KR101762199B1 - 바실러스 아밀로리쿼파시엔스로부터 유래된 수퍼옥시드 디스무타아제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주로부터 분리되고, 서열번호 1로 이루어지는 유전자 서열에 의해 코드화된 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD)를 생산하는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주 및 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다.

Description

바실러스 아밀로리쿼파시엔스로부터 유래된 수퍼옥시드 디스무타아제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그의 제조방법{POLYPEPTIDES WITH SUPEROXIDE DISMUTASE ACTIVITY DERIVED FROM BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS AND PREPARATION METHOD THEREOF}

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스로부터 유래된 수퍼옥시드 디스무타아제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주로부터 유래된 수퍼옥시드 디스무타아제 및 수퍼옥시드 디스무타아제의 제조방법에 관한 것이다.

항산화효소인 수퍼옥시드 디스무타아제 (이하, 간단히 “SOD” 라고 약칭한다)는 활성 산소의 하나인 수퍼옥시드 음이온(O₂ ^-)을 특이적으로 소거하는 것이 밝혀진 생리 활성 단백질로서, 인체 내부의 항산화 효소 활성을 촉진하고, 전반적인 항산화 방어기전을 강화하는 기능을 갖는 것으로 알려져 있다.

활성산소는 인체 내에서 정상적인 대사과정 중 생물학적 반응으로 형성된다. 그러나 활성산소의 축적이나 과도한 양의 활성산소의 생성은 대부분의 생물에 유해하고, 이러한 상태는 산화적 스트레스로 알려져 있다. 산화적 스트레스는 세포와 조직에서 여러 가지 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 지금까지 알려진 바에 의하면, 소화기 질환, 당뇨병, 암, 심혈관계 질환, 퇴행성 질환 등이 산화적 스트레스에 의하여 유발된다고 알려져 있다. 이를 방지하기 위하여, 생체 내에서 자유라디칼의 생성을 억제하기 위한 생리작용으로서, 산화성 자유라디칼에 전자를 공여하여 산화를 억제하거나 또는 과산화 라디칼(superoxide anion radical)을 정상 상태의 산소로 전환시키는 작용 기작이 알려져 있다.

이와 같은 산화적 스트레스가 노화를 비롯하여 각종 질환을 일으키는 중요한 원인임이 밝혀지면서 생체 내 활성산소를 제거하는 항산화제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 활성 산소종을 조절할 수 있는 수퍼옥시드 디스무타아제 (SOD), 카탈라아제(catalase), 퍼옥시다아제(peroxidase), 글루타치온 등의 항산화성 효소 및 비티민 C(아스코르브산), 비타민 E(토코페롤) 등의 천연물 유래의 저분자 항산화 물질에 대하여 많은 연구가 진행되고 있다. 합성 항산화제로는 BHA(butylated hydroxy anosole), BHT(butylated hydroxy toluene) 및 NDGA(nordihydroguaiaretic acid) 등도 많이 개발되어 의약품과 식품 분야에서 이용되고 있다.

그러나 이 같은 자연계에서 유래된 천연 항산화성 물질은 항산화 효과가 크지 않기 때문에, 이들 항산화성 물질을 사용하여 실효를 얻기 위해서는 다량으로 사용하여야 하고, 이로 인하여 가격이 상승하므로, 경제성이 낮다는 문제점이 있었다. 한편, 화학적으로 합성된 항산화성 물질은 천연 항산화성 물질보다도 우수한 항산화 효과를 나타내지만, 인체에 크고 작은 부작용을 유발시킨다는 새로운 문제점이 있어, 사용이 제한되고 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 자연계로부터 유래되어 안전성이 확보되면서도, 우수한 항산화 효과를 나타내는 항산화성 물질을 개발하기 위하여 예의 연구한 결과, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주로부터 유래된 추출물이 우수한 수퍼옥시드 디스무타아제 활성을 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스가 생산하는 수퍼옥시드 디스무타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 수퍼옥시드 디스무타아제를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 수퍼옥시드 디스무타아제 핵산 분자들을 포함하는 발현벡터 및 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 수퍼옥시드 디스무타아제를 이용하여 SOD를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 하나의 양상은,

바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주로부터 분리되고, 서열번호 1로 이루어지는 유전자 서열에 의해 코드화된 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.

