JPH09269A - 乳酸菌産生エキソポリサッカライド - Google Patents
乳酸菌産生エキソポリサッカライドInfo
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- JPH09269A JPH09269A JP8041635A JP4163596A JPH09269A JP H09269 A JPH09269 A JP H09269A JP 8041635 A JP8041635 A JP 8041635A JP 4163596 A JP4163596 A JP 4163596A JP H09269 A JPH09269 A JP H09269A
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- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
Abstract
(57)【要約】
【課題】 乳酸菌における本来のＥＰＳ産生の修復また
は安定化、さらにＥＰＳの構造の修飾手段の提供。 【解決手段】 ＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１
種の酵素をコードするゲノム起源のＤＮＡフラグメント
であり、これを乳酸菌にトランスフォーメーションする
ことにより、ＥＰＳを最初から産生しない細菌における
ＥＰＳの産生の回復または細菌が最初から産生している
ＥＰＳの構造の修飾が可能になる。染色体によってコー
ドされ、組成Ｇｌｃ：Ｇａｌ：ＧａｌＮａｃ＝１：２：
１を有するＥＰＳの生合成に関与する好熱性乳酸連鎖球
菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）株ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０のタンパク質、なら
びにＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１種の酵素を
全体的または部分的にコードするＤＮＡフラグメントを
ベクター中にクローニングし、他のＥＰＳを産生してい
る乳酸菌を組換えベクターでトランスフォームし、新し
いＥＰＳを産生する乳酸菌を選択する新しいＥＰＳの製
造方法も提供される。
は安定化、さらにＥＰＳの構造の修飾手段の提供。 【解決手段】 ＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１
種の酵素をコードするゲノム起源のＤＮＡフラグメント
であり、これを乳酸菌にトランスフォーメーションする
ことにより、ＥＰＳを最初から産生しない細菌における
ＥＰＳの産生の回復または細菌が最初から産生している
ＥＰＳの構造の修飾が可能になる。染色体によってコー
ドされ、組成Ｇｌｃ：Ｇａｌ：ＧａｌＮａｃ＝１：２：
１を有するＥＰＳの生合成に関与する好熱性乳酸連鎖球
菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）株ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０のタンパク質、なら
びにＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１種の酵素を
全体的または部分的にコードするＤＮＡフラグメントを
ベクター中にクローニングし、他のＥＰＳを産生してい
る乳酸菌を組換えベクターでトランスフォームし、新し
いＥＰＳを産生する乳酸菌を選択する新しいＥＰＳの製
造方法も提供される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エキソポリサッカ
ライドの生合成に関与する少なくとも１種の酵素をコー
ドする乳酸菌の染色体ＤＮＡフラグメントの使用、なら
びにこれらのフラグメントによってコードされる酵素に
関する。
ライドの生合成に関与する少なくとも１種の酵素をコー
ドする乳酸菌の染色体ＤＮＡフラグメントの使用、なら
びにこれらのフラグメントによってコードされる酵素に
関する。
【０００２】
【従来の技術】乳酸菌はそれらの培養培地中に２種類の
ポリサッカライド、すなわち単一糖の反復アッセンブリ
ーから構成されるデキストランもしくはレバンのような
ホモポリサッカライド、および反復単位を形成する数種
の異なる糖のアッセンブリーから構成され一般にエキソ
ポリサッカライドもしくはＥＰＳ（ＥＰＳは「エキソポ
リサッカライド」の略号である）と呼ばれるヘテロポリ
サッカライドを産生できることが知られている（Ｃｅｒ
ｎｉｎｇ Ｊ．，Ｂａｃｔｅｒｉｅｓ，〔乳酸菌〕，第
１巻，Ｒｏｓｓａｒｔ Ｈ．＆ Ｌｕｑｕｅｔ Ｆ．
Ｍ．著，Ｌｏｒｉｃａ，３０９−３２９頁，１９９
４）。
ポリサッカライド、すなわち単一糖の反復アッセンブリ
ーから構成されるデキストランもしくはレバンのような
ホモポリサッカライド、および反復単位を形成する数種
の異なる糖のアッセンブリーから構成され一般にエキソ
ポリサッカライドもしくはＥＰＳ（ＥＰＳは「エキソポ
リサッカライド」の略号である）と呼ばれるヘテロポリ
サッカライドを産生できることが知られている（Ｃｅｒ
ｎｉｎｇ Ｊ．，Ｂａｃｔｅｒｉｅｓ，〔乳酸菌〕，第
１巻，Ｒｏｓｓａｒｔ Ｈ．＆ Ｌｕｑｕｅｔ Ｆ．
Ｍ．著，Ｌｏｒｉｃａ，３０９−３２９頁，１９９
４）。
【０００３】ＥＰＳを産生する乳酸菌は、酸性化したミ
ルクへ粘着性および／または滑らかなクリーム様の舌ざ
わりを付与できる（Ｃｅｒｎｉｎｇら，ＦＥＭＳ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，８７，１１３−１３０，１９９
０）。ＥＰＳはまた、ヒトまたは動物の健康にとくに有
利な生物活性、たとえば抗腫瘍活性もしくはプロバイオ
ティックな活性を発揮することもできる（Ｏｄａ Ｍ．
ら，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４７，１６２
３−１６２５，１９８３；ＥＰ９４８７０１３９．
６）。
ルクへ粘着性および／または滑らかなクリーム様の舌ざ
わりを付与できる（Ｃｅｒｎｉｎｇら，ＦＥＭＳ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，８７，１１３−１３０，１９９
０）。ＥＰＳはまた、ヒトまたは動物の健康にとくに有
利な生物活性、たとえば抗腫瘍活性もしくはプロバイオ
ティックな活性を発揮することもできる（Ｏｄａ Ｍ．
ら，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４７，１６２
３−１６２５，１９８３；ＥＰ９４８７０１３９．
６）。
【０００４】さらに、その工業は乳酸菌内でのＥＰＳの
生合成の遺伝的不安定性の問題に直面している。これは
一般に、すべてまたは一部の乳酸菌によるＥＰＳ産生の
発酵時の損失として現れる（上記”Ｃｅｒｎｉｎｇ
Ｊ．”参照）。したがって、工業的発酵産物はそのＥＰ
Ｓ含量が変動しやすく、常に許容できるものとは限らな
い。これらの問題を除去するため、工業的製造に際し現
在では、最初の性質を失った細菌を分離できるように、
細菌を単離し周期的に性質を調べる方法に頼っている。
生合成の遺伝的不安定性の問題に直面している。これは
一般に、すべてまたは一部の乳酸菌によるＥＰＳ産生の
発酵時の損失として現れる（上記”Ｃｅｒｎｉｎｇ
Ｊ．”参照）。したがって、工業的発酵産物はそのＥＰ
Ｓ含量が変動しやすく、常に許容できるものとは限らな
い。これらの問題を除去するため、工業的製造に際し現
在では、最初の性質を失った細菌を分離できるように、
細菌を単離し周期的に性質を調べる方法に頼っている。
【０００５】好中温乳酸菌、すなわち至適増殖温度２８
〜３７℃の乳酸菌におけるＥＰＳ生合成には、糖の連結
を行う少なくとも１種の酵素が関与する。このような酵
素をコードする好中温乳酸菌の染色体またはプラスミド
遺伝子の同定および配列決定はまだ行われていないが、
ＥＰＳの生合成に関与するプラスミドは知られている。
〜３７℃の乳酸菌におけるＥＰＳ生合成には、糖の連結
を行う少なくとも１種の酵素が関与する。このような酵
素をコードする好中温乳酸菌の染色体またはプラスミド
遺伝子の同定および配列決定はまだ行われていないが、
ＥＰＳの生合成に関与するプラスミドは知られている。
【０００６】すなわち、ＷＯ ９２／０２１４２には、
発酵乳の粘度を増大させることができる物質を乳酸連鎖
球菌の亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ；好中温菌）内で産生させる
プラスミドｐＨＶ６７の存在が開示されている．ＵＳ
５，０６６，５８８には、乳酸連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）に増粘特性を付与でき
るＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ（好
中温菌）の株に由来する２つのプラスミドが記載されて
いる。同様に、Ｖｅｓｃｏｖｏらは、チーズ乳酸桿菌の
亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕ
ｂｓｐ．ｃａｓｅｉ株；好中温菌）から、いわゆる細胞
外のシックナーの産生に関連する機能、Ｍｕｃ＋表現型
をコードするプラスミドを証明している（Ｖｅｓｃｏｖ
ｏら，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，Ｖ
ｏｌ．２，７０９−７１２，１９８９）。
発酵乳の粘度を増大させることができる物質を乳酸連鎖
球菌の亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ；好中温菌）内で産生させる
プラスミドｐＨＶ６７の存在が開示されている．ＵＳ
５，０６６，５８８には、乳酸連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）に増粘特性を付与でき
るＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ（好
中温菌）の株に由来する２つのプラスミドが記載されて
いる。同様に、Ｖｅｓｃｏｖｏらは、チーズ乳酸桿菌の
亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｓｕ
ｂｓｐ．ｃａｓｅｉ株；好中温菌）から、いわゆる細胞
外のシックナーの産生に関連する機能、Ｍｕｃ＋表現型
をコードするプラスミドを証明している（Ｖｅｓｃｏｖ
ｏら，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，Ｖ
ｏｌ．２，７０９−７１２，１９８９）。
【０００７】最後に、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｅｒｇらは、
清酒乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ；
好中温菌）からＥＰＳの生合成に関与する染色体遺伝子
群の単離を探究している（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｅｒｇ
Ｄ．Ｊ．Ｃ．ら, ＦｉｒｓｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｐｏｌｕｓａｃｃｈ
ａｒｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｔｒｏｎｄｈｅ
ｉｍ，Ｎｏｒｗａｙ，１９９４年６月６〜８日）。しか
しながら、遺伝子はまだ同定も配列決定もされていな
い。
清酒乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ；
好中温菌）からＥＰＳの生合成に関与する染色体遺伝子
群の単離を探究している（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｅｒｇ
Ｄ．Ｊ．Ｃ．ら, ＦｉｒｓｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｐｏｌｕｓａｃｃｈ
ａｒｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｔｒｏｎｄｈｅ
ｉｍ，Ｎｏｒｗａｙ，１９９４年６月６〜８日）。しか
しながら、遺伝子はまだ同定も配列決定もされていな
い。
【０００８】さらに、好熱乳酸菌、すなわち至適増殖温
度３７〜４５℃の乳酸菌におけるＥＰＳの生合成はまだ
よく知られていない、しかしながら、プラスミドに関連
しないことはわかっている。すなわち、Ｖｅｓｃｏｖｏ
らは、乳酸桿菌の亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉ
ｃｕｓ株２０１；好熱菌）のＭｕｃ＋表現型が染色体機
能に連結していることを示している（Ｖｅｓｃｏｖｏ
ら, Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖ
ｏｌ．２，７０９−７１２，１９８９）。
度３７〜４５℃の乳酸菌におけるＥＰＳの生合成はまだ
よく知られていない、しかしながら、プラスミドに関連
しないことはわかっている。すなわち、Ｖｅｓｃｏｖｏ
らは、乳酸桿菌の亜種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉ
ｃｕｓ株２０１；好熱菌）のＭｕｃ＋表現型が染色体機
能に連結していることを示している（Ｖｅｓｃｏｖｏ
ら, Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖ
ｏｌ．２，７０９−７１２，１９８９）。
【０００９】すなわち、今日まで、好中温または好熱乳
酸菌のＥＰＳをコードする染色体またはプラスミド遺伝
子または遺伝子群は，同定も配列決定もされていない。
酸菌のＥＰＳをコードする染色体またはプラスミド遺伝
子または遺伝子群は，同定も配列決定もされていない。
【００１０】したがって、乳酸菌における本来のＥＰＳ
産生を修復または安定化する手段を提供することはきわ
めて有益である。さらに、ＥＰＳの構造を修飾する手段
を提供し、有利な性質を有する新たなＥＰＳを創製する
ことは有益である。
産生を修復または安定化する手段を提供することはきわ
めて有益である。さらに、ＥＰＳの構造を修飾する手段
を提供し、有利な性質を有する新たなＥＰＳを創製する
ことは有益である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、イン
ビボおよびインビトロにおけるＥＰＳの合成を制御、修
飾および／または修復する新規な手段を提供することに
ある。
ビボおよびインビトロにおけるＥＰＳの合成を制御、修
飾および／または修復する新規な手段を提供することに
ある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】この目的のために、本発
明は、リピート構造
明は、リピート構造
【化４】 （式中、ｎは＞１であり、Ａはβ−Ｄ−Ｇａｌｐ，β−
Ｄ−Ｇｌｃｐならびにそれらのアセチルおよびホスファ
チル誘導体からなる群より選ばれ、ｘおよびｙは２，
３，４，５または６である。ただしｘ＝ｙではない）を
もつＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１種の酵素を
コードする染色体起源の乳酸菌ＤＮＡに関する。
Ｄ−Ｇｌｃｐならびにそれらのアセチルおよびホスファ
チル誘導体からなる群より選ばれ、ｘおよびｙは２，
３，４，５または６である。ただしｘ＝ｙではない）を
もつＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１種の酵素を
コードする染色体起源の乳酸菌ＤＮＡに関する。
【００１３】本発明の他の課題は、本発明のＤＮＡフラ
グメントからなる組換えベクターに関する。
グメントからなる組換えベクターに関する。
【００１４】本発明の他の課題は、リピート構造
【化５】 を有するＥＰＳの生合成に関与可能なタンパク質であっ
て、配列番号：２，配列番号：３，配列番号：４，配列
番号：５，配列番号：６，配列番号：７，配列番号：
８，配列番号：９，配列番号：１０，配列番号：１１，
配列番号：１２，配列番号：１３および配列番号：１４
の配列ならびにその相同配列からなる群より選ばれるア
ミノ酸配列をもつタンパク質に関する（配列は以下の配
列表に示す）。
て、配列番号：２，配列番号：３，配列番号：４，配列
番号：５，配列番号：６，配列番号：７，配列番号：
８，配列番号：９，配列番号：１０，配列番号：１１，
配列番号：１２，配列番号：１３および配列番号：１４
の配列ならびにその相同配列からなる群より選ばれるア
ミノ酸配列をもつタンパク質に関する（配列は以下の配
列表に示す）。
【００１５】本発明の他の課題は、本発明のＤＮＡフラ
グメントをゲノム内にインテグレートされてまたは複製
可能なプラスミドの補助によって有する乳酸菌に関す
る。
グメントをゲノム内にインテグレートされてまたは複製
可能なプラスミドの補助によって有する乳酸菌に関す
る。
【００１６】本発明の他の課題は、（１）本発明の酵素
をコードするＤＮＡフラグメントを、宿主細胞内での自
動複製または宿主細胞へのインテグレートを可能にする
配列からなるベクター中にクローニングし、（２）宿主
細胞を上記ベクターでトランスフォームし、ついで
（３）トランスフォームされた宿主細胞をＥＰＳの産生
に適当な条件下に培養する、ＥＰＳの製造方法に関す
る。
をコードするＤＮＡフラグメントを、宿主細胞内での自
動複製または宿主細胞へのインテグレートを可能にする
配列からなるベクター中にクローニングし、（２）宿主
細胞を上記ベクターでトランスフォームし、ついで
（３）トランスフォームされた宿主細胞をＥＰＳの産生
に適当な条件下に培養する、ＥＰＳの製造方法に関す
る。
【００１７】本発明はまた、（１）ＥＰＳの生合成に関
与する少なくとも１種の酵素をコードするＤＮＡフラグ
メントをベクター中にクローニングし、（２）乳酸菌を
上記ベクターでトランスフォームし、次いで（３）トラ
ンスフォームされた乳酸菌を新たなＥＰＳの産生に適当
な条件下に培養する、新たなＥＰＳを製造する他の方法
に関する。
与する少なくとも１種の酵素をコードするＤＮＡフラグ
メントをベクター中にクローニングし、（２）乳酸菌を
上記ベクターでトランスフォームし、次いで（３）トラ
ンスフォームされた乳酸菌を新たなＥＰＳの産生に適当
な条件下に培養する、新たなＥＰＳを製造する他の方法
に関する。
【００１８】したがって、本発明は、乳酸菌におけるＥ
ＰＳの産生の修復または修飾のために、本発明のＤＮＡ
フラグメントの利用の可能性の道を開くものである。す
なわち、たとえば、液状デザート、ヨーグルト、スー
プ、乳製アイスクリーム、コーヒークリーム、ソースま
たはマヨネーズのような飲料または食品の増粘およびク
リーム化の目的でのＥＰＳの製造のために、本発明のＤ
ＮＡの乳酸菌内における発現または過剰発現を企図する
ことが可能である。
ＰＳの産生の修復または修飾のために、本発明のＤＮＡ
フラグメントの利用の可能性の道を開くものである。す
なわち、たとえば、液状デザート、ヨーグルト、スー
プ、乳製アイスクリーム、コーヒークリーム、ソースま
たはマヨネーズのような飲料または食品の増粘およびク
リーム化の目的でのＥＰＳの製造のために、本発明のＤ
ＮＡの乳酸菌内における発現または過剰発現を企図する
ことが可能である。
【００１９】本発明はまた、ＥＰＳの生合成に関与する
乳酸菌の染色体遺伝子を同定する新規な手段の提供を可
能にするものである。
乳酸菌の染色体遺伝子を同定する新規な手段の提供を可
能にするものである。
【００２０】最後に、本発明はまた、上述のＥＰＳの生
合成に関与する新規な酵素を提供する。すなわちこれら
の酵素はたとえば、ポリサッカライドたとえばオリゴサ
ッカライドまたはＥＰＳのインビトロ合成または修飾に
有利に使用することができる（Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｙ．
