JP3862776B2 - 乳酸菌産生エキソポリサッカライド - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エキソポリサッカライドの生合成に関与する少なくとも１種の酵素をコードする乳酸菌の染色体ＤＮＡフラグメントの使用、ならびにこれらのフラグメントによってコードされる酵素に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸菌はそれらの培養培地中に２種類のポリサッカライド、すなわち単一糖の反復アッセンブリーから構成されるデキストランもしくはレバンのようなホモポリサッカライド、および反復単位を形成する数種の異なる糖のアッセンブリーから構成され一般にエキソポリサッカライドもしくはＥＰＳ（ＥＰＳは「エキソポリサッカライド」の略号である）と呼ばれるヘテロポリサッカライドを産生できることが知られている（Ｃｅｒｎｉｎｇ Ｊ．，Ｂａｃｔｅｒｉｅｓ，〔乳酸菌〕，第１巻，Ｒｏｓｓａｒｔ Ｈ．＆ Ｌｕｑｕｅｔ Ｆ．Ｍ．著，Ｌｏｒｉｃａ，３０９−３２９頁，１９９４）。
【０００３】
ＥＰＳを産生する乳酸菌は、酸性化したミルクへ粘着性および／または滑らかなクリーム様の舌ざわりを付与できる（Ｃｅｒｎｉｎｇら，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８７，１１３−１３０，１９９０）。ＥＰＳはまた、ヒトまたは動物の健康にとくに有利な生物活性、たとえば抗腫瘍活性もしくはプロバイオティックな活性を発揮することもできる（Ｏｄａ Ｍ．ら，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４７，１６２３−１６２５，１９８３；ＥＰ９４８７０１３９．６）。
【０００４】
さらに、その工業は乳酸菌内でのＥＰＳの生合成の遺伝的不安定性の問題に直面している。これは一般に、すべてまたは一部の乳酸菌によるＥＰＳ産生の発酵時の損失として現れる（上記”Ｃｅｒｎｉｎｇ Ｊ．”参照）。したがって、工業的発酵産物はそのＥＰＳ含量が変動しやすく、常に許容できるものとは限らない。これらの問題を除去するため、工業的製造に際し現在では、最初の性質を失った細菌を分離できるように、細菌を単離し周期的に性質を調べる方法に頼っている。
【０００５】
好中温乳酸菌、すなわち至適増殖温度２８〜３７℃の乳酸菌におけるＥＰＳ生合成には、糖の連結を行う少なくとも１種の酵素が関与する。このような酵素をコードする好中温乳酸菌の染色体またはプラスミド遺伝子の同定および配列決定はまだ行われていないが、ＥＰＳの生合成に関与するプラスミドは知られている。
【０００６】
すなわち、ＷＯ ９２／０２１４２には、発酵乳の粘度を増大させることができる物質を乳酸連鎖球菌の亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ；好中温菌）内で産生させるプラスミドｐＨＶ６７の存在が開示されている．ＵＳ５，０６６，５８８には、乳酸連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）に増粘特性を付与できるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ（好中温菌）の株に由来する２つのプラスミドが記載されている。同様に、Ｖｅｓｃｏｖｏらは、チーズ乳酸桿菌の亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉ株；好中温菌）から、いわゆる細胞外のシックナーの産生に関連する機能、Ｍｕｃ＋表現型をコードするプラスミドを証明している（Ｖｅｓｃｏｖｏら，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２，７０９−７１２，１９８９）。
【０００７】
最後に、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｅｒｇらは、清酒乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ；好中温菌）からＥＰＳの生合成に関与する染色体遺伝子群の単離を探究している（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｅｒｇ Ｄ．Ｊ．Ｃ．ら, ＦｉｒｓｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｐｏｌｕｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｔｒｏｎｄｈｅｉｍ，Ｎｏｒｗａｙ，１９９４年６月６〜８日）。しかしながら、遺伝子はまだ同定も配列決定もされていない。
【０００８】
さらに、好熱乳酸菌、すなわち至適増殖温度３７〜４５℃の乳酸菌におけるＥＰＳの生合成はまだよく知られていない、しかしながら、プラスミドに関連しないことはわかっている。すなわち、Ｖｅｓｃｏｖｏらは、乳酸桿菌の亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ株２０１；好熱菌）のＭｕｃ＋表現型が染色体機能に連結していることを示している（Ｖｅｓｃｏｖｏら, Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２，７０９−７１２，１９８９）。
【０００９】
すなわち、今日まで、好中温または好熱乳酸菌のＥＰＳをコードする染色体またはプラスミド遺伝子または遺伝子群は，同定も配列決定もされていない。
【００１０】
したがって、乳酸菌における本来のＥＰＳ産生を修復または安定化する手段を提供することはきわめて有益である。さらに、ＥＰＳの構造を修飾する手段を提供し、有利な性質を有する新たなＥＰＳを創製することは有益である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、インビボおよびインビトロにおけるＥＰＳの合成を制御、修飾および／または修復する新規な手段を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この目的のために、本発明は、リピート構造
【化４】
（式中、ｎは＞１であり、Ａはβ−Ｄ−Ｇａｌｐ，β−Ｄ−Ｇｌｃｐならびにそれらのアセチルおよびホスファチル誘導体からなる群より選ばれ、ｘおよびｙは２，３，４，５または６である。ただしｘ＝ｙではない）をもつＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１種の酵素をコードする染色体起源の乳酸菌ＤＮＡに関する。
【００１３】
本発明の他の課題は、本発明のＤＮＡフラグメントからなる組換えベクターに関する。
【００１４】
本発明の他の課題は、リピート構造
【化５】
を有するＥＰＳの生合成に関与可能なタンパク質であって、配列番号：２，配列番号：３，配列番号：４，配列番号：５，配列番号：６，配列番号：７，配列番号：８，配列番号：９，配列番号：１０，配列番号：１１，配列番号：１２，配列番号：１３および配列番号：１４の配列ならびにその相同配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列をもつタンパク質に関する（配列は以下の配列表に示す）。
【００１５】
本発明の他の課題は、本発明のＤＮＡフラグメントをゲノム内にインテグレートされてまたは複製可能なプラスミドの補助によって有する乳酸菌に関する。
【００１６】
本発明の他の課題は、（１）本発明の酵素をコードするＤＮＡフラグメントを、宿主細胞内での自動複製または宿主細胞へのインテグレートを可能にする配列からなるベクター中にクローニングし、（２）宿主細胞を上記ベクターでトランスフォームし、ついで（３）トランスフォームされた宿主細胞をＥＰＳの産生に適当な条件下に培養する、ＥＰＳの製造方法に関する。
【００１７】
本発明はまた、（１）ＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１種の酵素をコードするＤＮＡフラグメントをベクター中にクローニングし、（２）乳酸菌を上記ベクターでトランスフォームし、次いで（３）トランスフォームされた乳酸菌を新たなＥＰＳの産生に適当な条件下に培養する、新たなＥＰＳを製造する他の方法に関する。
【００１８】
したがって、本発明は、乳酸菌におけるＥＰＳの産生の修復または修飾のために、本発明のＤＮＡフラグメントの利用の可能性の道を開くものである。すなわち、たとえば、液状デザート、ヨーグルト、スープ、乳製アイスクリーム、コーヒークリーム、ソースまたはマヨネーズのような飲料または食品の増粘およびクリーム化の目的でのＥＰＳの製造のために、本発明のＤＮＡの乳酸菌内における発現または過剰発現を企図することが可能である。
【００１９】
本発明はまた、ＥＰＳの生合成に関与する乳酸菌の染色体遺伝子を同定する新規な手段の提供を可能にするものである。
【００２０】
最後に、本発明はまた、上述のＥＰＳの生合成に関与する新規な酵素を提供する。すなわちこれらの酵素はたとえば、ポリサッカライドたとえばオリゴサッカライドまたはＥＰＳのインビトロ合成または修飾に有利に使用することができる（Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｙ．ら, Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１１４，９２８３−９２８９，１９９２）。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下の記述において、「ＥＰＳ」の語は，反復単位を形成する数種の異なる糖のアッセンブリーから構成され、乳酸菌によって産生されるエキソポリサッカライドを意味する。
【００２２】
アセチルおよびホスファチル誘導体の語は、糖の環上の位置Ｃ2 〜Ｃ6 に、少なくとも１個のアセチルおよびホスファチル基を有するガラクトースまたはグルコースを意味して使用される。
【００２３】
本発明の目的では、「相同配列」は、本発明の配列とは少数の核酸またはアミノ酸ベース、たとえば１〜５００塩基対（ｂｐ）または１〜１５０のアミノ酸の置換、欠失または付加の点でのみ異なるが同一の機能を有する核酸またはアミノ酸配列を意味するものと理解される。
【００２４】
この場合、遺伝子コードの縮重の結果として、同一のポリペプチドをコードする２つのＤＮＡ配列はとくに相同であると考えてよい。同様に、同一の抗体によって認識されるタンパク質であって、２つのタンパク質の認識の強度を示す値の比が１０００、好ましくは１００を越えない２つのタンパク質はたとえば、相同であるとみなされることになる。
【００２５】
配列が、本発明の配列と７０％以上とくに８０％または９０％以上のホモロジーを示す場合も相同であると考えられることになる。この場合、ホモロジーは、本発明の配列の場合と同一である相同配列の塩基またはアミノ酸の数と本発明の上記配列の塩基またはアミノ酸の総数の比によって決定される。
【００２６】
本発明の目的では、「ハイブリダイズするフラグメント」とは、本発明のフラグメントとサザンブロッティング法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら, ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９，９．３１〜９．５８章）によってハイブリダイズできる配列を意味するものと理解される。ハイブリダイゼーションは、非特異的なおよび不安定なハイブリダイゼーションを回避できるように、緊縮条件下に行われることが好ましい。
【００２７】
最後に、「フラグメント」または「ＤＮＡフラグメント」の語は、合成、インビトロでのたとえば「ポリメラーゼチェーン反応」と呼ばれる既知の方法による再生、またはインビボでのたとえば大腸菌、連鎖乳酸菌または乳酸桿菌好熱型の細菌で再生できる染色体起源の二本鎖ＤＮＡと理解されるべきである。
【００２８】
本発明のＤＮＡを選択するためには、ＥＰＳを産生しない乳酸菌中にＥＰＳを産生する乳酸菌からの大ＤＮＡフラグメントのライブラリーを構築し、ついで、ＥＰＳを産生するクローン（単数または複数）を選択することができる。この目的には、ＥＰＳを産生する乳酸菌のゲノムＤＮＡを比較的稀な制限部位に特異的な制限酵素（ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩ，ＰｓｔＩ）で、またはＳａｕ３Ａによる部分消化によって、たとえば消化する。消化産物を大フラグメントを受け入れる発現またはインテグレーションプラスミド（例ＩＩに記載のプラスミドｐＳＡ３）にクローニングし、組換えプラスミドをＥＰＳを産生しない同種の乳酸菌に導入し、ＥＰＳを産生するトランスフォームされた少なくとも１つのクローンを選択し、ついでＥＰＳの産生に関与するＤＮＡフラグメントを旧来の方法で同定し、単離し、配列を決定する。
【００２９】
本発明のフラグメントは大サイズとすることが可能で、それらはＥＰＳの生合成に関与する遺伝子群を含有できるという事実から、組換えプラスミドは突然変異誘発処置（ＵＶもしくは化学的処置またはトランスポゾンによる処置）によりＥＰＳの産生能が失われているという事実を除いてそれらのフラグメントの起源である乳酸菌と同一の株に導入するのが好ましい。
【００３０】
上述の方法の別法として、たとえば、ＥＰＳを産生する乳酸菌株からのＤＮＡフラグメントのプラスミドライブラリーを構築し、同じ乳酸菌の株をその内部では複製不可能なプラスミドでトランスフォームし、同種組換えによってそれらのゲノムにプラスミドがインテグレートされたトランスフォーマントを選択し（たとえば、抗生物質抵抗性による選択）、ＥＰＳをもはや産生しないトランスフォーマントを選択し、ついで選択されたトランスフォーマントのインテグレートされたプラスミドに隣接する染色体ＤＮＡフラグメントを単離し、配列を決定する。この目的では、トランスフォーマントの染色体を消化し、それをライゲートし、ついでインテグレートされたプラスミドに特異的なプローブを使用して逆ＰＣＲを実施するかまたは再循環プラスミドを複製可能な株にライゲーション産物を導入することもできる。
【００３１】
上述の選択方法の他の別法として、ＥＰＳを産生する乳酸菌をトランスポゾンからなるプラスミドによってトランスフォームし、この細菌を、トランスポゾンがベクターから切除されてゲノム中にランダムにインテグレートされる条件に付し、ＥＰＳの産生能を失った細菌のクローンを選択し、トランスポゾンがインテグレートされた上記クローンからゲノムＤＮＡフラグメントを単離することもできる。この方法は以下の例Ｉに詳細に記述する。
【００３２】
上に簡略に述べた選択方法はすべての既知の乳酸菌、とくに好中温乳酸菌たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅならびに好熱乳酸菌たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓに適用できることが指摘されねばならない。この目的では、本技術分野の熟練者は乳酸菌の各種とくにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓについて任意に選択できるトランスフォーメーション技術を有する（Ｓａｓａｋｉ Ｙ．ら, ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２，Ｆｏｕｒｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｎｏｏｄｗｉｊｋｅｒｈｏｕｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９９３年９月）。
【００３３】
さらに、上述の選択方法は、大抵、ＥＰＳの生合成に関与する遺伝子または遺伝子群の部分のみの単離を可能にする。しかしながら、本技術分野の熟練者はたとえば、単離されたフラグメントに基づく核酸プローブを用い、残りの部分を含有する１または２以上のクローンを染色体ライブラリー中で選択することにより遺伝子または遺伝子群の残部を容易に同定することができる（例Ｉ．６参照）。
【００３４】
したがって１９９５年６月７日付にてＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ ｏｒｇａｎｉｓｍｅ（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．，国立培養微生物収集機関），２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５，Ｆｒａｎｃｅに寄託され、受入番号ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０として受理されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株の１５．２ｋｂのＤＮＡ配列を特徴づけることが可能であった。さらに、このグラム陽性株は顕微鏡下に小さい鎖を形成する非鞭毛球菌の外観を呈する。この株は胞子を作らず、通性嫌気性菌である。
【００３５】
この１５．２ｋｂの配列は、リピート構造
【化６】
を有するＥＰＳの生合成に関与する新しい酵素をコードする遺伝子からなる。
【００３６】
この１５．２ｋｂの配列のヌクレオチド６４８〜１５２５０は以下の配列表中に配列番号：１として示す。配列番号：１の核酸配列中ヌクレオチド３５２〜１８０３, １８０７〜２５３５, ２５４７〜３２３９, ３２４９〜３９９５, ４０５１〜４７３１, ４８９８〜５８５４, ６４２５〜７５４０, ７７３６〜８２１２, ８２２１〜９１９２, ９２８５〜１０３６４，１０３９２〜１１３３９，１１３０２〜１２２２２および１２２３３〜１３６５１によって１３の完全遺伝子が区切られる。
