KR20030010879A - 비피도박테리움 아돌레센티스에서 분리된 β-갈락토시다제유전자 - Google Patents

비피도박테리움 아돌레센티스에서 분리된 β-갈락토시다제유전자 Download PDF

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KR20030010879A
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galactosidase
int57
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bifidobacterium
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지근억
박명수
조상희
윤현진
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주식회사 비피도
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Abstract

본 발명은 비피도박테리움 베타 갈락토시다제(β- galactosidase) 유전자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57(B.adolescentisInt57)에서 분리된 베타 갈락토시다제 유전자와 상기 유전자가 삽입된 재조합 벡터, 그리고 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명에서 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57로부터 분리된 베타 갈락토시다제 유전자는 식품에 직접 적용할 수 있는 안전한 식품용 선별 마커로 사용될 수 있다.

Description

비피도박테리움 아돌레센티스에서 분리된 β-갈락토시다제 유전자{β- galactosidase gene isolated from Bifidobacterium adolescentis}
본 발명은 비피도박테리움의 β-갈락토시다제(β-galactosidase) 유전자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57(B. adolescentisInt57)로부터 분리된 β-갈락토시다제 유전자와 상기 유전자가 삽입된 재조합 벡터, 그리고 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.
비피도박테리아(Bifidobacteria)는 장내 미생물들이 적당한 균형을 이루도록 하는데 중요한 역할을 하는 균으로서, 인체에 해롭지 않아 식품 첨가물로 이용되는 식품용 미생물이다. 비피도박테리움의 발효 주요 산물은 아세테이트 및 락테이트로 이들은 3:2의 비율로 생산되며, DNA의 GC 함유율은 55 내지 64%이다. 비피도박테리움은 숙주균에 특이적인 것으로 알려졌으며, 사람에서는 비피덤(B. bifidum), 롱검(B.longum), 브레베(B. breve), 인판티스(B. infantis) 및 아돌레센티스(B. adolescentis)가 발견되고 있으며, 상기 5종류의 균주는 프로바이오틱스로 사용되고 있다. 프로바이오틱스란 인간이나 동물에 살아있는 미생물을 분말 또는 발효산물의 형태로 투여했을 때, 장내 미생물의 바람직한 균형 및 그들의 생리 특성을 증진시키며 숙주에게 유익한 효과를 나타내는 미생물 식품 강화제를 의미한다(Fuller, R.,Journal of Applied Biotechnology, 66:365-378, 1989). 이러한 비피도박테리아는 숙주의 면역기능을 강화시키고 암에 대한 저항능력을 향상시킨다고 알려져 있다(Leeet al.,Biosci Biotechnol Biochem, 57:2127-2132, 1993).
한편, 최근에는 비피도박테리아로부터 플라스미드를 분리하고 분석하여, 이를 벡터제작에 이용하는 연구들이 발표되고 있으며(Parket al.,Korean Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 26:647-654, 1999; Argnaniet al.,Microbiology, 142:109-114, 1996; Rossiet al.,Res Microbiol.147:133-143, 1996; Missichet al.,Plasmid, 32:20-211, 1994), 이러한 벡터를 제작할 때에는 선별 마커(selectable marker)의 선택이 아주 중요하다고 알려져 있다.
일반적으로 외래 유전자가 도입된 형질전환체를 선발하기 위한 선별 마커로서 암피실린(ampicillin), 테트라싸이클린(tetracycline) 또는 카나마이신(kanamycin) 등의 항생제 내성 유전자가 사용된다. 그러나, 상기 선별 마커로 사용되는 항생제 내성 유전자들은 그들의 DNA가 고유생물체(indigenous organisms)로 전이될 가능성이 있기 때문에 식품의 첨가물로 사용하기에 적합치 못한 단점을 가지고 있다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 인체에 무해한 식품용 미생물로부터 분리된 유전자를 식품용 선별 마커로 사용하려는 연구가 진행되고 있다.