ら, Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅ
ｔｙ，１１４，９２８３−９２８９，１９９２）。
合成に関与する新規な酵素を提供する。すなわちこれら
の酵素はたとえば、ポリサッカライドたとえばオリゴサ
ッカライドまたはＥＰＳのインビトロ合成または修飾に
有利に使用することができる（Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｙ．
ら, Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅ
ｔｙ，１１４，９２８３−９２８９，１９９２）。
【００２１】
【発明の実施の形態】以下の記述において、「ＥＰＳ」
の語は，反復単位を形成する数種の異なる糖のアッセン
ブリーから構成され、乳酸菌によって産生されるエキソ
ポリサッカライドを意味する。
の語は，反復単位を形成する数種の異なる糖のアッセン
ブリーから構成され、乳酸菌によって産生されるエキソ
ポリサッカライドを意味する。
【００２２】アセチルおよびホスファチル誘導体の語
は、糖の環上の位置Ｃ2 〜Ｃ6 に、少なくとも１個のア
セチルおよびホスファチル基を有するガラクトースまた
はグルコースを意味して使用される。
は、糖の環上の位置Ｃ2 〜Ｃ6 に、少なくとも１個のア
セチルおよびホスファチル基を有するガラクトースまた
はグルコースを意味して使用される。
【００２３】本発明の目的では、「相同配列」は、本発
明の配列とは少数の核酸またはアミノ酸ベース、たとえ
ば１〜５００塩基対（ｂｐ）または１〜１５０のアミノ
酸の置換、欠失または付加の点でのみ異なるが同一の機
能を有する核酸またはアミノ酸配列を意味するものと理
解される。
明の配列とは少数の核酸またはアミノ酸ベース、たとえ
ば１〜５００塩基対（ｂｐ）または１〜１５０のアミノ
酸の置換、欠失または付加の点でのみ異なるが同一の機
能を有する核酸またはアミノ酸配列を意味するものと理
解される。
【００２４】この場合、遺伝子コードの縮重の結果とし
て、同一のポリペプチドをコードする２つのＤＮＡ配列
はとくに相同であると考えてよい。同様に、同一の抗体
によって認識されるタンパク質であって、２つのタンパ
ク質の認識の強度を示す値の比が１０００、好ましくは
１００を越えない２つのタンパク質はたとえば、相同で
あるとみなされることになる。
て、同一のポリペプチドをコードする２つのＤＮＡ配列
はとくに相同であると考えてよい。同様に、同一の抗体
によって認識されるタンパク質であって、２つのタンパ
ク質の認識の強度を示す値の比が１０００、好ましくは
１００を越えない２つのタンパク質はたとえば、相同で
あるとみなされることになる。
【００２５】配列が、本発明の配列と７０％以上とくに
８０％または９０％以上のホモロジーを示す場合も相同
であると考えられることになる。この場合、ホモロジー
は、本発明の配列の場合と同一である相同配列の塩基ま
たはアミノ酸の数と本発明の上記配列の塩基またはアミ
ノ酸の総数の比によって決定される。
８０％または９０％以上のホモロジーを示す場合も相同
であると考えられることになる。この場合、ホモロジー
は、本発明の配列の場合と同一である相同配列の塩基ま
たはアミノ酸の数と本発明の上記配列の塩基またはアミ
ノ酸の総数の比によって決定される。
【００２６】本発明の目的では、「ハイブリダイズする
フラグメント」とは、本発明のフラグメントとサザンブ
ロッティング法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら, Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９
８９，９．３１〜９．５８章）によってハイブリダイズ
できる配列を意味するものと理解される。ハイブリダイ
ゼーションは、非特異的なおよび不安定なハイブリダイ
ゼーションを回避できるように、緊縮条件下に行われる
ことが好ましい。
フラグメント」とは、本発明のフラグメントとサザンブ
ロッティング法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら, Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９
８９，９．３１〜９．５８章）によってハイブリダイズ
できる配列を意味するものと理解される。ハイブリダイ
ゼーションは、非特異的なおよび不安定なハイブリダイ
ゼーションを回避できるように、緊縮条件下に行われる
ことが好ましい。
【００２７】最後に、「フラグメント」または「ＤＮＡ
フラグメント」の語は、合成、インビトロでのたとえば
「ポリメラーゼチェーン反応」と呼ばれる既知の方法に
よる再生、またはインビボでのたとえば大腸菌、連鎖乳
酸菌または乳酸桿菌好熱型の細菌で再生できる染色体起
源の二本鎖ＤＮＡと理解されるべきである。
フラグメント」の語は、合成、インビトロでのたとえば
「ポリメラーゼチェーン反応」と呼ばれる既知の方法に
よる再生、またはインビボでのたとえば大腸菌、連鎖乳
酸菌または乳酸桿菌好熱型の細菌で再生できる染色体起
源の二本鎖ＤＮＡと理解されるべきである。
【００２８】本発明のＤＮＡを選択するためには、ＥＰ
Ｓを産生しない乳酸菌中にＥＰＳを産生する乳酸菌から
の大ＤＮＡフラグメントのライブラリーを構築し、つい
で、ＥＰＳを産生するクローン（単数または複数）を選
択することができる。この目的には、ＥＰＳを産生する
乳酸菌のゲノムＤＮＡを比較的稀な制限部位に特異的な
制限酵素（ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩ，ＰｓｔＩ）で、また
はＳａｕ３Ａによる部分消化によって、たとえば消化す
る。消化産物を大フラグメントを受け入れる発現または
インテグレーションプラスミド（例ＩＩに記載のプラス
ミドｐＳＡ３）にクローニングし、組換えプラスミドを
ＥＰＳを産生しない同種の乳酸菌に導入し、ＥＰＳを産
生するトランスフォームされた少なくとも１つのクロー
ンを選択し、ついでＥＰＳの産生に関与するＤＮＡフラ
グメントを旧来の方法で同定し、単離し、配列を決定す
る。
Ｓを産生しない乳酸菌中にＥＰＳを産生する乳酸菌から
の大ＤＮＡフラグメントのライブラリーを構築し、つい
で、ＥＰＳを産生するクローン（単数または複数）を選
択することができる。この目的には、ＥＰＳを産生する
乳酸菌のゲノムＤＮＡを比較的稀な制限部位に特異的な
制限酵素（ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩ，ＰｓｔＩ）で、また
はＳａｕ３Ａによる部分消化によって、たとえば消化す
る。消化産物を大フラグメントを受け入れる発現または
インテグレーションプラスミド（例ＩＩに記載のプラス
ミドｐＳＡ３）にクローニングし、組換えプラスミドを
ＥＰＳを産生しない同種の乳酸菌に導入し、ＥＰＳを産
生するトランスフォームされた少なくとも１つのクロー
ンを選択し、ついでＥＰＳの産生に関与するＤＮＡフラ
グメントを旧来の方法で同定し、単離し、配列を決定す
る。
【００２９】本発明のフラグメントは大サイズとするこ
とが可能で、それらはＥＰＳの生合成に関与する遺伝子
群を含有できるという事実から、組換えプラスミドは突
然変異誘発処置（ＵＶもしくは化学的処置またはトラン
スポゾンによる処置）によりＥＰＳの産生能が失われて
いるという事実を除いてそれらのフラグメントの起源で
ある乳酸菌と同一の株に導入するのが好ましい。
とが可能で、それらはＥＰＳの生合成に関与する遺伝子
群を含有できるという事実から、組換えプラスミドは突
然変異誘発処置（ＵＶもしくは化学的処置またはトラン
スポゾンによる処置）によりＥＰＳの産生能が失われて
いるという事実を除いてそれらのフラグメントの起源で
ある乳酸菌と同一の株に導入するのが好ましい。
【００３０】上述の方法の別法として、たとえば、ＥＰ
Ｓを産生する乳酸菌株からのＤＮＡフラグメントのプラ
スミドライブラリーを構築し、同じ乳酸菌の株をその内
部では複製不可能なプラスミドでトランスフォームし、
同種組換えによってそれらのゲノムにプラスミドがイン
テグレートされたトランスフォーマントを選択し（たと
えば、抗生物質抵抗性による選択）、ＥＰＳをもはや産
生しないトランスフォーマントを選択し、ついで選択さ
れたトランスフォーマントのインテグレートされたプラ
スミドに隣接する染色体ＤＮＡフラグメントを単離し、
配列を決定する。この目的では、トランスフォーマント
の染色体を消化し、それをライゲートし、ついでインテ
グレートされたプラスミドに特異的なプローブを使用し
て逆ＰＣＲを実施するかまたは再循環プラスミドを複製
可能な株にライゲーション産物を導入することもでき
る。
Ｓを産生する乳酸菌株からのＤＮＡフラグメントのプラ
スミドライブラリーを構築し、同じ乳酸菌の株をその内
部では複製不可能なプラスミドでトランスフォームし、
同種組換えによってそれらのゲノムにプラスミドがイン
テグレートされたトランスフォーマントを選択し（たと
えば、抗生物質抵抗性による選択）、ＥＰＳをもはや産
生しないトランスフォーマントを選択し、ついで選択さ
れたトランスフォーマントのインテグレートされたプラ
スミドに隣接する染色体ＤＮＡフラグメントを単離し、
配列を決定する。この目的では、トランスフォーマント
の染色体を消化し、それをライゲートし、ついでインテ
グレートされたプラスミドに特異的なプローブを使用し
て逆ＰＣＲを実施するかまたは再循環プラスミドを複製
可能な株にライゲーション産物を導入することもでき
る。
【００３１】上述の選択方法の他の別法として、ＥＰＳ
を産生する乳酸菌をトランスポゾンからなるプラスミド
によってトランスフォームし、この細菌を、トランスポ
ゾンがベクターから切除されてゲノム中にランダムにイ
ンテグレートされる条件に付し、ＥＰＳの産生能を失っ
た細菌のクローンを選択し、トランスポゾンがインテグ
レートされた上記クローンからゲノムＤＮＡフラグメン
トを単離することもできる。この方法は以下の例Ｉに詳
細に記述する。
を産生する乳酸菌をトランスポゾンからなるプラスミド
によってトランスフォームし、この細菌を、トランスポ
ゾンがベクターから切除されてゲノム中にランダムにイ
ンテグレートされる条件に付し、ＥＰＳの産生能を失っ
た細菌のクローンを選択し、トランスポゾンがインテグ
レートされた上記クローンからゲノムＤＮＡフラグメン
トを単離することもできる。この方法は以下の例Ｉに詳
細に記述する。
【００３２】上に簡略に述べた選択方法はすべての既知
の乳酸菌、とくに好中温乳酸菌たとえば、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉおよびＬａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅならびに好熱乳酸菌た
とえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒ
ｕｅｃｋｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓおよび
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓに
適用できることが指摘されねばならない。この目的で
は、本技術分野の熟練者は乳酸菌の各種とくにＬａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉ ｓｕｂｓ
ｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓについて任意に選択できるト
ランスフォーメーション技術を有する（Ｓａｓａｋｉ
Ｙ．ら, ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ，１２，Ｆｏｕｒｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
ｏｎ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｎ
ｏｏｄｗｉｊｋｅｒｈｏｕｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌ
ａｎｄｓ，１９９３年９月）。
の乳酸菌、とくに好中温乳酸菌たとえば、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉおよびＬａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅならびに好熱乳酸菌た
とえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒ
ｕｅｃｋｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓおよび
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓに
適用できることが指摘されねばならない。この目的で
は、本技術分野の熟練者は乳酸菌の各種とくにＬａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉ ｓｕｂｓ
ｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓについて任意に選択できるト
ランスフォーメーション技術を有する（Ｓａｓａｋｉ
Ｙ．ら, ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ，１２，Ｆｏｕｒｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
ｏｎ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｎ
ｏｏｄｗｉｊｋｅｒｈｏｕｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌ
ａｎｄｓ，１９９３年９月）。
【００３３】さらに、上述の選択方法は、大抵、ＥＰＳ
の生合成に関与する遺伝子または遺伝子群の部分のみの
単離を可能にする。しかしながら、本技術分野の熟練者
はたとえば、単離されたフラグメントに基づく核酸プロ
ーブを用い、残りの部分を含有する１または２以上のク
ローンを染色体ライブラリー中で選択することにより遺
伝子または遺伝子群の残部を容易に同定することができ
る（例Ｉ．６参照）。
の生合成に関与する遺伝子または遺伝子群の部分のみの
単離を可能にする。しかしながら、本技術分野の熟練者
はたとえば、単離されたフラグメントに基づく核酸プロ
ーブを用い、残りの部分を含有する１または２以上のク
ローンを染色体ライブラリー中で選択することにより遺
伝子または遺伝子群の残部を容易に同定することができ
る（例Ｉ．６参照）。
【００３４】したがって１９９５年６月７日付にてＣｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ ｏｒｇａｎｉｓｍｅ
（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．，国立培養微生物収集機関），２８
ｒｕｅ ｄｕ Ｄｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒ
ｉｓ ｃｅｄｅｘ １５，Ｆｒａｎｃｅに寄託され、受
入番号ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０として受理されたＳｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株の
１５．２ｋｂのＤＮＡ配列を特徴づけることが可能であ
った。さらに、このグラム陽性株は顕微鏡下に小さい鎖
を形成する非鞭毛球菌の外観を呈する。この株は胞子を
作らず、通性嫌気性菌である。
ｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ ｏｒｇａｎｉｓｍｅ
（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．，国立培養微生物収集機関），２８
ｒｕｅ ｄｕ Ｄｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒ
ｉｓ ｃｅｄｅｘ １５，Ｆｒａｎｃｅに寄託され、受
入番号ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０として受理されたＳｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株の
１５．２ｋｂのＤＮＡ配列を特徴づけることが可能であ
った。さらに、このグラム陽性株は顕微鏡下に小さい鎖
を形成する非鞭毛球菌の外観を呈する。この株は胞子を
作らず、通性嫌気性菌である。
【００３５】この１５．２ｋｂの配列は、リピート構造
【化６】 を有するＥＰＳの生合成に関与する新しい酵素をコード
する遺伝子からなる。
する遺伝子からなる。
【００３６】この１５．２ｋｂの配列のヌクレオチド６
４８〜１５２５０は以下の配列表中に配列番号：１とし
て示す。配列番号：１の核酸配列中ヌクレオチド３５２
〜１８０３, １８０７〜２５３５, ２５４７〜３２３
９, ３２４９〜３９９５, ４０５１〜４７３１, ４８９
８〜５８５４, ６４２５〜７５４０, ７７３６〜８２１
２, ８２２１〜９１９２, ９２８５〜１０３６４，１０
３９２〜１１３３９，１１３０２〜１２２２２および１
２２３３〜１３６５１によって１３の完全遺伝子が区切
られる。
４８〜１５２５０は以下の配列表中に配列番号：１とし
て示す。配列番号：１の核酸配列中ヌクレオチド３５２
〜１８０３, １８０７〜２５３５, ２５４７〜３２３
９, ３２４９〜３９９５, ４０５１〜４７３１, ４８９
８〜５８５４, ６４２５〜７５４０, ７７３６〜８２１
２, ８２２１〜９１９２, ９２８５〜１０３６４，１０
３９２〜１１３３９，１１３０２〜１２２２２および１
２２３３〜１３６５１によって１３の完全遺伝子が区切
られる。
【００３７】配列番号：１のすべてまたは部分は、トラ
ンスフォーメーション後に、最初はＥＰＳを産生しなか
った好中温または好熱乳酸菌、とくにＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓまたはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓのような宿主
細胞にＥＰＳ生合成の回復を可能にすることを示すこと
ができた。したがって一例を挙げれば、本発明のＤＮＡ
配列はＥＰＳをもはや産生しないＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ株ＣＮＣＭＩ−１５９０の変異体（天然の変異
体または突然変異に起因する変異体）にＥＰＳの産生を
回復させるために使用できる。
ンスフォーメーション後に、最初はＥＰＳを産生しなか
った好中温または好熱乳酸菌、とくにＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓまたはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓのような宿主
細胞にＥＰＳ生合成の回復を可能にすることを示すこと
ができた。したがって一例を挙げれば、本発明のＤＮＡ
配列はＥＰＳをもはや産生しないＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ株ＣＮＣＭＩ−１５９０の変異体（天然の変異
体または突然変異に起因する変異体）にＥＰＳの産生を
回復させるために使用できる。
【００３８】ＥＰＳの生合成を回復させるためには、少
なくとも上述の遺伝子からなる配列番号：１の配列の全
部または部分をＥＰ５６４，９６６に記載の方法によっ
て宿主細胞内にインテグレートすることができる。この
方法は本発明の教示の参考として本明細書に導入する。
略述すれば、この方法は（１）宿主細胞を、その宿主細
胞に由来するオペロンの部分に機能的に（リーディング
フレームが保存されて）インテグレートされた上記プラ