상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 13222BP로서 국제기탁된 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주(Bacillus amyloliquefaciens GF423)일 수 있다.

상기 수퍼옥시드 디스무타아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열목록 서열번호 2로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어진다.

본 발명의 다른 양상은 서열번호 1의 수퍼옥시드 디스무타아제를 코드화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 1의 염기서열을 갖는, 수퍼옥시드 디스무타아제(Superoxide Dismutase; SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 유전자를 포함하는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주(Bacillus amyloliquefaciens GF423)에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 13222BP로서 국제기탁된 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주 (Bacillus amyloliquefaciens GF423)를 배양하여 수득한 배양액으로부터 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드를 분리하는 것을 포함하는 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 유래의 수퍼옥시드 디스무타아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 현재 상업화되어 있는 다른 식물 유래의 수퍼옥시드 디스무타아제와 달리 세포 외부로 분비되어 효소 활성의 안정성이 우수하면서도, 종래의 천연 항산화성 물질보다도 항산화 효과가 우수하고, 합성 항산화성 물질과 동등한 수준의 항산화 효과를 나타내므로, 항산화성 물질을 포함하는 식품, 건강기능성 식품, 의약품, 화장품 등 각종 제품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

본 발명의 균주는 인간에게 안전한 미생물이고, SOD는 세포 외부로 분비되는 효소이므로, 본 발명에 따른 균주를 이용하여 SOD 제조하는 경우, 고가의 정제과정 (예를 들면, 컬럼 정제)을 거치지 않고 인간에게 안전성이 확보된 SOD를 대량으로 생산할 수 있다. 또한 본 발명에 의한 균주의 배양을 통한 SOD 생산은, 식물 유래의 SOD 생산에 비해 배양 시간이 짧고, 생산에 필요한 공간이 식물의 재배에 필요한 공간에 비해 월등히 적어 경제적으로 생산이 가능하다.

본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주는 수퍼옥시드 디스무타아제 생산성이 매우 우수하여, 식품, 건강기능성 식품, 건강보조식품, 의약품 및 화장품의 재료 생산에 유리하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라서 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주로부터 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD)를 정제한 결과를 나타낸 도면으로, 페닐 세파로즈의 용출 거동을 나타낸 그래프이다.
도 2는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주로부터 SOD 유전자를 불활성화시키는 방법을 도시한 도면이다.
도 3은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주로부터 SOD 유전자를 불활성화하기 위해 사용된 플라즈미드의 모식도이다.
도 4는 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주에 의해 생산된 SOD와 멜론 SOD의 아미노산 서열 상동성 비교 결과를 나타낸 도면이다.
5바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주의 배양 양상을 나타낸 그래프이다.
도 6a-b는 대장암 세포 증식에 대한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주에 의해서 생산된 본 발명의 SOD 활성을 갖는 폴리펩티드의 효과를 나타낸 그래프이다.

이하에서 도면을 참조하여 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.

본 명세서에서 용어 항산화란, 좁은 범위로는 체내에서 생성되는 자유라디칼, 상기 자유라디칼로부터 생성되는 과산화수소 또는 과산화물, 상기 과산화수소로부터 생성되는 하이드록시 라디칼의 생성 또는 반응을 억제, 감소 또는 제어하는 작용을 의미하고, 넓은 범위로는 자연계에서 발생하는 산화반응의 생성을 억제, 감소 또는 제어하는 작용을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 가장 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록 서열번호 1로 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 수퍼옥시드 디스무타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 96%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

본 발명의 하나의 양상은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주로부터 분리되고, 서열번호 1로 이루어지는 유전자 서열에 의해 코드화된 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.

바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주로부터 수퍼옥시드 디스무타아제를 생화학적으로 확인한 것은 본 발명자들에 의해 처음으로 이루어진 것이다.

