KR100539064B1

KR100539064B1 - 비피도박테리움에서 외래 유전자 발현 및 분비 시스템

Info

Publication number: KR100539064B1
Application number: KR10-2003-0021296A
Authority: KR
Inventors: 지근억; 박명수
Original assignee: 주식회사 비피도
Priority date: 2003-04-04
Filing date: 2003-04-04
Publication date: 2005-12-27
Also published as: KR20040087056A

Abstract

본 발명은 인간과 동물의 장내 세균중 유익균으로 알려진 비피도 박테리아 (Bifidobacteria)에서 분리한 플라스미드 벡터인 pBES2를 이용하여 유용한 단백질을 생산하기 위한 외래 유전자 발현 벡터 시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 외래 유전자 발현을 위하여 비피도박테리움에서 유래한 알파-아밀라제 유전자 (α-amylase)의 프로모터와 리보좀 결합부위(RBS) 및 시그날시퀀스를 포함하는 신규한 벡터 및 이를 이용한 외래 유전자 발현 시스템의 개발에 관한 것이다.

본 발명은 외래 유전자를 함유하는 발현벡터를 제조한 후 이를 이용하여 비피도 박테리움을 형질전환시킴으로서 유용한 단백질의 생산을 통한 기능성 유산균 제품을 만드는 데 이용할 수 있고, 뿐 만 아니라, 알파-아밀라제 유전자의 시그날 시퀀스는 대장균에서도 외래 유전자를 외부로 분비시 유용하여 산업적 가치가 크다.

Description

비피도박테리움에서 외래 유전자 발현 및 분비 시스템{FOREIGN GENE EXPRESSION AND SECRETION SYSTEM IN THE GENUS BIFIDOBACTERIUM}

본 발명은 인간과 동물의 장내 세균중 유익균으로 알려진 비피도 박테리아 (Bifidobacteria)에서 분리한 플라스미드 벡터인 pBES2를 이용하여 유용한 단백질을 생산하기 위한 외래 유전자 발현 벡터 시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 외래 유전자 발현을 위하여 비피도박테리움에서 유래한 알파-아밀라제 유전자 (α-amylase)의 프로모터와 리보좀 결합부위(RBS) 및 시그날시퀀스를 포함하는 신규한 벡터 및 이를 이용한 외래 유전자 발현 시스템에 관한 것이다.

비피도박테리움은 인간, 동물, 곤충 등의 장내에서 살아가는 미생물로 티시어(Tissier)에 의해 처음으로 발견되었다. 비피도박테리움은 그람양성, 절대혐기성, GC-rich 등의 특성을 가지며 모유아의 장내의 우세균총으로 발견된다. 비피도박테리아는 잘 알려진 유산균 계열인 락토바실라이(lactobacilli), 락토코카이 (lactococci)등 과는 다른 액시토마이세스 (Actinomycetes)계열로 코리네박테리아(Corynebacteria) 나 스트렙토마이세스(Streptomyces), 미코박테리아(Mycobacteria) 등과 분류학적으로 가깝게 위치한다. 또한 유산 생성균주로써 대사산물로 젖산:아세트산을 3:2비율로 생산하며, pH의 조절을 통해 외래 침입 병원균을 막아주는 역할을 한다. 이러한 특성들은 장내 정상균총의 균형을 유지하는데 주요 역할을 하는 것으로 알려졌다. 비피도박테리움으로 발효한 우유를 섭취하였을 때 유당불내증을 완화시키는 작용이 있고, 최근 연구에 따르면 콜레스테롤의 저하, 면역기능 강화, 항암활성 등 의 유용한 기능이 알려져 있다. 또한 장 점막에 흡착력이 우수하며 세계적으로 관심이 증가하고 있으며 비피도박테리움을 이용한 유제품개발에 열기가 높아가고 있다.

현재까지 비피도박테리움의 연구방향은 균주의 동정 및 계수, 스크리닝 방법 개발, 내산, 내담즙성, 박테리오신 등을 분비하는 균주의 스크리닝, 균주 자체 생화학적 특성 분석, 비피도박테리움 유래의 프라스미드 분석과 특징적인 효소의 클로닝 및 생화학적 분석 등이 주류를 이루고 있다. 또한 인간과 동물의 장내에 서식하는 젖산 균주들에서 유전자의 발현과 벡터 시스템의 개발 및 유전적 특성에 관한 연구가 발표되고 있으며 특별히 유산균주 중에서 락토코카이(lactococci), 락토바실라이(lactobacilli) 등의 유산균 분야에서 활발히 연구가 진행되고 있다.

1970년대 락토코카이(lactococci)에서 유용한 기능을 코딩하고 있는 플라스미드가 동정되고 분석되었으며, 1980년대 유전자 재조합 기술의 발달과 함께 유산균주 들의 대사에 관련된 여러 유전자가 분석되었다. 이 시기부터 유산균에서 분자생물학적 수준에서의 연구가 시작되기 시작하였다. 유산균주와 장내세균들의 축적된 이해를 바탕으로 공업적으로 좀더 효율적인 균주의 개량과 돌연변이 연구가 계속적으로 진행되어 왔다. 일반적으로 장내세균에서 플라스미드가 많이 발견되고 있지만 비피도박테리움에서는 드물게 발견되며 발견되는 것들은 대부분 작은 크기의 플라스미드를 보유하는 것으로 알려져 있다.

현재 유산균에서는 플라스미드 벡터를 이용하여 IL-2, lL-12, 성장인자 (growth factor), 박테리오신 (bacteriocin) 등 다양한 유용한 단백질 생산한다. 이는 기존의 E. coli에서 단백질발현 시스템을 유산균으로 전환시킨 것으로 식품화 가능한 단백질 생산의 가능성을 제시하고 있다. 그러나 유산균 계열에 비하여 비피도박테리아 (Bifidobacteria)는 장 점막세포를 자극하는 성질이 우수하여 뛰어난 면역활성 기능을 갖는 것으로 보고 되고 있다.