スミドからなりそのドナー内では複製されないドナープ
ラスミドでトランスフォームすること、（２）全プラス
ミドがインテグレートされてなるトランスフォーマント
を同定すること、（３）本発明のフラグメントのみが染
色体中にインテグレートされ、プラスミドの他の配列は
染色体から切除されたトランスフォーマントを選択する
こと、および（４）選ばれたトランスフォーマントをＥ
ＰＳの産生に適当な条件下に培養することを可能にし
た。
なくとも上述の遺伝子からなる配列番号：１の配列の全
部または部分をＥＰ５６４，９６６に記載の方法によっ
て宿主細胞内にインテグレートすることができる。この
方法は本発明の教示の参考として本明細書に導入する。
略述すれば、この方法は（１）宿主細胞を、その宿主細
胞に由来するオペロンの部分に機能的に（リーディング
フレームが保存されて）インテグレートされた上記プラ
スミドからなりそのドナー内では複製されないドナープ
ラスミドでトランスフォームすること、（２）全プラス
ミドがインテグレートされてなるトランスフォーマント
を同定すること、（３）本発明のフラグメントのみが染
色体中にインテグレートされ、プラスミドの他の配列は
染色体から切除されたトランスフォーマントを選択する
こと、および（４）選ばれたトランスフォーマントをＥ
ＰＳの産生に適当な条件下に培養することを可能にし
た。
【００３９】この方法は機能性プロモーターや翻訳アク
ティベーターを用いないことを可能にするものではない
ことに留意すべきである。さらに、ＥＰＳの産生に適当
な培養条件は本技術分野の熟練者の能力の範囲内にあ
り、本技術分野の熟練者には、使用される株に応じて、
標準培養培地の使用ならびに至適培地のｐＨ、温度およ
び攪拌の選択が可能である。
ティベーターを用いないことを可能にするものではない
ことに留意すべきである。さらに、ＥＰＳの産生に適当
な培養条件は本技術分野の熟練者の能力の範囲内にあ
り、本技術分野の熟練者には、使用される株に応じて、
標準培養培地の使用ならびに至適培地のｐＨ、温度およ
び攪拌の選択が可能である。
【００４０】また上記遺伝子の少なくとも１種からなる
配列番号：１の配列の全部または部分を、自己複製発現
プラスミド中の機能性プロモーターおよび翻訳アクティ
ベーターの下流、必要に応じてターミネーターの上流に
クローン化し、ついでこの組換えプラスミドで宿主細胞
をトランスフォームすることの選択も可能である。
配列番号：１の配列の全部または部分を、自己複製発現
プラスミド中の機能性プロモーターおよび翻訳アクティ
ベーターの下流、必要に応じてターミネーターの上流に
クローン化し、ついでこの組換えプラスミドで宿主細胞
をトランスフォームすることの選択も可能である。
【００４１】さらに、たとえば、最初はＥＰＳを産生し
ない連鎖乳酸菌を配列番号：１の配列でトランスフォー
ムした宿主細胞が産生するＥＰＳは、組換え酵素によっ
て正常に合成されるＥＰＳ、この場合は株ＣＮＣＭ Ｉ
−１５９０によって産生されるＥＰＳとは異なることが
観察される。したがって、１５．２ｋｂの配列の全部ま
たは部分の使用は上述のＥＰＳの変異体の創製を可能に
することができる。
ない連鎖乳酸菌を配列番号：１の配列でトランスフォー
ムした宿主細胞が産生するＥＰＳは、組換え酵素によっ
て正常に合成されるＥＰＳ、この場合は株ＣＮＣＭ Ｉ
−１５９０によって産生されるＥＰＳとは異なることが
観察される。したがって、１５．２ｋｂの配列の全部ま
たは部分の使用は上述のＥＰＳの変異体の創製を可能に
することができる。
【００４２】同様に、配列番号：１の配列の全部または
部分は、トランスフォーメーション後、宿主細胞たとえ
ば、好中温または好熱乳酸菌とくに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓまたはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓのような宿主
細胞によって最初に産生されるＥＰＳのリピート構造を
修飾することを可能にすることを示すことができた。
部分は、トランスフォーメーション後、宿主細胞たとえ
ば、好中温または好熱乳酸菌とくに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓまたはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓのような宿主
細胞によって最初に産生されるＥＰＳのリピート構造を
修飾することを可能にすることを示すことができた。
【００４３】すなわち、これらの観察は、（１）ＥＰＳ
の生合成に関与する少なくとも１種の酵素を全体的また
は部分的にコードするＤＮＡフラグメントをベクター中
にクローン化し、（２）乳酸菌をその組換えベクターで
トランスフォームし、（３）必要に応じて、新たなＥＰ
Ｓを産生する乳酸菌を選択し、ついで（４）トランスフ
ォームされた乳酸菌を新たなＥＰＳの産生に適当な条件
下に培養する、新たなＥＰＳの新規な製造方法の提供の
可能性を開くものである。ベクターは好ましくは本発明
のタンパク質をコードする。さらに、乳酸菌は上記ベク
ターによりコードされるタンパク質によって合成される
ＥＰＳ以外のＥＰＳを産生できる。
の生合成に関与する少なくとも１種の酵素を全体的また
は部分的にコードするＤＮＡフラグメントをベクター中
にクローン化し、（２）乳酸菌をその組換えベクターで
トランスフォームし、（３）必要に応じて、新たなＥＰ
Ｓを産生する乳酸菌を選択し、ついで（４）トランスフ
ォームされた乳酸菌を新たなＥＰＳの産生に適当な条件
下に培養する、新たなＥＰＳの新規な製造方法の提供の
可能性を開くものである。ベクターは好ましくは本発明
のタンパク質をコードする。さらに、乳酸菌は上記ベク
ターによりコードされるタンパク質によって合成される
ＥＰＳ以外のＥＰＳを産生できる。
【００４４】とくに、第一のＥＰＳの生合成に関与する
少なくとも１種の酵素を部分的にコードするＤＮＡフラ
グメントをインテグレーションベクター中にクローン化
し、組換えベクターを必要に応じて第二のＥＰＳを産生
できる好中温または好熱乳酸菌中に１もしくは２以上の
染色体またはプラスミド遺伝子を介して導入し、インテ
グレーションベクターがそれらの染色体中にインテグレ
ートされた細菌を単離し、ついで新たなＥＰＳを産生す
る細菌を第二のＥＰＳの生合成に関与する１または２以
上の遺伝子の不活性化によって選択する。好ましくは第
一および第二のＥＰＳは同一であり、リピート単位の側
鎖への糖の付加または糖の修飾に関与する少なくとも１
種の酵素たとえば、スルホ、ホスホまたはアセチルトラ
ンスフェラーゼを部分的に（少なくとも１５塩基対）コ
ードするＤＮＡフラグメントが選択される。
少なくとも１種の酵素を部分的にコードするＤＮＡフラ
グメントをインテグレーションベクター中にクローン化
し、組換えベクターを必要に応じて第二のＥＰＳを産生
できる好中温または好熱乳酸菌中に１もしくは２以上の
染色体またはプラスミド遺伝子を介して導入し、インテ
グレーションベクターがそれらの染色体中にインテグレ
ートされた細菌を単離し、ついで新たなＥＰＳを産生す
る細菌を第二のＥＰＳの生合成に関与する１または２以
上の遺伝子の不活性化によって選択する。好ましくは第
一および第二のＥＰＳは同一であり、リピート単位の側
鎖への糖の付加または糖の修飾に関与する少なくとも１
種の酵素たとえば、スルホ、ホスホまたはアセチルトラ
ンスフェラーゼを部分的に（少なくとも１５塩基対）コ
ードするＤＮＡフラグメントが選択される。
【００４５】同様に、第一のＥＰＳの生合成に関与する
少なくとも１種の酵素の全体をコードするＤＮＡフラグ
メントを複製可能な発現ベクター中にクローン化し、そ
の組換えベクターを、必要に応じて第二のＥＰＳを１も
しくは２以上の染色体またはプラスミド遺伝子を介して
産生できる好中温または好熱乳酸菌に導入し、複製可能
なベクターを含有する細菌を単離し、ついで第一のＥＰ
Ｓの生合成に関与する１または２以上の遺伝子の発現に
よって新規なＥＰＳを産生する細菌が選択される。好ま
しくは、糖の修飾に関与する酵素たとえば、スルホ、ホ
スホもしくはアセチルトランスフェラーゼ、または糖の
リピートを付加する酵素たとえばグルコシルもしくはガ
ラクトシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡフラ
グメントが選択される。
少なくとも１種の酵素の全体をコードするＤＮＡフラグ
メントを複製可能な発現ベクター中にクローン化し、そ
の組換えベクターを、必要に応じて第二のＥＰＳを１も
しくは２以上の染色体またはプラスミド遺伝子を介して
産生できる好中温または好熱乳酸菌に導入し、複製可能
なベクターを含有する細菌を単離し、ついで第一のＥＰ
Ｓの生合成に関与する１または２以上の遺伝子の発現に
よって新規なＥＰＳを産生する細菌が選択される。好ま
しくは、糖の修飾に関与する酵素たとえば、スルホ、ホ
スホもしくはアセチルトランスフェラーゼ、または糖の
リピートを付加する酵素たとえばグルコシルもしくはガ
ラクトシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡフラ
グメントが選択される。
【００４６】配列番号：１の配列に包含される遺伝子の
少なくとも１つを全体的にまたは部分的に使用するのが
好ましい。ＥＰＳの生合成に関与する好中温乳酸菌のプ
ラスミド遺伝子（既知のプラスミドから配列決定できる
遺伝子）の少なくとも１つも使用できる。
少なくとも１つを全体的にまたは部分的に使用するのが
好ましい。ＥＰＳの生合成に関与する好中温乳酸菌のプ
ラスミド遺伝子（既知のプラスミドから配列決定できる
遺伝子）の少なくとも１つも使用できる。
【００４７】最後に、組換えベクターは、本発明のＤＮ
Ａ配列、とくに配列番号：１の配列のすべてまたは部分
からなる線状または環状、一本鎖または二本鎖、発現ま
たはインテグレーションベクターとすることができる。
ＥＰ５６４，９６６に記載の方法を使用しない場合に
は、ベクターが適当な核酸配列（プロモーター、リボソ
ーム結合部位、好ましいコドン）を介して本発明のＤＮ
Ａを発現できるように、またそれがたとえば、様々な細
菌とくに大腸菌および／または連鎖球菌からの１もしく
は２以上の複製の起源を含有するように注意する必要が
ある。
Ａ配列、とくに配列番号：１の配列のすべてまたは部分
からなる線状または環状、一本鎖または二本鎖、発現ま
たはインテグレーションベクターとすることができる。
ＥＰ５６４，９６６に記載の方法を使用しない場合に
は、ベクターが適当な核酸配列（プロモーター、リボソ
ーム結合部位、好ましいコドン）を介して本発明のＤＮ
Ａを発現できるように、またそれがたとえば、様々な細
菌とくに大腸菌および／または連鎖球菌からの１もしく
は２以上の複製の起源を含有するように注意する必要が
ある。
【００４８】本発明はまた、配列番号：１の配列遺伝子
とくにそれらと相同な配列によってコードされる新たな
酵素に関する。したがって、これらの、オリゴサッカラ
イドまたはポリサッカライドたとえばＥＰＳの修飾また
はインビトロ合成のための使用が考慮される。この目的
では、これらの酵素の少なくとも１種は、細菌中で旧来
法によって過剰発現させ、旧来法たとえば培養培地の沈
殿および／またはクロマトグラフィーにより精製される
ことが好ましい。
とくにそれらと相同な配列によってコードされる新たな
酵素に関する。したがって、これらの、オリゴサッカラ
イドまたはポリサッカライドたとえばＥＰＳの修飾また
はインビトロ合成のための使用が考慮される。この目的
では、これらの酵素の少なくとも１種は、細菌中で旧来
法によって過剰発現させ、旧来法たとえば培養培地の沈
殿および／またはクロマトグラフィーにより精製される
ことが好ましい。
【００４９】本発明の他の課題は、その染色体にインテ
グレートされてまたは複製可能なプラスミドの補助によ
り本発明のＤＮＡ配列を含む乳酸菌に関する。その配列
は好ましくは配列番号：１の配列の遺伝子の少なくとも
１つからなる。
グレートされてまたは複製可能なプラスミドの補助によ
り本発明のＤＮＡ配列を含む乳酸菌に関する。その配列
は好ましくは配列番号：１の配列の遺伝子の少なくとも
１つからなる。
【００５０】本発明はまた、少なくとも１５ｂｐの配列
番号：１の配列のＤＮＡフラグメントまたはその配列に
相補性配列鎖のフラグメントの、ＰＣＲを実施するため
のプライマーとしてまたはＥＰＳの生合成に関与する乳
酸菌の遺伝子のインビトロ検出もしくはインビボ不活性
化のためのプローブとしての使用に関する。この下限
は、特異的にハイブリダイズする小フラグメントは一般
に長さ１５〜２５ｂｐであるという事実により任意に設
定される。
番号：１の配列のＤＮＡフラグメントまたはその配列に
相補性配列鎖のフラグメントの、ＰＣＲを実施するため
のプライマーとしてまたはＥＰＳの生合成に関与する乳
酸菌の遺伝子のインビトロ検出もしくはインビボ不活性
化のためのプローブとしての使用に関する。この下限
は、特異的にハイブリダイズする小フラグメントは一般
に長さ１５〜２５ｂｐであるという事実により任意に設
定される。
【００５１】
【実施例】本発明のＤＮＡフラグメント、組換えプラス
ミドおよびトランスフォームされた細菌を得る実施例で
ある以下の記述により、本発明を以下にさらに詳細に説
明する。それらの記述に先立ち、培養培地を説明する。
しかしながら、これらの実施例は本発明の課題の例示の
ために記載されるもので、いかなる意味でも本発明の限
定を構成するものではないことは自明の通りである。Ｄ
ＮＡの操作ならびに細菌細胞のクローニングおよびトラ
ンスフォーメーションは、とくに指示のない限り、上に
引用したＳａｍｂｒｏｏｋらの著作に記載のプロトコー
ルに従って実施する。百分率はとくに指示のある場合を
除き重量％を示す。
ミドおよびトランスフォームされた細菌を得る実施例で
ある以下の記述により、本発明を以下にさらに詳細に説
明する。それらの記述に先立ち、培養培地を説明する。
しかしながら、これらの実施例は本発明の課題の例示の
ために記載されるもので、いかなる意味でも本発明の限
定を構成するものではないことは自明の通りである。Ｄ
ＮＡの操作ならびに細菌細胞のクローニングおよびトラ
ンスフォーメーションは、とくに指示のない限り、上に
引用したＳａｍｂｒｏｏｋらの著作に記載のプロトコー
ルに従って実施する。百分率はとくに指示のある場合を
除き重量％を示す。
【００５２】培地：（固体培地に１．５％のバクトアガ
ールを添加） −Ｍ１７（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）：トリプトン０．５
％，ソイトン０．５％，水解ミート０．５％，酵母エキ
ス０．２５％，アスコルビン酸０．０５％，硫酸マグネ
シウム０．０２５％，β−グリセロリン酸二ナトリウム
１．９％および水 −ＬＭ１７：１％ラクトース含有Ｍ１７培地 −ＧＭ１７：１％グルコース含有Ｍ１７培地 −ＭＳＫ：酵母エキス０．１％含有脱脂粉乳（１０％再
構築粉末） −ＭＡＭ：アミノ酸混合物（４９５ｍｇ／ｌ Ａｌａ，
３４３ｍｇ／ｌ Ａｒｇ，６８２ｍｇ／ｌ Ａｓｐ，５
９ｍｇ／ｌ Ｃｙｓ，１２２９ｍｇ／ｌ Ｇｌｕ，７５
９ｍｇ／ｌ Ｇｌｙ，１５３ｍｇ／ｌ Ｈｉｓ，２１５
ｍｇ／ｌ Ｉｓｏ，４７０ｍｇ／ｌ Ｌｅｕ，５６５ｍ
ｇ／ｌ Ｌｙｓ，１２２ｍｇ／ｌ Ｍｅｔ，２５５ｍｇ
／ｌ Ｐｈｅ，４３６ｍｇ／ｌ Ｐｒｏ，６８ｍｇ／ｌ
Ｓｅｒ，１７０ｍｇ／ｌ Ｔｈｒ，６１ｍｇ／ｌ Ｔ
ｒｙ，３０４ｍｇ／ｌ Ｖａｌ，ｐＨ５に調整）１０％
含有脱脂粉乳（１０％再構築粉末） −ＨＪＬ：トリプトン３％，牛肉エキス０．２％，酵母
エキス１％，ラクトース１％およびＫＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ
６．５，０．５％ −ルテニウムレッド：酵母エキス０．５％，脱脂粉乳粉
末１０％，スクロース１％，アガール１．５％およびル
テニウムレッド０．０８ｇ／ｌ（ＦＲ２，６３２，９６
８参照）
ールを添加） −Ｍ１７（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）：トリプトン０．５
％，ソイトン０．５％，水解ミート０．５％，酵母エキ
ス０．２５％，アスコルビン酸０．０５％，硫酸マグネ
シウム０．０２５％，β−グリセロリン酸二ナトリウム
１．９％および水 −ＬＭ１７：１％ラクトース含有Ｍ１７培地 −ＧＭ１７：１％グルコース含有Ｍ１７培地 −ＭＳＫ：酵母エキス０．１％含有脱脂粉乳（１０％再
構築粉末） −ＭＡＭ：アミノ酸混合物（４９５ｍｇ／ｌ Ａｌａ，
３４３ｍｇ／ｌ Ａｒｇ，６８２ｍｇ／ｌ Ａｓｐ，５
９ｍｇ／ｌ Ｃｙｓ，１２２９ｍｇ／ｌ Ｇｌｕ，７５
９ｍｇ／ｌ Ｇｌｙ，１５３ｍｇ／ｌ Ｈｉｓ，２１５
ｍｇ／ｌ Ｉｓｏ，４７０ｍｇ／ｌ Ｌｅｕ，５６５ｍ
ｇ／ｌ Ｌｙｓ，１２２ｍｇ／ｌ Ｍｅｔ，２５５ｍｇ
／ｌ Ｐｈｅ，４３６ｍｇ／ｌ Ｐｒｏ，６８ｍｇ／ｌ
Ｓｅｒ，１７０ｍｇ／ｌ Ｔｈｒ，６１ｍｇ／ｌ Ｔ
ｒｙ，３０４ｍｇ／ｌ Ｖａｌ，ｐＨ５に調整）１０％
含有脱脂粉乳（１０％再構築粉末） −ＨＪＬ：トリプトン３％，牛肉エキス０．２％，酵母
エキス１％，ラクトース１％およびＫＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ
６．５，０．５％ −ルテニウムレッド：酵母エキス０．５％，脱脂粉乳粉
末１０％，スクロース１％，アガール１．５％およびル
テニウムレッド０．０８ｇ／ｌ（ＦＲ２，６３２，９６
８参照）
【００５３】例Ｉ：Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓ
ｆｉ６のＤＮＡフラグメントのクローニング Ｉ．１．ＥＰＳを産生するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ株の選択： Ｎｅｓｔｌｅコレクションからの乳酸菌の
株をＨＪＬ液体培地中で培養し、その希釈液をルテニウ
ムレッド固体培地上にプレートアウトする。ＥＰＳは細
胞壁の染料による染色を防止するので、ＥＰＳを産生す
る株は白色に維持される。これに反して、非産生株は細
胞壁のペプチドグリカンに対する染料の親和性のために
赤色に染まる。この方法で、寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−１
５９０として寄託され「株Ｓｆｉ６」の表示で以下の例
に指示するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓｆｉ６が
ＥＰＳ産生乳酸菌から選択された。
ｆｉ６のＤＮＡフラグメントのクローニング Ｉ．１．ＥＰＳを産生するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ株の選択： Ｎｅｓｔｌｅコレクションからの乳酸菌の
株をＨＪＬ液体培地中で培養し、その希釈液をルテニウ
ムレッド固体培地上にプレートアウトする。ＥＰＳは細
胞壁の染料による染色を防止するので、ＥＰＳを産生す
る株は白色に維持される。これに反して、非産生株は細
胞壁のペプチドグリカンに対する染料の親和性のために
赤色に染まる。この方法で、寄託番号ＣＮＣＭ Ｉ−１
５９０として寄託され「株Ｓｆｉ６」の表示で以下の例
に指示するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓｆｉ６が
ＥＰＳ産生乳酸菌から選択された。
【００５４】Ｉ．２．ＥＰＳのリピート構造：株Ｓｆｉ
６によって産生されるＥＰＳの構造は、Ｄｏｃｏら（Ｃ
ａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，１９８，３１３−３２１，
１９９５）に報告されている。このＥＰＳは組成Ｇｌ
ｃ：Ｇａｌ：ＧａｌＮａｃ＝１：２：１、およびテトラ
サッカライドのリピート単位
６によって産生されるＥＰＳの構造は、Ｄｏｃｏら（Ｃ
ａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，１９８，３１３−３２１，
１９９５）に報告されている。このＥＰＳは組成Ｇｌ
ｃ：Ｇａｌ：ＧａｌＮａｃ＝１：２：１、およびテトラ
サッカライドのリピート単位