본 발명의 SOD 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열목록 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명의 SOD 활성을 갖는 폴리펩티드는 상기한 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 96%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

본 발명의 다른 양상에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 SOD 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 SOD 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 분자는 서열목록 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 수퍼옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase; SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드를 생산하는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주 (Bacillus amyloliquefaciens GF423)에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 균주는 ㈜ 바이넥스로부터 구입한 비스판 분말에서 분리하였으며, SOD 생성능이 우수한 균주이다. 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주 (Bacillus amyloliquefaciens GF423)를 한국생명공학연구원에 2017년 3월 6일자로 기탁번호 KCTC 13222 BP로 국제기탁하였다.

본 발명의 상기 균주는 서열목록 서열번호 3 내지 11과 동일한 유전자 서열을 가진다.

본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주의 특성은 다음과 같다.

1) 균의 형태
	LB 한천평판 배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균의 특성 ①세포의 형태: 간균 ②운동성: 있음 ③포자형성능: 내포자 형성
2) 균락의 형태
	LB 한천평판 배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균락의 형태 ①형상: 원형 ②융기: 볼록③표면: 매끄러움(Smooth)
3) 생리적 성질
	① 생육온도: 생장가능 생육온도 15~40℃ 최적 생장온도 37℃ ② 생육 pH: 생장가능 생육 pH 5.0~7.5 최적 pH 6.0~6.5③ 산소에 대한 영향: 혐기성
4) 카탈라제	-
5) 가스형성여부	-
6) 15℃에서 생육	-
7) 45℃에서 생육	+
8) 인돌 생산	-
9) 젖산 생산	+

본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주의 당이용성은 다음과 같다.

Carbohydrate	Utilized	Carbohydrate	Utilized
Glycerol	-	Escune	+
Ertythritol	-	Salicine	+
D-Arabinose	-	Cellobiose	+
L-Arablnose	-	Maltose	-
Ribose	-	Lactose	-
D-Xylose	-	Melibiose	-
L-Xylose	-	Saccharose	+
Adonitol	-	Trehalose	+
bMlethyl-xy|oside	-	lnuline	-
Galactose	-	Melezitose	-
D-G|ucose	+	D-Rafnose	-
D-Fructose	+	Amidon	-
D-Mann0se	+	Glycogene	-
L-sorbose	-	Xylltol	-
Rhamnose	-	b Gentlobiose	-
Dulcitol	-	D-Turanose	-
lnositol	-	D-Lyxose	-
Mannitol	-	D-Tagatose	-
Sorbitol	+	D-Fucose	-
aMethyl-D-mannoside	-	L-Fucose	-
aMethyl-D-glucoside	-	D-Arabiltol	-
N Acetyl glucosamine	-	L-Arabiltol	-
Amygdaline	-	Gluconate	-
Arbutine	+	2 ceto-gIuconate	-
		5 ceto-gIuconate	-

본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 본 발명은 수퍼옥시드 디스무타아제를 코딩하는 서열번호 1의 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pL λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pL λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 발현 비히클은 아세틸-CoA 합성 효소 (ACS) 프로모터를 이용하여 pUC19를 조작하여 제작한 수퍼옥시드 디스무타아제 유전자를 포함하는 pACE2-BTC이다. 상기 acs 프로모터는 유도물질이 필요 없고, 대장균 숙주 세포 의존성이 없으며, 대수 증식기 후기 및 휴지기에서 과발현되는 특징을 갖는다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 수퍼옥시드 디스무타아제의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이며, 그 이유는 이러한 추가적인 서열은 항원성이 없고, 단백질 즉 중사슬 및 경사슬의 가변성 부위의 폴딩을 방해하지 않기 때문이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제할 수 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어, 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라 사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 다른 양상에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 임의의 숙주 세포를 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114 (1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841 (1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 충돌법 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD)를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 이소프로필-β-D- 티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 수퍼옥시드 디스무타아제를 이용하여 SOD을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서는 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 13222BP로서 국제기탁된 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주 (Bacillus amyloliquefaciens GF423)를 배양하여 수득한 배양액으로부터 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드를 분리하여 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드를 생산한다.

