_ManC	88.7
ΔLacZ_p12455_bm2FT_Lac12/p0706_Hypo	78.9
ΔLacZ_p12455_bm2FT_Lac12/p0706_WcaG	79.0
ΔLacZ_p12455_bm2FT_Lac12/p0706_Gmd	54.8

실시예 5. 2'-푸코실락토오스의 생산성 확인

최종적으로 제작된 균주들의 생산성을 비교하기 위해, 30℃ 온도, pH 7에서 락토오스를 첨가하여 65시간 배양 후, 2'-푸코실락토오스의 생산을 비교하였다. GDP-fuc 효소와 항시발현 프로모터의 다양한 조합을 통해 균주별 2'-푸코실락토오스의 생산성을 비교하였다 (표 9 및 도 8).

구분	2FL (mg/L), 30℃, 65h
b.megaterium 14581	0
ΔLacZ_pxyl_bm2FT	35.4
ΔLacZ_p12455_bm2FT	57.8
ΔLacZ_p12455_bm2FT_Lac12	67.6
ΔLacZ_p12455_bm2FT_Lac12/p12455_C_H_W_G	70
ΔLacZ_p12455_bm2FT_Lac12/p12455_C	74
ΔLacZ_p12455_bm2FT_Lac12/p0706_C_H_W_G	88.3

표 9 및 도 8에 나타난 바와 같이, 야생형 B.megaterium 14581의 경우, 2'-푸코실락토오스를 생산할 수 없으나, α-1,2-푸코오스 전이효소 도입, 다양한 항시 발현 프로모터 도입, LacZ 제거, 락토오스 막 수송 단백질 도입, GDP-fuc 합성 효소 도입 등에 의해 종래의 자일로스 유도 프로모터 대비 현저히 높은 2'-푸코실락토오스 생산성을 달성할 수 있었다.

<110> SAMYANG CORPORATION <120> Recombinant Bacillus genus microorganism and Method for producing human milk oligosaccharides using the same <130> DPP20205428KR <160> 31 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Am2FT_2 <400> 1 Met Asn Met Glu Arg Lys Thr Gly Leu Met Asn Lys Lys Tyr Val Ser 1 5 10 15 Pro Cys Phe Leu Pro Gly Met Arg Leu Gly Asn Ile Met Phe Thr Leu 20 25 30 Ala Ala Ala Cys Ala His Ala Arg Thr Val Gly Val Glu Cys Arg Val 35 40 45 Pro Trp Ala Tyr Asn Asp Ala Ser Leu Met Leu Arg Ser Arg Leu Gly 50 55 60 Gly Trp Val Leu Pro Ser Thr Pro Cys Gly Thr Asn Glu Pro Pro Ser 65 70 75 80 Trp Gln Glu Pro Ser Phe Ala Tyr Cys Pro Val Pro Ser Arg Ile Arg 85 90 95 Thr Gly Gly Leu Arg Gly Tyr Phe Gln Ser Ala Arg Tyr Phe Glu Gly 100 105 110 Gln Glu Ala Phe Ile Arg Ala Leu Phe Ala Pro Leu Thr Ala Glu Lys 115 120 125 Glu Pro Gly Ala Val Gly Ile His Ile Arg Leu Gly Asp Tyr Arg Arg 130 135 140 Leu Arg Asp Lys His Arg Ile Leu Asp Pro Gly Phe Leu Arg Arg Ala 145 150 155 160 Ala Gly His Leu Ser Ser Gly Lys Asn Arg Leu Val Leu Phe Ser Asp 165 170 175 Glu Pro Asp Glu Ala Ala Glu Met Leu Ala Arg Val Pro Ala Phe Gly 180 185 190 Arg Phe Ala Leu Glu Ile Asp Arg Gly Ala Pro Cys Glu Ser Leu Arg 195 200 205 Arg Met Thr Ala Met Glu Glu Leu Val Met Ser Cys Ser Ser Phe Ser 210 215 220 Trp Trp Gly Ala Trp Leu Gly Asn Thr Arg Lys Val Ile Val Pro Arg 225 230 235 240 Asp Trp Phe Val Gly Gly Val Glu Asp Tyr Arg Asp Ile Tyr Leu Pro 245 250 255 His Trp Val Thr Leu 260 <210> 2 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Bm2FT <400> 2 Met Lys Ile Val Gln Ile Ser Ser Gly Leu Gly Asn Gln Leu Phe Gln 1 5 10 15 Tyr Ala Leu Tyr Lys Arg Leu Ser Met Asn Asn Asn Asp Val Phe Leu 20 25 30 Asp Val Glu Thr Ser Tyr Gln Leu Asn Lys Asn Gln His Asn Gly Tyr 35 40 45 Glu Ile Glu Arg Ile Phe Ser Ile Gln Pro Ser His Ala Thr Lys Gly 50 55 60 Met Ile Asp Glu Leu Ala Asp Val Asp Asn Arg Leu Ile Asn Arg Leu 65 70 75 80 Arg Arg Lys Leu Phe Gly Pro Lys Asn Ser Met Tyr Thr Glu Thr Lys 85 90 95 Glu Phe Ser Tyr Asp Cys Glu Val Phe Thr Lys Asp Gly Ile Tyr Ile 100 105 110 Lys Gly Tyr Trp Gln Asn Tyr Asn Tyr Phe Lys Glu Ile Glu Asp Asp 115 120 125 Leu Lys Asn Glu Leu Val Phe Lys Lys Ala Leu Asp Leu Lys Asn Ser 130 135 140 His Leu Ile Asn Gln Met Asn Lys Glu Ile Ser Val Ser Ile His Val 145 150 155 160 Arg Arg Gly Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Glu Tyr Glu Asn Lys Phe Gly 165 170 175 Asn Ile Ala Asp Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Ala Ile Asn Phe Ile Lys 180 185 190 Lys Glu Val Asp Asp Pro Lys Phe Tyr Val Phe Ser Asp Asp Ile Lys 195 200 205 Trp Ala Lys Glu Asn Leu Asn Leu Thr Asp Asn Val Thr Tyr Val Glu 210 215 220 His Asn Lys Gly Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Met Arg Leu Met Thr Cys 225 230 235 240 Cys Lys His Asn Ile Ile Ala Asn Ser Thr Phe Ser Trp Trp Gly Ala 245 250 255 Phe Leu Asn Glu Asn Lys Asn Lys Ile Val Ile Ala Pro Gly Lys Trp 260 265 270 Ile Asn Val Glu Gly Val Gly Gly Ile Asn Leu Phe Pro Glu Gly Trp 275 280 285 Ile Val Tyr 290 <210> 3 <211> 299 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Bm2FT_2 <400> 3 Met Gly Cys Ile Lys Arg Leu Phe Leu Tyr Glu Tyr Gly Gly Arg Cys 1 5 10 15 Phe Leu Val Ile Val Lys Ile Lys Gly Gly Phe Gly Asn Gln Leu Phe 20 25 30 Thr Tyr Ala Ser Ala Tyr Ala Ile Ser Gln Glu Leu Gln Gln Asn Leu 35 40 45 Ile Met Asp Lys Val Ile Tyr Asp Leu Asp Tyr Phe Arg Lys Phe Glu 50 55 60 Leu Pro Ser Leu Ser Leu Lys Tyr Asp Gln Met Leu Ile Ser Lys Phe 65 70 75 80 Val Pro Asn Thr Lys Val Lys Thr Leu Ile Tyr Lys Val Leu Arg Arg 85 90 95 Leu Lys Leu Lys Gly Phe Thr Glu Val His Glu Lys Lys Glu Phe Ser 100 105 110 Phe Asp Glu Asn Ile Tyr Asn Leu Ser Gly Asp Ile Tyr Leu Asp Gly 115 120 125 Tyr Trp Gln Asn Tyr Arg Tyr Phe His Lys Tyr Tyr Lys Asp Leu Ser 130 135 140 Glu Met Phe Val Pro Arg Glu Thr Pro Arg Lys Glu Val Thr Asp Tyr 145 150 155 160 Ile Thr Ser Leu Arg Gly Val Asn Ser Val Ala Met His Val Arg Arg 165 170 175 Gly Asp Tyr Lys Thr Phe Asn Gly Gly