【００３７】
配列番号：１のすべてまたは部分は、トランスフォーメーション後に、最初はＥＰＳを産生しなかった好中温または好熱乳酸菌、とくにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓのような宿主細胞にＥＰＳ生合成の回復を可能にすることを示すことができた。したがって一例を挙げれば、本発明のＤＮＡ配列はＥＰＳをもはや産生しないＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭＩ−１５９０の変異体（天然の変異体または突然変異に起因する変異体）にＥＰＳの産生を回復させるために使用できる。
【００３８】
ＥＰＳの生合成を回復させるためには、少なくとも上述の遺伝子からなる配列番号：１の配列の全部または部分をＥＰ５６４，９６６に記載の方法によって宿主細胞内にインテグレートすることができる。この方法は本発明の教示の参考として本明細書に導入する。略述すれば、この方法は（１）宿主細胞を、その宿主細胞に由来するオペロンの部分に機能的に（リーディングフレームが保存されて）インテグレートされた上記プラスミドからなりそのドナー内では複製されないドナープラスミドでトランスフォームすること、（２）全プラスミドがインテグレートされてなるトランスフォーマントを同定すること、（３）本発明のフラグメントのみが染色体中にインテグレートされ、プラスミドの他の配列は染色体から切除されたトランスフォーマントを選択すること、および（４）選ばれたトランスフォーマントをＥＰＳの産生に適当な条件下に培養することを可能にした。
【００３９】
この方法は機能性プロモーターや翻訳アクティベーターを用いないことを可能にするものではないことに留意すべきである。さらに、ＥＰＳの産生に適当な培養条件は本技術分野の熟練者の能力の範囲内にあり、本技術分野の熟練者には、使用される株に応じて、標準培養培地の使用ならびに至適培地のｐＨ、温度および攪拌の選択が可能である。
【００４０】
また上記遺伝子の少なくとも１種からなる配列番号：１の配列の全部または部分を、自己複製発現プラスミド中の機能性プロモーターおよび翻訳アクティベーターの下流、必要に応じてターミネーターの上流にクローン化し、ついでこの組換えプラスミドで宿主細胞をトランスフォームすることの選択も可能である。
【００４１】
さらに、たとえば、最初はＥＰＳを産生しない連鎖乳酸菌を配列番号：１の配列でトランスフォームした宿主細胞が産生するＥＰＳは、組換え酵素によって正常に合成されるＥＰＳ、この場合は株ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０によって産生されるＥＰＳとは異なることが観察される。したがって、１５．２ｋｂの配列の全部または部分の使用は上述のＥＰＳの変異体の創製を可能にすることができる。
【００４２】
同様に、配列番号：１の配列の全部または部分は、トランスフォーメーション後、宿主細胞たとえば、好中温または好熱乳酸菌とくに、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓのような宿主細胞によって最初に産生されるＥＰＳのリピート構造を修飾することを可能にすることを示すことができた。
【００４３】
すなわち、これらの観察は、（１）ＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１種の酵素を全体的または部分的にコードするＤＮＡフラグメントをベクター中にクローン化し、（２）乳酸菌をその組換えベクターでトランスフォームし、（３）必要に応じて、新たなＥＰＳを産生する乳酸菌を選択し、ついで（４）トランスフォームされた乳酸菌を新たなＥＰＳの産生に適当な条件下に培養する、新たなＥＰＳの新規な製造方法の提供の可能性を開くものである。ベクターは好ましくは本発明のタンパク質をコードする。さらに、乳酸菌は上記ベクターによりコードされるタンパク質によって合成されるＥＰＳ以外のＥＰＳを産生できる。
【００４４】
とくに、第一のＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１種の酵素を部分的にコードするＤＮＡフラグメントをインテグレーションベクター中にクローン化し、組換えベクターを必要に応じて第二のＥＰＳを産生できる好中温または好熱乳酸菌中に１もしくは２以上の染色体またはプラスミド遺伝子を介して導入し、インテグレーションベクターがそれらの染色体中にインテグレートされた細菌を単離し、ついで新たなＥＰＳを産生する細菌を第二のＥＰＳの生合成に関与する１または２以上の遺伝子の不活性化によって選択する。好ましくは第一および第二のＥＰＳは同一であり、リピート単位の側鎖への糖の付加または糖の修飾に関与する少なくとも１種の酵素たとえば、スルホ、ホスホまたはアセチルトランスフェラーゼを部分的に（少なくとも１５塩基対）コードするＤＮＡフラグメントが選択される。
【００４５】
同様に、第一のＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１種の酵素の全体をコードするＤＮＡフラグメントを複製可能な発現ベクター中にクローン化し、その組換えベクターを、必要に応じて第二のＥＰＳを１もしくは２以上の染色体またはプラスミド遺伝子を介して産生できる好中温または好熱乳酸菌に導入し、複製可能なベクターを含有する細菌を単離し、ついで第一のＥＰＳの生合成に関与する１または２以上の遺伝子の発現によって新規なＥＰＳを産生する細菌が選択される。好ましくは、糖の修飾に関与する酵素たとえば、スルホ、ホスホもしくはアセチルトランスフェラーゼ、または糖のリピートを付加する酵素たとえばグルコシルもしくはガラクトシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡフラグメントが選択される。
【００４６】
配列番号：１の配列に包含される遺伝子の少なくとも１つを全体的にまたは部分的に使用するのが好ましい。ＥＰＳの生合成に関与する好中温乳酸菌のプラスミド遺伝子（既知のプラスミドから配列決定できる遺伝子）の少なくとも１つも使用できる。
【００４７】
最後に、組換えベクターは、本発明のＤＮＡ配列、とくに配列番号：１の配列のすべてまたは部分からなる線状または環状、一本鎖または二本鎖、発現またはインテグレーションベクターとすることができる。ＥＰ５６４，９６６に記載の方法を使用しない場合には、ベクターが適当な核酸配列（プロモーター、リボソーム結合部位、好ましいコドン）を介して本発明のＤＮＡを発現できるように、またそれがたとえば、様々な細菌とくに大腸菌および／または連鎖球菌からの１もしくは２以上の複製の起源を含有するように注意する必要がある。
【００４８】
本発明はまた、配列番号：１の配列遺伝子とくにそれらと相同な配列によってコードされる新たな酵素に関する。したがって、これらの、オリゴサッカライドまたはポリサッカライドたとえばＥＰＳの修飾またはインビトロ合成のための使用が考慮される。この目的では、これらの酵素の少なくとも１種は、細菌中で旧来法によって過剰発現させ、旧来法たとえば培養培地の沈殿および／またはクロマトグラフィーにより精製されることが好ましい。
【００４９】
本発明の他の課題は、その染色体にインテグレートされてまたは複製可能なプラスミドの補助により本発明のＤＮＡ配列を含む乳酸菌に関する。その配列は好ましくは配列番号：１の配列の遺伝子の少なくとも１つからなる。
【００５０】
本発明はまた、少なくとも１５ｂｐの配列番号：１の配列のＤＮＡフラグメントまたはその配列に相補性配列鎖のフラグメントの、ＰＣＲを実施するためのプライマーとしてまたはＥＰＳの生合成に関与する乳酸菌の遺伝子のインビトロ検出もしくはインビボ不活性化のためのプローブとしての使用に関する。この下限は、特異的にハイブリダイズする小フラグメントは一般に長さ１５〜２５ｂｐであるという事実により任意に設定される。
【００５１】
【実施例】
本発明のＤＮＡフラグメント、組換えプラスミドおよびトランスフォームされた細菌を得る実施例である以下の記述により、本発明を以下にさらに詳細に説明する。それらの記述に先立ち、培養培地を説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明の課題の例示のために記載されるもので、いかなる意味でも本発明の限定を構成するものではないことは自明の通りである。ＤＮＡの操作ならびに細菌細胞のクローニングおよびトランスフォーメーションは、とくに指示のない限り、上に引用したＳａｍｂｒｏｏｋらの著作に記載のプロトコールに従って実施する。百分率はとくに指示のある場合を除き重量％を示す。
【００５２】
培地：（固体培地に１．５％のバクトアガールを添加）
−Ｍ１７（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）：トリプトン０．５％，ソイトン０．５％，水解ミート０．５％，酵母エキス０．２５％，アスコルビン酸０．０５％，硫酸マグネシウム０．０２５％，β−グリセロリン酸二ナトリウム１．９％および水
−ＬＭ１７：１％ラクトース含有Ｍ１７培地
−ＧＭ１７：１％グルコース含有Ｍ１７培地
−ＭＳＫ：酵母エキス０．１％含有脱脂粉乳（１０％再構築粉末）
−ＭＡＭ：アミノ酸混合物（４９５ｍｇ／ｌ Ａｌａ，３４３ｍｇ／ｌ Ａｒｇ，６８２ｍｇ／ｌ Ａｓｐ，５９ｍｇ／ｌ Ｃｙｓ，１２２９ｍｇ／ｌ Ｇｌｕ，７５９ｍｇ／ｌ Ｇｌｙ，１５３ｍｇ／ｌ Ｈｉｓ，２１５ｍｇ／ｌ Ｉｓｏ，４７０ｍｇ／ｌ Ｌｅｕ，５６５ｍｇ／ｌ Ｌｙｓ，１２２ｍｇ／ｌ Ｍｅｔ，２５５ｍｇ／ｌ Ｐｈｅ，４３６ｍｇ／ｌ Ｐｒｏ，６８ｍｇ／ｌ Ｓｅｒ，１７０ｍｇ／ｌ Ｔｈｒ，６１ｍｇ／ｌ Ｔｒｙ，３０４ｍｇ／ｌ Ｖａｌ，ｐＨ５に調整）１０％含有脱脂粉乳（１０％再構築粉末）
−ＨＪＬ：トリプトン３％，牛肉エキス０．２％，酵母エキス１％，ラクトース１％およびＫＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ６．５，０．５％
−ルテニウムレッド：酵母エキス０．５％，脱脂粉乳粉末１０％，スクロース１％，アガール１．５％およびルテニウムレッド０．０８ｇ／ｌ（ＦＲ２，６３２，９６８参照）
【００５３】
例Ｉ：Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓｆｉ６のＤＮＡフラグメントのクローニング
Ｉ．１．ＥＰＳを産生するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株の選択：Ｎｅｓｔｌｅコレクションからの乳酸菌の株をＨＪＬ液体培地中で培養し、その希釈液をルテニウムレッド固体培地上にプレートアウトする。ＥＰＳは細胞壁の染料による染色を防止するので、ＥＰＳを産生する株は白色に維持される。これに反して、非産生株は細胞壁のペプチドグリカンに対する染料の親和性のために赤色に染まる。
この方法で、寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０として寄託され「株Ｓｆｉ６」の表示で以下の例に指示するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓｆｉ６がＥＰＳ産生乳酸菌から選択された。
【００５４】
Ｉ．２．ＥＰＳのリピート構造：株Ｓｆｉ６によって産生されるＥＰＳの構造は、Ｄｏｃｏら（Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，１９８，３１３−３２１，１９９５）に報告されている。このＥＰＳは組成Ｇｌｃ：Ｇａｌ：ＧａｌＮａｃ＝１：２：１、およびテトラサッカライドのリピート単位
【化７】
を有する。
【００５５】
Ｉ．３．トランスポゾンＴｎ９１６による突然変異誘発：ストレプトマイシン含量を２０から２０００μｇ／ｍｌまで増大させ補充したＨＪＬ培地に繰返し移してＳｆｉ６株を培養し、自然に抵抗性になる株を選択することによりストレプトマイシン抵抗性とする。
ストレプトマイシン抵抗性Ｓｆｉ６株、およびトランスポゾンＴｎ９１６（Ｔｎ９１６はテトラサイクリン抵抗性遺伝子をもつことが知られている；Ｇａｗｒｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３００，２８１−２８３，１９８２）をもつプラスミドｐＡＭ１８０を含有する腸球菌フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）株ＪＨ２−２を接合させる。この目的では、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ株ＪＨ２−２のＭ１７培地中３７℃での一夜培養液１ｍｌをＳｆｉ６株のＨＪＬ培地中４２℃での一夜培養液１０ｍｌと混合し、細胞を遠心分離し、１００μｌのＨＪＬ培地を含む試験管中に再懸濁し、懸濁液をＬＭ１７固体培地に適用し、これを３７℃で２０時間インキュベートし、細胞を掻き落として回収し、１０ｍｌのＨＪＬ液体培地の試験管中に再懸濁し、試験管を４２℃で時々振盪しながら４時間インキュベートし、ついで培養液の希釈液を２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび２０００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン補充固体ＬＭ１７培地上にプレートアウトする。
平行して２０の接合実験（独立の突然変異誘導）を行うことにより、この方法で２×１０4 のテトラサイクリンおよびストレプトマイシン抵抗性トランス接合体を選択することが可能であった。
【００５６】
Ｉ．４．ＥＰＳをもはや産生しない〔ＥＰＳ（−）表現型〕Ｓｆｉ６株変異体の選択：抵抗性トランス接合体を２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび２０００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したルテニウムレッド固体培地に移す。約１０％の接合体がＥＰＳ（−）の赤いコロニーを形成する。ついで約８００個の赤いコロニーを選択し、２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補充したＨＪＬ培地２００μｌを含むマイクトタイトレーションプレート中で一夜培養する。１００μｌのＨＪＬ培養体をついで１ｍｌのＭＳＫミルク中で培養する。試験した赤いコロニーの約２５％がミルク（ミルクは粘稠でも粘着性でもなく、培養上清の分析ではＥＰＳは認められない）中で安定なＥＰＳ（−）表現型を示す。他の赤いコロニーはＥＰＳ（＋）表現型を示すかまたはミルク中数回の継代培養後にＥＰＳ（＋）表現型を回復する。
結論として、ＥＰＳ（−）安定変異体は、ＥＰＳの生合成に関与する染色体遺伝子中へのトランスポゾンＴｎ９１６のインテグレーションの結果としてＥＰＳ産生能を失ったものである。実際、ＥＰＳ（−）安定変異体をテトラサイクリンを欠く増殖培地中で培養すると（トランスポゾンの切断および喪失）、ＥＰＳ（＋）表現型を回復できる。
【００５７】
Ｉ．５．ＥＰＳ（−）安定変異体の特性：約１００個の安定変異体を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化したその変異体からの染色体ＤＮＡプレパレーションのサザンブロッティングおよび、サザンブロットフィルターのプラスミドｐＩＣ１８２（Ｈｉｌｌら, Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏ．，５４，１２３０−１２３６，１９８８）由来の放射性ｔｅｔＭ遺伝子（テトラサイクリン抵抗性をコードする）とのハイブリダイゼーションによって分析する。分析した約８５％の変異体は、「遺伝子座Ａ」と呼ばれる位置に相当する同一の優位なバンドを示す。他の変異体の一部では、細胞壁の生合成に関与する既知の遺伝子座に相当するさらに２つのバンド（遺伝子座ＢおよびＣ）が認められる（発表準備中）。
【００５８】
Ｉ．６．遺伝子座Ａの特性：インテグレートされたトランスポゾンＴｎ９１６に近接する染色体領域は逆ＰＣＲによって単離できる。この目的では、任意に選択された変異体（変異体：１）からの染色体ＤＮＡプレパレーション１μｇを旧来法によりＨｉｎｄ ＩＩＩで４時間消化し、ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、７２０μｌの水で希釈し、希釈したＤＮＡを５６℃に５分間加熱し、ＤＮＡを氷上で冷却し、それに８０μｌの１０倍濃度のライゲーション緩衝液および５単位のＴ４ライガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加え１２℃で１６時間インキュベートし、７０℃に１５分間加熱してライガーゼを不活性化し、ついでブタノールに数回連続抽出して容量１００μｌに濃縮する。ライゲーション混合物１０μｌ、１００ｐｍｏｌのプライマー、１５ｍＭ ｄＮＴＰ、１０μｌの緩衝液および０．２単位のＳｕｐｅｒ−Ｔａｑポリメラーゼ（Ｓｔｅｈｌｉｎ ＧｍｂＨ）をついでＰＣＲデバイスに添加する。核酸プライマーはトランスポゾンＴｎ９１６の既知配列に基づいて選択される。
【００５９】
配列番号：１５ならびに配列番号：１６の配列を有するプライマーを用いると、ＰＣＲにより１−ｋｂフラグメントが単離できた。さらに、プライマー配列番号：１７および配列番号：１８の配列を用いると、４−ｋｂフラグメントが単離できた（以下の配列表参照）。