바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주의 배양은 당업계에 알려진 적합한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예로, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들어 문헌("Biochemical Engineering"by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176.)에 기재되어 있다.

본 발명의 균주의 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 다양한 미생물 배양 배지들은 예를 들어 문헌 ("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981.)에 기재되어 있다. 이들 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분들을 포함한다. 탄소원은 포도당, 젖당, 자당, 과당, 맥아당, 녹말 및 섬유소와 같은 탄수화물; 콩 오일, 해바라기 오일, 베버 오일 및 코코넛 오일과 같은 지방; 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산과 같은 지방산; 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올과 아세트산과 같은 유기산을 포함한다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 질소원으로는 펩톤, 효모 추출액, 육수, 맥아 추출액, 옥수수 침출액 및 콩가루와 같은 유기 질소원 및 요소, 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카보네이트 및 암모늄 니트레이트와 같은 무기 질소원을 포함한다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인산원으로서 추가적으로 포타슘 디히드로겐 포스페이트, 포타슘 디히드로겐 포스페이트 및 상응하는 소듐 포함 염들을 포함할 수 있다. 또한 배지는 마그네슘 설페이트 또는 아이언 설페이트와 같은 금속을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민 및 적합한 전구체 등이 첨가될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 암모늄 히드록사이드, 포타슘 히드록사이드, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 적절한 방식으로 첨가함으로써 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용함으로써 배양하는 동안 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양액의 호기성 조건을 유지하기 위해서, 배양액 내로 산소 또는 산소를 포함한 가스(예, 공기)가 배양액에 주입될 수 있다. 배양물의 온도는 일반적으로 20-45℃, 바람직하게는 25-40℃이다. 배양의 기간은 SOD 활성을 갖는 폴리펩티드의 생산이 원하는 수준에 도달할 때까지 계속될 수 있고 바람직한 배양시간은 48-72 시간이다.

SOD 활성을 갖는 폴리펩티드는 하기의 분리 방법에 의해 분리되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주 (Bacillus amyloliquefaciens GF423)를 배양한 배양액을 원심분리하여 상층

액 분획을 회수하고, 상층액 분획을 고상추출(Solid Phase Extraction)을 이용하여 전처리한 후, 상층액 분획을 크로마토그래피로 분리 및 정제한다. 여기서 크로마토그래피는 C18 역상 HPLC를 사용하는 것이 바람직하나 반드시 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 방법에서는 숙주 세포로부터 생산된 수퍼옥시드 디스무타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 정제한 정제 용액과 쉘락이 함유된 완충액을 혼합하여 동결건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. SOD를 경구 투여한 경우에 위장관 내에서 활성이 급속히 저하될 수 있기 때문에, 생체 이용률 및 효율성의 감소로 이어지는 문제가 있다. 이러한 문제는 SOD의 효과가 가장 높은 특정 세포 위치까지 SOD를 전달하는 것이 곤란하여 더욱 심화된다. 따라서 본 발명의 방법에서는 수퍼옥사이드 디스무타아제를 용액 상태에서 코팅할 수 있다. 구체적으로 정제 용액과 쉘락을 함유하는 완충액을 혼합한 후 동결건조시킨다. 이러한 동결건조된 샘플은 분말화하여 사용되기까지 약4℃에서 보관할 수 있다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 코팅의 예로는, 셀락 (shellac)을 들 수 있고, 이 밖에도 에틸 셀룰로스(ethyl cellulose), 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스 (hydroxypropyl methyl cellulose), 하이드록시프로필메틸셀룰로오즈 프탈레이트 (hydroxypropylmethyl cellulose phthalate), 제인(zein), 유드라짓(Eudragit) 및 이들의 조합을 포함하지만, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서는, 상기 코팅제는 SOD 정제 분말 총 중량을 기준으로 0.6 내지 4 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 코팅 용액에는 칼슘 클로라이드, 시트르산, 글리세린초산지방산 에스테르, 폴리소르베이트, D-소르비톨 또는 트리아세틴과 같은 가소제 등이 추가될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 균주 분리 및 동정