본 발명자들은 인체에 무해한 새로운 식품용 선별마커를 개발하기 위하여 노력하던 중, 식품용(food-grade) 미생물인 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57(B.adolescentisInt57)로부터, 식품용 선별 마커로 사용될 수 있는 β-갈락토시다제 유전자를 분리하고, 상기 유전자가 삽입된 재조합 벡터와 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57에서 분리된 β-갈락토시다제 유전자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
도 1은 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57로부터 분리된 β-갈락토시다제 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pBIG를EcoRI으로 처리한 후, 1% 아가로스 겔 전기영동을 수행한 결과의 사진이다.
레인 M : 분자량 사이즈 마커
레인 1 :EcoRI을 처리한 클로닝 벡터 pBR322
레인 2 :EcoRI을 처리한 재조합 벡터 pBIG
도 2는 본 발명의 재조합 벡터 pBIG의 개략적인 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 재조합 벡터 pBIG에 삽입된 β- 갈락토시다제 유전자의 제한효소위치와 ORFⅠ 및 Ⅱ의 크기 및 위치를 나타낸 모식도이다.
도 4는 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57로부터 분리된 유전자와 다른 여러 종의 β- 갈락토시다제 유전자와의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 5는 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57과 형질전환체 BIG의 β-갈락토시다제 활성을 비교한 것이다.
도 6은 β-갈락토시다제 활성을 나타내는 단백질을 찾기 위하여, 비변성겔(native gel)에서 전기영동을 수행한 결과이다.
레인 1-3 : 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57 세포 추출액(cell free extract)
레인 M : 분자량 사이즈 마커
레인 4-5 : 형질전환체 BIG의 세포 추출액
레인 6-7 : 형질전환체 BIG의 상층액(supernatant)
도 7은 비변성 겔에서 전기영동을 수행한 후 β-갈락토시다제 활성을 나타낸 단백질의 분자량을 확인하기 위하여, SDS-PAGE를 수행한 결과이다.
레인 1: 도 6의 레인 6-7에서, 형질전환체 BIG 상층액에서 활성을 나타내는 170kDa에 해당하는 단백질 밴드를 잘라내어 일렉트로일루션을 수행한 추출액
레인 2: 분자량 사이즈 마커
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57에서 분리된, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 β-갈락토시다제 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
일반적으로 선별 마커로 사용되는 항생제 내성 유전자들은 식품에 직접 사용할 수 없는 단점을 가지고 있다. 본 발명은 식품에 안전하게 사용할 수 있도록 식품 등급용 미생물로부터 분리된 새로운 β-갈락토시다제 유전자를 제공하는데 특징이 있다. β-갈락토시다제는 이당류인 락토스(lactose)를 단당류의 글루코스(glucose)와 갈락토스(galactose)로 분해하는 효소이다. 이 특징을 이용하여 선별마커로 사용되는 데, 그 기작은 다음과 같다. 외래 유전자가 벡터에 클로닝되었을 때, 구체적으로 β-갈락토시다제를 생성하는 유전자인 lacZ를 포함하는 벡터에 클로닝되었을 때, lacZ가 불활성화되고, 이러한 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체는 β-갈락토시다제를 생성하지 못하게 된다. 그 결과, 상기 형질전환체들은 β-갈락토시다제에 의해 분해되면 푸른색을 띠게 되는 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside)을 분해하지 못하므로 흰 색을 나타내게 된다. 반면에, 외래유전자가 상기 벡터에 클로닝되지 않았을 경우에는 lacZ는 정상적으로 발현되어 β-갈락토시다제를 생성하게 되므로, 외래유전자가 클로닝되지 않은 형질전환체는 X-gal을 분해하여 푸른색을 나타내게 된다. 이처럼 외래유전자가 클로닝된 형질전환체의 색을 확인함으로써 쉽게 클로닝 여부를 판단할 수 있기 때문에 선별 마커로 사용될 수 있다.