비피도박테리움에서 플라스미드를 보유하는 것으로 알려진 균주는 B. breve, B. longum, B. asteroides, B. indicum, B. globosum 등이 있다. 그러나 비피도박테리움에서 발견되는 플라스미드들이 가지는 기능은 아직 명확하지는 않으며 좀 더 연구가 필요하다. 비피도박테리움에서 플라스미드의 연구는 스고바티 비 일동(Sgorbati B et al.)에 의하여 시작되었다. B. longum, B. asteroides 에서는 다중 플라스미드가 일반적으로 발견되며 B. globosum, B. indicum의 약 60 %는 하나의 플라스미드를 보유하고 있다. B. longum에서 약 123 균주의 플라스미드 특징을 서던 블로팅 (Southern blotting)으로 분석하였을 때 유사한 구조를 이루고 있음이 확인 되었다(Sgorbati B et al. 1982). 그 플라스미드 중 pMB1 (1.9 Kb)이 B. longum에서 분리되었으며 분석되었다. 또한 E. coli 와의 셔틀벡터로 pMR3, pDG7이 만들어 졌으며 암피실린(ampicillin), 크로람페니콜(chloramphenicol) 저항 유전자를 보유하고 있다(Matteuzzi D. 1990). pRM2 역시 E. coli-B. longum 셔틀벡터로 엔테로코칼 스펙티노마이신(enterococcal spectinomycin) 저항 유전자를 보유하고 있다(Missich R. 1994). pMB1 레플리콘(replicon)을 바탕으로 pLF5 (chloramphenicol), pCLJ15(erythromycin), pSPEC1(spectinomycin) 등이 개발되었다. 현재 우리나라에서는 B. longum KJ로부터 pKJ50, pKJ36 이 스크리닝 되었으며 셔틀벡터인 pMS50, pMS36으로 구축되었다. (Park et al. 1997)

현재까지 비피도박테리아에서 트랜스알돌라제 (transaldolase), α-glucosidase(알파-글루코시다제), 베타-갈락토시다제(β-galactosidase), 포스포트랜스아세틸라제(phosphotransacetylase), 프럭토즈-6-포스패이트(fructose-6-phosphate) 포스포케토라제(phosphoketolase), L-락테이트 디하이드로게나제(L-lactate dehydrogenase), 담즙산염 하이드로라제(bile salt hydrolase) 등이 클로닝되고 분석되었다. 또한 강력한 프로모터 (strong promoter)를 보유하는 유전자의 프로모터를 이용하여 다른 유전자의 발현에 이용하는 것으로, 베타-갈락토시다제 (β-galactosidase) 유전자로부터 프로모터 부분을 분석한 후 자가 클로닝을 하여 유당을 유일한 탄소원으로 이용할 수 없는 영양요구체 비피도박테리아에서 유당을 이용할 수 있게 한 연구가 있었다. (Nucleotide sequence, expression and transcriptional analysis of the Bifidobacterium longum MB 219 lacZ gene. Rossi M, Altomare L, Gonzalez Vara y Rodriguez A, Brigidi P, Matteuzzi D. Arch Microbiol 2000 Jul-Aug;174(1-2):74-80 ). 그러나 아직까지 비피도박테리아에서 외래 유전자 발현에 관한 연구는 보고 되고 있지 않다.

본 발명은 비피도 박테리움에서 유래한 알파-아밀라제 서열, 이의 프로모터 및 시그날 시퀀스 부분의 염기서열을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 알파-아밀라제 유전자의 시그날 시퀀스를 포함하는 외래 유전자 분비용 카세트를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 프로모터, 시그날 시퀀스 및 리보좀 결합 부위를 클로닝하여 이를 비피도 박테리아에서 분리한 셔틀벡터인 pBES2에 도입한 신규한 발현 벡터인 pBESAF1를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 발현벡터에 바실러스 유래 피타제(Phytase)를 융합시킨 신규한 발현벡터인 pBESAF1-PHY를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 아밀라제 시스날 시퀀스를 이용한 대장균용 분비벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 프로모터, 시그날 시퀀스 및 리보좀 결합 부위를 클로닝하여 이를 비피도 박테리아에서 분리한 셔틀벡터인 pBES2에 도입한 신규한 발현 벡터인 pBESAF2를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 발현벡터에 대장균 유래 피타제(Phytase)를 융합시킨 신규한 발현벡터인 pBESAF2-appA를 제공하는데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 벡터로 형질 전환된 미생물체에서 유용한 외래 유전자를 발현케 하는 유용한 외래 유전자의 생산방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 서열 1, 2, 3에 개시된 바와 같이 비피도 박테리움에서 클로닝한 알파-아밀라제유전자, 프로모터 유전자, 시그날 시퀀스를 포함하는 유전자를 제공한다.

알파-아밀라제유전자의 염기서열을 결정하기 위하여 특허출원 제 2001-0009526호에 개시된 바와 같이 B. adolescentis Int-57 (KCCM10294) 유래의 아밀라아제를 클로닝하였고 제한효소지도 작성과 서브클로닝을 통하여 pYBamy59를 제조하였으며 아밀라제역가를 나타내는 2.5kb (BamHI-XbaI) 부분을 pUC19의 BamHI-XbaI 자리에 도입하고 엑소뉴클라아제 III(exonuclease III)로 처리하여 결실 돌연변이 플라스미드들을 얻은 후 이들을 각각 공지의 방법으로 시퀀싱(sequencing)하여 염기서열을 결정하였다. 그 결과 아밀라아제를 포함하는 부분은 2,477pb이고 G+C 함량은 53.5%로 나타났으며 1,785bp(691bp-2,475bp)의 ORF를 보여주었다. 염기서열을 BLAST로 GenBank의 다른 유전자와의 상동성을 분석한 결과는 아래 표와 같다.

비피더스 아밀라아제의 상동성 분석결과

균 주	상동성(identity;%)	유사성(similarity;%)	accession number
Streptococcus bovis	44	60	BAA24177
Bacillus subtilis	41	58	BAA31528
Bacillus subtilis	40	58	AAF14358

또한, 아밀라아제 아미노산서열을 분비신호 예측 프로그램 (/)을 이용하여 분석하여 본 결과 42-44번째 아미노산 (AQAS)부근으로 예측되었다.