㈜ 바이넥스로부터 비스판을 구입하여 이로부터 후술하는 과정에 의해서 본 발명의 SOD를 생산하는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주를 순수 분리하였다. 비스판 분말 0.1g을 10 ml 생리식염수 (0.9% NaCl)에 풀어 희석하여 LB 아가 플레이트에 도말하여 집락이 형성된 콜로니를 확보하였다. 이로부터 단일 콜로니를 취하여 다시 LB 아가 플레이트에 도말하였다. 이와 같은 과정을 3회 반복하여 단일 균주를 분리하였다. 분리된 세균은 그람 양성, 모양은 간균이었으며, 내포자 (endospore)를 생성할 수 있었다.

순수 분리된 균주를 동정하기 위해, Sambrook 등 (Sambrook, J. et al.: "Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed.", 2001, Cold Spring Harbor Press)의 방법으로 순수 분리된 균주로부터 지놈 (genome)을 정제하였다. 정제된 지놈은 Illumina사 HiSeq PE100을 이용하여 전체 지놈의 염기서열을 결정하였다.

분리된 균주의 지놈을 분석한 결과 9 카피의 16S rRNA 유전자 (서열목록 서열번호 3 내지 11)가 발견되었다. 16S rRNA 유전자들 중, BPJGP_r00130 (서열번호 7)와 BPJGP_r00160(서열번호 8)은 동일한 염기서열을 보였으나, 다른 16S rRNA 유전자들은 서로 다른 염기서열을 보였다. 즉 분리된 균주는 염기서열이 서로 다른 8가지의 16S rRNA 유전자들을 가지고 있었다.

9 카피의 16S rRNA 유전자 이용하여 속 수준 (Genus level)의 동정을 진행하였다. 사용한 16S rRNA 데이터베이스와 소프트웨어는 The Ribosomal Database Project의 Classifier (Wang, Q. et al., Appl Environ Microbiol., 73:5261-5267 (2007)), Living Tree Project의 Aligner (Pruesse, E. et al., Bioinformatics, 28:1823-1829 (2012)), EzTaxon database의 Identity (Kim, O.S. et al., Int J Syst Evol Microbiol., 62:716721 (2012))를 사용하였다. 분리된 균주는 모든 동정 소프트웨어에서 신뢰구간 (confidence) 95% 이상으로 바실러스 속으로 동정되었다.

분리된 균주를 EzTaxon 데이터베이스의 Identity (Kim, O.S. et al., Int J Syst Evol Microbiol., 62:716721 (2012))를 사용하여 종 수준 (Species level)의 동정을 진행하였다. 현재 종 수준 (Species level)을 동정하기 위한 16S rRNA의 상동성 역치값 (identity threshold)의 국제적 표준은 존재하지 않으나, 가장 널리 인정되고 있는 임계값 중 가장 높은 기준인 99% (Yarza, P. et al., Nature Rev. Microbiol., 12:635645 (2014))를 탐색 기준으로 이용하였다. 또한 순수 분리된 균주는 8 가지의 서로 다른 16S rRNA 유전자를 갖고 있기 때문에, 각 16S rRNA 유전자를 대상으로 검색하였고, 검색된 기준 균주들 중, 공통적으로 발견되는 기준 균주를 선택하였다. 탐색 결과 서로 다른 종에 속하는 80 종류의 기준 균주들이 탐색되었다. 이 결과는 16S rRNA 유전자의 상동성만을 이용하여 바실러스 속에 속하는 종들을 구별할 수 없다는 선행연구결과와 일치한다 (Janda J.M. & Abbott S.L., J Clin Microbiol., 45:2761-2764 (2007); Maughan H. & Van der Auwera G., Infect Genet Evol., 11:789-797 (2011)).