본 발명에서는 구체적으로 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57로부터 β-갈락토시다제 유전자를 분리하였고, 본 발명자들은 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57을 2001년 7월 18일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(기탁번호: KCCM 10294). 분리된 상기 β-갈락토시다제 유전자의 크기는 3,260bp이고, G+C 함량은 29.1%로 나타났다. 염기서열을 DNASIS(HITACHI)로 분석한 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 2개의 ORFs(open reading frames)가 발견되었는데, ORFI은 분자량이 87.9kDa으로 추정되는 단백질을 암호화하고, ORFⅡ는 분자량이 32.1kDa으로 ORFI의 반대쪽 가닥에 위치하는 것으로 추정된다. ORFI 염기서열의 상부(upstream)에 있는 7-bp부분은 리보솜 결합 부위(ribosome binding site)로 예상된다. 또한, 다른 종의 β-갈락토시다제 유전자와의 상동성을 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법인 BLAST를 이용하여 비교 분석한 결과, ORFI은 다양한 미생물들의 β-갈락토시다제의 아미노산 서열과 높은 상동성을 보였고, ORFⅡ는 운송 시스템(transportsystem)에 의존하는 결합단백질의 박테리아 구성부분(bacterial components)의 아미노산 서열과 높은 상동성을 보였다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57로부터 분리된 상기 β-갈락토시다제 유전자가 삽입된 재조합벡터 pBIG를 제공한다. 도 2에 본 발명에서 제조된 재조합 벡터 pBIG의 개략적인 개열지도가 도시되어 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 인간의 장내에서 발견되는 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57의 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하여, 제한효소로, 바람직하게는EcoRI 제한효소로 절단한 후, 절단된 DNA단편들을 클로닝 벡터 pBR322에 삽입시켰다. 그리고 나서, β-갈락토시다제 활성을 보이는 콜로니를 찾아 플라스미드를 분리해 내고, 분리된 플리스미드를 pBIG로 명명하였다. 이 때 클로닝 벡터로는 자체 내 lacZ 유전자를 포함하고 있지 않은 벡터라면 제한되지 않고 사용될 수 있으나, pBR322 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.
상기에서 제조된 pBIG에 삽입된 β-갈락토시다제 유전자의 염기서열을 분석하기 위하여, 상기 벡터 pBIG를EcoRI으로 절단하여 동일한 효소로 절단된 서열분석용 벡터에 서브클로닝하였다. 이 때, 서열분석용 벡터로 pUC19, pBR322, 또는 pBluesciptⅡ 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, pUC19 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 벡터 pBIG로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 다른 실시예에서는 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57로부터 β-갈락토시다제 유전자를 분리하여 클로닝벡터 pBR322에 삽입시킨 후, 이를 대장균 균주 DH5α에 형질전환시키고, β-갈락토시다제 활성을 갖는 푸른색 콜로니로 나타나는 형질전환체를 분리하였다. 상기 형질전환체를 BIG로 명명하였다. 형질전환 숙주로 사용되는 대장균 균주로는 DH5α, TOP10, 또는 MC4100 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 특히 DH5α를 사용하는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57과 본 발명의 형질전환체의 β-갈락토시다제 발현도를 비교측정하였다. β-갈락토시다제 발현도는 당업계에서 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있으나, 구체적으로 본 발명에서는 박 등의 방법(Parket al.,Korean Journal of Applied Microbiology and Biotechnology26:647-654. 1992)으로 측정하였으며, 도 5에 도시된 바와 같이, 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57보다 본 발명의 형질전환체 BIG에서 β-갈락토시다제 발현도가 높음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57로부터 분리된 β-갈락토시다제 유전자는 안전한 식품용 마커로서 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
비피도박테리움 아돌레센티스 Int57로부터 게놈 DNA의 분리 및 클로닝 벡터로의 삽입
비피도박테리움 아돌레센티스 Int57 균주는 2001년 7월 18일자로 한국미생물보존센터에 기탁되었다(KCCM 10294). 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57로부터 당업계에 공지된 통상의 방법을 이용하여 게놈 DNA를 분리한 후,EcoRI(Promega)으로 절단하였다. 상기의 절단된 게놈 DNA의 단편들을 동일한 제한 효소로 절단된 pBR322 벡터(NEB)에 삽입시킨 후, 이를 대장균 균주 DH5α(Promega)에 삼브룩 등의 방법(Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn, 1989)으로 형질전환시켰다.