第三の０．８−ｋｂフラグメントも変異体：１から、そのＲｓａＩで消化した染色体ＤＮＡから配列番号：１８および配列番号：１９の配列（以下の配列表参照）を有するプライマーを用いて第二の逆ＰＣＲを実施することにより単離できる。
１−ｋｂおよび０．８−ｋｂフラグメントを線状化プラスミドｐＧＥＭＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）中にクローン化した。これらのフラグメントをジデオキシヌクレオチド法で配列決定〔ｆ−ｍｏｌ（登録商標）ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ〕し、整合すると、配列番号：１の配列のヌクレオチド９９３３〜１１６４３に相当する３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をカバーする２つの配列を示す。
【００６０】
１−ｋｂおよび４−ｋｂフラグメントはまた、株Ｓｆｉｔ６のＤＮＡフラグメントを含有するλ−ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）ライブラリーのスクリーニングに使用された。この目的では、供給者の推薦に従い、上記変異体からのＤＮＡプレパレーションをＳａｕ３Ａで部分消化し、フラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離し、５−〜１２−ｋｂフラグメントに相当するバンドをゲルから切り出し、ＤＮＡを溶出し、ついで予めＢａｍＨＩで消化したλ−ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓベクターにライゲートする。ライゲーション産物をＧｉｇａｇｏｌｄ ＩＩＩ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いインビトロでエンカプシデートし、次にファージを大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と供給者の推薦に従い混合し、次に混合物をペトリ皿上にプレートアウトする。組換えプラークをついでそれらのＤＮＡのハイブリダイゼーション、予め放射性とした（Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｄ ＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１−ｋｂおよび４−ｋｂフラグメントととのＨｙｂｏｎｄ Ｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ）上へのトランスファーにより分析する。
【００６１】
３０００の組換えプラークから約２０の陽性プラークをハイブリダイゼーションによって分離することができ、それからついでλ−ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓベクターを単離し、次に染色体インサートを含有するｐＣＭＶベクターを切り出した（供給者のＳｔｒａｔａｇｅｎｅの説明書参照）。これらの組換えベクターは以下の実施例中においては「ｐＦＳ」と呼ばれる。
１１のｐＦＳベクターの染色体インサートをついで配列決定した〔ｆ−ｍｏｌ（登録商標）ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ〕。これらはベクターｐＦＳ１４，ｐＦＳ１５，ｐＦＳ２６，ｐＦＳ３０，ｐＦＳ３３，ｐＦＳ４９，ｐＦＳ５０，ｐＦＳ６５，ｐＦＳ７３，ｐＦＳ８０およびｐＦＳ８６であり、それぞれ配列番号：１のヌクレオチド配列，９３１４〜１４６０２，１〜３１５９, ７９８８〜１１２５３，１７０２〜７９９１, １３６１〜７２２９, ４４００〜８４７７, ６４８〜７６７６, ５９９７〜１１２５３，８４７４〜１３４８９，３５５０〜７２２９および６４８〜１７０２に相当するフラグメントからなる。
【００６２】
異なる染色体インサートの核酸配列を整合することにより、株Ｓｆｉ６の遺伝子座Ａに相当する１５．２ｋｂの配列をこの方法で特性づけることができた（図１Ａ参照）。この１５．２ｋｂの配列のヌクレオチド６４８〜１５２５０は配列番号：１の配列中に示されている。
【００６３】
Ｉ．７．配列番号：１の配列の分析：
配列番号：１の配列は株Ｓｆｉ６の全ｅｐｓオペロンから構成される。この配列はｅｐｓＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，ＬおよびＭと呼ばれる同一方向性の１３の完全ＯＲＦからなる（図１Ａ参照）。この配列にはさらに配列の３’末端に、相補性の配列鎖によってコードされる１つの完全ＯＲＦを含有する。ｏｒｆＺと呼ばれるこのＯＲＦは多分、他のＯＲＦに対するその逆の方向性からオペロンの末端を標識するものであろう。
【００６４】
最初の１３のＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列をＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンクに存在するタンパク質の配列とソフトウエアＦＡＳＴＡ，ＰＥＰＰＬＯＴおよびＰＩＬＥＵＰ（ＧＣＧ−ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を使用して比較すると、ｅｐｓオペロンによってコードされる１３のタンパク質の機能を推定することが可能である。結果は以下に示す。
【００６５】
ｅｐｓＡ ＯＲＦ（ヌクレオチド３５２〜１８０３）は自己溶菌酵素Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニン（Ｌａｚａｖｅｒｉｃら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３８，１９４９−１９６１，１９９２）の調節に関与する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＬｙｔＲタンパク質と２６．４％の同一性を有するＥｐｓＡタンパク質（配列番号：２）をコードする。したがってｅｐｓＡは多分、ｅｐｓオペロンのレギュレータータンパク質と考えられる。さらに、オペロンのレギュレーターＯＲＦは一般的に他のＯＲＦの上流に見出されることからｅｐｓＡ遺伝子は多分、ｅｐｓオペロンの最初の遺伝子であると思われる。これは、ターミネーターが配列番号：１の配列のヌクレオチド２３０〜２５２に、プロモーターがヌクレオチド２７４〜３０２に、リボソーム結合部位がヌクレオチド３４０〜３４５に見出される事実によって確認される。
【００６６】
ｅｐｓＢ遺伝子（ヌクレオチド１８０７〜２５３５）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのＣｐｓＡタンパク質と６７．５％の同一性および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のＣａｐＣタンパク質と３０％の同一性を有する（Ｒｕｂｅｎｓら, Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８，８４３−８８５，１９９３；Ｌｉｎら, Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６，７００５−７０１６，１９９４）ＥｐｓＢタンパク質（配列番号：３）をコードする。これらの遺伝子の正確な機能は、それらが細菌の外膜のリン脂質にカップリングするポリサッカライドから構成される莢膜の合成に必須であることを除いてまだ不明である。
【００６７】
ｅｐｓＣ遺伝子（ヌクレオチド２５４７〜３２３９）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの莢膜の合成に関与する（Ｒｕｂｅｎｓら）ＣｐｓＢタンパク質と５２％の同一性を有するＥｐｓＣタンパク質をコードする。ＥｐｓＣはまた、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ネズミチフス菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａおよび大腸菌のＣＬＤタンパク質の配列（Ｂａｔｃｈｅｌｏｒら, Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４，５２２８−５２３６，１９９２；Ｂａｓｔｉｎら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７，７２５−７３４，１９９３）と２３％の同一性、４９％の類似性およびそれに匹敵する疎水性プロファイルを有する。ＣＬＤタンパク質はポリサッカライドの合成時にその鎖の長さの制御に関与することが指摘されねばならない。
【００６８】
ｅｐｓＤ遺伝子（ヌクレオチド３２４９〜３９９５）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのＣｐｓＣタンパク質と６０．５％の同一性、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣａｐＡタンパク質と３４．５％の同一性およびＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉのＥｘｏＰタンパク質と３３％の同一性を有する（Ｒｕｂｅｎｓら, Ｌｉｎら, Ｂｅｃｋｅｒら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４１，３６７−３７９，１９９３）ＥｐｓＤタンパク質（配列番号：５）をコードする。ＥｘｏＰタンパク質は、ＥＰＳおよび／またはＥＰＳ前駆体のトランスロケーションに関与する膜タンパク質である。
【００６９】
ｅｐｓＥ遺伝子（ヌクレオチド４０５１〜４７３１）は、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する多くのタンパク質（Ｒｕｂｅｎｓら）と有意なホモロジーを示すＥｐｓＥタンパク質（配列番号：６）をコードする。したがって、この遺伝子はガラクトシルトランスフェラーゼをコードするものと思われる。
【００７０】
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓｆｉ６のｅｐｓＢ，Ｃ，ＤおよびＥ遺伝子は、ｃｐｓＡ，Ｂ，ＣおよびＤ遺伝子からなるＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのオペロンの場合（Ｒｕｂｅｎｓら）に類似することが注目される。しかもそれらは同じ方法で統合されている。２つの株の莢膜のポリサッカライドおよびＥＰＳは極めて異なることから、これは染色体領域が多分これらの２つの種の間で転換したことを指示するものであろう。
【００７１】
ｅｐｓＦ遺伝子（ヌクレオチド４８９８〜５８５４）は、多分ガラクトシルトランスフラーゼとして莢膜の生合成に関与していると考えられる（Ｌｉｎら）Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＣａｐＨおよびＣａｐＭとそれぞれ２４．５％および２３％の同一生を有するＥｐｓＦタンパク質（配列番号：７）をコードする。
【００７２】
ｅｐｓＧ遺伝子（ヌクレオチド６４２５〜７５４０）は外膜のＬＰＳポリサッカライドの生合成に関与するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＬＴ２のＮ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（ＭａｃＬａｃｈｌａｎら, Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３，７１５１−７１６３，１９９１）と２０．５％の同一性および５０％の類似性を有するＥｐｓＧタンパク質（配列番号：８）をコードする。Ｎ−アセチルグルコサミンは株Ｓｆｉ６のＥＰＳの生合成には関与しないので（アセチル化グルコースはない）、ＥｐｓＧ遺伝子は多分、グリコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、またはＮ−アセチルグルコサミンエピメラーゼ活性を有するＮ−アセチルグリコシルトランスフェラーゼをコードするものと思われる。
【００７３】
ｅｐｓＨ遺伝子（ヌクレオチド７７３６〜８２１２）は、ＮｏｄＬ−ＬａｃＡ−ＣｙｓＥアセチルトランスフェラーゼ（Ｄｏｗｎｉｅら, Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３，１６４９−１６５１，１９８９）と高いホモロジーを有するＥｐｓＨタンパク質（配列番号：９）をコードする。したがって、ＥｐｓＨタンパク質はＥＰＳのＮ−アセチルガラクトサミンの生合成に関与するアセチルトランスフェラーゼであるものと思われる。
【００７４】
ｅｐｓＩ遺伝子（ヌクレオチド８２２１〜９１９２）はＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのｒｆｂクラスターのＲｆｂＶ ＯＲＦによってコードされる、グリコシルトランスフェラーゼと考えられるタンパク質（Ｊｉａｎｇら；Ｌｉｕら, Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，４０８４−４０８８，１９９５）と２４％の同一性を有するＥｐｓＩタンパク質（配列番号：１０）をコードする。
【００７５】
ｅｐｓＪ遺伝子（ヌクレオチド９２８５〜１０３６４）は、群ＢおよびＣ２サルモネラのＯ抗原のポリメラーゼにそれ自体類似するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａのｒｆｂクラスターのＯＲＦのタンパク質（Ｌｅｅら, Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３８，１８４３−１８５５，１９９２；Ｍｏｒｏｎａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６，７３３−７４７，１９９４）の場合と２０％の同一性およびそれに匹敵する疎水性プロファイルを有するＥｐｓＪタンパク質（配列番号：１１）をコードする。ＥｐｓＪ遺伝子はしたがって、ＥＰＳのテトラサッカライド単位を重合させることができるＥＰＳポリメラーゼをコードするものと考えられる。
【００７６】
ｅｐｓＫ遺伝子（ヌクレオチド１０３９２〜１１３３９）は、膜のリン脂質にポリサッカライドをカップリングさせることによっての莢膜の生合成に関与する髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のｌｉｐＢ遺伝子によってコードされる、タンパク質（Ｆｒｏｓｃｈら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８，４８３−４９８，１９９３）と１８％の同一性ならびに４２％の類似性を有するＥｐｓＫタンパク質（配列番号：１２）をコードしている。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが外膜をもたないと仮定すれば（グラム陽性菌）、ｅｐｓＫ遺伝子は、ＥＰＳ輸送分子（多分、ＥｐｓＣおよびＥｐｓＤ）およびＥＰＳを切離す酵素と共同して膜を通過するＥＰＳの輸送を分担する細胞膜のリン脂質へのＥＰＳのカップリングに関与する酵素をコードすると考えることができる（Ｆｒｏｓｃｈらによって提起されたモデルと一致する）。
【００７７】
さらに、トランスポゾンＴｎ９１６は配列番号：１のヌクレオチド１０５４０〜１０５４１の間で、ｅｐｓオペロンの同定に用いられた変異体：１のｅｐｓＫ遺伝子中にインテグレートされる可能性が指摘される（上記Ｉ．６．の項参照）。
【００７８】
ｅｐｓＬ遺伝子（ヌクレオチド１１３０２〜１２２２２）は既知のタンパク質とはホモロジーを示さないＥｐｓＬタンパク質（配列番号：１４）をコードする。最初の３８のヌクレオチドは、ｅｐｓＫの３’末端と重複し、２つのタンパク質の一律発現とＥＰＳの膜輸送におけるＥｐｓＬタンパク質の活性が示唆される。
【００７９】
ｅｐｓＭ遺伝子（ヌクレオチド１２２３３〜１３６５１）は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンクからの既知のタンパク質とはホモロジーを示さないＥｐｓＭタンパク質（配列番号：１３）をコードする。この遺伝子の特異的なプロモーターが上流にないことから、この遺伝子は明らかに株Ｓｆｉ６のＥＰＳの生合成に関与している。
【００８０】
ｏｒｆＺ遺伝子（相補性鎖上１３７３２〜１４３０５）は、ｅｐｓオペロンにおける他のＯＲＦと逆方向に存在する。したがって、株Ｓｆｉ６のＥＰＳの生合成には多分関与していないと思われる。さらに、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンクの既知のタンパク質とはホモロジーを示さない。
【００８１】
結論として、１１のｐＳＦベクターから単離された染色体インサート（上記Ｉ．６．の項参照）はＥＰＳの生合成に明らかに関与するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓｆｉ６の染色体領域をカバーする。このようにして、上流にｅｐｓオペロンの開始の範囲を定めるプロモーターを含む１３の完全遺伝子が同定できた。
【００８２】
例ＩＩ：ｅｐｓＪ遺伝子の不活性化
ｅｐｓオペロンのｅｐｓＪ遺伝子を、ＥＰＳの生合成におけるその重要性を確認するために、相同組換えによって不活性化する。