【化７】 を有する。
【００５５】Ｉ．３．トランスポゾンＴｎ９１６による
突然変異誘発：ストレプトマイシン含量を２０から２０
００μｇ／ｍｌまで増大させ補充したＨＪＬ培地に繰返
し移してＳｆｉ６株を培養し、自然に抵抗性になる株を
選択することによりストレプトマイシン抵抗性とする。
ストレプトマイシン抵抗性Ｓｆｉ６株、およびトランス
ポゾンＴｎ９１６（Ｔｎ９１６はテトラサイクリン抵抗
性遺伝子をもつことが知られている；Ｇａｗｒｏｎら，
Ｎａｔｕｒｅ，３００，２８１−２８３，１９８２）を
もつプラスミドｐＡＭ１８０を含有する腸球菌フェカリ
ス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）株
ＪＨ２−２を接合させる。この目的では、Ｅ．ｆａｅｃ
ａｌｉｓ株ＪＨ２−２のＭ１７培地中３７℃での一夜培
養液１ｍｌをＳｆｉ６株のＨＪＬ培地中４２℃での一夜
培養液１０ｍｌと混合し、細胞を遠心分離し、１００μ
ｌのＨＪＬ培地を含む試験管中に再懸濁し、懸濁液をＬ
Ｍ１７固体培地に適用し、これを３７℃で２０時間イン
キュベートし、細胞を掻き落として回収し、１０ｍｌの
ＨＪＬ液体培地の試験管中に再懸濁し、試験管を４２℃
で時々振盪しながら４時間インキュベートし、ついで培
養液の希釈液を２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンお
よび２０００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン補充固体
ＬＭ１７培地上にプレートアウトする。平行して２０の
接合実験（独立の突然変異誘導）を行うことにより、こ
の方法で２×１０4 のテトラサイクリンおよびストレプ
トマイシン抵抗性トランス接合体を選択することが可能
であった。
突然変異誘発：ストレプトマイシン含量を２０から２０
００μｇ／ｍｌまで増大させ補充したＨＪＬ培地に繰返
し移してＳｆｉ６株を培養し、自然に抵抗性になる株を
選択することによりストレプトマイシン抵抗性とする。
ストレプトマイシン抵抗性Ｓｆｉ６株、およびトランス
ポゾンＴｎ９１６（Ｔｎ９１６はテトラサイクリン抵抗
性遺伝子をもつことが知られている；Ｇａｗｒｏｎら，
Ｎａｔｕｒｅ，３００，２８１−２８３，１９８２）を
もつプラスミドｐＡＭ１８０を含有する腸球菌フェカリ
ス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）株
ＪＨ２−２を接合させる。この目的では、Ｅ．ｆａｅｃ
ａｌｉｓ株ＪＨ２−２のＭ１７培地中３７℃での一夜培
養液１ｍｌをＳｆｉ６株のＨＪＬ培地中４２℃での一夜
培養液１０ｍｌと混合し、細胞を遠心分離し、１００μ
ｌのＨＪＬ培地を含む試験管中に再懸濁し、懸濁液をＬ
Ｍ１７固体培地に適用し、これを３７℃で２０時間イン
キュベートし、細胞を掻き落として回収し、１０ｍｌの
ＨＪＬ液体培地の試験管中に再懸濁し、試験管を４２℃
で時々振盪しながら４時間インキュベートし、ついで培
養液の希釈液を２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンお
よび２０００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン補充固体
ＬＭ１７培地上にプレートアウトする。平行して２０の
接合実験（独立の突然変異誘導）を行うことにより、こ
の方法で２×１０4 のテトラサイクリンおよびストレプ
トマイシン抵抗性トランス接合体を選択することが可能
であった。
【００５６】Ｉ．４．ＥＰＳをもはや産生しない〔ＥＰ
Ｓ（−）表現型〕Ｓｆｉ６株変異体の選択：抵抗性トラ
ンス接合体を２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよ
び２０００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した
ルテニウムレッド固体培地に移す。約１０％の接合体が
ＥＰＳ（−）の赤いコロニーを形成する。ついで約８０
０個の赤いコロニーを選択し、２．５μｇ／ｍｌのテト
ラサイクリンを補充したＨＪＬ培地２００μｌを含むマ
イクトタイトレーションプレート中で一夜培養する。１
００μｌのＨＪＬ培養体をついで１ｍｌのＭＳＫミルク
中で培養する。試験した赤いコロニーの約２５％がミル
ク（ミルクは粘稠でも粘着性でもなく、培養上清の分析
ではＥＰＳは認められない）中で安定なＥＰＳ（−）表
現型を示す。他の赤いコロニーはＥＰＳ（＋）表現型を
示すかまたはミルク中数回の継代培養後にＥＰＳ（＋）
表現型を回復する。結論として、ＥＰＳ（−）安定変異
体は、ＥＰＳの生合成に関与する染色体遺伝子中へのト
ランスポゾンＴｎ９１６のインテグレーションの結果と
してＥＰＳ産生能を失ったものである。実際、ＥＰＳ
（−）安定変異体をテトラサイクリンを欠く増殖培地中
で培養すると（トランスポゾンの切断および喪失）、Ｅ
ＰＳ（＋）表現型を回復できる。
Ｓ（−）表現型〕Ｓｆｉ６株変異体の選択：抵抗性トラ
ンス接合体を２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよ
び２０００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した
ルテニウムレッド固体培地に移す。約１０％の接合体が
ＥＰＳ（−）の赤いコロニーを形成する。ついで約８０
０個の赤いコロニーを選択し、２．５μｇ／ｍｌのテト
ラサイクリンを補充したＨＪＬ培地２００μｌを含むマ
イクトタイトレーションプレート中で一夜培養する。１
００μｌのＨＪＬ培養体をついで１ｍｌのＭＳＫミルク
中で培養する。試験した赤いコロニーの約２５％がミル
ク（ミルクは粘稠でも粘着性でもなく、培養上清の分析
ではＥＰＳは認められない）中で安定なＥＰＳ（−）表
現型を示す。他の赤いコロニーはＥＰＳ（＋）表現型を
示すかまたはミルク中数回の継代培養後にＥＰＳ（＋）
表現型を回復する。結論として、ＥＰＳ（−）安定変異
体は、ＥＰＳの生合成に関与する染色体遺伝子中へのト
ランスポゾンＴｎ９１６のインテグレーションの結果と
してＥＰＳ産生能を失ったものである。実際、ＥＰＳ
（−）安定変異体をテトラサイクリンを欠く増殖培地中
で培養すると（トランスポゾンの切断および喪失）、Ｅ
ＰＳ（＋）表現型を回復できる。
【００５７】Ｉ．５．ＥＰＳ（−）安定変異体の特性：
約１００個の安定変異体を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化し
たその変異体からの染色体ＤＮＡプレパレーションのサ
ザンブロッティングおよび、サザンブロットフィルター
のプラスミドｐＩＣ１８２（Ｈｉｌｌら, Ａｐｐｌｉｅ
ｄ ａｎｄ Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏ．，５４，１２３０−
１２３６，１９８８）由来の放射性ｔｅｔＭ遺伝子（テ
トラサイクリン抵抗性をコードする）とのハイブリダイ
ゼーションによって分析する。分析した約８５％の変異
体は、「遺伝子座Ａ」と呼ばれる位置に相当する同一の
優位なバンドを示す。他の変異体の一部では、細胞壁の
生合成に関与する既知の遺伝子座に相当するさらに２つ
のバンド（遺伝子座ＢおよびＣ）が認められる（発表準
備中）。
約１００個の安定変異体を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化し
たその変異体からの染色体ＤＮＡプレパレーションのサ
ザンブロッティングおよび、サザンブロットフィルター
のプラスミドｐＩＣ１８２（Ｈｉｌｌら, Ａｐｐｌｉｅ
ｄ ａｎｄ Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏ．，５４，１２３０−
１２３６，１９８８）由来の放射性ｔｅｔＭ遺伝子（テ
トラサイクリン抵抗性をコードする）とのハイブリダイ
ゼーションによって分析する。分析した約８５％の変異
体は、「遺伝子座Ａ」と呼ばれる位置に相当する同一の
優位なバンドを示す。他の変異体の一部では、細胞壁の
生合成に関与する既知の遺伝子座に相当するさらに２つ
のバンド（遺伝子座ＢおよびＣ）が認められる（発表準
備中）。
【００５８】Ｉ．６．遺伝子座Ａの特性：インテグレー
トされたトランスポゾンＴｎ９１６に近接する染色体領
域は逆ＰＣＲによって単離できる。この目的では、任意
に選択された変異体（変異体：１）からの染色体ＤＮＡ
プレパレーション１μｇを旧来法によりＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉで４時間消化し、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム
で抽出し、７２０μｌの水で希釈し、希釈したＤＮＡを
５６℃に５分間加熱し、ＤＮＡを氷上で冷却し、それに
８０μｌの１０倍濃度のライゲーション緩衝液および５
単位のＴ４ライガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）を加え１２℃で１６時間インキュベート
し、７０℃に１５分間加熱してライガーゼを不活性化
し、ついでブタノールに数回連続抽出して容量１００μ
ｌに濃縮する。ライゲーション混合物１０μｌ、１００
ｐｍｏｌのプライマー、１５ｍＭ ｄＮＴＰ、１０μｌ
の緩衝液および０．２単位のＳｕｐｅｒ−Ｔａｑポリメ
ラーゼ（Ｓｔｅｈｌｉｎ ＧｍｂＨ）をついでＰＣＲデ
バイスに添加する。核酸プライマーはトランスポゾンＴ
ｎ９１６の既知配列に基づいて選択される。
トされたトランスポゾンＴｎ９１６に近接する染色体領
域は逆ＰＣＲによって単離できる。この目的では、任意
に選択された変異体（変異体：１）からの染色体ＤＮＡ
プレパレーション１μｇを旧来法によりＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉで４時間消化し、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム
で抽出し、７２０μｌの水で希釈し、希釈したＤＮＡを
５６℃に５分間加熱し、ＤＮＡを氷上で冷却し、それに
８０μｌの１０倍濃度のライゲーション緩衝液および５
単位のＴ４ライガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）を加え１２℃で１６時間インキュベート
し、７０℃に１５分間加熱してライガーゼを不活性化
し、ついでブタノールに数回連続抽出して容量１００μ
ｌに濃縮する。ライゲーション混合物１０μｌ、１００
ｐｍｏｌのプライマー、１５ｍＭ ｄＮＴＰ、１０μｌ
の緩衝液および０．２単位のＳｕｐｅｒ−Ｔａｑポリメ
ラーゼ（Ｓｔｅｈｌｉｎ ＧｍｂＨ）をついでＰＣＲデ
バイスに添加する。核酸プライマーはトランスポゾンＴ
ｎ９１６の既知配列に基づいて選択される。
【００５９】配列番号：１５ならびに配列番号：１６の
配列を有するプライマーを用いると、ＰＣＲにより１−
ｋｂフラグメントが単離できた。さらに、プライマー配
列番号：１７および配列番号：１８の配列を用いると、
４−ｋｂフラグメントが単離できた（以下の配列表参
照）。第三の０．８−ｋｂフラグメントも変異体：１か
ら、そのＲｓａＩで消化した染色体ＤＮＡから配列番
号：１８および配列番号：１９の配列（以下の配列表参
照）を有するプライマーを用いて第二の逆ＰＣＲを実施
することにより単離できる。１−ｋｂおよび０．８−ｋ
ｂフラグメントを線状化プラスミドｐＧＥＭＴ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ，ＵＳＡ）中にクローン化した。これらのフラ
グメントをジデオキシヌクレオチド法で配列決定〔ｆ−
ｍｏｌ（登録商標）ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍ ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ〕し、整合する
と、配列番号：１の配列のヌクレオチド９９３３〜１１
６４３に相当する３つのオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）をカバーする２つの配列を示す。
配列を有するプライマーを用いると、ＰＣＲにより１−
ｋｂフラグメントが単離できた。さらに、プライマー配
列番号：１７および配列番号：１８の配列を用いると、
４−ｋｂフラグメントが単離できた（以下の配列表参
照）。第三の０．８−ｋｂフラグメントも変異体：１か
ら、そのＲｓａＩで消化した染色体ＤＮＡから配列番
号：１８および配列番号：１９の配列（以下の配列表参
照）を有するプライマーを用いて第二の逆ＰＣＲを実施
することにより単離できる。１−ｋｂおよび０．８−ｋ
ｂフラグメントを線状化プラスミドｐＧＥＭＴ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ，ＵＳＡ）中にクローン化した。これらのフラ
グメントをジデオキシヌクレオチド法で配列決定〔ｆ−
ｍｏｌ（登録商標）ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍ ｋｉｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ〕し、整合する
と、配列番号：１の配列のヌクレオチド９９３３〜１１
６４３に相当する３つのオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）をカバーする２つの配列を示す。
【００６０】１−ｋｂおよび４−ｋｂフラグメントはま
た、株Ｓｆｉｔ６のＤＮＡフラグメントを含有するλ−
ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳ
Ａ）ライブラリーのスクリーニングに使用された。この
目的では、供給者の推薦に従い、上記変異体からのＤＮ
ＡプレパレーションをＳａｕ３Ａで部分消化し、フラグ
メントをアガロースゲル電気泳動によって分離し、５−
〜１２−ｋｂフラグメントに相当するバンドをゲルから
切り出し、ＤＮＡを溶出し、ついで予めＢａｍＨＩで消
化したλ−ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓベクターにライゲー
トする。ライゲーション産物をＧｉｇａｇｏｌｄ ＩＩ
Ｉ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いイン
ビトロでエンカプシデートし、次にファージを大腸菌Ｘ
Ｌ１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と供給者の推薦
に従い混合し、次に混合物をペトリ皿上にプレートアウ
トする。組換えプラークをついでそれらのＤＮＡのハイ
ブリダイゼーション、予め放射性とした（Ｒａｎｄｏｍ
Ｐｒｉｍｅｄ ＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ，
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１−ｋｂお
よび４−ｋｂフラグメントととのＨｙｂｏｎｄ Ｎ ｍ
ｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，ＵＫ）上へのトランスファーにより分析す
る。
た、株Ｓｆｉｔ６のＤＮＡフラグメントを含有するλ−
ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳ
Ａ）ライブラリーのスクリーニングに使用された。この
目的では、供給者の推薦に従い、上記変異体からのＤＮ
ＡプレパレーションをＳａｕ３Ａで部分消化し、フラグ
メントをアガロースゲル電気泳動によって分離し、５−
〜１２−ｋｂフラグメントに相当するバンドをゲルから
切り出し、ＤＮＡを溶出し、ついで予めＢａｍＨＩで消
化したλ−ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓベクターにライゲー
トする。ライゲーション産物をＧｉｇａｇｏｌｄ ＩＩ
Ｉ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いイン
ビトロでエンカプシデートし、次にファージを大腸菌Ｘ
Ｌ１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と供給者の推薦
に従い混合し、次に混合物をペトリ皿上にプレートアウ
トする。組換えプラークをついでそれらのＤＮＡのハイ
ブリダイゼーション、予め放射性とした（Ｒａｎｄｏｍ
Ｐｒｉｍｅｄ ＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ，
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１−ｋｂお
よび４−ｋｂフラグメントととのＨｙｂｏｎｄ Ｎ ｍ
ｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，ＵＫ）上へのトランスファーにより分析す
る。
【００６１】３０００の組換えプラークから約２０の陽
性プラークをハイブリダイゼーションによって分離する
ことができ、それからついでλ−ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓ
ｓベクターを単離し、次に染色体インサートを含有する
ｐＣＭＶベクターを切り出した（供給者のＳｔｒａｔａ
ｇｅｎｅの説明書参照）。これらの組換えベクターは以
下の実施例中においては「ｐＦＳ」と呼ばれる。１１の
ｐＦＳベクターの染色体インサートをついで配列決定し
た〔ｆ−ｍｏｌ（登録商標）ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ〕。これらはベクターｐＦ
Ｓ１４，ｐＦＳ１５，ｐＦＳ２６，ｐＦＳ３０，ｐＦＳ
３３，ｐＦＳ４９，ｐＦＳ５０，ｐＦＳ６５，ｐＦＳ７
３，ｐＦＳ８０およびｐＦＳ８６であり、それぞれ配列
番号：１のヌクレオチド配列，９３１４〜１４６０２，
１〜３１５９, ７９８８〜１１２５３，１７０２〜７９
９１, １３６１〜７２２９, ４４００〜８４７７, ６４
８〜７６７６, ５９９７〜１１２５３，８４７４〜１３
４８９，３５５０〜７２２９および６４８〜１７０２に
相当するフラグメントからなる。
性プラークをハイブリダイゼーションによって分離する
ことができ、それからついでλ−ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓ
ｓベクターを単離し、次に染色体インサートを含有する
ｐＣＭＶベクターを切り出した（供給者のＳｔｒａｔａ
ｇｅｎｅの説明書参照）。これらの組換えベクターは以
下の実施例中においては「ｐＦＳ」と呼ばれる。１１の
ｐＦＳベクターの染色体インサートをついで配列決定し
た〔ｆ−ｍｏｌ（登録商標）ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ〕。これらはベクターｐＦ
Ｓ１４，ｐＦＳ１５，ｐＦＳ２６，ｐＦＳ３０，ｐＦＳ
３３，ｐＦＳ４９，ｐＦＳ５０，ｐＦＳ６５，ｐＦＳ７
３，ｐＦＳ８０およびｐＦＳ８６であり、それぞれ配列
番号：１のヌクレオチド配列，９３１４〜１４６０２，
１〜３１５９, ７９８８〜１１２５３，１７０２〜７９
９１, １３６１〜７２２９, ４４００〜８４７７, ６４
８〜７６７６, ５９９７〜１１２５３，８４７４〜１３
４８９，３５５０〜７２２９および６４８〜１７０２に
相当するフラグメントからなる。
【００６２】異なる染色体インサートの核酸配列を整合
することにより、株Ｓｆｉ６の遺伝子座Ａに相当する１
５．２ｋｂの配列をこの方法で特性づけることができた
（図１Ａ参照）。この１５．２ｋｂの配列のヌクレオチ
ド６４８〜１５２５０は配列番号：１の配列中に示され
ている。
することにより、株Ｓｆｉ６の遺伝子座Ａに相当する１
５．２ｋｂの配列をこの方法で特性づけることができた
（図１Ａ参照）。この１５．２ｋｂの配列のヌクレオチ
ド６４８〜１５２５０は配列番号：１の配列中に示され
ている。