본 발명은 비피도 박테리아에서 분리하여 개발한 플라스미드 벡터인 pBES2에 상기한 알파-아밀라제 유전자를 클로닝하여 pYBamy59 벡터를 제작한 후 이를 주형으로 하고, 프로모터 부분, 리보좀 결합 부위 및 시그날 시퀀스가 코딩된 AF1 DNA 또는 AF2 DNA를 pBES2 벡터에 클로닝하여 pBESAF1 및 pBESAF2를 각각 생성한다.

이때, 하기의 서열을 시발체로 하여 PCR(중합효소 연쇄반응)을 한다.

AF1 DNA를 클로닝하는 경우는

정방향 시발체(AF1-f) : 5' CCGAAATCTAGAGAAATACCGCAA 3'

역방향 시발체(AF1-r) : 5' ACGTTGGGTACCAAGCTTTCGCGAT 3'

이다. 이때, 정방향 시발체는 Xba I 부위가 존재하도록 디자인하고 역방향 시발체에는 Kpn I 부위가 존재하도록 디자인한다.

AF2 DNA를 클로닝하는 경우는

정방향 시발체(AF1-f) : 5' CCGAAATCTAGAGAAATACCGCAA 3'

역방향 시발체(AF2-r) :

5'CTCGCCCATGGATCCCGCCAGTCCGTAATGCTTGCG 3'

이고, 정방향 시발체는 Xba I 부위가 존재하도록 디자인하고 역방향 시발체에는 BamH I 부위가 존재하도록 디자인한다.

이들 시발체를 이용한 PCR 반응을 통하여 알파-아밀라제 유전자를 증폭한 후 이 증폭된 유전자 및 pBES2 셔틀벡터를 동일한 제한효소로 처리한 후 결합 등의 공지의 방법으로 통하여 결합 혼합물을 생성한다. 그 후 이를 대장균에 형질전환시켜서 최종적으로 본 발명의 외래 유전자 발현 시스템을 보유한 벡터 pBESAF1및 pBESAF2를 구성한다.

이때 사용된 pBES2 셔틀벡터는 특허 출원 제 2001-0009526호에 개시된 바와 같이, 상업용 E. coli 벡터인 pUC19와 B. longum MG1에서 분리한 pMG1을 PstI site로 융합시켜 구성된 셔틀벡터 pBES2이다. 이 pBES2는 약 7.6 Kb 크기이며 pUC19에서 유래한 암피실린 저항 유전자와 스테필로코코스(Staphylococcus)에서 유래한 클로람페니콜 저항유전자가 코딩되어 있다.

본 발명의 비피더스용 유전자 발현벡터(pBESAF1 및 pBESAF2)의 작동 유무를 확인하기 위하여 외래 유전자를 발현시킨다. 발현하고자 하는 외래 유전자란 인간의 단백질을 포함하여, 질병치료에 사용되거나, 또는 산업상 이용이 가능한 모든 단백질을 의미한다.

본 발명의 실시예에서는 pBESAF1의 경우는 바실러스(Bacillus) 유래의 피타제(phytase) 유전자(Genebank accession number AF292103)를 사용하여 분비 서열로 예상되는 끝부분 아래쪽인 알파-아밀라제 유전자의 리보좀 결합 부위가 포함된 약 600bp DNA 부분 이하에 외래 유전자를 융합하여 발현시킨다.

또한, pBESAF2의 경우는 대장균(E. coli) 유래의 피타제(phytase) 유전자(Genebank accession number 145283)를 사용하여 시그날 서열로 예상되는 끝부분 아래쪽인 알파-아밀라제 유전자의 리보좀 결합 부위가 포함된 약 650bp DNA 부분 이하에 외래 유전자를 융합하여 발현시킨다.

이들 유전자의 시발체를 합성한 후, 중합효소 연쇄 반응으로 이들을 증폭시키고 이와 본 발명의 외래 유전자 발현 벡터를 각각 동일한 제한 효소를 처리한 후 결합하여 외래유전자를 함유하는 발현벡터를 구성한다. 이들 결합 혼합물을 E.coli에 형질전환 시킨 후 각각의 외래 유전자가 들어있는 클론을 스크리닝하여 클론에서 플라스미드를 획득한다.

획득한 플라스미드의 외래유전자 발현 유무를 확인하기 위하여, 이들을 비피도박테리움, 대장균, 유산균, 효모 등 적당한 세포를 형질전환 시킨 후, 상기 발현벡터의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하고 유전자 발현을 분석한다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의거하여 보다 상세히 설명하면 하기와 같다. 하기의 실시 예들은 구체적인 설명을 하기 위하여 제고되는 것일 뿐이고 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

하기 실시 예에 사용된 실험방법 및 과정은 특별한 언급이 없는 한 다음의 참조 예에 따라 실시하였다.

[참조예 1]

중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)

주형 DNA 1㎕, dNTP 혼합용액(dATP, dGTP, dTTP, dCTP) 5㎕, 2배 GC 중합효소 완충용액 25㎕, 정방향 및 역방향 시발체 각각 50 pmole 및 Taq 중합효소 (LA Taq, TAKARA, Japan) 0.5㎕에 탈이온수 17.5㎕를 가하여 총 부피를 50㎕로 하여 중합효소 연쇄반응을 진행하였다.

[참조예 2]

결합 반응 (ligation)

벡터 DNA 0.5㎕, 삽입 DNA 1㎕, T4 DNA 리가제 완충용액 1㎕, 및 T4 리가제(Promega, USA) 1㎕ 에 탈이온수 6.5㎕을 첨가하여 총 부피를 10㎕로 한 후 16℃에서 12시간 결합 반응을 수행하였다.