この目的では、０．８−ｋｂ ＰＣＲフラグメントを含有するプラスミドｐＧＥＭＴ（上記Ｉ．６．の項参照）からＤｒａＩ−ＳａｌＩフラグメントを単離し、予めＥｃｏＲＶおよびＳａＩＩで消化した熱感受性プラスミドｐＳＡ３（Ｄａｏら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９，１１５−１１９，１９８５）にライゲートし、大腸菌株ＸＬｌ−ｂｌｕｅをライゲーション産物でトランスフォームし、トランスフォーマントを選択し、組換えプラスミドを単離し、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓｆｉ６をＳｌｏｓら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７，１３３３−１３３９，１９９１）によって記載された方法から適応された方法により組換えプラスミドでのエレクトロポレーションを用いてトランスフォームする。細胞を２．１ｋＶ、２５μＦおよび４００Ωの放電に付し、１ｍｌのＨＪＬ培地中に再懸濁し、３７℃（許容温度）で４時間インキュベートし、細胞を２．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを補充したＬＭ１７固体培地上にプレートアウトし、３７℃で１６時間インキュベートし、ついで生存しているトランスフォームされたコロニーを選択する。選択されたコロニーを２．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを補充したＨＪＬ培地２ｍｌ中で培養液の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ600 ）が０．２に達するまでインキュベートし、培養液をＯＤ600 が１．０に達するまで４５℃にし（プラスミドはも早複製しない）、培養体の希釈液を２．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシン補充ＬＭ１７固体培地上にプレートアウトし、４５℃で１２時間インキュベートする。
【００８３】
生存したコロニーのｅｐｓＪ遺伝子に組換えプラスミドｐＳＡ3 をインテグレートする。これは、生存コロニーをＥｃｏＲＩで消化した（ｐＳＡ３を１箇所でのみ切断する）染色体ＤＮＡプレパレーションのサザンブロッティングおよびサザンブロットフィルターの上述の放射性ＤｒａＩ−ＳａｌＩフラグメントとのハイブリダイゼーションにより確証する。プラスミドｐＳＡ３がインテグレートされたコロニーはサザンブロットフィルター上に２つのバンドを示す。さらに、ｅｐｓＪ遺伝子に組換えプラスミドｐＳＡ３がインテグレートされたコロニーはルテニウムレッド固体培地上でＥＰＳ（−）の表現型を示し、ＭＳＫミルク中でそれらの粘着性は喪失した（上記例Ｉ．４．参照）。
【００８４】
例ＩＩＩ：ｅｐｓＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，ＬおよびＭ遺伝子の不活性化
例ＩおよびＩＩに、トランスポゾンまたはインテグレートされるプラスミドの挿入によるｅｐｓＫおよびｅｐｓＪ遺伝子の不活性化は株Ｓｆｉ６におけるＥＰＳ生合成を遮断することを示した。
同様に株Ｓｆｉ６のｅｐｓオペロンの他の遺伝子は相同組換えによって不活性化され、したがってＥＰＳ生合成の遮断が観察できる。この目的では、上記例Ｉ．６．に記載の１１個のｐＦＳベクターの一つに由来するＯＲＦのフラグメントをＰＣＲで増幅する。それをプラスミドｐＳＡ３にクローン化し、ついで前の例における記載と同一条件下に、株Ｓｆｉ６にトランスフォームおよびインテグレートする。
【００８５】
例ＩＶ：ＥＰＳ産生の修復
ｐＦＳ３０をＥｃｏＲＩで切断し、フラグメントを分離し、５．５−ｋｂフラグメントを予めＥｃｏＲＩで消化したｐＦＳ１４にライゲートし、ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞をライゲーション産物でトランスフォームし、トランスフォームされ挿入体が正しい方向性を示すクローンを選択し、ｐＦＳ３０−１４と呼ばれるプラスミドを単離し、ｐＦＳ６５中央のＥｃｏＲＩフラグメントを、予めＥｃｏＲＩで切断したｐＦＳ３０−１４にライゲートし、ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞をライゲーション産物でトランスフォームし、トランスフォームされ、挿入体が正しい方向性を示すクローンをついで選択する。ｐＦＳ３０−６５−１４と呼ばれる得られた組換えプラスミドは配列番号：１の配列のヌクレオチド１７０２〜１４６０２からなる。
【００８６】
ｐＦＳ３０−６５−１４をついでＳａｌＩおよびＳｍａＩで切断し、１２．９ｋｂフラグメントを分離し、予めＥｃｏＲＶとＳａｌＩで切断したｐＳＡ３にライゲート、ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞をライゲーション産物でトランスフォームし、トランスフォームされたクローンを選択し、組換えｐＳＡ３プラスミドを単離する。
【００８７】
１９９３年３月２９日付で寄託されたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭ Ｉ−１２９２を組換えｐＳＡ３プラスミドでエレクトロポレーションによりトランスフォームする。このグラム陽性株は、顕微鏡下に小さい鎖を形成する非鞭毛球菌の外観を呈し、胞子は作らず、通性嫌気性菌であり、ＥＰＳを産生せず、そのゲノムにはｅｐｓオペロンの５’末端に相当するそのゲノム１０００ｂｐを有する。したがって組換えｐＳＡ３プラスミドは株ＣＮＣＭ Ｉ−１２９２のゲノムにインテグレートされる。一部のトランスフォームされたクローンはルテニウムレッド固体培地上でＥＰＳ（＋）の表現型を示し、ＭＳＫミルク内で粘着性を有する。
【００８８】
例Ｖ：ＥＰＳ産物の修復
株Ｓｆｉ６の染色体を、配列番号：１の配列を切断はしない酵素（ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩ，ＮｒｕＩ，ＳｔｕＩ）で消化し、消化産物をアガロースゲル上で分離し、１５−〜２５−ｋｂのバンドを溶出し、適当な制限酵素で予め切断したｐＳＡ３中にライゲートし、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭ Ｉ−１２９２をエレクトロポレーションによりトランスフォームし、トランスフォーマントはついでフィルター上へのコロニーのトランスファーついでそれらのＤＮＡの予め放射性としたｐＦＳ１４とのハイブリダイゼーションにより選択する。トランスフォームされた一部のクローンはルテニウムレッド固体培地上でＥＰＳ（＋）の表現型を示し、ＭＳＫミルク内で粘着性を有する。
【００８９】
例ＶＩ：ＥＰＳの修飾
１９９４年５月１８日付で寄託されたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭ Ｉ−１４２２を例Ｖの組換えｐＳＡ３プラスミドでエレクトロポレーションによりトランスフォームする。このグラム陽性株は、顕微鏡下に小さい鎖を形成する非鞭毛球菌の外観を呈し、胞子は作らず、通性嫌気性菌であり、組成Ｇｌｃ：Ｇａｌ＝２：２を有するＥＰＳを産生する。
【００９０】
例ＶＩＩ：ＥＰＳの修飾
１９９３年８月５日付で寄託されたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭＩ−１３５１を例Ｖの組換えｐＳＡ３プラスミドでのエレクトロポレーションによってトランスフォームする。このグラム陽性株は、顕微鏡下に小さい鎖を形成する非鞭毛球菌の外観を呈して、胞子は作らず、通性嫌気性菌であり、組成Ｇｌｃ：Ｇａｌ：Ｒｈａ＝１：３：２を有するＥＰＳを産生する。
【００９１】
例ＶＩＩＩ：ＥＰＳの修飾
株ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０の染色体ＤＮＡは、Ｓｌｏｓら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７，１３３３−１３３９，１９９１）の方法によって単離される。ＤＮＡプレパレーションはＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡフラグメントは０．７％アガロースゲル上電気泳動によって分離し、１２−〜１６−ｋｂフラグメントを溶出し、抽出されたＤＮＡを予めＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化しついで脱リン酸化したベクターｐＪＩＭ２２７９（Ｐ．Ｒｅｎａｕｌｔ，ＩＮＲＡ，Ｊｏｕｙ−ｅｎ−Ｊｏｓａｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅから入手）にライゲートする。ＧＭ１７培地上３０℃にて培養したＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４，１−９，１９８３）をＤｅ Ｖｏｓら（Ｇｅｎｅ，８５，１６９−１７６，１９８９）の方法によりトランスフォームする。トランスフォームされたクローンを、クローンのゲノムＤＮＡと配列番号：１５, １６, １７, １８および１９の配列を有するプローブの一つとのハイブリダイゼーションにより選択する。４００個のトランスフォーマント中、６つの陽性クローンが選択され、その一つが図１Ｃに示すｐＦＳ１０１と呼ばれるプラスミドを含有する。
【００９２】
プラスミドｐＦＳ１０１が組換えＥＰＳの産生を誘導できるか否かを決定するために、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ株ＭＧ１３６３をｐＦＳ１０１でトランスフォームし、ルテニウムレッド固体培地上に直接プレートアウトする。比較のために、プラスミドｐＪＩＭ２２７９でトランスフォームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３をついでルテニウムレッド固体培地上に直接プレートアウトする。結果はｐＪＩＭ２２７９を含むコロニーがすべて赤い表現型〔３０００ＥＰＳ（−）コロニー〕であるが、ｐＦＳ１０１を含有するコロニーの９９．５％以上が白色の表現型〔８００ＥＰＳ（＋）コロニー、２コロニーを除く〕を示す。したがって、ｐＦＳ１０１でトランスフォームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株ＭＧ１３６３は組換えＥＰＳを産生する。
【００９３】
ｐＦＳ１０１でトランスフォームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３のＥＰＳの産生は生物体をＭＡＭ培地中、ｐＨ５．５、３０℃において、６０ｒｐｍで電磁攪拌しながら培養することによって行われる。組換えＥＰＳは培養培地を４０％のトリクロロ酢酸と混合し、混合物を８０００ｇで２０分間遠心分離し、沈殿を等容量のアセトンと混合し、混合物を４℃で１２時間インキュベートし、混合物を１００００ｇで１時間沈殿させ、沈殿を水中に懸濁させ混合物のｐＨを７に調整し、水に対して２４時間透析し、１００，０００ｇで１時間超遠心し、上清を回収し、上清を凍結乾燥させる。比較のために、ｐＪＩＭ２２７９でトランスフォームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３を同一条件で培養し、同様にして糖を単離する。
【００９４】
中性糖の総量はＤｕｂｏｉｓら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２８，３５０−３５６，１９５６）の方法によって測定する。結果は、ｐＦＳ１０１でトランスフォームされた株がグルコース当量で表して１０ｍｇ／ｍｌの糖を産生するのに対し、ｐＪＩＭ２２７９でトランスフォームされた株では痕跡（＜１ｍｇ／ｌ）の糖を産生するにすぎない。
【００９５】
組換えＥＰＳの分子量は予め市販のデキストラン（Ｓｉｇｍａ）２×１０6 〜５×１０3 ダルトン（Ｄａ）で検量したＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に接続したＳｕｐｅｒｏｓｅ−６（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ゲルろ過カラム上クロマトグラフィーによって評価する。この目的では、２５０μｇの中性糖からなるサンプル０．２５〜１ｍｌをカラムに適用し、流速０．５ｍｌ／分の５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２で溶出する。比較のためにｐＪＩＭ２２７９でトランスフォームされた株によって産生された糖も同様に分離する。図２に示す結果は、ｐＪＩＭ２２７９でトランスフォームされた株は明らかに細胞壁に由来する異種ポリサッカライドを少量（２〜０．５×１０6 Ｄａ；分画８〜１５）および低分子量のオリゴサッカライド（モノおよびジサッカライド；分画２０〜２２）を大量に産生する。これに対し、ｐＦＳ１０１でトランスフォームされた株では高分子量の組換えＥＰＳ約２×１０6 Ｄａ（分画９）が明らかに認められる。
【００９６】
組換えＥＰＳの糖組成はＮｅｅｓｅｒら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４２，５８−６７，１９８４）の方法によってガスクロマトグラフィーで測定する。結果は、ｐＦＳ１０１でトランスフォームされた株の培養培地には、モル比でＧｌｃ：Ｇａｌが１：３で含まれる。細胞壁に由来する痕跡のラムノースが検出される。これに対し、ＧａｌＮａｃは検出されない。
【００９７】
ｐＦＳ１０１でトランスフォームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３によって産生されるＥＰＳの組成は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株 ＣＮＣＭＩ−１５９０によって産生されるＥＰＳの組成とは異なる。組換えＥＰＳの構造は、ＧａｌＮａｃがガラクトースによって置換されている以外は、株 ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０のＥＰＳの構造と同じであると考えるのが妥当である。
【００９８】
【配列表】
【００９９】
【化８】
【０１００】
【化９】
【０１０１】
【化１０】
【０１０２】
【化１１】
【０１０３】
【化１２】
【０１０４】
【化１３】
【０１０５】
【化１４】
【０１０６】
【化１５】
【０１０７】
【化１６】
【０１０８】
【化１７】
【０１０９】
【化１８】
【０１１０】
【化１９】
【０１１１】
【化２０】
【０１１２】
【化２１】
【０１１３】
【化２２】
【０１１４】
【０１１５】
【化２３】
【０１１６】
【化２４】
【０１１７】
【０１１８】
【化２５】
【０１１９】
【０１２０】
【化２６】
【０１２１】
【０１２２】
【化２７】
【０１２３】
【０１２４】
【化２８】
【０１２５】
【０１２６】
【化２９】
【０１２７】
【０１２８】
【化３０】
【０１２９】
【０１３０】
【化３１】
【０１３１】
【０１３２】
【化３２】
【０１３３】
【０１３４】
【化３３】
【０１３５】
【０１３６】
【化３４】
【０１３７】
【０１３８】
【化３５】
【０１３９】
【化３６】
【０１４０】
【０１４１】
【化３７】
【０１４２】
【０１４３】
【化３８】
【０１４４】
【０１４５】
【化３９】
【０１４６】
【０１４７】
【化４０】
【０１４８】
【０１４９】
【化４１】
【０１５０】
【０１５１】
【化４２】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ：Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０のＥＰＳの生合成に関与するオペロンの物理的地図。
プロモーターおよびターミネーターはそれぞれ、旗およびヘアピンで示す。縦の矢印はトランスポゾンＴｎ９１６の挿入部位の位置を指示する。水平の矢印は可能性のあるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の存在を指示する。ＯＲＦに相当する遺伝子の名称はその矢印の下に表示する。制限酵素は略号により示す（Ｓ＝ＳａｃＩ；Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩＩ；Ｅ＝ＥｃｏＲＩ；Ｂ＝ＢａｍＨＩ）。
図１Ｂ：１１ｐＦＳベクター中に存在する株 ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０の染色体インサートの表示。
Ｐ１，Ｐ２およびＰ３はスクリーニング時に用いられるプローブの位置を指示する。
図１Ｃ：ｐＪＩＭ２２７９中にクローニングされるＳａｃＩからＢａｍＨＩ制限部位までの全ｅｐｓオペロンからなるゲノムインサートｐＦＳ１０１の表示。
【図２】ｐＦＳ１０１またはｐＪＩＭ２２７９でトランスフォームしたＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３によって産生された糖からなるゲルろ過クロマトグラフィーのフラクションの４８５ｎｍにおける光学密度のグラフ。フラクション９：２×１０6 ダルトン（Ｄａ）；フラクション１１〜１３：５×１０5 Ｄａ；フラクション１４〜１６：７．２×１０4 Ｄａ；フラクション１７〜１８：４×１０4 Ｄａ；フラクション１９以上：＜５×１０3 Ｄａ。
【発明の属する技術分野】