<실시예 2>
β-갈락토시다제 유전자가 삽입된 형질전환체의 선별
상기 실시예 1에서 분리된 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57의 유전자 중 β-갈락토시다제 유전자가 삽입된 균주를 선별하기 위하여, 게놈 DNA 단편들을 pBR322 벡터(NEB)에 삽입시킨 것을 50㎍/㎖ 암피실린(ampicillin)과 20mg/ml X-gal(St. Louis, USA) 용액 40㎕가 첨가된 플레이트에 도말하였고, 24시간 후 β-갈락토시다제 활성을 갖는 푸른색 콜로니 중 하나를 선택하여 BIG로 명명하였다. 또한, 상기 형질전환체 BIG로부터 당업계에서 공지된 방법으로 플라스미드를 분리하고, 이를 pBIG로 명명하였다.
<실시예 3>
pBIG의 염기서열 분석을 위한 서브 클로닝
상기 실시예 2에서 제조된 재조합 벡터 pBIG를EcoRI 제한효소로 절단한 후, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 각각 4.36kb, 1.9kb 및 1.4kb의 크기를 가지는 세 개의 DNA 단편들이 나타남을 확인하였다. 클로닝 벡터 pBR322의 크기에 해당하는 4.36kb 크기의 DNA 단편을 제외한, 1.9kb 및 1.4kb크기의 DNA 단편들을 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57로부터 분리된 β-갈락토시다제 유전자라고 추정하였다. 이들의 서열분석을 위해, 상기의 1.9kb 및 1.4kb크기의 DNA 단편들을 각각 pUC19 벡터(NEB)에 서브클로닝하여 재조합 플라스미드 pUBIGL 및 pUBIGS를 제조하였다. 또한 상기 재조합 플라스미드 pUBIGL 및 pUBIGS를 대장균 균주 DH5α에 형질전환시켜, 각각의 형질전환체 BIGL 및 BIGS를 얻었다.
<실시예 4>
pUBIGL과 pUBIGS의 염기서열 분석
상기 실시예 3에서 제작된 두 플라스미드, pUBIGL 및 pUBIGS의 염기서열을 분석하기 위하여, 서열분석 키트(Kilo-Sequencing Deletion Kit, TAKARA)를 사용하여 한 방향 결실 돌연변이(unidirectional deletion mutant)를 제조하였고, 빅다이 터미네이터 시퀀싱 시스템(BigDye terminator and ABI377 system, Perkin-Elmer)을사용하여 염기서열을 분석하였다. DNA와 아미노산 서열 분석은 각각 DNASIS와 PROSIS 프로그램 (HITACHI)으로 수행하였다.
상기 방법으로 염기서열이 분석된 두 플라스미드 pUBIGL 및 pUBIGS의 염기서열을 결합하여, 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57의 β-갈락토시다제 유전자로 추정되는 DNA 전체단편의 크기를 결정하였다. 그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, β-갈락토시다제 유전자로 추정되는 DNA의 전체크기는 3,260bp이고, G+C 함량은 59.1%임을 확인하였다. 또한, 도 3에 도시된 바와 같이, 2개의 ORF가 발견되었는데, 그 중 ORFI은 782개의 아미노산으로 구성된 87.9kDa 분자크기의 단백질을 암호화하고, 또 다른 ORF인 ORFⅡ는 287개의 아미노산으로 이루어진 32.1kDa 크기의 단백질을 암호화함을 추정할 수 있었다. 상기 ORFⅡ는 ORF I의 반대쪽 가닥에 위치하고 있는 것으로 추정된다. ORFI의 상부(upsteam)에 있는 7-bp 부분은 리보솜 결합 부위(ribosome binding site)로 추정된다.