따라서 지놈을 기초한 분류를 진행하였다. 위의 과정에서 선별된 균주를 대상으로, 첫째 분리된 균주의 전체 지놈의 상동성을 in silico DNA-DNA Hybridization (DDH; Auch A.F. et al., Stand Genomic Sci., 28:117-234 (2010))을 이용하여 분석하여 70% 이상의 상동성을 보이는 기준 균주를 선택하였다. 이 결과 2 종류의 기준 균주들이 발견되었고(표 3), 발견된 기준 균주들과 분리된 균주의 지놈 수준에서의 ANI (the average nucleotide identity)와 AAI (the average amino acid identity)를 분석하여 검증하였다 (Rodriguez-R L.M. & Konstantinidis K.T., https://doi.org/10.7287/peerj.preprints.1900v1 (2016)).

하기 표 2에 분리된 균주와 DDH 분석에서 가장 상동성이 높은 3종류의 기준 균주들의 16S rRNA 유전자, DDH, ANI, AAI의 결과를 나타내었다.

	바실러스 아밀로리쿼파시엔스 플란타룸	바실러스 아밀로리쿼파시엔스 아미리로리쿼파시엔스	바실러스 섭틸리스 스피지제니	종 구별기준
기준 균주	FZB42	DSM7	NRRL B-23049
16S rRNA	99.67~99.73%	99.46~99.66%	99.18~99.39%	98.65%
DDH	92.10%	78.60%	32.70%	70%
ANI	98.65%	93.59%	80.04%	95%
AAI	98.79%	95.09%	79.88%	95%

이상과 같이 16S rRNA 유전자, 전체 지놈 비교를 통하여, 순수 분리된 균주는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens )에 속하는 미생물로 동정하고, 분리된 균주를 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423(B. amyloliquefaciens GF423)로 명명하고, 2017년 3월 6일자로 국제기탁기관인 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 13222BP를 부여받았다.

미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 뉴클레오티드 데이터베이스를 대상으로 검색한 결과, 본 발명의 균주와 동일한 16S rRNA 유전자 (서열번호 3 내지 11)와 100% 상동성을 갖는 생물체는 존재하지 않았다.

실시예 2- 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423로부터 수퍼옥시드 디스무타아제 (SOD)의 분리/정제

2.1 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 의 배양

바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주의 배양을 위해, LB 한천 배지 (Luria-Bertani (LB) 아가; 트립토판 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 10 g/L, 아가 15 g/L)에서 형성된 단일 콜로니를 LB 배지 30 ml에 접종하여, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이 종 배양을 다시 3L의 1 mM 황산망간 (MnSO₄)이 포함된 LB 배지에 접종하고 37℃에서 20시간 동안 배양하였다.

2.2 수퍼옥시드 디스무타아제의 분리 및 정제

세포 배양액을 4℃, 3,578xg에서 20분간 원심분리하여 상등액을 취한 후, 초미세여과(Ultrafiltration, 이하 UF, MWCO 10,000)를 이용하여 10배 농축하였다. 농축된 상등액 300 ml을 4℃에서 교반하면서 60% 포화도까지 황산암모늄 (ammonium sulfate)을 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. 이후 3,578g에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취하여, 2 M 황산암모늄이 포함된 50 mM 인산칼륨 (potassium phosphate, pH 7.5)으로 평형화된 HiPrep™ Phenyl HP 16/10 컬럼에 로딩하였다. 이 후, 2 M 내지 0.1 M의 황산암모늄이 포함된 50 mM 인산칼륨 (pH 7.5)을 이용하여 용출하였다 (도 1A).

SOD 함유 분획 (#35-#40)을 모은 후, UF (MWCO 10,000)를 이용하여 농축하고, 50 mM 인산칼륨 (pH 7.5)으로 투석하여 염을 제거하였다. 단백질의 농도는 브래드포드(Bradford M, Anal Biochem, 72, 248-254, 1976)의 방법으로 측정하였다. 정제 거동은 도 1에 나타내었다.