【００６３】Ｉ．７．配列番号：１の配列の分析： 配列番号：１の配列は株Ｓｆｉ６の全ｅｐｓオペロンか
ら構成される。この配列はｅｐｓＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，
Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，ＬおよびＭと呼ばれる同一方
向性の１３の完全ＯＲＦからなる（図１Ａ参照）。この
配列にはさらに配列の３’末端に、相補性の配列鎖によ
ってコードされる１つの完全ＯＲＦを含有する。ｏｒｆ
Ｚと呼ばれるこのＯＲＦは多分、他のＯＲＦに対するそ
の逆の方向性からオペロンの末端を標識するものであろ
う。
ら構成される。この配列はｅｐｓＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，
Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，ＬおよびＭと呼ばれる同一方
向性の１３の完全ＯＲＦからなる（図１Ａ参照）。この
配列にはさらに配列の３’末端に、相補性の配列鎖によ
ってコードされる１つの完全ＯＲＦを含有する。ｏｒｆ
Ｚと呼ばれるこのＯＲＦは多分、他のＯＲＦに対するそ
の逆の方向性からオペロンの末端を標識するものであろ
う。
【００６４】最初の１３のＯＲＦによってコードされる
アミノ酸配列をＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンクに存
在するタンパク質の配列とソフトウエアＦＡＳＴＡ，Ｐ
ＥＰＰＬＯＴおよびＰＩＬＥＵＰ（ＧＣＧ−ｓｏｆｔｗ
ａｒｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を使用して比較
すると、ｅｐｓオペロンによってコードされる１３のタ
ンパク質の機能を推定することが可能である。結果は以
下に示す。
アミノ酸配列をＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンクに存
在するタンパク質の配列とソフトウエアＦＡＳＴＡ，Ｐ
ＥＰＰＬＯＴおよびＰＩＬＥＵＰ（ＧＣＧ−ｓｏｆｔｗ
ａｒｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を使用して比較
すると、ｅｐｓオペロンによってコードされる１３のタ
ンパク質の機能を推定することが可能である。結果は以
下に示す。
【００６５】ｅｐｓＡ ＯＲＦ（ヌクレオチド３５２〜
１８０３）は自己溶菌酵素Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ
−アラニン（Ｌａｚａｖｅｒｉｃら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，１３８，１９４９−１９６１，１９
９２）の調節に関与する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）のＬｙｔＲタンパク質と２６．４％の
同一性を有するＥｐｓＡタンパク質（配列番号：２）を
コードする。したがってｅｐｓＡは多分、ｅｐｓオペロ
ンのレギュレータータンパク質と考えられる。さらに、
オペロンのレギュレーターＯＲＦは一般的に他のＯＲＦ
の上流に見出されることからｅｐｓＡ遺伝子は多分、ｅ
ｐｓオペロンの最初の遺伝子であると思われる。これ
は、ターミネーターが配列番号：１の配列のヌクレオチ
ド２３０〜２５２に、プロモーターがヌクレオチド２７
４〜３０２に、リボソーム結合部位がヌクレオチド３４
０〜３４５に見出される事実によって確認される。
１８０３）は自己溶菌酵素Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ
−アラニン（Ｌａｚａｖｅｒｉｃら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，１３８，１９４９−１９６１，１９
９２）の調節に関与する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）のＬｙｔＲタンパク質と２６．４％の
同一性を有するＥｐｓＡタンパク質（配列番号：２）を
コードする。したがってｅｐｓＡは多分、ｅｐｓオペロ
ンのレギュレータータンパク質と考えられる。さらに、
オペロンのレギュレーターＯＲＦは一般的に他のＯＲＦ
の上流に見出されることからｅｐｓＡ遺伝子は多分、ｅ
ｐｓオペロンの最初の遺伝子であると思われる。これ
は、ターミネーターが配列番号：１の配列のヌクレオチ
ド２３０〜２５２に、プロモーターがヌクレオチド２７
４〜３０２に、リボソーム結合部位がヌクレオチド３４
０〜３４５に見出される事実によって確認される。
【００６６】ｅｐｓＢ遺伝子（ヌクレオチド１８０７〜
２５３５）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌ
ａｃｔｉａｅのＣｐｓＡタンパク質と６７．５％の同一
性および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ ａｕｒｅｕｓ）のＣａｐＣタンパク質と３０％の同
一性を有する（Ｒｕｂｅｎｓら, Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．，８，８４３−８８５，１９９３；Ｌｉｎら,
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６，７００５−７０１
６，１９９４）ＥｐｓＢタンパク質（配列番号：３）を
コードする。これらの遺伝子の正確な機能は、それらが
細菌の外膜のリン脂質にカップリングするポリサッカラ
イドから構成される莢膜の合成に必須であることを除い
てまだ不明である。
２５３５）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌ
ａｃｔｉａｅのＣｐｓＡタンパク質と６７．５％の同一
性および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ ａｕｒｅｕｓ）のＣａｐＣタンパク質と３０％の同
一性を有する（Ｒｕｂｅｎｓら, Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．，８，８４３−８８５，１９９３；Ｌｉｎら,
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６，７００５−７０１
６，１９９４）ＥｐｓＢタンパク質（配列番号：３）を
コードする。これらの遺伝子の正確な機能は、それらが
細菌の外膜のリン脂質にカップリングするポリサッカラ
イドから構成される莢膜の合成に必須であることを除い
てまだ不明である。
【００６７】ｅｐｓＣ遺伝子（ヌクレオチド２５４７〜
３２３９）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌ
ａｃｔｉａｅの莢膜の合成に関与する（Ｒｕｂｅｎｓ
ら）ＣｐｓＢタンパク質と５２％の同一性を有するＥｐ
ｓＣタンパク質をコードする。ＥｐｓＣはまた、Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ネズミチフ
ス菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａおよ
び大腸菌のＣＬＤタンパク質の配列（Ｂａｔｃｈｅｌｏ
ｒら, Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４，５２２８−５
２３６，１９９２；Ｂａｓｔｉｎら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，７，７２５−７３４，１９９３）と２３
％の同一性、４９％の類似性およびそれに匹敵する疎水
性プロファイルを有する。ＣＬＤタンパク質はポリサッ
カライドの合成時にその鎖の長さの制御に関与すること
が指摘されねばならない。
３２３９）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌ
ａｃｔｉａｅの莢膜の合成に関与する（Ｒｕｂｅｎｓ
ら）ＣｐｓＢタンパク質と５２％の同一性を有するＥｐ
ｓＣタンパク質をコードする。ＥｐｓＣはまた、Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ネズミチフ
ス菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａおよ
び大腸菌のＣＬＤタンパク質の配列（Ｂａｔｃｈｅｌｏ
ｒら, Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４，５２２８−５
２３６，１９９２；Ｂａｓｔｉｎら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，７，７２５−７３４，１９９３）と２３
％の同一性、４９％の類似性およびそれに匹敵する疎水
性プロファイルを有する。ＣＬＤタンパク質はポリサッ
カライドの合成時にその鎖の長さの制御に関与すること
が指摘されねばならない。
【００６８】ｅｐｓＤ遺伝子（ヌクレオチド３２４９〜
３９９５）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌ
ａｃｔｉａｅのＣｐｓＣタンパク質と６０．５％の同一
性、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣ
ａｐＡタンパク質と３４．５％の同一性およびＲｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉのＥｘｏＰタンパク質と
３３％の同一性を有する（Ｒｕｂｅｎｓら, Ｌｉｎら,
Ｂｅｃｋｅｒら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４
１，３６７−３７９，１９９３）ＥｐｓＤタンパク質
（配列番号：５）をコードする。ＥｘｏＰタンパク質
は、ＥＰＳおよび／またはＥＰＳ前駆体のトランスロケ
ーションに関与する膜タンパク質である。
３９９５）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌ
ａｃｔｉａｅのＣｐｓＣタンパク質と６０．５％の同一
性、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣ
ａｐＡタンパク質と３４．５％の同一性およびＲｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉのＥｘｏＰタンパク質と
３３％の同一性を有する（Ｒｕｂｅｎｓら, Ｌｉｎら,
Ｂｅｃｋｅｒら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４
１，３６７−３７９，１９９３）ＥｐｓＤタンパク質
（配列番号：５）をコードする。ＥｘｏＰタンパク質
は、ＥＰＳおよび／またはＥＰＳ前駆体のトランスロケ
ーションに関与する膜タンパク質である。
【００６９】ｅｐｓＥ遺伝子（ヌクレオチド４０５１〜
４７３１）は、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を
有する多くのタンパク質（Ｒｕｂｅｎｓら）と有意なホ
モロジーを示すＥｐｓＥタンパク質（配列番号：６）を
コードする。したがって、この遺伝子はガラクトシルト
ランスフェラーゼをコードするものと思われる。
４７３１）は、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を
有する多くのタンパク質（Ｒｕｂｅｎｓら）と有意なホ
モロジーを示すＥｐｓＥタンパク質（配列番号：６）を
コードする。したがって、この遺伝子はガラクトシルト
ランスフェラーゼをコードするものと思われる。
【００７０】Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｓｆｉ６
のｅｐｓＢ，Ｃ，ＤおよびＥ遺伝子は、ｃｐｓＡ，Ｂ，
ＣおよびＤ遺伝子からなるＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの
オペロンの場合（Ｒｕｂｅｎｓら）に類似することが注
目される。しかもそれらは同じ方法で統合されている。
２つの株の莢膜のポリサッカライドおよびＥＰＳは極め
て異なることから、これは染色体領域が多分これらの２
つの種の間で転換したことを指示するものであろう。
のｅｐｓＢ，Ｃ，ＤおよびＥ遺伝子は、ｃｐｓＡ，Ｂ，
ＣおよびＤ遺伝子からなるＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの
オペロンの場合（Ｒｕｂｅｎｓら）に類似することが注
目される。しかもそれらは同じ方法で統合されている。
２つの株の莢膜のポリサッカライドおよびＥＰＳは極め
て異なることから、これは染色体領域が多分これらの２
つの種の間で転換したことを指示するものであろう。
【００７１】ｅｐｓＦ遺伝子（ヌクレオチド４８９８〜
５８５４）は、多分ガラクトシルトランスフラーゼとし
て莢膜の生合成に関与していると考えられる（Ｌｉｎ
ら）Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＣａｐＨおよびＣａｐＭとそれ
ぞれ２４．５％および２３％の同一生を有するＥｐｓＦ
タンパク質（配列番号：７）をコードする。
５８５４）は、多分ガラクトシルトランスフラーゼとし
て莢膜の生合成に関与していると考えられる（Ｌｉｎ
ら）Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＣａｐＨおよびＣａｐＭとそれ
ぞれ２４．５％および２３％の同一生を有するＥｐｓＦ
タンパク質（配列番号：７）をコードする。
【００７２】ｅｐｓＧ遺伝子（ヌクレオチド６４２５〜
７５４０）は外膜のＬＰＳポリサッカライドの生合成に
関与するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍＬＴ２のＮ−アセチルグルコサミントランスフェラー
ゼ（ＭａｃＬａｃｈｌａｎら, Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１７３，７１５１−７１６３，１９９１）と２
０．５％の同一性および５０％の類似性を有するＥｐｓ
Ｇタンパク質（配列番号：８）をコードする。Ｎ−アセ
チルグルコサミンは株Ｓｆｉ６のＥＰＳの生合成には関
与しないので（アセチル化グルコースはない）、Ｅｐｓ
Ｇ遺伝子は多分、グリコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−
アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、またはＮ−
アセチルグルコサミンエピメラーゼ活性を有するＮ−ア
セチルグリコシルトランスフェラーゼをコードするもの
と思われる。
７５４０）は外膜のＬＰＳポリサッカライドの生合成に
関与するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍＬＴ２のＮ−アセチルグルコサミントランスフェラー
ゼ（ＭａｃＬａｃｈｌａｎら, Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１７３，７１５１−７１６３，１９９１）と２
０．５％の同一性および５０％の類似性を有するＥｐｓ
Ｇタンパク質（配列番号：８）をコードする。Ｎ−アセ
チルグルコサミンは株Ｓｆｉ６のＥＰＳの生合成には関
与しないので（アセチル化グルコースはない）、Ｅｐｓ
Ｇ遺伝子は多分、グリコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−
アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、またはＮ−
アセチルグルコサミンエピメラーゼ活性を有するＮ−ア
セチルグリコシルトランスフェラーゼをコードするもの
と思われる。
【００７３】ｅｐｓＨ遺伝子（ヌクレオチド７７３６〜
８２１２）は、ＮｏｄＬ−ＬａｃＡ−ＣｙｓＥアセチル
トランスフェラーゼ（Ｄｏｗｎｉｅら, Ｍｏｌ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．，３，１６４９−１６５１，１９８９）
と高いホモロジーを有するＥｐｓＨタンパク質（配列番
号：９）をコードする。したがって、ＥｐｓＨタンパク
質はＥＰＳのＮ−アセチルガラクトサミンの生合成に関
与するアセチルトランスフェラーゼであるものと思われ
る。
８２１２）は、ＮｏｄＬ−ＬａｃＡ−ＣｙｓＥアセチル
トランスフェラーゼ（Ｄｏｗｎｉｅら, Ｍｏｌ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．，３，１６４９−１６５１，１９８９）
と高いホモロジーを有するＥｐｓＨタンパク質（配列番
号：９）をコードする。したがって、ＥｐｓＨタンパク
質はＥＰＳのＮ−アセチルガラクトサミンの生合成に関
与するアセチルトランスフェラーゼであるものと思われ
る。
【００７４】ｅｐｓＩ遺伝子（ヌクレオチド８２２１〜
９１９２）はＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉ
ｕｍのｒｆｂクラスターのＲｆｂＶ ＯＲＦによってコ
ードされる、グリコシルトランスフェラーゼと考えられ
るタンパク質（Ｊｉａｎｇら；Ｌｉｕら, Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．，１７７，４０８４−４０８８，１９９
５）と２４％の同一性を有するＥｐｓＩタンパク質（配
列番号：１０）をコードする。
９１９２）はＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉ
ｕｍのｒｆｂクラスターのＲｆｂＶ ＯＲＦによってコ
ードされる、グリコシルトランスフェラーゼと考えられ
るタンパク質（Ｊｉａｎｇら；Ｌｉｕら, Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．，１７７，４０８４−４０８８，１９９
５）と２４％の同一性を有するＥｐｓＩタンパク質（配
列番号：１０）をコードする。
【００７５】ｅｐｓＪ遺伝子（ヌクレオチド９２８５〜
１０３６４）は、群ＢおよびＣ２サルモネラのＯ抗原の
ポリメラーゼにそれ自体類似するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｅｎｔｅｒｉｃａのｒｆｂクラスターのＯＲＦのタン
パク質（Ｌｅｅら, Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，１３８，１８４３−１８５５，１９９２；Ｍｏｒ
ｏｎａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６，７３３
−７４７，１９９４）の場合と２０％の同一性およびそ
れに匹敵する疎水性プロファイルを有するＥｐｓＪタン
パク質（配列番号：１１）をコードする。ＥｐｓＪ遺伝
子はしたがって、ＥＰＳのテトラサッカライド単位を重
合させることができるＥＰＳポリメラーゼをコードする
ものと考えられる。
１０３６４）は、群ＢおよびＣ２サルモネラのＯ抗原の
ポリメラーゼにそれ自体類似するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｅｎｔｅｒｉｃａのｒｆｂクラスターのＯＲＦのタン
パク質（Ｌｅｅら, Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，１３８，１８４３−１８５５，１９９２；Ｍｏｒ
ｏｎａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６，７３３
−７４７，１９９４）の場合と２０％の同一性およびそ
れに匹敵する疎水性プロファイルを有するＥｐｓＪタン
パク質（配列番号：１１）をコードする。ＥｐｓＪ遺伝
子はしたがって、ＥＰＳのテトラサッカライド単位を重