[참조예 3]

발현 벡터의 획득

각각의 결합 혼합물을 E. coli DH5α로 CaCl₂법으로 형질전환시켜서 LB 고체배지(Luria-bertani 브로쓰에 1.5 % 아가 및 암피실린 50㎍/㎖ 포함)에 도말하여 37℃에서 12시간 정치 배양하여 형질전환체를 얻고, 이중 삽입 DNA가 들어 있는 클론을 스크리닝하여 각각의 클론에서 플라스미드 벡터를 획득하였다.

[참조예 4]

비피도 박테리움에서 피타제 유전자 발현의 분석

각각의 외래 유전자가 융합된 발현 벡터를 가지는 형질전환체를 0.05% L-시스테인을 함유한 MRS 배지에서 배양한 후 14,000 rpm에서 3분간 원심 분리하여 50 ㎕ 상층액을 수확하였다. 상층액에서의 피타제(Phytase) 활성 분석을 위하여 새 마이크로퓨지 튜브에 옮겼다.

[참조예 5]

대장균(E. coli)에서 피타제 유전자 발현의 분석

대장균 유래 피타제(Phytase) 외래 유전자가 융합된 발현 벡터를 가지는 형질전환체를 LB 배지에서 배양한 후 14,000 rpm에서 3분간 원심 분리하여 상층액을 수확하였다. 상층액에서의 피타제(Phytase) 활성 분석을 위하여 새 마이크로퓨지 튜브에 옮겼다.

[실시예 1]

pYBamy59 벡터의 형질전환 및 아밀라제 활성실험

pYBamy59 로 형질전환된 비피도박테리아에서 알파-아밀라제의 활성을 실험하기 위하여 형질전환체를 0.05% L-시스테인을 포함하는 MRS 배지에서 배양하여 4시간 간격으로 성장곡선을 작성하였고, 그에 따른 알파-아밀라제의 활성을 DNS법을 사용하여 분석하였다. 배양액을 14,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 상징액(culture broth) 및 균체(pellet)로 나누고 균체는 PBS(pH7.4)로 2회 수세한 후 PBS 400 ul에 현탁하여 초음파분쇄에 사용하였다. 초음파분쇄 후 14,000 rpm에서 3 분 동안 원심 분리하여 상징액(cell extract)과 균체파쇄물(debris)로 나누고 균체파쇄물은 PBS(pH7.4)로 2회 수세한 후 PBS 400 ul에 현탁하였다. 각각에 대하여 DNS 당 정량법을 이용하여 알파-아밀라아제의 활성을 분석하였다.

도 1 에 도시된 바와 같이, 알파-아밀라아제의 활성은 대부분이 상징액에서 보였고, 나머지 분획에서는 미미하였다. 배양 배지와 세포추출물에서의 알파-아밀라제 활성을 비교해 볼 때, 균체 밖으로 약 96%의 알파-아밀라아제 단백질이 분비되고 있음을 확인하였다. 따라서 알파-아밀라제의 분비신호 유전자에 대해 산업적으로 이용할 가치가 높은 것으로 사료된다.

[실시예 2]

비피도 박테리아 발현벡터 pBESAF1의 제조

비피도 박테리움으로부터 유래한 알파-아밀라제 유전자의 프로모터 부분과 리보좀 결합 부위 및 시그날시퀀스 부분을 pBES2에 클로닝하기 위하여 PCR하였다. 이때, PCR 주형으로 pYBamy59를 사용하였고, 사용된 시발체는 다음과 같다.

정방향 시발체(AF1-f) : 5' CCGAAATCTAGAGAAATACCGCAA 3'

역방향 시발체(AF1-r) : 5' ACGTTGGGTACCAAGCTTTCGCGAT 3'

정방향 시발체에는 Xba I site가 존재하도록 디자인하였고 역방향 시발체에는 Kpn I site가 존재하도록 디자인한 후, 참조예 1과 같은 PCR 반응을 1. 95℃에서 5분, 2. 95℃에서 30초, 3. 40℃에서 1분, 4. 72℃에서 1분 30초, 5. 72℃에서 10분, 6. 4℃로 진행 한 후 2-4번을 30번 반복하였다.

PCR 후 Wizard PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였고 Xba I 과 Kpn I 을 처리하였다. 또한, pBES2 역시 같은 제한효소로 처리하고 겔 DNA 정제 키트(gel DNA purification kit QIAXII, Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후 송아지 장에서 분리한 알칼린 포스파타제를 사용하여 탈인산화반응을 시켰다. 다음 단계로 참조예 2와 같이, 벡터 DNA 와 삽입 DNA의 결합반응을 수행하였다.

이 결합 혼합물을 참조예 3과 같이 수행하여 알파-아밀라제 유전자의 프로모터 부분, 리보좀 결합 부위 및 시그날 시퀀스가 가 코딩된 600 bp DNA 단편이 삽입되었음을 확인하였다. 최종적으로 외래 유전자 발현 시스템을 보유한 비피도박테리아 발현벡터인 pBESAF1을 구성하였다. 이는 도2에 도시된 바와 같다.

[실시예 3]

비피도 박테리아 발현벡터 pBESAF2의 제조 (도 3 참조)

정방향 시발체(AF1-f): 5' CCGAAATCTAGAGAAATACCGCAA 3'

역방향 시발체(AF2-r): 5'CTCGCCCATGGATCCCGCCAGTCCGTAATGCTTGCG 3'

정방향 시발체에는 Xba I site가 존재하도록 디자인하였고 역방향 시발체에는 BamH I site가 존재하도록 디자인한 후, 참조예 1과 같은 PCR 반응을 1. 95℃에서 5분, 2. 95℃에서 30초, 3. 40℃에서 1분, 4. 72℃에서 1분 30초, 5. 72℃에서 10분, 6. 4℃로 진행 한 후 2-4번을 30번 반복하였다.

PCR 후 Wizard PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였고 Xba I 과 BamH I 을 처리하였다. 또한, pBES2 역시 같은 제한효소로 처리하고 겔 DNA 정제 키트(gel DNA purification kit QIAXII, Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후 송아지 장에서 분리한 알칼린 포스파타제를 사용하여 탈인산화반응을 시켰다. 다음 단계로 참조예 2와 같이, 벡터 DNA 와 삽입 DNA의 결합반응을 수행하였다.