수퍼옥시드 디스무타아제의 활성은 수퍼옥시드 디스무타아제 분석 키트(Cayman Chemical, Michigan, USA)를 이용하여 확인하였다. 수퍼옥시드 디스무타아제 활성의 1 단위는 수퍼옥시드 라디칼을 50% 억제하는 효소의 양으로 정의된다. 정제된 SOD의 활성은 2231.12 ± 269 U/mg, SDS 상의 분자량은 약 22,000 dalton이었다.

실시예 3- 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423로부터 수퍼옥시드 디스무타아제 (SOD)의 유전자의 확인

Edman 분해 방법을 이용하여, 정제된 SOD의 N-말단을 분석한 결과, Ala-Tyr-Lys-Leu-Pro-Glu의 아미노산 서열을 확인하였다. 지놈 상에 위의 아미노산 서열을 코드화할 수 있는 유전자를 탐색한 결과 서열번호 1의 유전자를 발견하였다.

서열번호 1의 유전자가 SOD을 코드화하는 유전자인지를 검증하기 위해, 서열번호 1의 유전자를 도 2와 같이 불활성화하였다. 에리쓰로마이신 저항성 유전자는 EmF (gaagcaaacttaagagtgtg)와 EmR (tccttggaagctgtcagtag)의 올리고 프라이머를 이용하여 pDG1664 plasmid (Guerout-Fleury,A.M. ey al., Gene 180:57-61 (1996))로부터 1144 bp 크기의 PCR 증폭 산물을 얻었다. 서열번호 1의 유전자의 양끝 상동성 부위는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 지놈을 주형으로 사용하고, 프라이머 1 (aaacagctg ggatgaacacaagtgagag) 과 프라이머 2 (cacactcttaagtttgcttc caattctggaagtttgtaag) 조합으로 778 bp 크기와, 프라이머 3 (ctactgacagcttccaaggatacctgaactaccaaaaccg)과 프라이머 4 (aaacagctg aagctcatgaccacagcaag)의 조합으로 796 bp 크기의 PCR 산물을 증폭하여 에리쓰로마이신 저항성 유전자와 PCR로 연결하여 단일 절편의 DNA로 만들었다. 연결된 DNA는 pUori-ts-cm 플라스미드 (도 3)의 PvuII 제한효소 자리에 삽입하였다. 완성된 플라스미드 pUori-sodem (도 3)은 Zhang 등의 방법 (Zhang G.Q. et al., Anal Biochem. 409:130-137 (2011))으로 B. amyloliquefaciens GF423으로 형질도입하였다. 30℃에서 클로람페니콜(10 ㎍/ml)과 에리쓰로마이신 (5 ㎍/ml)이 첨가된 LB 배지에서 생성된 형질전환체를 선별하였고 에리쓰로마이신 (5 ㎍/ml)이 첨가된 LB 액상배지에 접종하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 배양액을 에리쓰로마이신 (5 ㎍/ml)이 함유된 LB 아가 배지에 도말하여 37℃에서 콜로니를 형성시키고 이들로부터 클로람페니콜에 대한 감수성을 가지는 콜로니들을 선별하여 SOD 유전자가 불활성화된 균주를 확보하였다.

모균과 서열번호 1의 유전자가 불활성화된 균주의 SOD 활성을 비교한 결과, 동일한 세포 OD₆₀₀에서 불활성화된 균주 (3.1 SOD U/ml)는 모균 (41.4 SOD U/ml)에 비해 SOD 활성이 10배 이상 감소한 것으로 보아, 서열번호 1의 유전자는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423이 생산하는 주요 SOD 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드화한다는 것을 확인하였다.

실시예 4- 멜론 SOD와 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 SOD의 상동성 비교

멜론 (Cucumis melon)의 미토콘드리아 (XP_008457298, XP_008457297) 클로로플라스트 (XP_008453838, XP_008450700, XP_008450699, XP_008465422, NP_001315382), 사이토졸 (XP_008441989, XP_008455578, |XP_008455574, ALO62043, ALO62042)내에 존재하는 SOD와 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GR423 균주에 의해 생산된 SOD의 아미노산 서열과 상동성을 조사한 결과 모두 40% 이하의 상동성 (identity)을 보였다. 하기 표 4에 상동성 (identity)과 유사성 (similarity)을 나타내었다.