Lys Cys Leu Ser Leu Asp Tyr 180 185 190 Tyr Ile Lys Ala Met Glu Tyr Phe Asn Ser Asn Asp Val Gln Phe Tyr 195 200 205 Val Phe Thr Asp Asp Ile Asp Phe Cys Glu Lys Asn Leu Pro Asn Ser 210 215 220 Glu Asn Ile Asn Tyr Val Ser Arg Ser Glu Lys Leu Thr Asp Ile Glu 225 230 235 240 Glu Phe Phe Ile Met Lys Glu Cys Lys Asn Phe Ile Ile Ala Asn Ser 245 250 255 Ser Phe Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Ser Glu Gln Lys Ala Asp Ser 260 265 270 Leu Ile Val Ala Pro Val Val Asp Met Trp Lys Arg Asp Phe Tyr Pro 275 280 285 Asp Glu Trp Val Ala Leu Asn Thr His Leu Glu 290 295 <210> 4 <211> 287 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Bm2FT_3 <400> 4 Met Ile Ile Val Gln Ile Lys Gly Gly Leu Gly Asn Gln Leu Phe Ser 1 5 10 15 Tyr Ala Ser Ala Tyr Gly Ile Ala Arg Glu Asn Glu Thr Glu Leu Ile 20 25 30 Ile Asp Arg Tyr Ile Tyr Asp Thr Ser Tyr Ser Leu Arg Lys Tyr Met 35 40 45 Leu Asp Phe Phe Pro Glu Ile Asp Glu Ala Leu Leu Leu Lys Tyr Ile 50 55 60 Pro Lys Lys Asn Lys Ile Ser Gln Ile Met Tyr Lys Leu Ile Arg Lys 65 70 75 80 Ser Lys Leu Lys Tyr Lys Tyr Lys Ala Gln Leu Phe Leu Glu Glu Glu 85 90 95 Glu Phe Lys Phe Thr Arg Ile Ser Thr Gln Asn Glu Asn Leu Tyr Leu 100 105 110 Asn Gly Tyr Trp Gln Ser Tyr Val Tyr Phe Asp Lys Tyr Arg Asn Asp 115 120 125 Ile Ile Lys Lys Phe Thr Pro Leu Val Ser Phe Asn Gln Asp Gly Asn 130 135 140 Gln Leu Leu Asn Glu Ile Lys Ser Tyr Asn Ser Val Ala Ile His Val 145 150 155 160 Arg Arg Gly Asp Tyr Ile Asn Phe Lys Gly Gly Lys Cys Leu Asp Ser 165 170 175 Ser Tyr Tyr Ile Lys Ala Met Lys His Leu Tyr Asn Leu Lys Gly Lys 180 185 190 Asn Leu Phe Phe Tyr Ile Phe Thr Asp Asp Val Glu Tyr Cys Lys Arg 195 200 205 Ile Phe Lys Asn Val Ala Asn Val Lys Phe Ile Gly Glu Glu Ala Lys 210 215 220 Leu Ser Asp Phe Glu Glu Phe Thr Leu Met Thr His Cys Lys Asn Leu 225 230 235 240 Ile Ile Gly Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Ala Ser 245 250 255 Cys Lys Asp Lys Ala Val Ile Ala Pro Val Val Asp Met Trp Thr Glu 260 265 270 Asp Phe Tyr Leu Pro Glu Trp Ile Lys Ile Lys Ala Asp Leu Gln 275 280 285 <210> 5 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Bs2FT <400> 5 Met Lys Ile Val His Ile Ser Ser Gly Leu Gly Asn Gln Met Phe Gln 1 5 10 15 Tyr Ala Leu Tyr Lys Lys Leu Ser Leu Ile Gln Asp Asn Val Phe Leu 20 25 30 Asp Thr Ile Thr Ser Tyr Gln Leu Tyr Pro Asn Gln His Asn Gly Tyr 35 40 45 Glu Leu Glu Lys Val Phe Thr Ile Lys Pro Arg His Ala Ser Lys Glu 50 55 60 Leu Thr Tyr Asn Leu Ser Asp Leu Asp Asn Ser Val Thr Ser Arg Ile 65 70 75 80 Arg Arg Lys Leu Ile Gly Ser Lys Lys Ser Met Tyr Ile Glu His Lys 85 90 95 Glu Phe Glu Tyr Asp Pro Asn Leu Phe Tyr Gln Glu Asn Ile Tyr Ile 100 105 110 Lys Gly Tyr Trp Gln Asn Tyr Asp Tyr Phe Lys Asp Ile Glu Asn Glu 115 120 125 Leu Lys Asn Asp Phe Thr Phe Gln Arg Ala Leu Asp Glu Lys Asn Asn 130 135 140 Asn Leu Ala Ile Lys Ile Asn Asn Glu Asn Ser Ile Ser Ile His Val 145 150 155 160 Arg Arg Gly Asp Tyr Tyr Leu Asn Arg Lys Asn Gln Glu Lys Phe Gly 165 170 175 Asp Ile Ala Asn Leu Glu Tyr Tyr Ser Lys Ala Ile Ser Tyr Ile Lys 180 185 190 Glu Arg Ile Asp Asn Pro Lys Phe Tyr Ile Phe Ser Asp Asn Val Glu 195 200 205 Trp Val Lys Gln Asn Leu Asn Ser Leu Glu Glu Ala Val Tyr Ile Asp 210 215 220 Tyr Asn Val Gly Asn Asp Ser Tyr Lys Asp Met Gln Leu Met Ser Leu 225 230 235 240 Cys Lys His Asn Ile Ile Ala Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Gly Ala 245 250 255 Phe Leu Asn Lys Asn Met Glu Lys Ile Val Ile Ala Pro Gly Lys Trp 260 265 270 Ile Asn Met Lys Gly Val Lys Lys Val Asn Leu Phe Pro Lys Asp Trp 275 280 285 Ile Ile Tyr 290 <210> 6 <211> 786 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding Am2FT_2 <400> 6 atgaacatgg aacggaaaac cggccttatg aataaaaaat atgtttcccc gtgtttcctg 60 cccggcatgc ggctgggcaa catcatgttc acgctggcgg ccgcctgtgc ccacgcccgt 120 accgtagggg tggagtgccg ggtgccctgg gcttacaatg acgcttccct gatgctgcgc 180 tcccggctcg gcggctgggt gctcccttct acgccgtgcg gcaccaatga acctccatcc 240 tggcaggaac cttcctttgc ctattgtccg gttccctccc gcatccggac gggcgggctt 300 cgcggctact tccagagcgc acggtatttt gaagggcagg aagcgttcat ccgggcgctt 360 ttcgcgcctc tcaccgcgga gaaggagccc ggcgccgttg gcattcacat ccggcttggg 420 gactacaggc gcctccgtga caagcaccgc attctggacc ctggtttcct gcggagggcc 480 gcagggcatt tatcatccgg gaagaaccgt ctggtgctgt tcagcgatga gccggacgag 540 gcggcggaga tgcttgcgcg cgtgccggca ttcggacgct ttgcgctgga aatcgaccgc 600 ggcgctccgt gcgaatccct ccgccgcatg acggcgatgg aggaactcgt catgtcgtgt 660 tcttcctttt cctggtgggg cgcgtggctg ggaaataccc ggaaggtcat cgttccgcgc 720 gactggtttg tcggcggtgt ggaagactac cgggatattt acctgcccca ttgggtaaca 780 ctgtaa 786 <210> 7 <211> 876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding Bm2FT <400> 7 atgaaaattg ttcagatttc ttctggtctg ggtaaccagc tgttccagta cgccctgtac 60 aaacgtctgt ctatgaacaa caacgatgtg ttcctggatg tggagacgtc ttatcaactg 120 