<실시예 5>
다른 종의 β-갈락토시다제 유전자와의 아미노산 서열 상동성(homology) 비교 분석
본 발명에서 분리된, 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57의 β-갈락토시다제 유전자로 추정되는 유전자와 다른 종의 β-갈락토시다제 유전자와의 아미노산 서열 상동성(homology) 비교분석은 BLASTN, SLASTP, BLASTX 및 TBLASTN(Altschulet al.,J.Mol Biol. 215:403-410, 1990) 프로그램과 BLAST 서치용 World Wide Web서버를 이용하여 수행하였다. 관계가 있는 아미노산 서열의 복합 서열 정렬(multiple sequence alignment)은 CLUSTAL V 프로그램(Higgins,Methods Mol Biol. 25:307-318, 1994)을 사용하여 수행하였다
도 4에 도시된 바와 같이, 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57로부터 분리된 β-갈락토시다제 유전자로 추정되는 유전자와 다른 여러 종의 β-갈락토시다제 유전자와의 아미노산 서열을 비교한 결과, ORFI은 브레베(B. breve) YIT 4010, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophillus) 등 다양한 미생물들의 β-갈락토시다제 유전자와 높은 아미노산 서열 상동성(homology)을 보였고, ORFⅡ는 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이시스 코에리컬러(Streptomyces coelicolor) 등 여러 미생물들의 운송 시스템(transport system)에 의존하는 결합단백질의 박테리아 구성부분(bacterial components)과 높은 아미노산 서열의 상동성을 보임을 확인할 수 있었다. 상기 아미노산 서열의 비교결과, 본 실험에서 분리된 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57의 유전자가 β-갈락토시다제 유전자일 개연성이 높음을 확인할 수 있었다.
<실시예 6>
형질전환체 BIG, UBIGL,UBIGS의 β-갈락토시다제 활성 측정
β-갈락토시다제 활성 측정은 박 등의 방법(Parket al.,Korean Journal of Applied Microbiology and Biotechnology26:647-654. 1992)에 따라 수행하였다. 상기 실시예 3 및 4에서 얻은 각 형질전환체 BIG, UBIGL 및 UBIGS를 0.05% 시스테인 HCl이 첨가된 BHI(Difco)배지를 이용하여 37℃에서 배양하면서 각 시간대별로 1㎖씩 취했다. 이렇게 얻어진 세포들을 0.1M 인산완충용액(phosphate buffer)으로 2회 세척한 후, 동일한 버퍼 392㎕로 현탁했다. 상기 현탁액에 아세톤:부탄올=9:1의 용액 8㎕와 4mM PNPG(p-nitrophenyl-β-D glucopyranoside)를 첨가하였다. 상기 혼합액을 볼텍싱(vortexing)하여 45℃에서 15동안 반응시킨 후, 0.5M Na2CO3용액 600㎕을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 그리고 나서, 상기에서 얻어진 추출액의 흡광도를 400nm에서 측정하였다. 효소 활성 1유닛(unit)은 표준곡선(standard curve)에 따라서 1분당 1μmol의 PNP를 방출시키는 효소의 양으로 정의된다. 또한, 비활성(specific activity)은 단백질 1㎎ 당 1유닛(unit)으로 정의된다. 단백질 농도는 로우리의 방법(Lowryet al.J.Biol.chem. 193:265-271, 1951)으로 측정하였다.
상기와 같이 β-갈락토시다제 활성을 측정한 결과, 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57에서 분리된 유전자의 전체 단편이 삽입된 형질전환체 BIG에서는 효소활성이 측정되었으나, 서열분석을 위해EcoRI으로 잘려진 각 단편이 pUC19 클로닝 벡터에 삽입된 형질전환체인 UBIGL, UBIGS에서는 β-갈락토시다제 활성이 측정되지 않았다. 즉, DNA 전체단편이 삽입된 BIG에서만 β-갈락토시다제가 발현됨을 확인할 수 있었다. 이로써, 본 발명에서 분리된, 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57의 유전자(전체 단편)가 β-갈락토시다제 유전자임을 확인할 수 있었다.
<실시예 7>
비피도박테리움 아돌레센티스 Int57의 β-갈락토시다제 활성 측정
상기 실시예 6과 동일한 방법으로 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57에서 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다.