이 결합 혼합물을 참조예 3과 같이 수행하여 알파-아밀라제 유전자의 프로모터 부분, 리보좀 결합 부위 및 시그날 시퀀스가 가 코딩된 650 bp DNA 단편이 삽입되었음을 확인하였다. 최종적으로 외래 유전자 발현 시스템을 보유한 비피도박테리아 발현벡터인 pBESAF2를 구성하였고 이는 2002년 11월 27일자 한국 미생물보존센타에 기탁하였다. (기탁번호 KCCM-10452)

[실시예 4]

외래 유전자인 바실러스 유래의 피타제 유전자의 준비

본 발명의 발현벡터인 pBESAF1의 작동 유무를 확인하기 위하여 외래유전자로서 바실러스 (Bacillus) 유래의 피타제를 비피도박테리움에서 발현시켜보았다. 피타제 유전자는 약 1.1 Kb의 크기이며 pGEM-T(Promega, USA)에 클로닝 되어 있는 것을 사용하였다.

먼저, 피타제 유전자를 PCR하기 위하여 다음과 같이 시발체를 디자인하였다.

정방향 시발체(phyB-f) : 5'GCGGGGATCCGATTGGTACCGATGTCTGAT3'

역방향 시발체(phyB-r) : 5'CGCGGATCCACTAGTTCATGAGCTCTATTT3'

정방향 시발체에는 Kpn I 부위, 역방향 시발체에는 Spe I 부위가 들어가도록 디자인하여 시그날 시퀀스 이후에서부터 종료코돈까지 PCR 하였다.

PCR의 조건은 참조 예1과 동일하나, 주형을 0.5㎕사용하고, 탈이온수 대신에 탈이온화증류수를 18㎕사용하여 진행하였고, 45℃에서 1분동안 아닐링하였다.

PCR 후 DNA 단편을 위자드 PCR 정제 키트 (Wizard PCR purification kit, Promega, USA)로 정제하고 Kpn I 및 Spe I 제한효소로 처리하였다.

[실시예 5]

외래 유전자인 대장균(E. coli) 유래의 피타제 유전자의 준비

본 발명의 발현벡터인 pBESAF2의 작동 유무를 확인하기 위하여 외래유전자로서 대장균 (E. coli) 유래의 피타제를 대장균과 비피도박테리움에서 발현시켜보았다. 피타제 유전자는 약 1.3 Kb의 크기이며 pGEM-T(Promega, USA)에 클로닝 되어 있는 것을 사용하였다.

정방향 시발체(phyE-f): 5'GTCTGGATCCATGCAGAGTGAGCCGGAGCTGAAG3'

역방향 시발체(phyE-r) : 5'GTCATCGAATTCAGAGCATTCAGGTAACT3'

정방향 시발체에는 BamH I 부위, 역방향 시발체에는 EcoR I 부위가 들어가도록 디자인하여 시그날 시퀀스 이후에서부터 종료코돈까지 PCR 하였다.

PCR 후 DNA 단편을 위자드 PCR 정제 키트 (wizard PCR purification kit, Promega, USA)로 정제하고 BamH I 및 EcoR I 제한효소로 처리하였다.

[실시예 6]

외래 유전자 바실러스 피타제와 pBESAF1이 결합된 pBESAF1-PHY의 구성

Kpn I 및 Spe I 로 처리된 피타제 유전자와 Kpn I 및 Spe I 로 처리되고 CIAP로 탈인산화된 pBESAF1을 결합시켰다. 이때, 외래 유전자는 비피도박테리움에서 클로닝한 알파-아밀라제 유전자의 프로모터 부분, 리보좀 결합부위 및 시그날시퀀스가 포함된 약 600 bp DNA 부분 이하에 외래 유전자를 융합시켰다.

결합 조건은 참조예 2와 동일하나, 삽입 DNA 0.5㎕ 및 탈이온수 5.5 ㎕을 사용하여 16℃에서 12 시간 수행하였다.

참조예 3의 방법으로 각각의 클론에서 플라스미드를 획득하였고, 이를 pBESAF1-PHY로 명명하였다. 이는 도 2에 표시된 바와 같다.

[실시예 7]

외래 유전자 대장균 피타제와 pBESAF2가 결합된 pBESAF2-appA의 구성

BamH I 및 EcoR I 로 처리된 피타제 유전자와 BamH I 및 EcoR I 로 처리되고 CIAP로 탈인산화된 pBESAF2를 결합시켰다. 이때, 외래 유전자는 비피도박테리움에서 클로닝한 알파-아밀라제 유전자의 프로모터 부분, 리보좀 결합부위 및 시그날시퀀스가 포함된 약 650 bp DNA 부분 이하에 외래 유전자를 융합시켰다.

참조예 3의 방법으로 각각의 클론에서 플라스미드를 획득하였고, 이를 pBESAF2-appA로 명명하였다. 이는 도 3에 표시된 바와 같다.

[실시예 8]

비피도 박테리움으로 형질전환

비피도 박테리움을 0.05% L-시스테인, 0.5M 수크로스가 포함된 MRS 배지에 접종하여 OD₆₀₀ 0.45 까지 37℃에서 혐기성 조건으로 배양하였다. 상기 배양액을 6,000 rpm으로 10분동안 원심분리하고 0.2M 수크로스 용액으로 2회 수세한 후 최초 배지 부피의 1/320의 0.2M 수크로스 용액에 재현탁하여, 비피도 박테리아의 컴피턴트(competent)세포를 제조하였다. 상기 컴피턴트 세포 약 80 ul를 새 마이크로퓨지 튜브(microfuge tube)에 옮긴 후 각 1 ug DNA (pBESAF1, pBESAF2, pBESAF1-PHY 또는 pBESAF2-appA)를 넣고 잘 섞어준 후 2.0 KV, 25 uF, 200 Ω 조건으로 전기천공법(electroporation)을 수행하였다. 펄스를 준 후 0.05% L-시스테인 및 0.2M 수크로스가 포함된 미리 가열된 MRS 배지 800 ul와 섞어 37℃에서 3시간 정치배양한 후 0.05% L-시스테인, 0.2M 수크로스 및 3㎍/ml 클로람페니콜에 도말하고 4일간 혐기 배양하여 수득된 형질전환체 중 몇 개의 콜로니를 선택하여 외래유전자 발현 분석에 사용하였다.