本発明は、エキソポリサッカライドの生合成に関与する少なくとも１種の酵素をコードする乳酸菌の染色体ＤＮＡフラグメントの使用、ならびにこれらのフラグメントによってコードされる酵素に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸菌はそれらの培養培地中に２種類のポリサッカライド、すなわち単一糖の反復アッセンブリーから構成されるデキストランもしくはレバンのようなホモポリサッカライド、および反復単位を形成する数種の異なる糖のアッセンブリーから構成され一般にエキソポリサッカライドもしくはＥＰＳ（ＥＰＳは「エキソポリサッカライド」の略号である）と呼ばれるヘテロポリサッカライドを産生できることが知られている（Ｃｅｒｎｉｎｇ Ｊ．，Ｂａｃｔｅｒｉｅｓ，〔乳酸菌〕，第１巻，Ｒｏｓｓａｒｔ Ｈ．＆ Ｌｕｑｕｅｔ Ｆ．Ｍ．著，Ｌｏｒｉｃａ，３０９−３２９頁，１９９４）。
【０００３】
ＥＰＳを産生する乳酸菌は、酸性化したミルクへ粘着性および／または滑らかなクリーム様の舌ざわりを付与できる（Ｃｅｒｎｉｎｇら，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８７，１１３−１３０，１９９０）。ＥＰＳはまた、ヒトまたは動物の健康にとくに有利な生物活性、たとえば抗腫瘍活性もしくはプロバイオティックな活性を発揮することもできる（Ｏｄａ Ｍ．ら，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４７，１６２３−１６２５，１９８３；ＥＰ９４８７０１３９．６）。
【０００４】
さらに、その工業は乳酸菌内でのＥＰＳの生合成の遺伝的不安定性の問題に直面している。これは一般に、すべてまたは一部の乳酸菌によるＥＰＳ産生の発酵時の損失として現れる（上記”Ｃｅｒｎｉｎｇ Ｊ．”参照）。したがって、工業的発酵産物はそのＥＰＳ含量が変動しやすく、常に許容できるものとは限らない。これらの問題を除去するため、工業的製造に際し現在では、最初の性質を失った細菌を分離できるように、細菌を単離し周期的に性質を調べる方法に頼っている。
【０００５】
好中温乳酸菌、すなわち至適増殖温度２８〜３７℃の乳酸菌におけるＥＰＳ生合成には、糖の連結を行う少なくとも１種の酵素が関与する。このような酵素をコードする好中温乳酸菌の染色体またはプラスミド遺伝子の同定および配列決定はまだ行われていないが、ＥＰＳの生合成に関与するプラスミドは知られている。
【０００６】
すなわち、ＷＯ ９２／０２１４２には、発酵乳の粘度を増大させることができる物質を乳酸連鎖球菌の亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ；好中温菌）内で産生させるプラスミドｐＨＶ６７の存在が開示されている．ＵＳ５，０６６，５８８には、乳酸連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）に増粘特性を付与できるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ（好中温菌）の株に由来する２つのプラスミドが記載されている。同様に、Ｖｅｓｃｏｖｏらは、チーズ乳酸桿菌の亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉ株；好中温菌）から、いわゆる細胞外のシックナーの産生に関連する機能、Ｍｕｃ＋表現型をコードするプラスミドを証明している（Ｖｅｓｃｏｖｏら，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２，７０９−７１２，１９８９）。
【０００７】
最後に、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｅｒｇらは、清酒乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ；好中温菌）からＥＰＳの生合成に関与する染色体遺伝子群の単離を探究している（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｅｒｇ Ｄ．Ｊ．Ｃ．ら, ＦｉｒｓｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｐｏｌｕｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｔｒｏｎｄｈｅｉｍ，Ｎｏｒｗａｙ，１９９４年６月６〜８日）。しかしながら、遺伝子はまだ同定も配列決定もされていない。
【０００８】
さらに、好熱乳酸菌、すなわち至適増殖温度３７〜４５℃の乳酸菌におけるＥＰＳの生合成はまだよく知られていない、しかしながら、プラスミドに関連しないことはわかっている。すなわち、Ｖｅｓｃｏｖｏらは、乳酸桿菌の亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ株２０１；好熱菌）のＭｕｃ＋表現型が染色体機能に連結していることを示している（Ｖｅｓｃｏｖｏら, Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２，７０９−７１２，１９８９）。
【０００９】
すなわち、今日まで、好中温または好熱乳酸菌のＥＰＳをコードする染色体またはプラスミド遺伝子または遺伝子群は，同定も配列決定もされていない。
【００１０】
したがって、乳酸菌における本来のＥＰＳ産生を修復または安定化する手段を提供することはきわめて有益である。さらに、ＥＰＳの構造を修飾する手段を提供し、有利な性質を有する新たなＥＰＳを創製することは有益である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、インビボおよびインビトロにおけるＥＰＳの合成を制御、修飾および／または修復する新規な手段を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この目的のために、本発明は、リピート構造
【化４】
【００１３】
本発明の他の課題は、本発明のＤＮＡフラグメントからなる組換えベクターに関する。
【００１４】
本発明の他の課題は、リピート構造
【化５】
【００１５】
本発明の他の課題は、本発明のＤＮＡフラグメントをゲノム内にインテグレートされてまたは複製可能なプラスミドの補助によって有する乳酸菌に関する。
【００１６】
本発明の他の課題は、（１）本発明の酵素をコードするＤＮＡフラグメントを、宿主細胞内での自動複製または宿主細胞へのインテグレートを可能にする配列からなるベクター中にクローニングし、（２）宿主細胞を上記ベクターでトランスフォームし、ついで（３）トランスフォームされた宿主細胞をＥＰＳの産生に適当な条件下に培養する、ＥＰＳの製造方法に関する。
【００１７】
本発明はまた、（１）ＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１種の酵素をコードするＤＮＡフラグメントをベクター中にクローニングし、（２）乳酸菌を上記ベクターでトランスフォームし、次いで（３）トランスフォームされた乳酸菌を新たなＥＰＳの産生に適当な条件下に培養する、新たなＥＰＳを製造する他の方法に関する。
【００１８】
したがって、本発明は、乳酸菌におけるＥＰＳの産生の修復または修飾のために、本発明のＤＮＡフラグメントの利用の可能性の道を開くものである。すなわち、たとえば、液状デザート、ヨーグルト、スープ、乳製アイスクリーム、コーヒークリーム、ソースまたはマヨネーズのような飲料または食品の増粘およびクリーム化の目的でのＥＰＳの製造のために、本発明のＤＮＡの乳酸菌内における発現または過剰発現を企図することが可能である。
【００１９】
本発明はまた、ＥＰＳの生合成に関与する乳酸菌の染色体遺伝子を同定する新規な手段の提供を可能にするものである。
【００２０】
最後に、本発明はまた、上述のＥＰＳの生合成に関与する新規な酵素を提供する。すなわちこれらの酵素はたとえば、ポリサッカライドたとえばオリゴサッカライドまたはＥＰＳのインビトロ合成または修飾に有利に使用することができる（Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｙ．ら, Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１１４，９２８３−９２８９，１９９２）。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下の記述において、「ＥＰＳ」の語は，反復単位を形成する数種の異なる糖のアッセンブリーから構成され、乳酸菌によって産生されるエキソポリサッカライドを意味する。
【００２２】
アセチルおよびホスファチル誘導体の語は、糖の環上の位置Ｃ2 〜Ｃ6 に、少なくとも１個のアセチルおよびホスファチル基を有するガラクトースまたはグルコースを意味して使用される。
【００２３】
本発明の目的では、「相同配列」は、本発明の配列とは少数の核酸またはアミノ酸ベース、たとえば１〜５００塩基対（ｂｐ）または１〜１５０のアミノ酸の置換、欠失または付加の点でのみ異なるが同一の機能を有する核酸またはアミノ酸配列を意味するものと理解される。
【００２４】
この場合、遺伝子コードの縮重の結果として、同一のポリペプチドをコードする２つのＤＮＡ配列はとくに相同であると考えてよい。同様に、同一の抗体によって認識されるタンパク質であって、２つのタンパク質の認識の強度を示す値の比が１０００、好ましくは１００を越えない２つのタンパク質はたとえば、相同であるとみなされることになる。
【００２５】
配列が、本発明の配列と７０％以上とくに８０％または９０％以上のホモロジーを示す場合も相同であると考えられることになる。この場合、ホモロジーは、本発明の配列の場合と同一である相同配列の塩基またはアミノ酸の数と本発明の上記配列の塩基またはアミノ酸の総数の比によって決定される。
【００２６】
本発明の目的では、「ハイブリダイズするフラグメント」とは、本発明のフラグメントとサザンブロッティング法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら, ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９，９．３１〜９．５８章）によってハイブリダイズできる配列を意味するものと理解される。ハイブリダイゼーションは、非特異的なおよび不安定なハイブリダイゼーションを回避できるように、緊縮条件下に行われることが好ましい。
【００２７】
最後に、「フラグメント」または「ＤＮＡフラグメント」の語は、合成、インビトロでのたとえば「ポリメラーゼチェーン反応」と呼ばれる既知の方法による再生、またはインビボでのたとえば大腸菌、連鎖乳酸菌または乳酸桿菌好熱型の細菌で再生できる染色体起源の二本鎖ＤＮＡと理解されるべきである。
【００２８】
本発明のＤＮＡを選択するためには、ＥＰＳを産生しない乳酸菌中にＥＰＳを産生する乳酸菌からの大ＤＮＡフラグメントのライブラリーを構築し、ついで、ＥＰＳを産生するクローン（単数または複数）を選択することができる。この目的には、ＥＰＳを産生する乳酸菌のゲノムＤＮＡを比較的稀な制限部位に特異的な制限酵素（ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩ，ＰｓｔＩ）で、またはＳａｕ３Ａによる部分消化によって、たとえば消化する。消化産物を大フラグメントを受け入れる発現またはインテグレーションプラスミド（例ＩＩに記載のプラスミドｐＳＡ３）にクローニングし、組換えプラスミドをＥＰＳを産生しない同種の乳酸菌に導入し、ＥＰＳを産生するトランスフォームされた少なくとも１つのクローンを選択し、ついでＥＰＳの産生に関与するＤＮＡフラグメントを旧来の方法で同定し、単離し、配列を決定する。
【００２９】
本発明のフラグメントは大サイズとすることが可能で、それらはＥＰＳの生合成に関与する遺伝子群を含有できるという事実から、組換えプラスミドは突然変異誘発処置（ＵＶもしくは化学的処置またはトランスポゾンによる処置）によりＥＰＳの産生能が失われているという事実を除いてそれらのフラグメントの起源である乳酸菌と同一の株に導入するのが好ましい。
【００３０】
上述の方法の別法として、たとえば、ＥＰＳを産生する乳酸菌株からのＤＮＡフラグメントのプラスミドライブラリーを構築し、同じ乳酸菌の株をその内部では複製不可能なプラスミドでトランスフォームし、同種組換えによってそれらのゲノムにプラスミドがインテグレートされたトランスフォーマントを選択し（たとえば、抗生物質抵抗性による選択）、ＥＰＳをもはや産生しないトランスフォーマントを選択し、ついで選択されたトランスフォーマントのインテグレートされたプラスミドに隣接する染色体ＤＮＡフラグメントを単離し、配列を決定する。この目的では、トランスフォーマントの染色体を消化し、それをライゲートし、ついでインテグレートされたプラスミドに特異的なプローブを使用して逆ＰＣＲを実施するかまたは再循環プラスミドを複製可能な株にライゲーション産物を導入することもできる。
【００３１】
上述の選択方法の他の別法として、ＥＰＳを産生する乳酸菌をトランスポゾンからなるプラスミドによってトランスフォームし、この細菌を、トランスポゾンがベクターから切除されてゲノム中にランダムにインテグレートされる条件に付し、ＥＰＳの産生能を失った細菌のクローンを選択し、トランスポゾンがインテグレートされた上記クローンからゲノムＤＮＡフラグメントを単離することもできる。この方法は以下の例Ｉに詳細に記述する。
【００３２】
上に簡略に述べた選択方法はすべての既知の乳酸菌、とくに好中温乳酸菌たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅならびに好熱乳酸菌たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓに適用できることが指摘されねばならない。この目的では、本技術分野の熟練者は乳酸菌の各種とくにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓについて任意に選択できるトランスフォーメーション技術を有する（Ｓａｓａｋｉ Ｙ．ら, ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２，Ｆｏｕｒｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｎｏｏｄｗｉｊｋｅｒｈｏｕｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９９３年９月）。
【００３３】
さらに、上述の選択方法は、大抵、ＥＰＳの生合成に関与する遺伝子または遺伝子群の部分のみの単離を可能にする。しかしながら、本技術分野の熟練者はたとえば、単離されたフラグメントに基づく核酸プローブを用い、残りの部分を含有する１または２以上のクローンを染色体ライブラリー中で選択することにより遺伝子または遺伝子群の残部を容易に同定することができる（例Ｉ．６参照）。
【００３４】
したがって１９９５年６月７日付にてＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ ｏｒｇａｎｉｓｍｅ（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．，国立培養微生物収集機関），２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５，Ｆｒａｎｃｅに寄託され、受入番号ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０として受理されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株の１５．２ｋｂのＤＮＡ配列を特徴づけることが可能であった。さらに、このグラム陽性株は顕微鏡下に小さい鎖を形成する非鞭毛球菌の外観を呈する。この株は胞子を作らず、通性嫌気性菌である。
【００３５】
この１５．２ｋｂの配列は、リピート構造
【化６】
【００３６】
この１５．２ｋｂの配列のヌクレオチド６４８〜１５２５０は以下の配列表中に配列番号：１として示す。配列番号：１の核酸配列中ヌクレオチド３５２〜１８０３, １８０７〜２５３５, ２５４７〜３２３９, ３２４９〜３９９５, ４０５１〜４７３１, ４８９８〜５８５４, ６４２５〜７５４０, ７７３６〜８２１２, ８２２１〜９１９２, ９２８５〜１０３６４，１０３９２〜１１３３９，１１３０２〜１２２２２および１２２３３〜１３６５１によって１３の完全遺伝子が区切られる。
【００３７】
配列番号：１のすべてまたは部分は、トランスフォーメーション後に、最初はＥＰＳを産生しなかった好中温または好熱乳酸菌、とくにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓのような宿主細胞にＥＰＳ生合成の回復を可能にすることを示すことができた。したがって一例を挙げれば、本発明のＤＮＡ配列はＥＰＳをもはや産生しないＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭＩ−１５９０の変異体（天然の変異体または突然変異に起因する変異体）にＥＰＳの産生を回復させるために使用できる。
【００３８】
ＥＰＳの生合成を回復させるためには、少なくとも上述の遺伝子からなる配列番号：１の配列の全部または部分をＥＰ５６４，９６６に記載の方法によって宿主細胞内にインテグレートすることができる。この方法は本発明の教示の参考として本明細書に導入する。略述すれば、この方法は（１）宿主細胞を、その宿主細胞に由来するオペロンの部分に機能的に（リーディングフレームが保存されて）インテグレートされた上記プラスミドからなりそのドナー内では複製されないドナープラスミドでトランスフォームすること、（２）全プラスミドがインテグレートされてなるトランスフォーマントを同定すること、（３）本発明のフラグメントのみが染色体中にインテグレートされ、プラスミドの他の配列は染色体から切除されたトランスフォーマントを選択すること、および（４）選ばれたトランスフォーマントをＥＰＳの産生に適当な条件下に培養することを可能にした。