상기 실시예 6 및 7에서 측정된 형질전환체 BIG와 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57 세포 추출물의 β-갈락토시다제 활성을 비교하였다. 그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 형질전환체 BIG의 효소 활성이 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57보다 21.3배 높음을 확인할 수 있었다. 이것은 β-갈락토시다제의 발현도가 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57보다 본 발명에서 재조된 형질전환체에서 더 높다는 것을 나타내는 것이다. 상기 실험결과로 본 발명에서 제공하는 β-갈락토시다제 유전자는 선별마커로서 적합함을 확인할 수 있었다.
<실시예 8>
비피도박테리움 아돌레센티스 Int57로부터 분리된 β-갈락토시다제 단백질의 분자량 측정
본 발명자들은 PNPG(p-nitrophenyl-β-D glucopyranoside)나 ONPG(ο-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)대신 X-gal을 이용하여 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다. 데이비스의 방법(Davis, B.J.Ann NY Acad Sci. 121:404-427, 1964)에 따라 정제하지 않은 세포 추출물을 10% 비변성 겔(non-denaturingpolyacryamide gel electrophoresis)에 전기영동한 후, 0.1M 인산완충 용액(pH 6.0) 1㎖에 X-gal 80g이 녹여진 용액으로 파란색이 나올 때까지 45℃에서 염색함으로써 β-갈락토시다제 활성을 나타내는 단백질 밴드를 찾았다. 그리고 나서, β-갈락토시다제 단백질의 분자량을 알아보기 위해서, 상기 비변성 겔상에서 활성을 나타내는 단백질 밴드를 잘라내어 삼브룩 등의 방법(Sambrooket al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd edn, 1989)에 따라 일텍트로일루션을 수행하여 단백질을 추출한 후 10% SDS-PAGE를 수행하였다.
상기의 방법으로 전기영동을 수행한 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57의 세포 추출물에서는 170kDa, 350kDa크기의 강하게 염색된 단백질 밴드가, 그리고 88kDa크기의 약하게 염색된 밴드가 나타났다. 또한, BIG의 세포 추출물에서도 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57의 세포 추출물에서 나타난 바와 같은 크기의 밴드들이 나타났으나, BIG의 상층액(supernatant)에서는 170kDa 크기에 해당하는 강한 밴드만이 보였다. 그리고 나서, BIG 상층액의 170kDa 크기에 해당하는 밴드를 잘라내어 일렉트로일루션을 수행하고 단백질을 추출한 후, 이것을 10% SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과, 도 7에 도시된 바와 같이, 88kDa의 분자량을 갖는 하나의 밴드가 나타남을 확인할 수 있었다.
상기 실험 결과로 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57과 BIG 세포추출물에서 나타난 단백질은 사량체(tetramer)이고, BIG의 상층액에서 나타난 단백질은 이량체(dimer), 그리고 희미하게 보였던 88kDa크기의 밴드는 단량체(monomer)임을 추정할 수 있다. 이러한 결과는 클로닝되어 BIG에서 발현된 β-갈락토시다제의 주요분비형태가 이량체이고, 또한 분비정보를 이량체(dimer)에서 보유하고 있다는 것을 보여준다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명자들은 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57로부터 β-갈락토시다제 유전자를 분리하고, 상기 유전자가 삽입된 재조합 벡터와 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 개발하였다. 본 발명에서 비피도박테리움 아돌레센티스 Int57로부터 분리된 β-갈락토시다제 유전자는 식품에 직접 적용할 수 있는 안전한 식품용 선별 마커로 사용될 수 있다.

Claims (3)

  1. 비피도박테리움 아돌레센티스(B. adolescentis) Int57(KCCM 10294)로부터 분리된 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 β-갈락토시다제(β-galactosidase) 유전자.
  2. 제 1항의 β-갈락토시다제 유전자가 삽입된 재조합벡터 pBIG.
  3. 제2항의 재조합 벡터로 형질전환한 형질전환체.
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