aacaaaaatc agcacaatgg ttacgaaatt gaacgtattt tttccatcca gccatcccat 180 gctaccaagg gtatgatcga tgaactggcc gatgtagaca accgtctgat caaccgctta 240 cgtcgtaaac tgtttggtcc gaaaaactct atgtataccg aaaccaaaga gttcagctac 300 gattgtgaag ttttcaccaa 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attatcgttg aagtatgatc aaatgttaat tagtaagttt 240 gtacctaata ctaaggttaa aactttaatt tataaagttt taaggaggtt aaaattaaaa 300 ggatttacag aggtacatga aaaaaaggaa ttttcttttg atgaaaatat ttacaatttg 360 tcaggtgata tttatttaga tggttattgg cagaattata gatatttcca taaatattat 420 aaagatctgt cggaaatgtt tgtaccaaga gaaactccta gaaaagaagt aactgattat 480 atcacgtctt tacggggagt taattctgtt gctatgcatg ttaggagagg agattataaa 540 acttttaacg gaggaaaatg tttgtcttta gattattata ttaaggctat ggaatatttc 600 aattcaaatg atgtacaatt ttatgtattt acagatgata ttgatttttg tgagaaaaac 660 ctcccgaata gtgaaaatat taattatgtg tcaagaagcg agaaacttac agatattgaa 720 gaattcttta ttatgaaaga atgtaaaaat tttataattg ctaatagtag tttttcgtgg 780 tgggctgctt atttaagtga acagaaagca gatagtttaa ttgtagcccc tgttgttgac 840 atgtggaaaa gagattttta tccagatgag tgggtggcat tgaatacaca tttagaatag 900 900 <210> 9 <211> 864 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding Bm2FT_3 <400> 9 atgataattg ttcaaatcaa gggcggatta ggtaatcaac ttttttcgta tgcttctgct 60 tatggaattg caagagagaa tgaaacagaa ttaattattg atcgatatat atatgataca 120 agctactctt taagaaaata tatgttggat tttttccctg agatcgatga agcactactt 180 ctaaagtata tacctaaaaa aaataaaatt tcacaaatta tgtataaatt gattagaaaa 240 tctaagttga aatataagta caaagctcaa ttatttttag aagaagagga atttaagttt 300 actagaatta gtacccagaa tgaaaatttg tatttaaatg gttattggca aagttatgtg 360 tactttgata aatatcgtaa tgacattatt aaaaaattca cccctttagt aagctttaat 420 caagatggaa atcaacttct taacgaaatt aaaagttata attcagtggc tatccatgtc 480 aggagagggg attatattaa ttttaaaggt ggaaagtgtt tagatagttc ttattatata 540 aaggcaatga agcatttata caatttaaaa ggaaaaaatt tgttttttta tatttttaca 600 gatgatgtgg aatattgtaa aagaattttt aaaaacgtag ctaatgttaa atttataggt 660 gaggaagcaa aattgagtga ttttgaagag tttactttga tgactcattg taaaaacctc 720 ataataggta acagctcatt ttcttggtgg gcagcttact tagcctcttg taaagataaa 780 gctgtaatag ctccagtggt agatatgtgg actgaagatt tctatctacc tgaatggata 840 aaaattaaag cggatttaca atag 864 <210> 10 <211> 876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding Bs2FT <400> 10 atgaaaatag tacacataag tagcggttta ggaaatcaaa tgtttcaata tgctctatat 60 aaaaaactgt ccttaattca agataatgtt tttttggata caattaccag ttatcagttg 120 tatcctaatc aacataatgg atatgagtta gagaaggtat ttacaattaa accaaggcat 180 gcaagtaaag aattaacata caatttatca gacttagata attcagtaac atctcgcatt 240 cgtaggaaat taattggaag taaaaagagc atgtatatag aacataaaga atttgaatac 300 gatcctaatt tattttatca agaaaatata tatataaaag gttactggca gaattatgat 360 tattttaaag atatagaaaa tgaattaaag aatgatttta cttttcaaag agctttagat 420 gagaaaaata ataatttagc tattaaaatt aacaatgaga attcaatatc aattcatgta 480 agacgtggtg attattactt aaacagaaag aatcaagaga agtttggaga tatcgctaat 540 ttggaatact attcaaaggc aattagctat attaaagaaa gaatagacaa tccaaagttt 600 tatatctttt cagataatgt tgagtgggta aagcaaaatc ttaattcgtt agaggaagct 660 gtatatatag attataacgt gggaaatgat agttacaagg atatgcaact aatgagtctt 720 tgtaaacata atattattgc taatagttct tttagttggt ggggagcatt tttgaataag 780 aatatggaga aaatagttat tgcacctggg aagtggatta atatgaaagg tgtaaaaaaa 840 gtcaatcttt tcccaaagga ttggataatt tattaa 876 <210> 11 <211> 950 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p3610 promoter <400> 11 caaatcttcc tttcatctgc tcatatatga tgctaattta cggatacaac ataaaaaggc 60 ccatccgctc ctagcataag ctaggggcga atggaccgcg ttgccaccct aattagtaca 120 cataattgtg aactatcttt attcatgtaa cgttgaggtc aacgttcaag ctttgcactt 180 gaaagctcca aagtccattc tgcaggtttc aatgtttgtt ctcaccagcc acaaactctc 240 tgaaaatgaa aattctgcat actactcttt ttcacagctt taattatata gttattcgtt 300 attataacgc gaaaaagcag gaatttaaac atcttatcac taaaaagttt tataagacaa 360 tttactggga tttttcagcg gcaaaaaaag acaagaacct tttaattaaa gcatttcttg 420 atgaaaattt ggtggaggat ttggtaaaaa tcttttattt aatatttcta atggctttgt 480 aatactatcg taatacctat actacaaaaa agattttaga agtctgacaa gtaggcacaa 540 tccttataag ataaggtttt ttcccccatg acaaaaaaat accattaaat aatagtattg 600 caataaattt ttaaaatatt tataataggc gtaacaaaca tattttttac aaaggtatta 660 caatttctta atttttcaga aaacacaaaa tagacaatgt tttgtttcaa ttagcgaatt 720 ttgtaatgaa tgagtcttct acatattaag cgcatacatt ggatttacag catgtaaaca 780 attgatgaca gtttcataga gtagaagaat aattttgcag tgaggtcttt aatgctctac 840 tacatgaaaa aataactgat tattttgtat tgaaagagga ttaagaaatt agtgcatatc 900 aaaaaaatat ggttgccaca caaacaaaat ttaatagggg gtaacacgca 950 <210> 12 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p12455 promoter <400> 12 agaagttctc ctttccaaat agggcttata aaataattag cacttgagtt gatagagtgc 60 taattactct tcttatttaa catgtattgg ggtatttgtc aatatattag gagattcacc 