合させることができるＥＰＳポリメラーゼをコードする
ものと考えられる。
【００７６】ｅｐｓＫ遺伝子（ヌクレオチド１０３９２
〜１１３３９）は、膜のリン脂質にポリサッカライドを
カップリングさせることによっての莢膜の生合成に関与
する髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔ
ｉｄｉｓ）のｌｉｐＢ遺伝子によってコードされる、タ
ンパク質（Ｆｒｏｓｃｈら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，８，４８３−４９８，１９９３）と１８％の同一
性ならびに４２％の類似性を有するＥｐｓＫタンパク質
（配列番号：１２）をコードしている。Ｓ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓが外膜をもたないと仮定すれば（グラム
陽性菌）、ｅｐｓＫ遺伝子は、ＥＰＳ輸送分子（多分、
ＥｐｓＣおよびＥｐｓＤ）およびＥＰＳを切離す酵素と
共同して膜を通過するＥＰＳの輸送を分担する細胞膜の
リン脂質へのＥＰＳのカップリングに関与する酵素をコ
ードすると考えることができる（Ｆｒｏｓｃｈらによっ
て提起されたモデルと一致する）。
〜１１３３９）は、膜のリン脂質にポリサッカライドを
カップリングさせることによっての莢膜の生合成に関与
する髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔ
ｉｄｉｓ）のｌｉｐＢ遺伝子によってコードされる、タ
ンパク質（Ｆｒｏｓｃｈら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，８，４８３−４９８，１９９３）と１８％の同一
性ならびに４２％の類似性を有するＥｐｓＫタンパク質
（配列番号：１２）をコードしている。Ｓ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓが外膜をもたないと仮定すれば（グラム
陽性菌）、ｅｐｓＫ遺伝子は、ＥＰＳ輸送分子（多分、
ＥｐｓＣおよびＥｐｓＤ）およびＥＰＳを切離す酵素と
共同して膜を通過するＥＰＳの輸送を分担する細胞膜の
リン脂質へのＥＰＳのカップリングに関与する酵素をコ
ードすると考えることができる（Ｆｒｏｓｃｈらによっ
て提起されたモデルと一致する）。
【００７７】さらに、トランスポゾンＴｎ９１６は配列
番号：１のヌクレオチド１０５４０〜１０５４１の間
で、ｅｐｓオペロンの同定に用いられた変異体：１のｅ
ｐｓＫ遺伝子中にインテグレートされる可能性が指摘さ
れる（上記Ｉ．６．の項参照）。
番号：１のヌクレオチド１０５４０〜１０５４１の間
で、ｅｐｓオペロンの同定に用いられた変異体：１のｅ
ｐｓＫ遺伝子中にインテグレートされる可能性が指摘さ
れる（上記Ｉ．６．の項参照）。
【００７８】ｅｐｓＬ遺伝子（ヌクレオチド１１３０２
〜１２２２２）は既知のタンパク質とはホモロジーを示
さないＥｐｓＬタンパク質（配列番号：１４）をコード
する。最初の３８のヌクレオチドは、ｅｐｓＫの３’末
端と重複し、２つのタンパク質の一律発現とＥＰＳの膜
輸送におけるＥｐｓＬタンパク質の活性が示唆される。
〜１２２２２）は既知のタンパク質とはホモロジーを示
さないＥｐｓＬタンパク質（配列番号：１４）をコード
する。最初の３８のヌクレオチドは、ｅｐｓＫの３’末
端と重複し、２つのタンパク質の一律発現とＥＰＳの膜
輸送におけるＥｐｓＬタンパク質の活性が示唆される。
【００７９】ｅｐｓＭ遺伝子（ヌクレオチド１２２３３
〜１３６５１）は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンク
からの既知のタンパク質とはホモロジーを示さないＥｐ
ｓＭタンパク質（配列番号：１３）をコードする。この
遺伝子の特異的なプロモーターが上流にないことから、
この遺伝子は明らかに株Ｓｆｉ６のＥＰＳの生合成に関
与している。
〜１３６５１）は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンク
からの既知のタンパク質とはホモロジーを示さないＥｐ
ｓＭタンパク質（配列番号：１３）をコードする。この
遺伝子の特異的なプロモーターが上流にないことから、
この遺伝子は明らかに株Ｓｆｉ６のＥＰＳの生合成に関
与している。
【００８０】ｏｒｆＺ遺伝子（相補性鎖上１３７３２〜
１４３０５）は、ｅｐｓオペロンにおける他のＯＲＦと
逆方向に存在する。したがって、株Ｓｆｉ６のＥＰＳの
生合成には多分関与していないと思われる。さらに、Ｓ
ｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンクの既知のタンパク質と
はホモロジーを示さない。
１４３０５）は、ｅｐｓオペロンにおける他のＯＲＦと
逆方向に存在する。したがって、株Ｓｆｉ６のＥＰＳの
生合成には多分関与していないと思われる。さらに、Ｓ
ｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンクの既知のタンパク質と
はホモロジーを示さない。
【００８１】結論として、１１のｐＳＦベクターから単
離された染色体インサート（上記Ｉ．６．の項参照）は
ＥＰＳの生合成に明らかに関与するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ株Ｓｆｉ６の染色体領域をカバーする。この
ようにして、上流にｅｐｓオペロンの開始の範囲を定め
るプロモーターを含む１３の完全遺伝子が同定できた。
離された染色体インサート（上記Ｉ．６．の項参照）は
ＥＰＳの生合成に明らかに関与するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ株Ｓｆｉ６の染色体領域をカバーする。この
ようにして、上流にｅｐｓオペロンの開始の範囲を定め
るプロモーターを含む１３の完全遺伝子が同定できた。
【００８２】例ＩＩ：ｅｐｓＪ遺伝子の不活性化 ｅｐｓオペロンのｅｐｓＪ遺伝子を、ＥＰＳの生合成に
おけるその重要性を確認するために、相同組換えによっ
て不活性化する。この目的では、０．８−ｋｂ ＰＣＲ
フラグメントを含有するプラスミドｐＧＥＭＴ（上記
Ｉ．６．の項参照）からＤｒａＩ−ＳａｌＩフラグメン
トを単離し、予めＥｃｏＲＶおよびＳａＩＩで消化した
熱感受性プラスミドｐＳＡ３（Ｄａｏら，Ａｐｐｌ．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９，１１５−
１１９，１９８５）にライゲートし、大腸菌株ＸＬｌ−
ｂｌｕｅをライゲーション産物でトランスフォームし、
トランスフォーマントを選択し、組換えプラスミドを単
離し、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓｆｉ６をＳｌ
ｏｓら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，５７，１３３３−１３３９，１９９１）によって
記載された方法から適応された方法により組換えプラス
ミドでのエレクトロポレーションを用いてトランスフォ
ームする。細胞を２．１ｋＶ、２５μＦおよび４００Ω
の放電に付し、１ｍｌのＨＪＬ培地中に再懸濁し、３７
℃（許容温度）で４時間インキュベートし、細胞を２．
５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを補充したＬＭ１７固
体培地上にプレートアウトし、３７℃で１６時間インキ
ュベートし、ついで生存しているトランスフォームされ
たコロニーを選択する。選択されたコロニーを２．５μ
ｇ／ｍｌのエリスロマイシンを補充したＨＪＬ培地２ｍ
ｌ中で培養液の６００ｎｍにおける光学密度（Ｏ
Ｄ600 ）が０．２に達するまでインキュベートし、培養
液をＯＤ600 が１．０に達するまで４５℃にし（プラス
ミドはも早複製しない）、培養体の希釈液を２．５μｇ
／ｍｌのエリスロマイシン補充ＬＭ１７固体培地上にプ
レートアウトし、４５℃で１２時間インキュベートす
る。
おけるその重要性を確認するために、相同組換えによっ
て不活性化する。この目的では、０．８−ｋｂ ＰＣＲ
フラグメントを含有するプラスミドｐＧＥＭＴ（上記
Ｉ．６．の項参照）からＤｒａＩ−ＳａｌＩフラグメン
トを単離し、予めＥｃｏＲＶおよびＳａＩＩで消化した
熱感受性プラスミドｐＳＡ３（Ｄａｏら，Ａｐｐｌ．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９，１１５−
１１９，１９８５）にライゲートし、大腸菌株ＸＬｌ−
ｂｌｕｅをライゲーション産物でトランスフォームし、
トランスフォーマントを選択し、組換えプラスミドを単
離し、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株Ｓｆｉ６をＳｌ
ｏｓら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，５７，１３３３−１３３９，１９９１）によって
記載された方法から適応された方法により組換えプラス
ミドでのエレクトロポレーションを用いてトランスフォ
ームする。細胞を２．１ｋＶ、２５μＦおよび４００Ω
の放電に付し、１ｍｌのＨＪＬ培地中に再懸濁し、３７
℃（許容温度）で４時間インキュベートし、細胞を２．
５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを補充したＬＭ１７固
体培地上にプレートアウトし、３７℃で１６時間インキ
ュベートし、ついで生存しているトランスフォームされ
たコロニーを選択する。選択されたコロニーを２．５μ
ｇ／ｍｌのエリスロマイシンを補充したＨＪＬ培地２ｍ
ｌ中で培養液の６００ｎｍにおける光学密度（Ｏ
Ｄ600 ）が０．２に達するまでインキュベートし、培養
液をＯＤ600 が１．０に達するまで４５℃にし（プラス
ミドはも早複製しない）、培養体の希釈液を２．５μｇ
／ｍｌのエリスロマイシン補充ＬＭ１７固体培地上にプ
レートアウトし、４５℃で１２時間インキュベートす
る。
【００８３】生存したコロニーのｅｐｓＪ遺伝子に組換
えプラスミドｐＳＡ3 をインテグレートする。これは、
生存コロニーをＥｃｏＲＩで消化した（ｐＳＡ３を１箇
所でのみ切断する）染色体ＤＮＡプレパレーションのサ
ザンブロッティングおよびサザンブロットフィルターの
上述の放射性ＤｒａＩ−ＳａｌＩフラグメントとのハイ
ブリダイゼーションにより確証する。プラスミドｐＳＡ
３がインテグレートされたコロニーはサザンブロットフ
ィルター上に２つのバンドを示す。さらに、ｅｐｓＪ遺
伝子に組換えプラスミドｐＳＡ３がインテグレートされ
たコロニーはルテニウムレッド固体培地上でＥＰＳ
（−）の表現型を示し、ＭＳＫミルク中でそれらの粘着
性は喪失した（上記例Ｉ．４．参照）。
えプラスミドｐＳＡ3 をインテグレートする。これは、
生存コロニーをＥｃｏＲＩで消化した（ｐＳＡ３を１箇
所でのみ切断する）染色体ＤＮＡプレパレーションのサ
ザンブロッティングおよびサザンブロットフィルターの
上述の放射性ＤｒａＩ−ＳａｌＩフラグメントとのハイ
ブリダイゼーションにより確証する。プラスミドｐＳＡ
３がインテグレートされたコロニーはサザンブロットフ
ィルター上に２つのバンドを示す。さらに、ｅｐｓＪ遺
伝子に組換えプラスミドｐＳＡ３がインテグレートされ
たコロニーはルテニウムレッド固体培地上でＥＰＳ
（−）の表現型を示し、ＭＳＫミルク中でそれらの粘着
性は喪失した（上記例Ｉ．４．参照）。
【００８４】例ＩＩＩ：ｅｐｓＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，
Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，ＬおよびＭ遺伝子の不活性化 例ＩおよびＩＩに、トランスポゾンまたはインテグレー
トされるプラスミドの挿入によるｅｐｓＫおよびｅｐｓ
Ｊ遺伝子の不活性化は株Ｓｆｉ６におけるＥＰＳ生合成
を遮断することを示した。同様に株Ｓｆｉ６のｅｐｓオ
ペロンの他の遺伝子は相同組換えによって不活性化さ
れ、したがってＥＰＳ生合成の遮断が観察できる。この
目的では、上記例Ｉ．６．に記載の１１個のｐＦＳベク
ターの一つに由来するＯＲＦのフラグメントをＰＣＲで
増幅する。それをプラスミドｐＳＡ３にクローン化し、
ついで前の例における記載と同一条件下に、株Ｓｆｉ６
にトランスフォームおよびインテグレートする。
Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，ＬおよびＭ遺伝子の不活性化 例ＩおよびＩＩに、トランスポゾンまたはインテグレー
トされるプラスミドの挿入によるｅｐｓＫおよびｅｐｓ
Ｊ遺伝子の不活性化は株Ｓｆｉ６におけるＥＰＳ生合成
を遮断することを示した。同様に株Ｓｆｉ６のｅｐｓオ
ペロンの他の遺伝子は相同組換えによって不活性化さ
れ、したがってＥＰＳ生合成の遮断が観察できる。この
目的では、上記例Ｉ．６．に記載の１１個のｐＦＳベク
ターの一つに由来するＯＲＦのフラグメントをＰＣＲで
増幅する。それをプラスミドｐＳＡ３にクローン化し、
ついで前の例における記載と同一条件下に、株Ｓｆｉ６
にトランスフォームおよびインテグレートする。
【００８５】例ＩＶ：ＥＰＳ産生の修復 ｐＦＳ３０をＥｃｏＲＩで切断し、フラグメントを分離
し、５．５−ｋｂフラグメントを予めＥｃｏＲＩで消化
したｐＦＳ１４にライゲートし、ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞
をライゲーション産物でトランスフォームし、トランス
フォームされ挿入体が正しい方向性を示すクローンを選
択し、ｐＦＳ３０−１４と呼ばれるプラスミドを単離
し、ｐＦＳ６５中央のＥｃｏＲＩフラグメントを、予め
ＥｃｏＲＩで切断したｐＦＳ３０−１４にライゲート
し、ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞をライゲーション産物でトラ
ンスフォームし、トランスフォームされ、挿入体が正し
い方向性を示すクローンをついで選択する。ｐＦＳ３０
−６５−１４と呼ばれる得られた組換えプラスミドは配
列番号：１の配列のヌクレオチド１７０２〜１４６０２
からなる。
し、５．５−ｋｂフラグメントを予めＥｃｏＲＩで消化
したｐＦＳ１４にライゲートし、ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞
をライゲーション産物でトランスフォームし、トランス
フォームされ挿入体が正しい方向性を示すクローンを選
択し、ｐＦＳ３０−１４と呼ばれるプラスミドを単離
し、ｐＦＳ６５中央のＥｃｏＲＩフラグメントを、予め
ＥｃｏＲＩで切断したｐＦＳ３０−１４にライゲート
し、ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞をライゲーション産物でトラ
ンスフォームし、トランスフォームされ、挿入体が正し
い方向性を示すクローンをついで選択する。ｐＦＳ３０
−６５−１４と呼ばれる得られた組換えプラスミドは配
列番号：１の配列のヌクレオチド１７０２〜１４６０２
からなる。
【００８６】ｐＦＳ３０−６５−１４をついでＳａｌＩ
およびＳｍａＩで切断し、１２．９ｋｂフラグメントを
分離し、予めＥｃｏＲＶとＳａｌＩで切断したｐＳＡ３
にライゲート、ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞をライゲーション
産物でトランスフォームし、トランスフォームされたク
ローンを選択し、組換えｐＳＡ３プラスミドを単離す
る。
およびＳｍａＩで切断し、１２．９ｋｂフラグメントを
分離し、予めＥｃｏＲＶとＳａｌＩで切断したｐＳＡ３
にライゲート、ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞をライゲーション
産物でトランスフォームし、トランスフォームされたク
ローンを選択し、組換えｐＳＡ３プラスミドを単離す
る。
【００８７】１９９３年３月２９日付で寄託されたＳ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭ Ｉ−１２９２を
組換えｐＳＡ３プラスミドでエレクトロポレーションに
よりトランスフォームする。このグラム陽性株は、顕微
鏡下に小さい鎖を形成する非鞭毛球菌の外観を呈し、胞
子は作らず、通性嫌気性菌であり、ＥＰＳを産生せず、
そのゲノムにはｅｐｓオペロンの５’末端に相当するそ
のゲノム１０００ｂｐを有する。したがって組換えｐＳ
Ａ３プラスミドは株ＣＮＣＭ Ｉ−１２９２のゲノムに
インテグレートされる。一部のトランスフォームされた
クローンはルテニウムレッド固体培地上でＥＰＳ（＋）
の表現型を示し、ＭＳＫミルク内で粘着性を有する。
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭ Ｉ−１２９２を
組換えｐＳＡ３プラスミドでエレクトロポレーションに
よりトランスフォームする。このグラム陽性株は、顕微
鏡下に小さい鎖を形成する非鞭毛球菌の外観を呈し、胞
子は作らず、通性嫌気性菌であり、ＥＰＳを産生せず、
そのゲノムにはｅｐｓオペロンの５’末端に相当するそ
のゲノム１０００ｂｐを有する。したがって組換えｐＳ
Ａ３プラスミドは株ＣＮＣＭ Ｉ−１２９２のゲノムに
インテグレートされる。一部のトランスフォームされた
クローンはルテニウムレッド固体培地上でＥＰＳ（＋）
の表現型を示し、ＭＳＫミルク内で粘着性を有する。
【００８８】例Ｖ：ＥＰＳ産物の修復 株Ｓｆｉ６の染色体を、配列番号：１の配列を切断はし
ない酵素（ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩ，ＮｒｕＩ，Ｓｔｕ
Ｉ）で消化し、消化産物をアガロースゲル上で分離し、
１５−〜２５−ｋｂのバンドを溶出し、適当な制限酵素
で予め切断したｐＳＡ３中にライゲートし、Ｓ．ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭ Ｉ−１２９２をエレク
トロポレーションによりトランスフォームし、トランス
フォーマントはついでフィルター上へのコロニーのトラ
ンスファーついでそれらのＤＮＡの予め放射性としたｐ
ＦＳ１４とのハイブリダイゼーションにより選択する。
トランスフォームされた一部のクローンはルテニウムレ
ッド固体培地上でＥＰＳ（＋）の表現型を示し、ＭＳＫ
ミルク内で粘着性を有する。
ない酵素（ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩ，ＮｒｕＩ，Ｓｔｕ
Ｉ）で消化し、消化産物をアガロースゲル上で分離し、
１５−〜２５−ｋｂのバンドを溶出し、適当な制限酵素
で予め切断したｐＳＡ３中にライゲートし、Ｓ．ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭ Ｉ−１２９２をエレク
トロポレーションによりトランスフォームし、トランス
フォーマントはついでフィルター上へのコロニーのトラ
ンスファーついでそれらのＤＮＡの予め放射性としたｐ
ＦＳ１４とのハイブリダイゼーションにより選択する。
トランスフォームされた一部のクローンはルテニウムレ
ッド固体培地上でＥＰＳ（＋）の表現型を示し、ＭＳＫ
ミルク内で粘着性を有する。
【００８９】例ＶＩ：ＥＰＳの修飾 １９９４年５月１８日付で寄託されたＳ．ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭ Ｉ−１４２２を例Ｖの組換え
ｐＳＡ３プラスミドでエレクトロポレーションによりト
ランスフォームする。このグラム陽性株は、顕微鏡下に
小さい鎖を形成する非鞭毛球菌の外観を呈し、胞子は作
らず、通性嫌気性菌であり、組成Ｇｌｃ：Ｇａｌ＝２：
２を有するＥＰＳを産生する。
ｐｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭ Ｉ−１４２２を例Ｖの組換え
ｐＳＡ３プラスミドでエレクトロポレーションによりト
ランスフォームする。このグラム陽性株は、顕微鏡下に
小さい鎖を形成する非鞭毛球菌の外観を呈し、胞子は作
らず、通性嫌気性菌であり、組成Ｇｌｃ：Ｇａｌ＝２：