【００３９】
この方法は機能性プロモーターや翻訳アクティベーターを用いないことを可能にするものではないことに留意すべきである。さらに、ＥＰＳの産生に適当な培養条件は本技術分野の熟練者の能力の範囲内にあり、本技術分野の熟練者には、使用される株に応じて、標準培養培地の使用ならびに至適培地のｐＨ、温度および攪拌の選択が可能である。
【００４０】
また上記遺伝子の少なくとも１種からなる配列番号：１の配列の全部または部分を、自己複製発現プラスミド中の機能性プロモーターおよび翻訳アクティベーターの下流、必要に応じてターミネーターの上流にクローン化し、ついでこの組換えプラスミドで宿主細胞をトランスフォームすることの選択も可能である。
【００４１】
さらに、たとえば、最初はＥＰＳを産生しない連鎖乳酸菌を配列番号：１の配列でトランスフォームした宿主細胞が産生するＥＰＳは、組換え酵素によって正常に合成されるＥＰＳ、この場合は株ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０によって産生されるＥＰＳとは異なることが観察される。したがって、１５．２ｋｂの配列の全部または部分の使用は上述のＥＰＳの変異体の創製を可能にすることができる。
【００４２】
同様に、配列番号：１の配列の全部または部分は、トランスフォーメーション後、宿主細胞たとえば、好中温または好熱乳酸菌とくに、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓのような宿主細胞によって最初に産生されるＥＰＳのリピート構造を修飾することを可能にすることを示すことができた。
【００４３】
すなわち、これらの観察は、（１）ＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１種の酵素を全体的または部分的にコードするＤＮＡフラグメントをベクター中にクローン化し、（２）乳酸菌をその組換えベクターでトランスフォームし、（３）必要に応じて、新たなＥＰＳを産生する乳酸菌を選択し、ついで（４）トランスフォームされた乳酸菌を新たなＥＰＳの産生に適当な条件下に培養する、新たなＥＰＳの新規な製造方法の提供の可能性を開くものである。ベクターは好ましくは本発明のタンパク質をコードする。さらに、乳酸菌は上記ベクターによりコードされるタンパク質によって合成されるＥＰＳ以外のＥＰＳを産生できる。
【００４４】
とくに、第一のＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１種の酵素を部分的にコードするＤＮＡフラグメントをインテグレーションベクター中にクローン化し、組換えベクターを必要に応じて第二のＥＰＳを産生できる好中温または好熱乳酸菌中に１もしくは２以上の染色体またはプラスミド遺伝子を介して導入し、インテグレーションベクターがそれらの染色体中にインテグレートされた細菌を単離し、ついで新たなＥＰＳを産生する細菌を第二のＥＰＳの生合成に関与する１または２以上の遺伝子の不活性化によって選択する。好ましくは第一および第二のＥＰＳは同一であり、リピート単位の側鎖への糖の付加または糖の修飾に関与する少なくとも１種の酵素たとえば、スルホ、ホスホまたはアセチルトランスフェラーゼを部分的に（少なくとも１５塩基対）コードするＤＮＡフラグメントが選択される。
【００４５】
同様に、第一のＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１種の酵素の全体をコードするＤＮＡフラグメントを複製可能な発現ベクター中にクローン化し、その組換えベクターを、必要に応じて第二のＥＰＳを１もしくは２以上の染色体またはプラスミド遺伝子を介して産生できる好中温または好熱乳酸菌に導入し、複製可能なベクターを含有する細菌を単離し、ついで第一のＥＰＳの生合成に関与する１または２以上の遺伝子の発現によって新規なＥＰＳを産生する細菌が選択される。好ましくは、糖の修飾に関与する酵素たとえば、スルホ、ホスホもしくはアセチルトランスフェラーゼ、または糖のリピートを付加する酵素たとえばグルコシルもしくはガラクトシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡフラグメントが選択される。
【００４６】
配列番号：１の配列に包含される遺伝子の少なくとも１つを全体的にまたは部分的に使用するのが好ましい。ＥＰＳの生合成に関与する好中温乳酸菌のプラスミド遺伝子（既知のプラスミドから配列決定できる遺伝子）の少なくとも１つも使用できる。
【００４７】
最後に、組換えベクターは、本発明のＤＮＡ配列、とくに配列番号：１の配列のすべてまたは部分からなる線状または環状、一本鎖または二本鎖、発現またはインテグレーションベクターとすることができる。ＥＰ５６４，９６６に記載の方法を使用しない場合には、ベクターが適当な核酸配列（プロモーター、リボソーム結合部位、好ましいコドン）を介して本発明のＤＮＡを発現できるように、またそれがたとえば、様々な細菌とくに大腸菌および／または連鎖球菌からの１もしくは２以上の複製の起源を含有するように注意する必要がある。
【００４８】
本発明はまた、配列番号：１の配列遺伝子とくにそれらと相同な配列によってコードされる新たな酵素に関する。したがって、これらの、オリゴサッカライドまたはポリサッカライドたとえばＥＰＳの修飾またはインビトロ合成のための使用が考慮される。この目的では、これらの酵素の少なくとも１種は、細菌中で旧来法によって過剰発現させ、旧来法たとえば培養培地の沈殿および／またはクロマトグラフィーにより精製されることが好ましい。
【００４９】
本発明の他の課題は、その染色体にインテグレートされてまたは複製可能なプラスミドの補助により本発明のＤＮＡ配列を含む乳酸菌に関する。その配列は好ましくは配列番号：１の配列の遺伝子の少なくとも１つからなる。
【００５０】
本発明はまた、少なくとも１５ｂｐの配列番号：１の配列のＤＮＡフラグメントまたはその配列に相補性配列鎖のフラグメントの、ＰＣＲを実施するためのプライマーとしてまたはＥＰＳの生合成に関与する乳酸菌の遺伝子のインビトロ検出もしくはインビボ不活性化のためのプローブとしての使用に関する。この下限は、特異的にハイブリダイズする小フラグメントは一般に長さ１５〜２５ｂｐであるという事実により任意に設定される。
【００５１】
【実施例】
本発明のＤＮＡフラグメント、組換えプラスミドおよびトランスフォームされた細菌を得る実施例である以下の記述により、本発明を以下にさらに詳細に説明する。それらの記述に先立ち、培養培地を説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明の課題の例示のために記載されるもので、いかなる意味でも本発明の限定を構成するものではないことは自明の通りである。ＤＮＡの操作ならびに細菌細胞のクローニングおよびトランスフォーメーションは、とくに指示のない限り、上に引用したＳａｍｂｒｏｏｋらの著作に記載のプロトコールに従って実施する。百分率はとくに指示のある場合を除き重量％を示す。
【００５２】
培地：（固体培地に１．５％のバクトアガールを添加）
−Ｍ１７（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）：トリプトン０．５％，ソイトン０．５％，水解ミート０．５％，酵母エキス０．２５％，アスコルビン酸０．０５％，硫酸マグネシウム０．０２５％，β−グリセロリン酸二ナトリウム１．９％および水
−ＬＭ１７：１％ラクトース含有Ｍ１７培地
−ＧＭ１７：１％グルコース含有Ｍ１７培地
−ＭＳＫ：酵母エキス０．１％含有脱脂粉乳（１０％再構築粉末）
−ＭＡＭ：アミノ酸混合物（４９５ｍｇ／ｌ Ａｌａ，３４３ｍｇ／ｌ Ａｒｇ，６８２ｍｇ／ｌ Ａｓｐ，５９ｍｇ／ｌ Ｃｙｓ，１２２９ｍｇ／ｌ Ｇｌｕ，７５９ｍｇ／ｌ Ｇｌｙ，１５３ｍｇ／ｌ Ｈｉｓ，２１５ｍｇ／ｌ Ｉｓｏ，４７０ｍｇ／ｌ Ｌｅｕ，５６５ｍｇ／ｌ Ｌｙｓ，１２２ｍｇ／ｌ Ｍｅｔ，２５５ｍｇ／ｌ Ｐｈｅ，４３６ｍｇ／ｌ Ｐｒｏ，６８ｍｇ／ｌ Ｓｅｒ，１７０ｍｇ／ｌ Ｔｈｒ，６１ｍｇ／ｌ Ｔｒｙ，３０４ｍｇ／ｌ Ｖａｌ，ｐＨ５に調整）１０％含有脱脂粉乳（１０％再構築粉末）
−ＨＪＬ：トリプトン３％，牛肉エキス０．２％，酵母エキス１％，ラクトース１％およびＫＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ６．５，０．５％
−ルテニウムレッド：酵母エキス０．５％，脱脂粉乳粉末１０％，スクロース１％，アガール１．５％およびルテニウムレッド０．０８ｇ／ｌ（ＦＲ２，６３２，９６８参照）
【００５３】
例Ｉ：Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓｆｉ６のＤＮＡフラグメントのクローニング
Ｉ．１．ＥＰＳを産生するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株の選択：Ｎｅｓｔｌｅコレクションからの乳酸菌の株をＨＪＬ液体培地中で培養し、その希釈液をルテニウムレッド固体培地上にプレートアウトする。ＥＰＳは細胞壁の染料による染色を防止するので、ＥＰＳを産生する株は白色に維持される。これに反して、非産生株は細胞壁のペプチドグリカンに対する染料の親和性のために赤色に染まる。
この方法で、寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０として寄託され「株Ｓｆｉ６」の表示で以下の例に指示するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓｆｉ６がＥＰＳ産生乳酸菌から選択された。
【００５４】
Ｉ．２．ＥＰＳのリピート構造：株Ｓｆｉ６によって産生されるＥＰＳの構造は、Ｄｏｃｏら（Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，１９８，３１３−３２１，１９９５）に報告されている。このＥＰＳは組成Ｇｌｃ：Ｇａｌ：ＧａｌＮａｃ＝１：２：１、およびテトラサッカライドのリピート単位
【化７】
【００５５】
Ｉ．３．トランスポゾンＴｎ９１６による突然変異誘発：ストレプトマイシン含量を２０から２０００μｇ／ｍｌまで増大させ補充したＨＪＬ培地に繰返し移してＳｆｉ６株を培養し、自然に抵抗性になる株を選択することによりストレプトマイシン抵抗性とする。
ストレプトマイシン抵抗性Ｓｆｉ６株、およびトランスポゾンＴｎ９１６（Ｔｎ９１６はテトラサイクリン抵抗性遺伝子をもつことが知られている；Ｇａｗｒｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３００，２８１−２８３，１９８２）をもつプラスミドｐＡＭ１８０を含有する腸球菌フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）株ＪＨ２−２を接合させる。この目的では、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ株ＪＨ２−２のＭ１７培地中３７℃での一夜培養液１ｍｌをＳｆｉ６株のＨＪＬ培地中４２℃での一夜培養液１０ｍｌと混合し、細胞を遠心分離し、１００μｌのＨＪＬ培地を含む試験管中に再懸濁し、懸濁液をＬＭ１７固体培地に適用し、これを３７℃で２０時間インキュベートし、細胞を掻き落として回収し、１０ｍｌのＨＪＬ液体培地の試験管中に再懸濁し、試験管を４２℃で時々振盪しながら４時間インキュベートし、ついで培養液の希釈液を２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび２０００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン補充固体ＬＭ１７培地上にプレートアウトする。
平行して２０の接合実験（独立の突然変異誘導）を行うことにより、この方法で２×１０4 のテトラサイクリンおよびストレプトマイシン抵抗性トランス接合体を選択することが可能であった。
【００５６】
Ｉ．４．ＥＰＳをもはや産生しない〔ＥＰＳ（−）表現型〕Ｓｆｉ６株変異体の選択：抵抗性トランス接合体を２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび２０００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したルテニウムレッド固体培地に移す。約１０％の接合体がＥＰＳ（−）の赤いコロニーを形成する。ついで約８００個の赤いコロニーを選択し、２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補充したＨＪＬ培地２００μｌを含むマイクトタイトレーションプレート中で一夜培養する。１００μｌのＨＪＬ培養体をついで１ｍｌのＭＳＫミルク中で培養する。試験した赤いコロニーの約２５％がミルク（ミルクは粘稠でも粘着性でもなく、培養上清の分析ではＥＰＳは認められない）中で安定なＥＰＳ（−）表現型を示す。他の赤いコロニーはＥＰＳ（＋）表現型を示すかまたはミルク中数回の継代培養後にＥＰＳ（＋）表現型を回復する。
結論として、ＥＰＳ（−）安定変異体は、ＥＰＳの生合成に関与する染色体遺伝子中へのトランスポゾンＴｎ９１６のインテグレーションの結果としてＥＰＳ産生能を失ったものである。実際、ＥＰＳ（−）安定変異体をテトラサイクリンを欠く増殖培地中で培養すると（トランスポゾンの切断および喪失）、ＥＰＳ（＋）表現型を回復できる。
【００５７】
Ｉ．５．ＥＰＳ（−）安定変異体の特性：約１００個の安定変異体を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化したその変異体からの染色体ＤＮＡプレパレーションのサザンブロッティングおよび、サザンブロットフィルターのプラスミドｐＩＣ１８２（Ｈｉｌｌら, Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏ．，５４，１２３０−１２３６，１９８８）由来の放射性ｔｅｔＭ遺伝子（テトラサイクリン抵抗性をコードする）とのハイブリダイゼーションによって分析する。分析した約８５％の変異体は、「遺伝子座Ａ」と呼ばれる位置に相当する同一の優位なバンドを示す。他の変異体の一部では、細胞壁の生合成に関与する既知の遺伝子座に相当するさらに２つのバンド（遺伝子座ＢおよびＣ）が認められる（発表準備中）。
【００５８】
Ｉ．６．遺伝子座Ａの特性：インテグレートされたトランスポゾンＴｎ９１６に近接する染色体領域は逆ＰＣＲによって単離できる。この目的では、任意に選択された変異体（変異体：１）からの染色体ＤＮＡプレパレーション１μｇを旧来法によりＨｉｎｄ ＩＩＩで４時間消化し、ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、７２０μｌの水で希釈し、希釈したＤＮＡを５６℃に５分間加熱し、ＤＮＡを氷上で冷却し、それに８０μｌの１０倍濃度のライゲーション緩衝液および５単位のＴ４ライガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加え１２℃で１６時間インキュベートし、７０℃に１５分間加熱してライガーゼを不活性化し、ついでブタノールに数回連続抽出して容量１００μｌに濃縮する。ライゲーション混合物１０μｌ、１００ｐｍｏｌのプライマー、１５ｍＭ ｄＮＴＰ、１０μｌの緩衝液および０．２単位のＳｕｐｅｒ−Ｔａｑポリメラーゼ（Ｓｔｅｈｌｉｎ ＧｍｂＨ）をついでＰＣＲデバイスに添加する。核酸プライマーはトランスポゾンＴｎ９１６の既知配列に基づいて選択される。
【００５９】
配列番号：１５ならびに配列番号：１６の配列を有するプライマーを用いると、ＰＣＲにより１−ｋｂフラグメントが単離できた。さらに、プライマー配列番号：１７および配列番号：１８の配列を用いると、４−ｋｂフラグメントが単離できた（以下の配列表参照）。
第三の０．８−ｋｂフラグメントも変異体：１から、そのＲｓａＩで消化した染色体ＤＮＡから配列番号：１８および配列番号：１９の配列（以下の配列表参照）を有するプライマーを用いて第二の逆ＰＣＲを実施することにより単離できる。
１−ｋｂおよび０．８−ｋｂフラグメントを線状化プラスミドｐＧＥＭＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）中にクローン化した。これらのフラグメントをジデオキシヌクレオチド法で配列決定〔ｆ−ｍｏｌ（登録商標）ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ〕し、整合すると、配列番号：１の配列のヌクレオチド９９３３〜１１６４３に相当する３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をカバーする２つの配列を示す。
【００６０】