120 aaagagatta aaaattagac tgaaaaaagc aaacttttaa aaaaaggttg aacgttctga 180 aagagtttgc tagaatatac ttaatttcaa agactatatg tgactggcga aacgcggata 240 accgtgagga agcatatagt gacgtagccg ttcgcctggg cagaggtaag ggattaatac 300 atatctctta cctctttctg tttaggggga gaggatatag aagttatcag acatgtaggc 360 tgaaaaacca gacttttaaa aaaattaaaa atgaagttcc tttatccaaa ggtaaaaaca 420 tgtaaaacta cgatgataat cagaggagag tacaaa 456 <210> 13 <211> 398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p24930 promoter <400> 13 aaatctccac tcctttacag aaaaaattcc ccataccttt ctgtgtaaaa cgtgaaaaac 60 aaaattgagc ctctgctcaa ctagacatta aatgatatac gaagcgcctc ttttgaatat 120 atatcttgga agaacattcc ttcaccccac gtaaagaaaa tgcttacatt tccatttgtt 180 tcaataacac acaaaatcaa aacatctgca tgtgtcattg ctttgttaca gccctatagg 240 taaaacatac aattgtatgt aaaaagatgc ggcctcaaaa tatattataa acaattatct 300 gacttttgtg aatcaaaaga gagaagaaat tttaaaaaaa ttattattat acaaaaattt 360 ctacgaaaaa agttcggtta atttcataaa taaataag 398 <210> 14 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTu promoter <400> 14 aatgatgaag gttgaagttg ttatccctga cgaatactta ggagatatca tgggtgacat 60 tacgtctcgt cgtggacgtg tagaaggtat ggaagcacgc ggtaacgctc aagttgtacg 120 tgcattcgtt ccactttctg aaatgtttgg ttatgcaact gcattacgtt caaacactca 180 aggtcgcgga acatattcta tgcacttcga tcactacgaa gaagttccta aatcaatttc 240 agaagaaatt attaaaaaaa ataaaggtga ataattgatt ttcactcttt attgaagtat 300 aactacttat gtacgctgtg aaagtggagt tcattccctt tcacggcctc ataaaacata 360 aactacatga attttaagga ggattttcga 390 <210> 15 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pPDC promoter <400> 15 aggagttaat tcatgaaagt ggcgatatca ctattgtagc aggagctgat tatgagttaa 60 aagggaatca aacatcttat gtaactgcta aacttcccta ttccaagcag ctgtattcca 120 aaacagtaga cttgattcaa atgtcgcgca atccaaactc taacaacatt cacggtgaat 180 tcattggtct ttggaaagtt tccgcaaaag gcactgaggt tgtaaaaaaa gctttggaag 240 aactggcgca aagaaaagat tttgctcagc tcacgttttc tgatttcttt aattatgtta 300 atctaattca cccggttgct gttaaatata caatggggtc atggatagat accgaaacgt 360 atacaaagat tcaaaaagat ggtgggaaaa 390 <210> 16 <211> 949 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p0706 promoter <400> 16 caaatcttcc tttcatctgc acatatatga tgctagttta aggatacaac ataaaaaggc 60 ccatccgctc ctagcataag ctaggggcga atggaccgcg ttgccaccct aattagcaca 120 cattattgtg aactatcttt attcatgtaa cgttgaggtc aacgttcaag ctttgcactt 180 gaaagctcca aagtccattc tgcaggtttc aatgtttgtt ctcaccagcc acaaactctc 240 taaaaatgaa aattctgcat actactcttt ttcacagctt taattatata gttattcgtt 300 attataacgc gaaaaagcag gaatttaaac atcttatcgc taaaaagttt tataagacaa 360 tttactggaa tttttcagcg acaaaaaaag acaagaacct tttaattaaa gcatttcttg 420 atgaaaattt ggtgtaggat ttggtaaaaa tcttttattt agtatttcta atagctctgt 480 aatactattg taatacctat actacaaaaa agattttaga cgtctgacaa gtaggcacga 540 tccttataag ataaggtttt ttccttcgcc acaaaaaaat atcattagat aatagtattg 600 caataaattt ttaaaatatt tataataggc gtaacaaaca tattttttac aaaggtatta 660 caatttctta atttttcaga aaaaacaaaa tagccaatgt tttgtttcaa ttagcgaatt 720 ttgtaatgaa tgagccttct acatattaag cgcatacatt ggatttacag catgtaaaca 780 attgatgaca gtttcatata gtagaagaat aattttgctg tgagttcttt aatgctctac 840 catacgaaaa aataactgat tattttgtat tgaaagagga ttaagaaatt ggtgattatt 900 aaaaaatatg gttgtcacac aaacaaaatt taataggggg taacatgca 949 <210> 17 <211> 587 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of lactose permease Lac12 <400> 17 Met Ala Asp His Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Gln Lys Lys Pro Ile 1 5 10 15 Asn Thr Ile Glu His Lys Asp Thr Leu Gly Asn 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cacaaagaag ctttaaactc tgataacgat 120 aacacatctg gtttaaaaat taacggtgta ccaattgaag atgctcgtga agaagtatta 180 ttaccaggtt acttatctaa acaatactac aaattatacg gtttatgttt cattacatac 240 ttatgtgcta caatgcaagg ttacgatggt gctttaatgg gttctattta cacagaagat 300 gcttacttaa aatactacca cttagatatt aactcttctt ctggtacagg tttagtattc 360 tctattttca acgtaggtca aatttgtggt gctttcttcg taccattaat ggattggaaa 420 ggtcgtaaac cagctatttt aattggttgt ttaggtgtag taattggtgc tattatttct 480 tctttaacaa caacaaaatc tgctttaatt ggtggtcgtt ggttcgtagc tttcttcgct 540 acaattgcta acgctgctgc tccaacatac tgtgctgaag tagctccagc tcacttacgt 600 ggtaaagtag ctggtttata caacacatta tggtctgtag gttctattgt agctgctttc 660 tctacatacg gtacaaacaa aaacttccca aactcttcta aagctttcaa aattccatta 720 tacttacaaa tgatgttccc aggtttagta tgtattttcg gttggttaat tccagaatct 780 ccacgttggt tagtaggtgt aggtcgtgaa gaagaagctc gtgaattcat tattaaatac 840 cacttaaacg gtgatcgtac acacccatta ttagatatgg aaatggctga aattattgaa 900 tctttccacg gtacagattt atctaaccca ttagaaatgt tagatgtacg ttctttattc 960 cgtacacgtt ctgatcgtta ccgtgctatg ttagtaattt taatggcttg gttcggtcaa 1020 ttctctggta acaacgtatg ttcttactac ttaccaacaa tgttacgtaa cgtaggtatg 1080 aaatctgtat ctttaaacgt attaatgaac