[실시예 9]

pBESAF1-PHY 벡터로 형질전환된 비피도박테리움에서 바실러스 유래의 피타제 유전자 발현 분석

참조예 4와 같은 방법을 이용하여 pBESAF1-PHY를 가지는 형질전환체를 초음파 파쇄하여 원심분리 후 얻은 상층액과 배양액의 상층액 각각을 Heinonen 등이 사용한 무기 오르쏘 인산염 측정법을 이용하여 분석하였다. 이 방법은 반응액에 Acetone-Acid-Molybdate 용액(AAM solution)을 첨가하여 무기인산염이 존재할 때 노란색의 발색반응을 나타내는 원리를 이용한 것이다. 프로토콜은 Heinonen 등이 사용한 방법을 따랐다.

그 결과는 표 3과 같다.

무기인산염의 표준 데이타

Pi 농도	O.D.
375 nmol	1.305
188 nmol	0.696
94 nmol	0.372
47 nmol	0.207

피타제활성의 분석

	표준가와의 O.D. 차이	Pi 농도	피타제활성(U)
펠렛	0.539	147 nmol	0.13 U
상층액	0.035	10 nmol	0.01 U

*1UNIT은 1분간 피태이트(PHYTATE)로부터 무기인산염 1.0 umol을 유리시킨다.

이 표로 알 수 있듯이, 균체 및 상징액에서 외래 유전자인 피타제의 활성을 확인할 수 있다.

뿐만 아니라, 균체 및 상징액에서의 피타제 활성의 차이는 피타제 유전자 전방에 붙인 알파-아밀라제 유래의 시그날 시퀀스의 영향으로 대부분의 피타제 효소가 분비되었음을 보여준다. 그 비율로 보면, 도 4에 도시된 바와 같이. 세포 내에서 보이는 피타제 활성은 6% 정도였고 배양액으로 분비된 피타제 활성은 94%를 나타내었다. 이 결과는 알파-아밀라제를 비피도박테리움에 발현시켰을 때와 비슷한 양상을 보임을 알 수 있다. (도 5 참조) 따라서 유용한 외래 유전자에 의한 단백질을 외부로 분비하고자 할 때 이용될 수 있어 유용한 카세트 시스템인 것으로 사료된다.

[실시예 10]

pBESAF2-appA 벡터로 형질전환된 비피도박테리움에서 대장균 유래의 피타제 유전자 발현 분석

참조예 4와 같은 방법을 이용하여 pBESAF2-appA를 가지는 형질전환체를 원심분리후 배양 상층액을 Heinonen 등이 사용한 무기 오르쏘 인산염 측정법을 이용하여 분석하였다. 이 방법은 반응액에 Acetone-Acid-Molybdate 용액(AAM solution)을 첨가하여 무기인산염이 존재할 때 노란색의 발색반응을 나타내는 원리를 이용한 것이다. 프로토콜은 Heinonen 등이 사용한 방법을 따랐다.

그 결과는 표 4와 같다.

피타제 활성의 분석

	표준가와의 O.D. 차이	Pi 농도	피타제활성(U)
상층액	0.100 / 50 ㎕	15.8 nmol	21.1 U

*1UNIT은 1분간 피타이트(PHYTATE)로부터 무기인산염 1.0 umol을 유리시킨다.

이 표로 알 수 있듯이, 상층액에서 대장균 유래 외래 유전자인 피타제의 활성을 확인할 수 있다.

배양 상층액에서의 피타제 활성이 보이는 것은 피타제 유전자 전방에 붙인 알파-아밀라제 유래의 시그날 시퀀스의 영향으로 피타제가 균체 밖으로 분비됨을 알 수 있으며 그 활성 또한 바실러스 유래의 피타제 효소 활성 보다 크게 높은 값을 보인다. 현재 유산균에서 나타나는 피타제 활성 중에서 가장 높은 활성을 보이며 이는 피타제 활성을 가진 유산균 생균제로의 응용 가능성이 매우 높을 것으로 사료된다.

[실시예 11]

pBESAF2appA로 형질전환된 대장균(E. coli DH5a)에서의 피타제 발현

pBESAF2appA로 형질전환된 대장균(E. coli DH5a)을 LB 배지에 접종하여 37℃에서 진탕 배양 조건으로 배양하였다. 시간대별로 샘플링하여 균 배양액을 14,000 rpm으로 3분 동안 원심분리하고 배양 상층액을 취하여 피타제 활성 측정에 사용하였다. 프로토콜은 Heinonen 등이 사용한 방법을 따랐다.

그 결과는 표 5와 같다.

피타제 활성의 분석

	표준가와의 O.D. 차이	Pi 농도	피타제활성(U)
상층액	0.216 / 50 ㎕	37.1 nmol	49.5 U

[실시예 12]

T7 promoter를 이용한 발현벡터 pET29-AF2appA의 제조

비피도 박테리움으로부터 유래한 알파-아밀라제 유전자의 시그날시퀀스 부분과 대장균 유래 파타제를 pET29 벡터에 클로닝하기 위하여 PCR하였다. 이때, PCR 주형으로 pBESAF2appA를 사용하였고, 사용된 시발체는 다음과 같다.

정방향 시발체(AF1-F) : 5' CCGAAACATATGGAAATACCGCAA 3'

역방향 시발체(AF2-ㄲ): 5'CTCGCCCATGAATTCCGCCAGTCCGTAATGCTTGCG 3'

정방향 시발체에는 Nde I site가 존재하도록 디자인하였고 역방향 시발체에는 EcoR I site가 존재하도록 디자인한 후, 참조예 1과 같은 PCR 반응을 1. 95℃에서 5분, 2. 95℃에서 30초, 3. 50℃에서 1분, 4. 72℃에서 1분 30초, 5. 72℃에서 10분, 6. 4℃로 진행 한 후 2-4번을 30번 반복하였다.