２を有するＥＰＳを産生する。
【００９０】例ＶＩＩ：ＥＰＳの修飾 １９９３年８月５日付で寄託されたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭＩ−１３５１を例Ｖの組換えｐＳ
Ａ３プラスミドでのエレクトロポレーションによってト
ランスフォームする。このグラム陽性株は、顕微鏡下に
小さい鎖を形成する非鞭毛球菌の外観を呈して、胞子は
作らず、通性嫌気性菌であり、組成Ｇｌｃ：Ｇａｌ：Ｒ
ｈａ＝１：３：２を有するＥＰＳを産生する。
ｈｉｌｕｓ株ＣＮＣＭＩ−１３５１を例Ｖの組換えｐＳ
Ａ３プラスミドでのエレクトロポレーションによってト
ランスフォームする。このグラム陽性株は、顕微鏡下に
小さい鎖を形成する非鞭毛球菌の外観を呈して、胞子は
作らず、通性嫌気性菌であり、組成Ｇｌｃ：Ｇａｌ：Ｒ
ｈａ＝１：３：２を有するＥＰＳを産生する。
【００９１】例ＶＩＩＩ：ＥＰＳの修飾 株ＣＮＣＭ Ｉ−１５９０の染色体ＤＮＡは、Ｓｌｏｓ
ら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，５７，１３３３−１３３９，１９９１）の方法に
よって単離される。ＤＮＡプレパレーションはＳａｃＩ
およびＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡフラグメントは０．
７％アガロースゲル上電気泳動によって分離し、１２−
〜１６−ｋｂフラグメントを溶出し、抽出されたＤＮＡ
を予めＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化しついで脱リン
酸化したベクターｐＪＩＭ２２７９（Ｐ．Ｒｅｎａｕｌ
ｔ，ＩＮＲＡ，Ｊｏｕｙ−ｅｎ−Ｊｏｓａｓ，Ｐａｒｉ
ｓ，Ｆｒａｎｃｅから入手）にライゲートする。ＧＭ１
７培地上３０℃にて培養したＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１５４，１−９，１９８３）をＤｅ Ｖｏｓら
（Ｇｅｎｅ，８５，１６９−１７６，１９８９）の方法
によりトランスフォームする。トランスフォームされた
クローンを、クローンのゲノムＤＮＡと配列番号：１
５, １６, １７, １８および１９の配列を有するプロー
ブの一つとのハイブリダイゼーションにより選択する。
４００個のトランスフォーマント中、６つの陽性クロー
ンが選択され、その一つが図１Ｃに示すｐＦＳ１０１と
呼ばれるプラスミドを含有する。
ら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，５７，１３３３−１３３９，１９９１）の方法に
よって単離される。ＤＮＡプレパレーションはＳａｃＩ
およびＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡフラグメントは０．
７％アガロースゲル上電気泳動によって分離し、１２−
〜１６−ｋｂフラグメントを溶出し、抽出されたＤＮＡ
を予めＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化しついで脱リン
酸化したベクターｐＪＩＭ２２７９（Ｐ．Ｒｅｎａｕｌ
ｔ，ＩＮＲＡ，Ｊｏｕｙ−ｅｎ−Ｊｏｓａｓ，Ｐａｒｉ
ｓ，Ｆｒａｎｃｅから入手）にライゲートする。ＧＭ１
７培地上３０℃にて培養したＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１５４，１−９，１９８３）をＤｅ Ｖｏｓら
（Ｇｅｎｅ，８５，１６９−１７６，１９８９）の方法
によりトランスフォームする。トランスフォームされた
クローンを、クローンのゲノムＤＮＡと配列番号：１
５, １６, １７, １８および１９の配列を有するプロー
ブの一つとのハイブリダイゼーションにより選択する。
４００個のトランスフォーマント中、６つの陽性クロー
ンが選択され、その一つが図１Ｃに示すｐＦＳ１０１と
呼ばれるプラスミドを含有する。
【００９２】プラスミドｐＦＳ１０１が組換えＥＰＳの
産生を誘導できるか否かを決定するために、Ｌ．ｌａｃ
ｔｉｓ株ＭＧ１３６３をｐＦＳ１０１でトランスフォー
ムし、ルテニウムレッド固体培地上に直接プレートアウ
トする。比較のために、プラスミドｐＪＩＭ２２７９で
トランスフォームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３
６３をついでルテニウムレッド固体培地上に直接プレー
トアウトする。結果はｐＪＩＭ２２７９を含むコロニー
がすべて赤い表現型〔３０００ＥＰＳ（−）コロニー〕
であるが、ｐＦＳ１０１を含有するコロニーの９９．５
％以上が白色の表現型〔８００ＥＰＳ（＋）コロニー、
２コロニーを除く〕を示す。したがって、ｐＦＳ１０１
でトランスフォームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株ＭＧ１３
６３は組換えＥＰＳを産生する。
産生を誘導できるか否かを決定するために、Ｌ．ｌａｃ
ｔｉｓ株ＭＧ１３６３をｐＦＳ１０１でトランスフォー
ムし、ルテニウムレッド固体培地上に直接プレートアウ
トする。比較のために、プラスミドｐＪＩＭ２２７９で
トランスフォームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３
６３をついでルテニウムレッド固体培地上に直接プレー
トアウトする。結果はｐＪＩＭ２２７９を含むコロニー
がすべて赤い表現型〔３０００ＥＰＳ（−）コロニー〕
であるが、ｐＦＳ１０１を含有するコロニーの９９．５
％以上が白色の表現型〔８００ＥＰＳ（＋）コロニー、
２コロニーを除く〕を示す。したがって、ｐＦＳ１０１
でトランスフォームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株ＭＧ１３
６３は組換えＥＰＳを産生する。
【００９３】ｐＦＳ１０１でトランスフォームされた
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３のＥＰＳの産生は生
物体をＭＡＭ培地中、ｐＨ５．５、３０℃において、６
０ｒｐｍで電磁攪拌しながら培養することによって行わ
れる。組換えＥＰＳは培養培地を４０％のトリクロロ酢
酸と混合し、混合物を８０００ｇで２０分間遠心分離
し、沈殿を等容量のアセトンと混合し、混合物を４℃で
１２時間インキュベートし、混合物を１００００ｇで１
時間沈殿させ、沈殿を水中に懸濁させ混合物のｐＨを７
に調整し、水に対して２４時間透析し、１００，０００
ｇで１時間超遠心し、上清を回収し、上清を凍結乾燥さ
せる。比較のために、ｐＪＩＭ２２７９でトランスフォ
ームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３を同一条
件で培養し、同様にして糖を単離する。
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３のＥＰＳの産生は生
物体をＭＡＭ培地中、ｐＨ５．５、３０℃において、６
０ｒｐｍで電磁攪拌しながら培養することによって行わ
れる。組換えＥＰＳは培養培地を４０％のトリクロロ酢
酸と混合し、混合物を８０００ｇで２０分間遠心分離
し、沈殿を等容量のアセトンと混合し、混合物を４℃で
１２時間インキュベートし、混合物を１００００ｇで１
時間沈殿させ、沈殿を水中に懸濁させ混合物のｐＨを７
に調整し、水に対して２４時間透析し、１００，０００
ｇで１時間超遠心し、上清を回収し、上清を凍結乾燥さ
せる。比較のために、ｐＪＩＭ２２７９でトランスフォ
ームされたＬ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３を同一条
件で培養し、同様にして糖を単離する。
【００９４】中性糖の総量はＤｕｂｏｉｓら（Ａｎａ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２８，３５０−３５６，１９５６）の
方法によって測定する。結果は、ｐＦＳ１０１でトラン
スフォームされた株がグルコース当量で表して１０ｍｇ
／ｍｌの糖を産生するのに対し、ｐＪＩＭ２２７９でト
ランスフォームされた株では痕跡（＜１ｍｇ／ｌ）の糖
を産生するにすぎない。
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２８，３５０−３５６，１９５６）の
方法によって測定する。結果は、ｐＦＳ１０１でトラン
スフォームされた株がグルコース当量で表して１０ｍｇ
／ｍｌの糖を産生するのに対し、ｐＪＩＭ２２７９でト
ランスフォームされた株では痕跡（＜１ｍｇ／ｌ）の糖
を産生するにすぎない。
【００９５】組換えＥＰＳの分子量は予め市販のデキス
トラン（Ｓｉｇｍａ）２×１０6 〜５×１０3 ダルトン
（Ｄａ）で検量したＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）に接続したＳｕｐｅｒｏｓｅ−６（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）ゲルろ過カラム上クロマトグラフィーによって
評価する。この目的では、２５０μｇの中性糖からなる
サンプル０．２５〜１ｍｌをカラムに適用し、流速０．
５ｍｌ／分の５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２で溶出す
る。比較のためにｐＪＩＭ２２７９でトランスフォーム
された株によって産生された糖も同様に分離する。図２
に示す結果は、ｐＪＩＭ２２７９でトランスフォームさ
れた株は明らかに細胞壁に由来する異種ポリサッカライ
ドを少量（２〜０．５×１０6 Ｄａ；分画８〜１５）お
よび低分子量のオリゴサッカライド（モノおよびジサッ
カライド；分画２０〜２２）を大量に産生する。これに
対し、ｐＦＳ１０１でトランスフォームされた株では高
分子量の組換えＥＰＳ約２×１０6 Ｄａ（分画９）が明
らかに認められる。
トラン（Ｓｉｇｍａ）２×１０6 〜５×１０3 ダルトン
（Ｄａ）で検量したＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）に接続したＳｕｐｅｒｏｓｅ−６（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）ゲルろ過カラム上クロマトグラフィーによって
評価する。この目的では、２５０μｇの中性糖からなる
サンプル０．２５〜１ｍｌをカラムに適用し、流速０．
５ｍｌ／分の５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２で溶出す
る。比較のためにｐＪＩＭ２２７９でトランスフォーム
された株によって産生された糖も同様に分離する。図２
に示す結果は、ｐＪＩＭ２２７９でトランスフォームさ
れた株は明らかに細胞壁に由来する異種ポリサッカライ
ドを少量（２〜０．５×１０6 Ｄａ；分画８〜１５）お
よび低分子量のオリゴサッカライド（モノおよびジサッ
カライド；分画２０〜２２）を大量に産生する。これに
対し、ｐＦＳ１０１でトランスフォームされた株では高
分子量の組換えＥＰＳ約２×１０6 Ｄａ（分画９）が明
らかに認められる。
【００９６】組換えＥＰＳの糖組成はＮｅｅｓｅｒら
（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４２，５８−６７，
１９８４）の方法によってガスクロマトグラフィーで測
定する。結果は、ｐＦＳ１０１でトランスフォームされ
た株の培養培地には、モル比でＧｌｃ：Ｇａｌが１：３
で含まれる。細胞壁に由来する痕跡のラムノースが検出
される。これに対し、ＧａｌＮａｃは検出されない。
（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４２，５８−６７，
１９８４）の方法によってガスクロマトグラフィーで測
定する。結果は、ｐＦＳ１０１でトランスフォームされ
た株の培養培地には、モル比でＧｌｃ：Ｇａｌが１：３
で含まれる。細胞壁に由来する痕跡のラムノースが検出
される。これに対し、ＧａｌＮａｃは検出されない。
【００９７】ｐＦＳ１０１でトランスフォームされた
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３によって産生される
ＥＰＳの組成は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株 Ｃ
ＮＣＭＩ−１５９０によって産生されるＥＰＳの組成と
は異なる。組換えＥＰＳの構造は、ＧａｌＮａｃがガラ
クトースによって置換されている以外は、株 ＣＮＣＭ
Ｉ−１５９０のＥＰＳの構造と同じであると考えるの
が妥当である。
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ株 ＭＧ１３６３によって産生される
ＥＰＳの組成は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株 Ｃ
ＮＣＭＩ−１５９０によって産生されるＥＰＳの組成と
は異なる。組換えＥＰＳの構造は、ＧａｌＮａｃがガラ
クトースによって置換されている以外は、株 ＣＮＣＭ
Ｉ−１５９０のＥＰＳの構造と同じであると考えるの
が妥当である。
【００９８】
（１）配列番号：１ 配列の長さ：１４６０２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３５２．．１８０３ 他の情報：／産物＝”ｅｐｓＡ” 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１８０７．．２５３５ 他の情報：／産物＝”ｅｐｓＢ" 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２５４７．．３２３９ 他の情報：／産物＝”ｅｐｓＣ" 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３２４９．．３９９５ 他の情報：／産物＝”ｅｐｓＤ" 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４０５１．．４７３１ 他の情報：／産物＝”ｅｐｓＥ" 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４８９８．．５８５４ 他の情報：／産物＝”ｅｐｓＦ" 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：６４２５．．７５４０ 他の情報：／産物＝”ｅｐｓＧ" 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：７７３６．．８２１２ 他の情報：／産物＝”ｅｐｓＨ" 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：８２２１．．９１９２ 他の情報：／産物＝”ｅｐｓＩ" 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：９２８５．．１０３６４ 他の情報：／産物＝”ｅｐｓＪ" 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１０３９２．．１１３３９ 他の情報：／産物＝”ｅｐｓＫ" 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ．ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１１３０２．．１２２２２ 他の情報：／産物＝ヌクレオチド１０３９２−１１３３
９ＣＤＳ（ｅｐｓＫ）を包含するＣＤＳ（ｅｐｓＬ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１２２３３．．１３６５１ 他の情報：／産物＝”ｅｐｓＭ" 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ．ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１３７３２．．１４３０５ 他の情報：／”機能＝相補鎖上ＣＤＳ"／産物＝”ｏｒ
ｆｚ" 配列の特徴 特徴を表す記号：ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ 存在位置：２３０．．２５２ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ 存在位置：２７４．．３０２ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＲＢＳ 存在位置：３４０．．３４５ 配列
９ＣＤＳ（ｅｐｓＫ）を包含するＣＤＳ（ｅｐｓＬ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１２２３３．．１３６５１ 他の情報：／産物＝”ｅｐｓＭ" 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ．ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１３７３２．．１４３０５ 他の情報：／”機能＝相補鎖上ＣＤＳ"／産物＝”ｏｒ
ｆｚ" 配列の特徴 特徴を表す記号：ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ 存在位置：２３０．．２５２ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ 存在位置：２７４．．３０２ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＲＢＳ 存在位置：３４０．．３４５ 配列
【００９９】
【化８】
【０１００】
【化９】
【０１０１】
【化１０】
【０１０２】
【化１１】
【０１０３】
【化１２】
【０１０４】
【化１３】
【０１０５】
【化１４】
【０１０６】
【化１５】
【０１０７】
【化１６】
【０１０８】
【化１７】
【０１０９】
【化１８】
【０１１０】
【化１９】
【０１１１】
【化２０】
【０１１２】
【化２１】
【０１１３】
【化２２】
【０１１４】（２）配列番号：２ 配列の長さ：４８４アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１１５】
【化２３】
【０１１６】
【化２４】
【０１１７】（３）配列番号：３ 配列の長さ：２４３アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１１８】
【化２５】
【０１１９】（４）配列番号：４ 配列の長さ：２３１アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１２０】
【化２６】
【０１２１】（５）配列番号：５ 配列の長さ：２４９アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１２２】
【化２７】
【０１２３】（６）配列番号：６ 配列の長さ：２２７アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質
【０１２４】
【化２８】
【０１２５】（７）配列番号：７ 配列の長さ：３１９アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１２６】
【化２９】
【０１２７】（８）配列番号：８ 配列の長さ：３７２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１２８】
【化３０】
【０１２９】（９）配列番号：９ 配列の長さ：１５９アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１３０】
【化３１】
【０１３１】（１０）配列番号：１０ 配列の長さ：３２４アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１３２】
【化３２】