ggtgtatact ctattgtaac atggatttct 1140 tctatttgtg gtgctttctt cattgataaa attggtcgtc gtgaaggttt cttaggttct 1200 atttctggtg ctgctttagc tttaacaggt ttatctattt gtacagctcg ttacgaaaaa 1260 acaaaaaaaa aatctgcttc taacggtgct ttagtattca tttacttatt cggtggtatt 1320 ttctctttcg ctttcacacc aatgcaatct atgtactcta cagaagtatc tacaaactta 1380 acacgttcta aagctcaatt attaaacttc gtagtatctg gtgtagctca attcgtaaac 1440 caattcgcta caccaaaagc tatgaaaaac attaaatact ggttctacgt attctacgta 1500 ttcttcgata ttttcgaatt cattgtaatt tacttcttct tcgtagaaac aaaaggtcgt 1560 tctttagaag aattagaagt agtattcgaa gctccaaacc cacgtaaagc ttctgtagat 1620 caagctttct tagctcaagt acgtgctaca ttagtacaac gtaacgatgt acgtgtagct 1680 aacgctcaaa acttaaaaga acaagaacca ttaaaatctg atgctgatca cgtagaaaaa 1740 ttatctgaag ctgaatctgt ataa 1764 <210> 20 <211> 1242 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding lactose permease LacY <400> 20 atgaaaagtt caaaaagttt atattggaag ctgagtgcat attttttctt cttctttttt 60 acgtggtcgt ccagctactc tttattttct atctggttag ggcaagagat taagttgaac 120 ggatcagcaa caggcttaat cttttctgtg aacgctatct ttgctttgtg tatgcagcct 180 ttgtacggat atatatctga caggataggt ttaaagaaac acgttttatt ttttattagc 240 tgtcttttag tgtttgtagg accattttat atttttgttt atggaccttt gcttcaatac 300 aatgtggtga taggggctat tattggaggc ttatatttag gagtagcgtt tttggcgggc 360 atcggagcga ttgaaacata catagagaaa gtcagccgaa aatataaatt tgagtatgga 420 aaatctagaa tgtgggggtc attaggctgg gctgcagcta cgttttttgc aggacaatta 480 tttaatatta atcctcacat taatttttgg gtggcatctg tttcagcggt tatcctagtc 540 gctattattt tttctgtaaa agtagaaatg agcagttatg aaatggaaaa agctgaatcc 600 gtcacgctaa gagatgtagg tagtttattt ttattgaagg aattttggtt ttttatgatt 660 tatgttgttg gtgttacatg cgtatatggg gtatacgatc agcaatttcc tatctattat 720 gcatctttgt ttcctactga atcgataggt aaccaagtat ttggctactt aaattcgttt 780 caagtatttt tagaagctgg aatgatgttc gcagcaccgt ttattgtaaa taagatcggt 840 gcaaaaaata gtttaatttt agcaggattt ctaatgggat ttcgtattat tgggtcaggg 900 cttgttgttg gtccaatcgg aatatcttca atgaaactca ttcatgcatt agaacttcct 960 attatgctca ttgccatctt taaatatttg gcagctaact ttgacacgcg cctatcttcc 1020 atcctttatt tggttggatt ccaatttgct tcgcaaatag gtgcttcagt tctttcaccc 1080 atagtgggag gattatatga tagcgtaggt ttttcccgta cctatttaat tatgggaggt 1140 atggttttgg tatttaacgt tatttcgatg tttacactac taaactctaa aaaacataga 1200 tttataagaa aagatgtaca agaaaacacg cagattatat ag 1242 <210> 21 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS <400> 21 aaagggggaa a 11 <210> 22 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS <400> 22 gaaggaggtg a 11 <210> 23 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase <400> 23 Met Lys Leu Val Leu Leu Ser Gly Gly Ser Gly Lys Arg Leu Trp Pro 1 5 10 15 Leu Ser Asn Asp Thr Arg Ser Lys Gln Phe Leu Lys Val Leu Glu Gly 20 25 30 Arg Asp Gly Gln Lys Glu Ser Met Val Gln Arg Val Trp Ser Gln Ile 35 40 45 Glu Ala Val Gly Leu Asn Glu Ser Thr Val Ile Ala Thr Ser Lys Leu 50 55 60 Gln Arg Asp Met Ile Thr Gly Gln Val Gly Thr Asp Ile Pro Leu Ile 65 70 75 80 Ile Glu Pro Glu Arg Arg Asp Thr Phe Pro Ala Ile Ala Leu Ala Ala 85 90 95 Ser Tyr Leu His Ser Glu Glu Gln Ala Ser Glu Asp Glu Ile Val Val 100 105 110 Val Leu Pro Val Asp Pro Tyr Val Glu Asp Gly Phe Phe Glu Arg Val 115 120 125 Lys Asp Leu Glu Ser Val Leu Arg Asp Ser Lys Ala Asp Leu Ala Leu 130 135 140 Met Gly Val Thr Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Lys Tyr Gly Tyr Ile Val 145 150 155 160 Pro Glu Gly Lys Val Gln Gly Asp Ser Tyr Phe Thr Val Asp Cys Phe 165 170 175 Thr Glu Lys Pro Ser Glu Glu Ala Ala Val Gly Leu Ile Asn Gln Arg 180 185 190 Ala Leu Trp Asn Cys Gly Val Phe Ala Phe Arg Leu Gly Tyr Leu Leu 195 200 205 Gln Ile Leu Gln Glu Lys Lys Leu Pro Leu Gln Phe Glu Thr Leu His 210 215 220 Lys Glu Tyr Ala Thr Leu Pro Lys Ile Ser Phe Asp Tyr Glu Val Val 225 230 235 240 Glu Lys Ala Ser His Ile Val Ala Leu Pro Tyr Asp Gly Tyr Trp Lys 245 250 255 Asp Leu Gly Thr Trp Asn Thr Leu Thr Glu Glu Met Ala Thr Ser Gln 260 265 270 Ile Gly Lys Gly Val Leu Thr Asp Asp Ser Ala Asn Thr His Leu Val 275 280 285 Asn Glu Leu Asp Ile Pro Val Thr Val Leu Gly Val Lys Asp Val Val 290 295 300 Val Ala Ala Ser Pro Asp Gly Ile Leu Val Ala Asp Lys Ala Ser Ser 305 310 315 320 Pro Lys Ile Lys Glu Ile Ile Gly Asp Trp Asn Tyr Pro Pro Met Tyr 325 330 335 Glu Glu Arg Leu Trp Gly Trp Ser Arg Val Leu Asp Tyr Ala Lys Tyr 340 345 350 Asp Glu Glu Thr Glu Met Val Thr Lys Arg Ile His Ile Ser Lys Gly 355 360 365 Lys Asn Ser Thr Tyr His Tyr His Asn Leu Arg Asp Glu Val Trp Thr 370 375 380 Ile Val Arg Gly Glu Gly Glu Leu Ala Leu Asp Asp Tyr Ile Arg Arg 385 390 395 400 Val Lys Ala Gly Asp Ile Ile His Leu Pro Ala Gly Lys Lys His Gly 405 410 415 Ile His Ala Leu Thr Asp Leu Glu Phe Ile Glu Val Gln Thr Gly Lys 420 425 430 Val Ile Ser Asn Glu Asp Ser Ile Arg Leu Ile Tyr Asp Trp Asn Asp 435 440 