PCR 후 Wizard PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였고 Nde I 과 EcoR I 을 처리하였다. 또한, pBES2 역시 같은 제한효소로 처리하고 겔 DNA 정제 키트(gel DNA purification kit, QIAXII, Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후 송아지 장에서 분리한 알칼린 포스파타제를 사용하여 탈인산화반응을 시켰다. 다음 단계로 참조예 2와 같이, 벡터 DNA 와 삽입 DNA의 결합반응을 수행하였다.

이 결합 혼합물을 참조예 3과 같이 수행하여 알파-아밀라제 유전자의 시그날 시퀀스와 대장균 피타제 유전자가 코딩된 약 1.85 kb 크기의 DNA 단편이 삽입되었음을 확인하였다. 이는 도 5에 표시된 바와 같다.

[실시예 13]

pET29-AF2appA로 형질전환된 대장균(E. coli BL21(DE3))에서의 피타제 발현

pET29-AF2appA로 형질전환된 대장균(E. coli BL21(DE3))을 LB 배지에 접종하여 OD₆₀₀ 0.5까지 배양한 후 IPTG 0.5 mM를 첨가한 후 계속해서 37℃에서 진탕 배양 조건으로 배양하였다. 시간대별로 샘플링하여 균 배양액을 14,000 rpm으로 3분 동안 원심분리하고 배양 상층액을 취하여 피타제 활성 측정에 사용하였다. 프로토콜은 Heinonen 등이 사용한 방법을 따랐다.

그 결과는 표 6과 같다.

피타제 활성의 분석

	표준가와의 O.D. 차이	Pi 농도	피타제활성(U)
상층액	0.403 / 50 ㎕	103.3 nmol	103.3 U

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 비피도박테리움 유래의 알파-아밀라제의 프로모터, 리보좀 결합부위 및 시그날 시퀀스를 포함한 벡터를 제조하여 여기에 유용한 외래 유전자를 삽입하여 외래 유전자를 함유하는 발현벡터를 제조한 후 이를 이용하여 비피도 박테리움을 형질전환시킴으로서 유용한 단백질의 생산을 통한 기능성 유산균 제품을 만드는 데 이용할 수 있을 것이다.

뿐만 아니라, 비피도박테리움 유래의 알파-아밀라제의 시그날 시퀀스를 포함하는 발현카세트 시스템은 외래 유전자를 세포밖으로 분비시키는데 유용하므로, 외부 분비 유전자에 대하여 산업적인 가치가 클 것이다.

도 1 은 pYBamy59 벡터로 형질전환된 비피도박테리움에서 알파-아밀라제의 활성을 분석한 그래프이다.

도 2 은 비피도박테리움 유래의 알파-아밀라제 유전자의 프로모터, 리보좀 결합부위 및 시그날 시퀀스를 포함하는 발현벡터 pBESAF1의 제작단계와 이를 이용한 pBESAF1-PHY의 제작단계를 나타낸 것이다.

도 3 은 비피도박테리움 유래의 알파-아밀라제 유전자의 프로모터, 리보좀 결합부위 및 시그날 시퀀스를 포함하는 발현벡터 pBESAF2의 제작단계와 이를 이용한 pBESAF2-appA의 제작단계를 나타낸 것이다.

도 4 은 대장균용 분비 벡터인 pET29-AF2appA의 제작단계를 나타낸 것이다.

도 5 는 발현벡터 pBESAF1-PHY로 형질전환시킨 비피도박테리움에서 무기 오르쏘 인산염 측정법을 이용하여 균체 및 상징액에서의 피타제 활성의 차이를 나타낸 그래프이다.