１−ｋｂおよび４−ｋｂフラグメントはまた、株Ｓｆｉｔ６のＤＮＡフラグメントを含有するλ−ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）ライブラリーのスクリーニングに使用された。この目的では、供給者の推薦に従い、上記変異体からのＤＮＡプレパレーションをＳａｕ３Ａで部分消化し、フラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離し、５−〜１２−ｋｂフラグメントに相当するバンドをゲルから切り出し、ＤＮＡを溶出し、ついで予めＢａｍＨＩで消化したλ−ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓベクターにライゲートする。ライゲーション産物をＧｉｇａｇｏｌｄ ＩＩＩ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いインビトロでエンカプシデートし、次にファージを大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と供給者の推薦に従い混合し、次に混合物をペトリ皿上にプレートアウトする。組換えプラークをついでそれらのＤＮＡのハイブリダイゼーション、予め放射性とした（Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｄ ＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１−ｋｂおよび４−ｋｂフラグメントととのＨｙｂｏｎｄ Ｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ）上へのトランスファーにより分析する。
【００６１】
３０００の組換えプラークから約２０の陽性プラークをハイブリダイゼーションによって分離することができ、それからついでλ−ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓベクターを単離し、次に染色体インサートを含有するｐＣＭＶベクターを切り出した（供給者のＳｔｒａｔａｇｅｎｅの説明書参照）。これらの組換えベクターは以下の実施例中においては「ｐＦＳ」と呼ばれる。
１１のｐＦＳベクターの染色体インサートをついで配列決定した〔ｆ−ｍｏｌ（登録商標）ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ〕。これらはベクターｐＦＳ１４，ｐＦＳ１５，ｐＦＳ２６，ｐＦＳ３０，ｐＦＳ３３，ｐＦＳ４９，ｐＦＳ５０，ｐＦＳ６５，ｐＦＳ７３，ｐＦＳ８０およびｐＦＳ８６であり、それぞれ配列番号：１のヌクレオチド配列，９３１４〜１４６０２，１〜３１５９, ７９８８〜１１２５３，１７０２〜７９９１, １３６１〜７２２９, ４４００〜８４７７, ６４８〜７６７６, ５９９７〜１１２５３，８４７４〜１３４８９，３５５０〜７２２９および６４８〜１７０２に相当するフラグメントからなる。
【００６２】
異なる染色体インサートの核酸配列を整合することにより、株Ｓｆｉ６の遺伝子座Ａに相当する１５．２ｋｂの配列をこの方法で特性づけることができた（図１Ａ参照）。この１５．２ｋｂの配列のヌクレオチド６４８〜１５２５０は配列番号：１の配列中に示されている。
【００６３】
Ｉ．７．配列番号：１の配列の分析：
配列番号：１の配列は株Ｓｆｉ６の全ｅｐｓオペロンから構成される。この配列はｅｐｓＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，ＬおよびＭと呼ばれる同一方向性の１３の完全ＯＲＦからなる（図１Ａ参照）。この配列にはさらに配列の３’末端に、相補性の配列鎖によってコードされる１つの完全ＯＲＦを含有する。ｏｒｆＺと呼ばれるこのＯＲＦは多分、他のＯＲＦに対するその逆の方向性からオペロンの末端を標識するものであろう。
【００６４】
最初の１３のＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列をＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンクに存在するタンパク質の配列とソフトウエアＦＡＳＴＡ，ＰＥＰＰＬＯＴおよびＰＩＬＥＵＰ（ＧＣＧ−ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を使用して比較すると、ｅｐｓオペロンによってコードされる１３のタンパク質の機能を推定することが可能である。結果は以下に示す。
【００６５】
ｅｐｓＡ ＯＲＦ（ヌクレオチド３５２〜１８０３）は自己溶菌酵素Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニン（Ｌａｚａｖｅｒｉｃら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３８，１９４９−１９６１，１９９２）の調節に関与する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＬｙｔＲタンパク質と２６．４％の同一性を有するＥｐｓＡタンパク質（配列番号：２）をコードする。したがってｅｐｓＡは多分、ｅｐｓオペロンのレギュレータータンパク質と考えられる。さらに、オペロンのレギュレーターＯＲＦは一般的に他のＯＲＦの上流に見出されることからｅｐｓＡ遺伝子は多分、ｅｐｓオペロンの最初の遺伝子であると思われる。これは、ターミネーターが配列番号：１の配列のヌクレオチド２３０〜２５２に、プロモーターがヌクレオチド２７４〜３０２に、リボソーム結合部位がヌクレオチド３４０〜３４５に見出される事実によって確認される。
【００６６】
ｅｐｓＢ遺伝子（ヌクレオチド１８０７〜２５３５）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのＣｐｓＡタンパク質と６７．５％の同一性および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のＣａｐＣタンパク質と３０％の同一性を有する（Ｒｕｂｅｎｓら, Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８，８４３−８８５，１９９３；Ｌｉｎら, Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６，７００５−７０１６，１９９４）ＥｐｓＢタンパク質（配列番号：３）をコードする。これらの遺伝子の正確な機能は、それらが細菌の外膜のリン脂質にカップリングするポリサッカライドから構成される莢膜の合成に必須であることを除いてまだ不明である。
【００６７】
ｅｐｓＣ遺伝子（ヌクレオチド２５４７〜３２３９）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの莢膜の合成に関与する（Ｒｕｂｅｎｓら）ＣｐｓＢタンパク質と５２％の同一性を有するＥｐｓＣタンパク質をコードする。ＥｐｓＣはまた、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ネズミチフス菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａおよび大腸菌のＣＬＤタンパク質の配列（Ｂａｔｃｈｅｌｏｒら, Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４，５２２８−５２３６，１９９２；Ｂａｓｔｉｎら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７，７２５−７３４，１９９３）と２３％の同一性、４９％の類似性およびそれに匹敵する疎水性プロファイルを有する。ＣＬＤタンパク質はポリサッカライドの合成時にその鎖の長さの制御に関与することが指摘されねばならない。
【００６８】
ｅｐｓＤ遺伝子（ヌクレオチド３２４９〜３９９５）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのＣｐｓＣタンパク質と６０．５％の同一性、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣａｐＡタンパク質と３４．５％の同一性およびＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉのＥｘｏＰタンパク質と３３％の同一性を有する（Ｒｕｂｅｎｓら, Ｌｉｎら, Ｂｅｃｋｅｒら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４１，３６７−３７９，１９９３）ＥｐｓＤタンパク質（配列番号：５）をコードする。ＥｘｏＰタンパク質は、ＥＰＳおよび／またはＥＰＳ前駆体のトランスロケーションに関与する膜タンパク質である。
【００６９】
ｅｐｓＥ遺伝子（ヌクレオチド４０５１〜４７３１）は、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する多くのタンパク質（Ｒｕｂｅｎｓら）と有意なホモロジーを示すＥｐｓＥタンパク質（配列番号：６）をコードする。したがって、この遺伝子はガラクトシルトランスフェラーゼをコードするものと思われる。
【００７０】
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓｆｉ６のｅｐｓＢ，Ｃ，ＤおよびＥ遺伝子は、ｃｐｓＡ，Ｂ，ＣおよびＤ遺伝子からなるＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのオペロンの場合（Ｒｕｂｅｎｓら）に類似することが注目される。しかもそれらは同じ方法で統合されている。２つの株の莢膜のポリサッカライドおよびＥＰＳは極めて異なることから、これは染色体領域が多分これらの２つの種の間で転換したことを指示するものであろう。
【００７１】
ｅｐｓＦ遺伝子（ヌクレオチド４８９８〜５８５４）は、多分ガラクトシルトランスフラーゼとして莢膜の生合成に関与していると考えられる（Ｌｉｎら）Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＣａｐＨおよびＣａｐＭとそれぞれ２４．５％および２３％の同一生を有するＥｐｓＦタンパク質（配列番号：７）をコードする。
【００７２】
ｅｐｓＧ遺伝子（ヌクレオチド６４２５〜７５４０）は外膜のＬＰＳポリサッカライドの生合成に関与するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＬＴ２のＮ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（ＭａｃＬａｃｈｌａｎら, Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３，７１５１−７１６３，１９９１）と２０．５％の同一性および５０％の類似性を有するＥｐｓＧタンパク質（配列番号：８）をコードする。Ｎ−アセチルグルコサミンは株Ｓｆｉ６のＥＰＳの生合成には関与しないので（アセチル化グルコースはない）、ＥｐｓＧ遺伝子は多分、グリコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、またはＮ−アセチルグルコサミンエピメラーゼ活性を有するＮ−アセチルグリコシルトランスフェラーゼをコードするものと思われる。
【００７３】
ｅｐｓＨ遺伝子（ヌクレオチド７７３６〜８２１２）は、ＮｏｄＬ−ＬａｃＡ−ＣｙｓＥアセチルトランスフェラーゼ（Ｄｏｗｎｉｅら, Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３，１６４９−１６５１，１９８９）と高いホモロジーを有するＥｐｓＨタンパク質（配列番号：９）をコードする。したがって、ＥｐｓＨタンパク質はＥＰＳのＮ−アセチルガラクトサミンの生合成に関与するアセチルトランスフェラーゼであるものと思われる。
【００７４】
ｅｐｓＩ遺伝子（ヌクレオチド８２２１〜９１９２）はＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのｒｆｂクラスターのＲｆｂＶ ＯＲＦによってコードされる、グリコシルトランスフェラーゼと考えられるタンパク質（Ｊｉａｎｇら；Ｌｉｕら, Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，４０８４−４０８８，１９９５）と２４％の同一性を有するＥｐｓＩタンパク質（配列番号：１０）をコードする。
【００７５】
ｅｐｓＪ遺伝子（ヌクレオチド９２８５〜１０３６４）は、群ＢおよびＣ２サルモネラのＯ抗原のポリメラーゼにそれ自体類似するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａのｒｆｂクラスターのＯＲＦのタンパク質（Ｌｅｅら, Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３８，１８４３−１８５５，１９９２；Ｍｏｒｏｎａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６，７３３−７４７，１９９４）の場合と２０％の同一性およびそれに匹敵する疎水性プロファイルを有するＥｐｓＪタンパク質（配列番号：１１）をコードする。ＥｐｓＪ遺伝子はしたがって、ＥＰＳのテトラサッカライド単位を重合させることができるＥＰＳポリメラーゼをコードするものと考えられる。
【００７６】
ｅｐｓＫ遺伝子（ヌクレオチド１０３９２〜１１３３９）は、膜のリン脂質にポリサッカライドをカップリングさせることによっての莢膜の生合成に関与する髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のｌｉｐＢ遺伝子によってコードされる、タンパク質（Ｆｒｏｓｃｈら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８，４８３−４９８，１９９３）と１８％の同一性ならびに４２％の類似性を有するＥｐｓＫタンパク質（配列番号：１２）をコードしている。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが外膜をもたないと仮定すれば（グラム陽性菌）、ｅｐｓＫ遺伝子は、ＥＰＳ輸送分子（多分、ＥｐｓＣおよびＥｐｓＤ）およびＥＰＳを切離す酵素と共同して膜を通過するＥＰＳの輸送を分担する細胞膜のリン脂質へのＥＰＳのカップリングに関与する酵素をコードすると考えることができる（Ｆｒｏｓｃｈらによって提起されたモデルと一致する）。
【００７７】
さらに、トランスポゾンＴｎ９１６は配列番号：１のヌクレオチド１０５４０〜１０５４１の間で、ｅｐｓオペロンの同定に用いられた変異体：１のｅｐｓＫ遺伝子中にインテグレートされる可能性が指摘される（上記Ｉ．６．の項参照）。
【００７８】
ｅｐｓＬ遺伝子（ヌクレオチド１１３０２〜１２２２２）は既知のタンパク質とはホモロジーを示さないＥｐｓＬタンパク質（配列番号：１４）をコードする。最初の３８のヌクレオチドは、ｅｐｓＫの３’末端と重複し、２つのタンパク質の一律発現とＥＰＳの膜輸送におけるＥｐｓＬタンパク質の活性が示唆される。
【００７９】
ｅｐｓＭ遺伝子（ヌクレオチド１２２３３〜１３６５１）は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンクからの既知のタンパク質とはホモロジーを示さないＥｐｓＭタンパク質（配列番号：１３）をコードする。この遺伝子の特異的なプロモーターが上流にないことから、この遺伝子は明らかに株Ｓｆｉ６のＥＰＳの生合成に関与している。
【００８０】
ｏｒｆＺ遺伝子（相補性鎖上１３７３２〜１４３０５）は、ｅｐｓオペロンにおける他のＯＲＦと逆方向に存在する。したがって、株Ｓｆｉ６のＥＰＳの生合成には多分関与していないと思われる。さらに、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンクの既知のタンパク質とはホモロジーを示さない。
【００８１】
結論として、１１のｐＳＦベクターから単離された染色体インサート（上記Ｉ．６．の項参照）はＥＰＳの生合成に明らかに関与するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓｆｉ６の染色体領域をカバーする。このようにして、上流にｅｐｓオペロンの開始の範囲を定めるプロモーターを含む１３の完全遺伝子が同定できた。
【００８２】
例ＩＩ：ｅｐｓＪ遺伝子の不活性化
ｅｐｓオペロンのｅｐｓＪ遺伝子を、ＥＰＳの生合成におけるその重要性を確認するために、相同組換えによって不活性化する。
この目的では、０．８−ｋｂ ＰＣＲフラグメントを含有するプラスミドｐＧＥＭＴ（上記Ｉ．６．の項参照）からＤｒａＩ−ＳａｌＩフラグメントを単離し、予めＥｃｏＲＶおよびＳａＩＩで消化した熱感受性プラスミドｐＳＡ３（Ｄａｏら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９，１１５−１１９，１９８５）にライゲートし、大腸菌株ＸＬｌ−ｂｌｕｅをライゲーション産物でトランスフォームし、トランスフォーマントを選択し、組換えプラスミドを単離し、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓｆｉ６をＳｌｏｓら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７，１３３３−１３３９，１９９１）によって記載された方法から適応された方法により組換えプラスミドでのエレクトロポレーションを用いてトランスフォームする。細胞を２．１ｋＶ、２５μＦおよび４００Ωの放電に付し、１ｍｌのＨＪＬ培地中に再懸濁し、３７℃（許容温度）で４時間インキュベートし、細胞を２．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを補充したＬＭ１７固体培地上にプレートアウトし、３７℃で１６時間インキュベートし、ついで生存しているトランスフォームされたコロニーを選択する。選択されたコロニーを２．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを補充したＨＪＬ培地２ｍｌ中で培養液の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ600 ）が０．２に達するまでインキュベートし、培養液をＯＤ600 が１．０に達するまで４５℃にし（プラスミドはも早複製しない）、培養体の希釈液を２．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシン補充ＬＭ１７固体培地上にプレートアウトし、４５℃で１２時間インキュベートする。