445 Val Ile Lys Gln Phe Gln Ser Ser Arg Pro Gln Val Ile Leu 450 455 460 <210> 24 <211> 359 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of phosphomannomurase <400> 24 Leu Lys Thr Ile Ala Tyr Tyr Ile Ser Asp Tyr Gly Tyr Gly His Ala 1 5 10 15 Thr Arg Ser Thr Ala Ile Ile Arg Gln Leu Leu Lys Gln Asn Glu Glu 20 25 30 Ile Glu Ile Ile Ile Cys His Ser Phe Ala Ile Glu Phe Leu Arg Gln 35 40 45 Ser Phe Arg Tyr Glu Arg Arg Val Arg Phe Arg Glu Ile Leu Thr Asp 50 55 60 Val Gly Tyr Val Leu Lys Glu Asn Ser Leu Glu Pro Asp Ala Asp Leu 65 70 75 80 Leu Asn Arg Gln Val Ala Ser Tyr Val Ser Ser Phe His Thr Lys Leu 85 90 95 Met Tyr Glu Lys His Phe Met Lys Val Ala Asn Val Ser Phe Val Ile 100 105 110 Ser Asp Ile Ser Pro Leu Gly Ile Ala Gly Ala Tyr Leu Leu Lys Leu 115 120 125 Pro Ser Leu Gly Ile Ser Asn Phe Thr Trp Phe Thr Ala Tyr Glu Gly 130 135 140 Leu Ile Gly Glu Leu Ser Leu Glu Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Lys Gln 145 150 155 160 Met Thr Tyr Gln Phe Ser Leu Ala Cys Ser Asp Glu Pro His Trp Gly 165 170 175 Ile Lys Glu Asn Gln Ser Phe Gly Phe Tyr Ser Arg Glu Ile Asn Asp 180 185 190 Ser Glu Val Gln Arg Ile Arg Lys Glu Ile Asp Pro Glu Gly Glu Ser 195 200 205 Tyr Ile Ile Tyr Phe Gly Leu Gly Met Lys Val Asp Ile Gly Thr Leu 210 215 220 Ser Asp Leu Pro Ile Trp Gln Ser Pro Asn Cys Lys Phe Ile Val Ser 225 230 235 240 Ser Asn Val Asp Val Thr His Pro Asn Val Tyr Lys Ile Pro Gln Asp 245 250 255 Glu Thr Glu Thr Gln His Tyr Val Ala Ala Ala Asp Leu Gly Leu Thr 260 265 270 Lys Ala Gly Trp Gly Thr Ile Ser Glu Ala Val Cys Ala Gly Val Pro 275 280 285 Leu Leu Ile Thr Asn Arg Ser Ser Met Lys Glu Asp Arg His Thr Ile 290 295 300 Asp Tyr Leu Val Arg His Gln Leu Cys Asp Leu Ile Glu Trp Lys Glu 305 310 315 320 Leu Glu Gly Leu Val Val Thr Pro Ser Leu Ile Glu Thr Cys Arg Arg 325 330 335 Gln Gln Ile Asn Arg Tyr Lys Asn Glu Ala Met His Ile Ala Glu Glu 340 345 350 Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ser 355 <210> 25 <211> 313 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of GDP-L-fucose synthase <400> 25 Met Asn Lys Asn Ser Lys Ile Tyr Val Ala Gly His Arg Gly Leu Val 1 5 10 15 Gly Ser Ala Ile Val Arg Lys Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asn Leu 20 25 30 Val Tyr Arg Thr Ser Ala Glu Leu Asp Leu Arg Asp Lys Pro Thr Val 35 40 45 Asp Ala Phe Phe Ala Glu Glu Lys Pro Glu Phe Val Phe Leu Ala Ala 50 55 60 Ala Lys Val Gly Gly Ile Val Ala Asn Asn Glu Tyr Pro Ala Glu Phe 65 70 75 80 Ile His Asp Asn Leu Leu Ile Gln Ser Asn Ile Ile Asp Ala Ala Tyr 85 90 95 Arg Asn Asp Val Glu Lys Leu Leu Phe Leu Gly Ser Thr Cys Ile Tyr 100 105 110 Pro Lys Leu Ala Pro Gln Pro Leu Lys Glu Glu Tyr Leu Leu Thr Gly 115 120 125 Glu Leu Glu Pro Thr Asn Glu Pro Tyr Ala Ile Ala Lys Ile Ala Gly 130 135 140 Ile Lys Met Cys Glu Ser Tyr Asn Arg Gln Tyr Gly Thr Lys Tyr Ile 145 150 155 160 Ser Ala Met Pro Thr Asn Leu Tyr Gly Pro Asn Asp Asn Phe Asp Leu 165 170 175 His Thr Ser His Val Leu Pro Ala Leu Leu Arg Lys Phe His Glu Ala 180 185 190 Lys Glu Ser Asn Ala Pro Phe Val Glu Met Trp Gly Thr Gly Thr Pro 195 200 205 Lys Arg Glu Phe Leu Tyr Ser Asp Asp Leu Ala Asp Ala Cys Val Phe 210 215 220 Leu Met Asn Thr Tyr Glu Gly Asn Glu Ile Val Asn Ile Gly Val Gly 225 230 235 240 Glu Asp Ile Thr Ile Lys Glu Leu Gly Glu Lys Val Lys Ala Val Val 245 250 255 Gly Tyr Glu Gly Asn Ile Gln Phe Asp Thr Ser Lys Pro Asp Gly Thr 260 265 270 Pro Arg Lys Leu Val Asp Val Thr Lys Leu Asn Ser Leu Gly Trp Lys 275 280 285 Ala Glu Thr Ala Leu Glu Asp Gly Leu Gln Lys Ala Tyr Gln Trp Phe 290 295 300 Leu Asp Asn Glu Leu Ala Ala Ala Lys 305 310 <210> 26 <211> 359 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of GDP-D-mannose-4,6-dehydratase <400> 26 Met Lys Thr Ala Leu Ile Thr Gly Val Thr Gly Gln Asp Gly Ser Tyr 1 5 10 15 Leu Ala Glu Leu Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Glu Val His Gly Leu Ile 20 25 30 Arg Arg Ser Ser Ser Tyr Asn Gln Glu Arg Leu Glu Asp Leu Leu Thr 35 40 45 Glu Glu Ala Ala Ser Ala Leu Leu Asn Asn Ser Asn Phe His Leu His 50 55 60 Tyr Gly Asp Val Thr Asp Ala Leu Asn Val Thr Arg Ile Ile Gly Asp 65 70 75 80 Ile Gln Pro Asp Glu Ile Tyr Asn Leu Ala Ala Gln Ser His Val Arg 85 90 95 Val Ser Phe Asp Met Pro Gly Tyr Thr Leu Asp Val Asp Ala Lys Gly 100 105 110 Thr Leu Asn Ile Leu Glu Ala Val Arg Ile Leu Gly Leu Thr Asp Lys 115 120 125 Thr Arg Val Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly Lys Val Gln 130 135 140 Glu Val Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg Ser Pro Tyr 145 150 155 160 Gly Val Ala Lys Ile Tyr Gly Phe Trp Ile Thr Lys Asn Tyr Arg Glu 165 170 175 Ser Tyr Ser Met Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu Ser 180 185 190 Glu Arg Arg Gly Glu Thr Phe Val Thr Arg Lys Ile Thr Leu Ala Ala 195 200 205 Ser Arg Ile Ala Gln Gly Lys Gln Gln Lys Leu