<110> BIFIDO CO., LTD. <120> FOREIGN GENE EXPRESSION AND SECRETION SYSTEM IN BIFIDOBACTERIUM SPECIES <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2477 <212> DNA <213> Bifidobacterium sp. <400> 1 tctagacgaa tgttccagca ttttctgaca acaagcaata ctccgttcca gataaacatc 60 aattaactcg cgcttatgca agcagtactc agagaaagcc actatgaatg ccaccacagc 120 caacagggcc ataacacagt tagcaattgt gtcaatgtac tcaaccatca ttcccctttc 180 cctgaaaaca aatactagat tgtttcagtc agtcacatca tcaagtattc cgaaatatac 240 agaaataccg caatgcacgg caaattcaat taaacgcaac tcttcatagg ccacttaaac 300 aaaccaccac cccatcaaat tggatagagc atatacaagc ccacatccag cagcaccccc 360 gtacccctac ttgcgcaaat gagaaagatt tgcagggttg acgcatcgac aacaactgga 420 ttgcattttc agggcatcgc cgaatatact cccaccacac aacaagttag ggtggtacaa 480 aacaccatca attaagtacc acctttgcaa acattttcac aaatgaaaga gttgtttcag 540 caacgatttt cattgttttt tccaaggctt ttcgcacttt agcaccctag aaaaggtata 600 aaataaacag catacgttcg caatagtgca aacgctatca aagaagatga acccccgtta 660 aagggattga agaaaaggaa taaaggagcc atgaaacatc ggaaacccgc accggcctgg 720 cataggctgg ggctgaagat tagcaagaaa gtggtggtcg gcatcaccgc cgcggcgacc 780 gccttcggcg gactggcaat cgccagcacc gcagcacagg ccagcaccga tcgcgacagc 840 tacgccgaca ccgttgaaaa caccacgttc gaacaggcgc gcaagcatta cggactggcg 900 cagcaaatga gcgagggcgc caccctgcat gcatgggagt ggagcttcaa aaccattgag 960 gaaaacatcc ccgctattgc cgaagccggt tacacctccg tgcagaccga gccgatttcc 1020 gctattcata acggcggcaa gggcatgatc ttcaccgaga actggtacta cgtatatcag 1080 ccgaccgaca ccaccatcgg caactgggtg atgggtaccg aagatgatct gaagagcctg 1140 tgcaacgcgg ctcacaagta cggcgtgcgt atcatcgtcg atgtggtagc caaccatatg 1200 accgcgactt ggggcgccat cgccgatcgt tggaagaagt ccgagtacta ccaccacgac 1260 tgcaatgacg gtgatgtgca ggattggaac aaccgctatc aggtgaccca ctgcaagctg 1320 ctcggcctgt atgacatcaa cactgagaac accaaaaccg ccaacatgat gcacgatttc 1380 ctcgtgcaag cggtcaacga cggtgtggac gggttccgtt tcgatgcggc caagcacatc 1440 gaactgccgg acgagtataa cggctcccag tattggaaca tcattcttaa caatggcgcg 1500 cagttccaat acggcgaagt gttgcaggat tccatctccc gcgatagcga ctatgcaaag 1560 ctgttctcca gccacagcaa gaacggcggc ggcgtcaccg atctctacgg cagcaagctg 1620 cgcggagccc tgaattcgaa gaacctgaac gccggcaccc tgtccgattg gagcaactcc 1680 gccagcccga gcaatcttgt ctcttggctg gaatcgcatg ataactattc caatagcgat 1740 agggaatcca ccggcatgag cgaatggcag atgaccatgg gctggggcgt gatcggttcc 1800 cgttcccaga ccatgccgct gtacttcgac cgcccggtcg gctccggcgg cagccagccg 1860 cagttcgccg agaaaagcaa gctcggcgat gccggtgcgg attcttggaa ggatgcgcag 1920 gtcgtggcgg tgaaccactt ccgcaatact atgaacaaca acaaggcttc ggagtatctg 1980 cgcaactgcg gcgcgaattc ctgcctcatg gtggaacgct acatcaagga cggcaacttc 2040 aagaacgacg gcgtgaccat caccaacatg ggtgatacgc aagagctgtc cggcactgcc 2100 accaaccttg acgacggcac ctacaaggac caggtctccg gcggtaccat caccgtttcc 2160 ggcggcaaga ttacttccgg ctctgctccc ggcggcaaga tcagtgtgtt cttcaccgac 2220 aattccggtt cggtctccgc aaccccgggc gacagctcgt tcaagacgga caccactacc 2280 gttaccctga atgcgaacaa cgtcaccgat gccacctaca ccacttcgga gggcaagtcc 2340 ggctcgtatc aggatggcga caccatcacc atcggcgctt ccacggcgat cggtgacacc 2400 atcaccgtga agctgcaggg caaggatgcg gatggccaaa cggtctccgc aacatacaag 2460 tacacgaaga aggatcc 2477 <210> 2 <211> 78 <212> PRT <213> Bifidobacterium sp. <400> 2 Met Lys His Arg Lys Pro Ala Pro Ala Trp His Arg Leu Gly Leu Lys 1 5 10 15 Ile Ser Lys Lys Val Val Val Gly Ile Thr Ala Ala Ala Thr Ala Phe 20 25 30 Gly Gly Leu Ala Ile Ala Ser Thr Ala Ala Gln Ala Ser Thr Asp Arg 35 40 45 Asp Ser Tyr Ala Asp Thr Val Glu Asn Thr Thr Phe Glu Gln Ala Arg 50 55 60 Lys His Tyr Gly Leu Ala Gln Gln Met Ser Glu Gly Ala Thr 65 70 75 <210> 3 <211> 450 <212> DNA <213> Bifidobacterium sp. <400> 3 agaaataccg caatgcacgg caaattcaat taaacgcaac tcttcatagg ccacttaaac 60 aaaccaccac cccatcaaat tggatagagc atatacaagc ccacatccag cagcaccccc 120 gtacccctac ttgcgcaaat gagaaagatt tgcagggttg acgcatcgac aacaactgga 180 ttgcattttc agggcatcgc cgaatatact cccaccacac aacaagttag ggtggtacaa 240 aacaccatca attaagtacc acctttgcaa acattttcac aaatgaaaga gttgtttcag 300 caacgatttt cattgttttt tccaaggctt ttcgcacttt agcaccctag aaaaggtata 360 aaataaacag catacgttcg caatagtgca aacgctatca aagaagatga acccccgtta 420 aagggattga agaaaaggaa taaaggagcc 450

Claims

서열번호 1에 개시된 염기서열로 표시되는 비피도박테리움에서 유래한 알파-아밀라제의 유전자.
서열번호 2에 개시된 염기서열로 표시되는 비피도박테리움에서 유래한 알파-아밀라아제 유전자의 시그날 시퀀스.
제 2항의 알파-아밀라제 유전자의 시그날시퀀스를 포함하는 외래 유전자 분비용 카세트 시스템.
서열번호 3에 개시된 염기서열로 표시되는 비피도박테리움에서 유래한 알파-아밀라제 유전자의 프로모터 유전자.
비피도박테리움에서 유래한 알파-아밀라제의 제 4항의 프로모터 유전자, 리보좀 결합부위 및 제 2항의 시그날 시퀀스가 pBES2 벡터로 클로닝된 것을 특징으로 하는 pBESAF1 및 pBESAF2 발현벡터 (KCCM-10452)로 구성된 군에서 선택되는 하나의 발현벡터 .
제 5항의 발현벡터에 외래 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 6항에 있어서, 외래 유전자는 바실러스(Bacillus) 및 대장균 유래의 피타제(phytase) 유전자인 것을 특징으로 하는 피타제 발현벡터인 pBESAF1-PHY 및 pBESAF2-appA로 구성된 군에서 선택되는 하나의 발현벡터.
제 6항 또는 7항의 발현벡터로 형질 전환된 외래 유전자 발현 형질전환체.
제 8항에 있어서, 형질전환체는 대장균 또는 비피도박테리움인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제 8항의 형질전환체를 배양하여 외래유전자를 생산하여 제조하는 방법.
제 2항의 비피더스 알파아밀라아제 분비신호를 이용하여 대장균에서 외래 유전자를 분비하는 방법.