【０１３３】（１１）配列番号：１１ 配列の長さ：３６０アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１３４】
【化３３】
【０１３５】（１２）配列番号：１２ 配列の長さ：３１６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１３６】
【化３４】
【０１３７】（１３）配列番号：１３ 配列の長さ：４７３アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１３８】
【化３５】
【０１３９】
【化３６】
【０１４０】（１４）配列番号：１４ 配列の長さ：３０７アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１４１】
【化３７】
【０１４２】（１５）配列番号：１５ 配列の長さ：３２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ｄｅｓｃ＝”ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ”） 配列
ｌｅｏｔｉｄｅ”） 配列
【０１４３】
【化３８】
【０１４４】（１６）配列番号：１６ 配列の長さ：３０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ｄｅｓｃ＝”ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ”） 配列
ｌｅｏｔｉｄｅ”） 配列
【０１４５】
【化３９】
【０１４６】（１７）配列番号：１７ 配列の長さ：３１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ｄｅｓｃ＝”ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ”） 配列
ｌｅｏｔｉｄｅ”） 配列
【０１４７】
【化４０】
【０１４８】（１８）配列番号：１８ 配列の長さ：３１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ｄｅｓｃ＝”ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ”） 配列
ｌｅｏｔｉｄｅ”） 配列
【０１４９】
【化４１】
【０１５０】（１９）配列番号：１９ 配列の長さ：３１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ｄｅｓｃ＝”ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ”） 配列
ｌｅｏｔｉｄｅ”） 配列
【０１５１】
【化４２】
【図１】図１Ａ：Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株ＣＮ
ＣＭ Ｉ−１５９０のＥＰＳの生合成に関与するオペロ
ンの物理的地図。プロモーターおよびターミネーターは
それぞれ、旗およびヘアピンで示す。縦の矢印はトラン
スポゾンＴｎ９１６の挿入部位の位置を指示する。水平
の矢印は可能性のあるオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）の存在を指示する。ＯＲＦに相当する遺伝子
の名称はその矢印の下に表示する。制限酵素は略号によ
り示す（Ｓ＝ＳａｃＩ；Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩＩ；Ｅ＝Ｅ
ｃｏＲＩ；Ｂ＝ＢａｍＨＩ）。 図１Ｂ：１１ｐＦＳベクター中に存在する株 ＣＮＣＭ
Ｉ−１５９０の染色体インサートの表示。Ｐ１，Ｐ２
およびＰ３はスクリーニング時に用いられるプローブの
位置を指示する。 図１Ｃ：ｐＪＩＭ２２７９中にクローニングされるＳａ
ｃＩからＢａｍＨＩ制限部位までの全ｅｐｓオペロンか
らなるゲノムインサートｐＦＳ１０１の表示。
ＣＭ Ｉ−１５９０のＥＰＳの生合成に関与するオペロ
ンの物理的地図。プロモーターおよびターミネーターは
それぞれ、旗およびヘアピンで示す。縦の矢印はトラン
スポゾンＴｎ９１６の挿入部位の位置を指示する。水平
の矢印は可能性のあるオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）の存在を指示する。ＯＲＦに相当する遺伝子
の名称はその矢印の下に表示する。制限酵素は略号によ
り示す（Ｓ＝ＳａｃＩ；Ｈ＝Ｈｉｎｄ ＩＩＩ；Ｅ＝Ｅ
ｃｏＲＩ；Ｂ＝ＢａｍＨＩ）。 図１Ｂ：１１ｐＦＳベクター中に存在する株 ＣＮＣＭ
Ｉ−１５９０の染色体インサートの表示。Ｐ１，Ｐ２
およびＰ３はスクリーニング時に用いられるプローブの
位置を指示する。 図１Ｃ：ｐＪＩＭ２２７９中にクローニングされるＳａ
ｃＩからＢａｍＨＩ制限部位までの全ｅｐｓオペロンか
らなるゲノムインサートｐＦＳ１０１の表示。
【図２】ｐＦＳ１０１またはｐＪＩＭ２２７９でトラン
スフォームしたＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
株 ＭＧ１３６３によって産生された糖からなるゲルろ
過クロマトグラフィーのフラクションの４８５ｎｍにお
ける光学密度のグラフ。フラクション９：２×１０6 ダ
ルトン（Ｄａ）；フラクション１１〜１３：５×１０5
Ｄａ；フラクション１４〜１６：７．２×１０4 Ｄａ；
フラクション１７〜１８：４×１０4 Ｄａ；フラクショ
ン１９以上：＜５×１０3 Ｄａ。
スフォームしたＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
株 ＭＧ１３６３によって産生された糖からなるゲルろ
過クロマトグラフィーのフラクションの４８５ｎｍにお
ける光学密度のグラフ。フラクション９：２×１０6 ダ
ルトン（Ｄａ）；フラクション１１〜１３：５×１０5
Ｄａ；フラクション１４〜１６：７．２×１０4 Ｄａ；
フラクション１７〜１８：４×１０4 Ｄａ；フラクショ
ン１９以上：＜５×１０3 Ｄａ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:46）
Claims (13)
- 【請求項１】 リピート構造 【化１】 （式中、ｎは＞１であり、Ａはβ−Ｄ−Ｇａｌｐ、β−
Ｄ−Ｇｌｃｐならびにそれらのアセチルおよびホスファ
チル誘導体からなる群より選ばれ、ｘおよびｙは２，
３，４，５または６である。ただしｘ＝ｙではない）を
有するエキソポリサッカライド（以下、エキソポリサッ
カライドをＥＰＳともいう）の生合成に関与する少なく
とも１種の酵素をコードする染色体起源の乳酸菌ＤＮ
Ａ。 - 【請求項２】 リピート構造 【化２】 を有するＥＰＳの生合成に関与する少なくとも１種の酵
素をコードする「請求項１」に記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号：１の核酸配列からなる「請求
項１」に記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列番号：１の核酸配列中ヌクレオチド
３５２〜１８０３,１８０７〜２５３５, ２５４７〜３
２３９, ３２４９〜３９９５, ４０５１〜４７３１, ４
８９８〜５８５４, ６４２５〜７５４０, ７７３６〜８
２１２, ８２２１〜９１９２, ９２８５〜１０３６４，
１０３９２〜１１３３９，１１３０２〜１２２２２およ
び１２２３３〜１３６５１によって区切られた遺伝子の
群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子からなる「請求
項２」に記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 「請求項３および４」のいずれかに記載
のＤＮＡと相同であるかまたはそれとハイブリダイズす
る「請求項２」に記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】 「請求項１〜５」の一つに記載のＤＮＡ
からなる組換えベクター。 - 【請求項７】 リピート構造 【化３】 を有するＥＰＳの生合成に関与可能であって、配列番
号：２，配列番号：３，配列番号：４，配列番号：５，
配列番号：６，配列番号：７，配列番号：８，配列番
号：９，配列番号：１０，配列番号：１１，配列番号：
１２，配列番号：１３および配列番号：１４の配列なら
びにそれらの機能性相同配列からなる群より選ばれるア
ミノ酸配列をもつタンパク質。 - 【請求項８】 「請求項１」に記載のＤＮＡフラグメン
トをゲノムにインテグレートされてまたは複製可能なプ
ラスミドの補助により有する乳酸菌。 - 【請求項９】 （１）「請求項７」に記載のＥＰＳの生
合成に関与する酵素をコードするＤＮＡフラグメント
を、宿主細胞内での自動複製または宿主細胞へのインテ
グレートを可能にする配列からなるベクター中にクロー
ニングし、（２）宿主細胞を上記ベクターでトランスフ
ォームし、（３）トランスフォームされた宿主細胞をＥ
ＰＳの産生に適当な条件下に培養するＥＰＳの製造方
法。 - 【請求項１０】 ベクターはさらに、宿主細胞中で機能
性のプロモーター配列および翻訳アクティベーター配列
からなる「請求項９」に記載の方法。 - 【請求項１１】 （１）ＥＰＳの生合成に関与する少な
くとも１種の酵素をコードするＤＮＡフラグメントをベ
クター中にクローニングし、（２）他のＥＰＳを必要に
応じて産生する乳酸菌を上記ベクターでトランスフォー
ムし、（３）トランスフォームされた乳酸菌を次いで新
たなＥＰＳの産生に適当な条件下に培養するＥＰＳの製
造方法。 - 【請求項１２】 「請求項２〜５」の一つに記載のＤＮ
Ａフラグメントをベクター中にクローニングする「請求
項９〜１１」の一つに記載の方法。 - 【請求項１３】 少なくとも１５ｂｐを有する配列番
号：１の配列のＤＮＡフラグメントまたはその相補性配
列鎖からなる、ＰＣＲ反応に使用可能なプライマーまた
はＥＰＳの生合成に関与する乳酸菌の遺伝子のインビト
ロ検出もしくはインビボ不活性化のためのプローブ。
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|---|---|---|---|
| EP95201669A EP0750042A1 (fr) | 1995-06-20 | 1995-06-20 | Bactéries lactiques produisant des exopolysaccharides |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| EP (1) | EP0750042A1 (ja) |
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| AU (1) | AU709636B2 (ja) |
| CA (1) | CA2169201A1 (ja) |
| DE (1) | DE69521034D1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2008053588A1 (fr) | 2006-10-27 | 2008-05-08 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Gène régulateur de la production de cytokines et utilisation de celui-ci |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0957170A1 (fr) * | 1998-04-22 | 1999-11-17 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Identification de gènes de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus Lfi5 impliqués dans la biosynthèse d'exopolysaccharides |
| EP0957168A1 (fr) * | 1998-04-22 | 1999-11-17 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Identification de gènes de Streptococcus thermophilus Sfi39 impliqués dans la biosynthèse d'exopolysaccharides |
| WO1999062316A2 (fr) * | 1998-04-22 | 1999-12-09 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Identification de genes de bacteries lactiques impliques dans la biosynthese d'exopolysaccharides |
| EP0957169A1 (fr) * | 1998-04-22 | 1999-11-17 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Identification de gènes de Lactobacillus helveticus LH59 impliqués dans la biosynthèse d'exopolysaccharides |
| HU228700B1 (en) | 1998-07-22 | 2013-05-28 | Stichting Dienst Landbouwkundi | Streptococcus suis vaccines and diagnostic tests |
| IL130303A0 (en) | 1999-06-03 | 2000-06-01 | M G Novobiotech Ltd | A bacterial strain processed plant extracts and probiotic compositions for human and veterinary use |
| AU2001239737B9 (en) * | 2000-02-02 | 2007-03-22 | The State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University | Biopolymer thickener |
| EP1205552A1 (en) * | 2000-11-09 | 2002-05-15 | ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. | Virulence of streptococci, involving ORFs from Streptococcus suis |
| WO2002061070A2 (en) * | 2001-02-02 | 2002-08-08 | Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. | Environmentally regulated genes, involved in the virulence of streptococcus suis |
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| US8038654B2 (en) * | 2007-02-26 | 2011-10-18 | Becton, Dickinson And Company | Syringe having a hinged needle shield |
| EP2023143A1 (en) * | 2007-08-06 | 2009-02-11 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Immunogenic streptococcus proteins |
| GB0914878D0 (en) * | 2009-08-26 | 2009-09-30 | Plant Bioscience Ltd | Competetive exclusion compositions and methods |
| CN109182186B (zh) * | 2018-09-19 | 2022-02-01 | 内蒙古大学 | 一种乳酸菌胞外多糖及免疫佐剂 |
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|---|---|---|---|---|
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| WO1988000948A1 (en) * | 1986-07-28 | 1988-02-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Method to control and produce novel biopolymers |
| US5133978A (en) | 1990-08-03 | 1992-07-28 | Sing Wesley D | High viscosity bacterial compositions and methods |
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- 1995-12-28 AT AT95203663T patent/ATE201447T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-12-28 DE DE69521034T patent/DE69521034D1/de not_active Expired - Lifetime
-
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- 1996-02-05 AU AU43354/96A patent/AU709636B2/en not_active Ceased
- 1996-02-06 US US08/597,236 patent/US5733765A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-09 CA CA002169201A patent/CA2169201A1/en not_active Abandoned
- 1996-02-13 NZ NZ280974A patent/NZ280974A/en unknown
- 1996-02-28 JP JP04163596A patent/JP3862776B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-14 US US08/746,682 patent/US5786184A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008053588A1 (fr) | 2006-10-27 | 2008-05-08 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Gène régulateur de la production de cytokines et utilisation de celui-ci |
| US8404823B2 (en) | 2006-10-27 | 2013-03-26 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Cytokine production regulator gene and use thereof |
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| US5786184A (en) | 1998-07-28 |
| NZ280974A (en) | 1998-08-26 |
| AU4335496A (en) | 1997-01-09 |
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