Thr Leu Gly Asn Leu 210 215 220 Asp Ser Leu Arg Asp Trp Gly Tyr Ala Lys Asp Tyr Val Glu Cys Met 225 230 235 240 Trp Leu Ile Leu Gln His Asp Lys Pro Glu Asp Phe Val Ile Ala Thr 245 250 255 Gly Glu Met His Ser Val Arg Glu Phe Val Gln Leu Ala Phe Lys His 260 265 270 Thr Gly Ile Glu Ile Glu Trp Ser Gly Glu Gly Leu Glu Glu Lys Gly 275 280 285 Thr Asn Lys Ala Thr Gly Glu Val Ile Val Glu Ile Asp Pro Lys Phe 290 295 300 Phe Arg Pro Ala Glu Val Asp Gln Leu Leu Gly Asp Pro Thr Lys Ala 305 310 315 320 Lys Thr Leu Leu Lys Trp Asn Pro Thr Lys Thr Ser Phe Glu Glu Leu 325 330 335 Val Arg Ile Met Val Glu Ala Asp Met Lys Lys Val Glu Ser Glu Glu 340 345 350 Lys Ile Lys Val Met Phe Asp 355 <210> 27 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase <400> 27 atgaaacttg tattgttatc gggtggatct ggtaagcgtc tatggccgtt atcaaatgat 60 acgcgttcga agcagttttt aaaggtatta gaaggacgag atggacagaa agagtcaatg 120 gttcagcgcg tctggagtca aattgaagcg gttgggttaa atgagtcaac ggttattgcg 180 acgtctaagc ttcagcgtga tatgattaca ggtcaggttg gcaccgatat tccgttgatt 240 attgaacctg agcgccgcga tacgtttcca gcgattgctt tagctgcttc atatcttcat 300 tccgaagagc aagcatctga agatgaaatc gttgtggtgt tgccagttga cccttatgtg 360 gaagacggat tttttgaacg ggtaaaagat ttagaaagtg tgcttcgtga ttcaaaagcg 420 gatttagcgt taatgggtgt tacacctacg tatccttcat ctaagtacgg gtacatcgtg 480 ccggaaggaa aggtacaagg ggacagttat tttacagtgg attgttttac agaaaagccg 540 agtgaagaag cagctgttgg attaattaat cagcgtgcgc tttggaactg cggcgttttt 600 gcgtttcgtt taggttattt gcttcaaatt ttacaagaga aaaaacttcc acttcaattt 660 gaaacgctac ataaagaata tgcaacattg cctaaaatta gttttgacta tgaagtggtg 720 gaaaaggcaa gtcatattgt cgcgcttccg tatgatgggt actggaaaga tcttggtaca 780 tggaatacgt taacggaaga aatggcgaca tctcaaattg gaaaaggtgt attaacggac 840 gactcagcta atacgcattt agtgaatgaa ttagatattc cggttacggt attaggcgta 900 aaagatgtag ttgttgccgc tagtccagat gggatcttag ttgcggataa agcatctagt 960 cctaagatta aagaaattat tggcgactgg aactaccctc caatgtatga agaacgtctt 1020 tggggctggt cacgcgtgtt agattatgca aagtatgatg aagaaactga aatggtgaca 1080 aaacgtattc atatttcaaa aggaaagaac tcgacgtatc actatcataa tttacgtgat 1140 gaagtatgga cgattgtacg tggagaagga gagcttgcgc ttgatgacta cattcgccgc 1200 gtaaaagcag gggatattat tcacttgccg gctggcaaaa agcacggaat tcatgcgtta 1260 accgaccttg aatttattga agtacaaacg ggaaaagtga tttcaaatga agatagtatt 1320 cgccttattt atgactggaa tgatgtgatc aagcaattcc aatcatcaag accgcaggtg 1380 attttataa 1389 <210> 28 <211> 1080 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding phosphomannomurase <400> 28 ttgaaaacaa ttgcctatta catttcagac tacggatatg gccacgcgac tagaagcacg 60 gccattattc gtcaattatt aaagcaaaat gaagaaatag aaattattat ttgtcattca 120 tttgcgattg agtttctcag acaatctttt agatatgaac gtcgtgtgag gtttcgagag 180 attttaacgg atgtcggcta cgtgctaaaa gaaaattcac tagaaccaga cgctgatttg 240 ttgaatcgtc aagttgcttc ttatgtatca agctttcata cgaagcttat gtatgagaag 300 cactttatga aagtagccaa cgtttcattc gtgatttcgg atatttctcc gttagggatc 360 gcaggtgcct atctattaaa attgccttct ttaggaatat caaatttcac ttggtttaca 420 gcatacgaag ggttaattgg agagctatcg ctggaatttt tagaaaaacg ttataagcag 480 atgacgtatc agttttcgct agcatgtagt gatgagccac attggggtat caaagaaaat 540 caaagctttg gtttttattc aagagaaata aacgattctg aagtacagcg tattcgtaaa 600 gagattgatc ctgaaggtga gagttacatc atctacttcg gtctgggtat gaaagtagat 660 attggaacgt tgtcggactt gcctatttgg caaagtccaa actgcaagtt tatcgtttca 720 tcgaatgttg atgttactca tcccaatgtt tataaaattc ctcaagatga aacagaaacg 780 cagcactatg tagcagcagc tgatcttggt ttaacaaaag caggctgggg cacgattagt 840 gaagcggttt gcgctggtgt gccgctgttg attacaaatc gcagcagcat gaaagaagat 900 cgtcatacga ttgattattt agttcgtcat cagctatgcg acttaataga gtggaaagag 960 ttagaaggtt tagtagtaac tccttcgctt attgagacat gcaggcggca gcaaatcaat 1020 cgctataaaa atgaagcgat gcatatcgcc gaagaaatca ataaaaaaat aaacagttag 1080 1080 <210> 29 <211> 942 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding GDP-L-fucose synthase <400> 29 atgaacaaaa attcgaaaat ttacgtagct ggtcatagag gtctcgtcgg ttcagctatc 60 gtacgaaaac tacaagaaaa aggctatagc aatctagtgt atcgcacaag cgctgagcta 120 gatttaagag acaagccgac agtagacgca ttctttgctg aagaaaagcc agaatttgtt 180 ttcttagcag ccgctaaagt aggtggtatt gtggcaaaca atgaatatcc agcggaattt 240 attcacgata acttattgat tcaatcaaat attattgatg cagcatatcg caatgatgta 300 gagaaactat tattcctagg aagtacatgt atttatccaa aattagcgcc tcagccatta 360 aaagaagaat acttactaac aggtgagctg gagccaacaa acgaaccgta tgcaattgct 420 aaaattgctg gaatcaaaat gtgtgaatcc tataaccgtc agtacggaac aaaatatatc 480 tcggcaatgc ctactaacct ttacggtcca aacgacaatt ttgaccttca tacatcacac 540 gttcttcctg cactgcttcg taagttccat gaagcgaaag aaagcaatgc gccgtttgtt 600 gaaatgtggg gaacaggcac accaaaacgt gaatttctat attcagatga cctagcagat 660 gcgtgcgtat tcttaatgaa tacatatgaa ggcaatgaaa tcgttaatat cggtgtggga 720 gaagatatta cgattaaaga acttggcgaa aaagtaaaag