【００８３】
生存したコロニーのｅｐｓＪ遺伝子に組換えプラスミドｐＳＡ3 をインテグレートする。これは、生存コロニーをＥｃｏＲＩで消化した（ｐＳＡ３を１箇所でのみ切断する）染色体ＤＮＡプレパレーションのサザンブロッティングおよびサザンブロットフィルターの上述の放射性ＤｒａＩ−ＳａｌＩフラグメントとのハイブリダイゼーションにより確証する。プラスミドｐＳＡ３がインテグレートされたコロニーはサザンブロットフィルター上に２つのバンドを示す。さらに、ｅｐｓＪ遺伝子に組換えプラスミドｐＳＡ３がインテグレートされたコロニーはルテニウムレッド固体培地上でＥＰＳ（−）の表現型を示し、ＭＳＫミルク中でそれらの粘着性は喪失した（上記例Ｉ．４．参照）。
【００８４】
例ＩＩＩ：ｅｐｓＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，ＬおよびＭ遺伝子の不活性化
例ＩおよびＩＩに、トランスポゾンまたはインテグレートされるプラスミドの挿入によるｅｐｓＫおよびｅｐｓＪ遺伝子の不活性化は株Ｓｆｉ６におけるＥＰＳ生合成を遮断することを示した。
同様に株Ｓｆｉ６のｅｐｓオペロンの他の遺伝子は相同組換えによって不活性化され、したがってＥＰＳ生合成の遮断が観察できる。この目的では、上記例Ｉ．６．に記載の１１個のｐＦＳベクターの一つに由来するＯＲＦのフラグメントをＰＣＲで増幅する。それをプラスミドｐＳＡ３にクローン化し、ついで前の例における記載と同一条件下に、株Ｓｆｉ６にトランスフォームおよびインテグレートする。
【００８５】
例ＩＶ：ＥＰＳ産生の修復
ｐＦＳ３０をＥｃｏＲＩで切断し、フラグメントを分離し、５．５−ｋｂフラグメントを予めＥｃｏＲＩで消化したｐＦＳ１４にライゲートし、ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞をライゲーション産物でトランスフォームし、トランスフォームされ挿入体が正しい方向性を示すクローンを選択し、ｐＦＳ３０−１４と呼ばれるプラスミドを単離し、ｐＦＳ６５中央のＥｃｏＲＩフラグメントを、予めＥｃｏＲＩで切断したｐＦＳ３０−１４にライゲートし、ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞をライゲーション産物でトランスフォームし、トランスフォームされ、挿入体が正しい方向性を示すクローンをついで選択する。ｐＦＳ３０−６５−１４と呼ばれる得られた組換えプラスミドは配列番号：１の配列のヌクレオチド１７０２〜１４６０２からなる。
【００８６】
ｐＦＳ３０−６５−１４をついでＳａｌＩおよびＳｍａＩで切断し、１２．９ｋｂフラグメントを分離し、予めＥｃｏＲＶとＳａｌＩで切断したｐＳＡ３にライゲート、ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞をライゲーション産物でトランスフォームし、トランスフォームされたクローンを選択し、組換えｐＳＡ３プラスミドを単離する。
【００８７】
１９９３年３月２９日付で寄託されたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭ Ｉ−１２９２を組換えｐＳＡ３プラスミドでエレクトロポレーションによりトランスフォームする。このグラム陽性株は、顕微鏡下に小さい鎖を形成する非鞭毛球菌の外観を呈し、胞子は作らず、通性嫌気性菌であり、ＥＰＳを産生せず、そのゲノムにはｅｐｓオペロンの５’末端に相当するそのゲノム１０００ｂｐを有する。したがって組換えｐＳＡ３プラスミドは株ＣＮＣＭ Ｉ−１２９２のゲノムにインテグレートされる。一部のトランスフォームされたクローンはルテニウムレッド固体培地上でＥＰＳ（＋）の表現型を示し、ＭＳＫミルク内で粘着性を有する。
【００８８】
例Ｖ：ＥＰＳ産物の修復
株Ｓｆｉ６の染色体を、配列番号：１の配列を切断はしない酵素（ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩ，ＮｒｕＩ，ＳｔｕＩ）で消化し、消化産物をアガロースゲル上で分離し、１５−〜２５−ｋｂのバンドを溶出し、適当な制限酵素で予め切断したｐＳＡ３中にライゲートし、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭ Ｉ−１２９２をエレクトロポレーションによりトランスフォームし、トランスフォーマントはついでフィルター上へのコロニーのトランスファーついでそれらのＤＮＡの予め放射性としたｐＦＳ１４とのハイブリダイゼーションにより選択する。トランスフォームされた一部のクローンはルテニウムレッド固体培地上でＥＰＳ（＋）の表現型を示し、ＭＳＫミルク内で粘着性を有する。
【００８９】
例ＶＩ：ＥＰＳの修飾
１９９４年５月１８日付で寄託されたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭ Ｉ−１４２２を例Ｖの組換えｐＳＡ３プラスミドでエレクトロポレーションによりトランスフォームする。このグラム陽性株は、顕微鏡下に小さい鎖を形成する非鞭毛球菌の外観を呈し、胞子は作らず、通性嫌気性菌であり、組成Ｇｌｃ：Ｇａｌ＝２：２を有するＥＰＳを産生する。
【００９０】
例ＶＩＩ：ＥＰＳの修飾
１９９３年８月５日付で寄託されたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭＩ−１３５１を例Ｖの組換えｐＳＡ３プラスミドでのエレクトロポレーションによってトランスフォームする。このグラム陽性株は、顕微鏡下に小さい鎖を形成する非鞭毛球菌の外観を呈して、胞子は作らず、通性嫌気性菌であり、組成Ｇｌｃ：Ｇａｌ：Ｒｈａ＝１：３：２を有するＥＰＳを産生する。
【００９１】
例ＶＩＩＩ：ＥＰＳの修飾
株ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０の染色体ＤＮＡは、Ｓｌｏｓら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７，１３３３−１３３９，１９９１）の方法によって単離される。ＤＮＡプレパレーションはＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡフラグメントは０．７％アガロースゲル上電気泳動によって分離し、１２−〜１６−ｋｂフラグメントを溶出し、抽出されたＤＮＡを予めＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化しついで脱リン酸化したベクターｐＪＩＭ２２７９（Ｐ．Ｒｅｎａｕｌｔ，ＩＮＲＡ，Ｊｏｕｙ−ｅｎ−Ｊｏｓａｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅから入手）にライゲートする。ＧＭ１７培地上３０℃にて培養したＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４，１−９，１９８３）をＤｅ Ｖｏｓら（Ｇｅｎｅ，８５，１６９−１７６，１９８９）の方法によりトランスフォームする。トランスフォームされたクローンを、クローンのゲノムＤＮＡと配列番号：１５, １６, １７, １８および１９の配列を有するプローブの一つとのハイブリダイゼーションにより選択する。４００個のトランスフォーマント中、６つの陽性クローンが選択され、その一つが図１Ｃに示すｐＦＳ１０１と呼ばれるプラスミドを含有する。
【００９２】
プラスミドｐＦＳ１０１が組換えＥＰＳの産生を誘導できるか否かを決定するために、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ株ＭＧ１３６３をｐＦＳ１０１でトランスフォームし、ルテニウムレッド固体培地上に直接プレートアウトする。比較のために、プラスミドｐＪＩＭ２２７９でトランスフォームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３をついでルテニウムレッド固体培地上に直接プレートアウトする。結果はｐＪＩＭ２２７９を含むコロニーがすべて赤い表現型〔３０００ＥＰＳ（−）コロニー〕であるが、ｐＦＳ１０１を含有するコロニーの９９．５％以上が白色の表現型〔８００ＥＰＳ（＋）コロニー、２コロニーを除く〕を示す。したがって、ｐＦＳ１０１でトランスフォームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株ＭＧ１３６３は組換えＥＰＳを産生する。
【００９３】
ｐＦＳ１０１でトランスフォームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３のＥＰＳの産生は生物体をＭＡＭ培地中、ｐＨ５．５、３０℃において、６０ｒｐｍで電磁攪拌しながら培養することによって行われる。組換えＥＰＳは培養培地を４０％のトリクロロ酢酸と混合し、混合物を８０００ｇで２０分間遠心分離し、沈殿を等容量のアセトンと混合し、混合物を４℃で１２時間インキュベートし、混合物を１００００ｇで１時間沈殿させ、沈殿を水中に懸濁させ混合物のｐＨを７に調整し、水に対して２４時間透析し、１００，０００ｇで１時間超遠心し、上清を回収し、上清を凍結乾燥させる。比較のために、ｐＪＩＭ２２７９でトランスフォームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３を同一条件で培養し、同様にして糖を単離する。
【００９４】
中性糖の総量はＤｕｂｏｉｓら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２８，３５０−３５６，１９５６）の方法によって測定する。結果は、ｐＦＳ１０１でトランスフォームされた株がグルコース当量で表して１０ｍｇ／ｍｌの糖を産生するのに対し、ｐＪＩＭ２２７９でトランスフォームされた株では痕跡（＜１ｍｇ／ｌ）の糖を産生するにすぎない。
【００９５】
組換えＥＰＳの分子量は予め市販のデキストラン（Ｓｉｇｍａ）２×１０6 〜５×１０3 ダルトン（Ｄａ）で検量したＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に接続したＳｕｐｅｒｏｓｅ−６（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ゲルろ過カラム上クロマトグラフィーによって評価する。この目的では、２５０μｇの中性糖からなるサンプル０．２５〜１ｍｌをカラムに適用し、流速０．５ｍｌ／分の５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２で溶出する。比較のためにｐＪＩＭ２２７９でトランスフォームされた株によって産生された糖も同様に分離する。図２に示す結果は、ｐＪＩＭ２２７９でトランスフォームされた株は明らかに細胞壁に由来する異種ポリサッカライドを少量（２〜０．５×１０6 Ｄａ；分画８〜１５）および低分子量のオリゴサッカライド（モノおよびジサッカライド；分画２０〜２２）を大量に産生する。これに対し、ｐＦＳ１０１でトランスフォームされた株では高分子量の組換えＥＰＳ約２×１０6 Ｄａ（分画９）が明らかに認められる。
【００９６】
組換えＥＰＳの糖組成はＮｅｅｓｅｒら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４２，５８−６７，１９８４）の方法によってガスクロマトグラフィーで測定する。結果は、ｐＦＳ１０１でトランスフォームされた株の培養培地には、モル比でＧｌｃ：Ｇａｌが１：３で含まれる。細胞壁に由来する痕跡のラムノースが検出される。これに対し、ＧａｌＮａｃは検出されない。
【００９７】
ｐＦＳ１０１でトランスフォームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３によって産生されるＥＰＳの組成は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株 ＣＮＣＭＩ−１５９０によって産生されるＥＰＳの組成とは異なる。組換えＥＰＳの構造は、ＧａｌＮａｃがガラクトースによって置換されている以外は、株 ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０のＥＰＳの構造と同じであると考えるのが妥当である。
【００９８】
【配列表】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【化３０】
【化３１】
【化３２】
【化３３】
【化３４】
【化３５】
【化３６】
【化３７】
【化３８】
【化３９】
【化４０】
【化４１】
【化４２】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ：Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０のＥＰＳの生合成に関与するオペロンの物理的地図。
プロモーターおよびターミネーターはそれぞれ、旗およびヘアピンで示す。縦の矢印はトランスポゾンＴｎ９１６の挿入部位の位置を指示する。水平の矢印は可能性のあるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の存在を指示する。ＯＲＦに相当する遺伝子の名称はその矢印の下に表示する。制限酵素は略号により示す（Ｓ＝ＳａｃＩ；Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩＩ；Ｅ＝ＥｃｏＲＩ；Ｂ＝ＢａｍＨＩ）。
図１Ｂ：１１ｐＦＳベクター中に存在する株 ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０の染色体インサートの表示。
Ｐ１，Ｐ２およびＰ３はスクリーニング時に用いられるプローブの位置を指示する。
図１Ｃ：ｐＪＩＭ２２７９中にクローニングされるＳａｃＩからＢａｍＨＩ制限部位までの全ｅｐｓオペロンからなるゲノムインサートｐＦＳ１０１の表示。
【図２】ｐＦＳ１０１またはｐＪＩＭ２２７９でトランスフォームしたＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３によって産生された糖からなるゲルろ過クロマトグラフィーのフラクションの４８５ｎｍにおける光学密度のグラフ。フラクション９：２×１０6 ダルトン（Ｄａ）；フラクション１１〜１３：５×１０5 Ｄａ；フラクション１４〜１６：７．２×１０4 Ｄａ；フラクション１７〜１８：４×１０4 Ｄａ；フラクション１９以上：＜５×１０3 Ｄａ。
Claims (9)
- 乳酸菌により産生されるエキソポリサッカライドの生合成に関与する少なくとも１つの酵素をコードするＤＮＡ分子であって、前記エキソポリサッカライドが、以下：
- 請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む組換えベクター。
- 乳酸菌により産生されるエキソポリサッカライドの生合成に関与するタンパク質であって、前記エキソポリサッカライドが、以下：
- 請求項２に記載のベクターによりトランスフォームされた乳酸菌。
- 乳酸菌により産生されるエキソポリサッカライドを製造する方法であって、前記エキソポリサッカライドが、リピート単位を形成する種々の異なる糖の組立てにより形成され、前記方法が、以下：
・請求項３に記載のエキソポリサッカライドの生合成に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ分子をベクター中にクローニングする工程であって、前記ベクターが自動複製又は宿主細胞へのインテグレーションを可能にする配列をさらに含む、上記工程、
・宿主細胞を前記ベクターを通してトランスフォームする工程、及び
・次いで、前記トランスフォームされた宿主細胞を前記エキソポリサッカライドを産生するために都合の良い条件に培養する工程
からなる、上記方法。 - 前記ベクターが、前記宿主細胞において機能性のプロモーター配列及び翻訳アクティベーター配列をさらに含む、請求項５に記載の方法。
- 乳酸菌により産生されるエキソポリサッカライドを製造する方法であって、前記エキソポリサッカライドが、リピート単位を形成する種々の異なる糖の組立てにより形成され、前記方法が、以下：
・請求項３に記載のエキソポリサッカライドの生合成に関与するタンパク質の少なくとも１つをコードするＤＮＡ分子をベクター中にクローニングする工程、
・別のエキソポリサッカライドを産生する乳酸菌を前記ベクターを通してトランスフォームする工程、及び
・次いで、前記トランスフォームされた乳酸菌を新たなエキソポリサッカライドを産生するために都合の良い条件に培養する工程
からなる、上記方法。 - 請求項１に記載のＤＮＡ分子をベクター中にクローニングする、請求項６又は７に記載の方法。
- 配列番号：１の配列若しくはその相補鎖の配列の少なくとも１５ｂｐからなり、エキソポリサッカライドの生合成に関与する乳酸菌由来の遺伝子をインビトロで検出するためのＰＣＲプライマー又はプローブ。
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