cagttgttgg ttatgaagga 780 aatattcagt ttgatacgtc aaaaccagac ggaacgcctc gtaaactagt agacgtaaca 840 aaattgaaca gtcttggctg gaaagcagaa acagctttag aagacggtct tcaaaaagcg 900 tatcagtggt ttttagataa cgaactagct gcagcaaaat aa 942 <210> 30 <211> 1080 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding GDP-D-mannose-4,6-dehydratase <400> 30 atgaaaacag cattaattac aggtgtaaca ggacaagatg gatcatactt agcagaactt 60 ttactagaaa aaggctatga agtgcacgga ctaattcgcc gcagctcttc ttataaccaa 120 gagcgtctag aagatctttt aacagaagaa gcagcgagcg cattattaaa caactcaaac 180 ttccaccttc actatggtga cgtaacagat gcattaaatg ttactcgtat tattggtgac 240 attcagccag atgaaattta caatctagct gcacagtcac atgtacgtgt gtcttttgat 300 atgcctggat atacattaga tgttgatgca aaaggtacgt taaacattct tgaagctgta 360 cgtattttag ggttaacaga taaaacacgt gtgtaccaag cttctacatc tgaactgtac 420 ggaaaagttc aagaagtacc acaaaaggaa acaacacctt tctaccctcg ttctccatat 480 ggcgtagcga aaatttacgg cttttggatt acaaagaact accgtgaatc ttatagcatg 540 tttgcagtaa acggtatttt atttaaccat gaatcagagc gccgcggcga aacgttcgta 600 acacgtaaaa ttacgcttgc tgcttcacgt atcgcgcaag gcaagcagca aaaattaacg 660 cttggaaact tagactcttt acgtgactgg ggttacgcaa aagactatgt agaatgcatg 720 tggttaattc ttcaacacga taaacctgaa gattttgtta ttgcgactgg tgaaatgcac 780 tcagtacgtg aatttgtaca gcttgcattc aaacatacag gcattgaaat tgagtggagc 840 ggtgaaggtc tagaagaaaa aggaacaaat aaagcaacgg gtgaagtgat cgtagaaatc 900 gatcctaagt tcttccgtcc tgcagaagtg gatcaattgt taggtgatcc aactaaagcc 960 aagactttat taaagtggaa ccccactaag acttcgtttg aagaattagt tcgcattatg 1020 gtggaagcgg acatgaagaa ggttgaaagc gaagagaaga ttaaggtgat gtttgattaa 1080 1080 <210> 31 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS <400> 31 aaggaggtg 9

Claims

바실러스 (Bacillus) 속 미생물 유래의 α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산 서열과, 이와 작동 가능하게 연결된 항시 발현 프로모터를 포함하는 조절 서열을 포함하며,
바실러스 (Bacillus) 속 미생물에서 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 유전자 발현 카세트 (gene expression cassette).
제1항에 있어서, 상기 항시 발현 프로모터는 p3610, p12455, p24930, pTu, 및 pPDC로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 유전자 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 조절 서열은 서열번호 21의 핵산 서열을 포함하는 리보좀 결합 영역 (Ribosome Binding Site, RBS)을 포함하는, 유전자 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 2 내지 5로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 유전자 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 7 내지 10으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 핵산 서열을 포함하는 것인, 유전자 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 유전자 발현 카세트는 락토오스 막 수송 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인, 유전자 발현 카세트.
제6항에 있어서, 상기 락토오스 막 수송 단백질은 Lac12 및 LacY로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 유전자 발현 카세트.
제6항에 있어서, 상기 락토오스 막 수송 단백질의 조절 서열을 추가로 포함하며, 상기 조절 서열은 프로모터 및 RBS로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 유전자 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 유전자 발현 카세트는 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 및 바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis) 로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상에서 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 것인, 유전자 발현 카세트.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 α-1,2-푸코오스 전이효소를 발현하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터.
제10항에 있어서, 상기 벡터는 도 1a의 개열지도를 가지는 재조합 벡터인, 벡터.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 유전자 발현 카세트를 포함하거나, 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 바실러스 속 미생물.
제12항에 있어서, 상기 벡터는 푸코오스 합성 유전자 발현 카세트를 추가로 포함하는 것, 또는 상기 미생물은 푸코오스 합성 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터를 추가로 포함하는 것인, 미생물.
삭제
제13항에 있어서, 상기 푸코오스 합성 유전자 발현 카세트는,
GTP 만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제를 암호화하는 핵산 서열, 포스포만노뮤타아제를 암호화하는 핵산 서열, GDP-L-푸코오스 신타아제 (WcaG)를 암호화하는 핵산 서열, 및 GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제를 암호화하는 핵산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과, 이와 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함하며,
상기 조절 서열은 항시 발현 프로모터를 포함하는 것인, 미생물.
제15항에 있어서, 상기 푸코오스 합성 유전자 발현 카세트에 포함되는 조절 서열은 p3610, p12455, p24930, p0706, pTu, 및 pPDC로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 항시 발현 프로모터를 포함하는 것인, 미생물.
제13항에 있어서, 상기 푸코오스 합성 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터는 도 1b의 개열지도를 가지는 재조합 벡터인, 미생물.
제12항에 있어서, 상기 바실러스 속 미생물은 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 및 바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 미생물.
제12항에 따른 재조합 바실러스 속 미생물을 이용하여 얻어진 α-1,2-푸코오스 전이효소, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 2'-푸코실락토오스 생산용 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 유전자 발현 카세트를 포함하거나, 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 바실러스 속 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 2’-푸코실락토오스 (2’-fucolsylactose)의 제조방법.