	멜론 미토콘드리아 SOD X1	멜론 미토콘드리아 SOD X2
바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 SOD	36.2 % (51.0 %)	30.7 % (43.2 %)

도 4는 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주에 의해 생산된 SOD와 멜론 미토콘드리아 SOD와 상동성을 비교 도시한 결과이다.

실시예 5- 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423유래의 수퍼옥시드 디스무타아제 (SOD)의 생산

5.1 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423의 배양

상기 균주의 배양을 위해, LB 한천 배지에서 형성된 단일 콜로니를 LB 배지 50 ml에 접종하여, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이 종배양을 다시 500 ml의 LB 배지에 접종하여 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 이 2차 종배양을 다시 50L의 1 mM 황산망간이 포함된 LB 배지에 접종하고 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423의 배양 거동은 도 5에 나타내었다.

5.2 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 배양액 후 공정

세포 배양액에 0.7% 인산수소이칼륨 (K₂HPO₄)을 첨가하고 이 혼합액에 1.4% 염화칼슘 (CaCl₂)을 첨가한 이후 다시 0.7% 인산수소이칼륨을 첨가하여 30분 동안 혼합하여 응집 (flocculation)을 유도하였다. 이후 4℃, 3,578g에서 20분간 원심분리하여 상등액을 취한 후, UF(MWCO 10,000)를 이용하여 10배 농축하였다.

5.3 수퍼옥시드 디스무타아제의 코팅

바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 유래 수퍼옥시드 디스무타아제의 코팅은 천연 코팅제제인 쉘락(shellac)을 이용하였다. 쉘락 농도 변화에 따른 코팅효율은 표 5에 나타내었다.

SOD 건조 중량에 대한 쉘락 중량% (w/w)	코팅된 SOD를 완충 용액에 현탁한 직후 측정한 SOD 역가	현택 후 24시간 후 측정한 SOD 역가	코팅효율 (%)*
0.6	22.2	655.3	96.6
1.2	22.1	666.2	96.7
2.3	17.6	648.1	97.3
3.5	15.4	618.1	97.5
3.9	13.9	653.6	97.9

* (1-(코팅 SOD를 완충 용액에 현택 직후 측정한 SOD 역가/현택 후 24시간 후 측정한 SOD 역가))*100

쉘락은 50 mM 인산칼륨 (pH 7.0) 완충용액에 용해하여, 수퍼옥시드 디스무타아제 정제 용액과 혼합하여 동결 건조시켰다. 동결건조된 샘플은 분말 형태로 4℃에서 보관하였다.

실시예 6- 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD)의 활성 측정

정제한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 (B. amyloliquefaciens GF423) 균주 유래의 수퍼옥시드 디스무타아제(GF423 SOD)의 활성을 수퍼옥시드 디스무타아제 활성 측정 키트(SOD activity assay kit, cayman 706002)를 이용하여 측정하였다.

먼저 샘플 완충액(50 mM Tris-HCl pH 8.0)을 이용하여 표준 샘플(standard sample)과 수퍼옥시드 디스무타아제 샘플(SOD samples)을 희석하여 준비하고 96웰에 라디칼 디텍터(radical detector) 200 ㎕를 분주한 후 표준샘플과 수퍼옥시드 디스무타아제 샘플을 10 ㎕씩 분주하였다. 그 다음 잔틴 옥시다아제(xanthine oxidase)를 20 ㎕씩 분주하고, 상온에서 30분간 인큐베이션(incubation) 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 샘플의 흡광도 값으로부터 선형비율 (linearized rate, LR)값을 구해 표준곡선을 그리고 표준곡선에서 얻은 식을 이용하여 수퍼옥시드 디스무타아제의 활성을 하기 수학식 1에 의해 산출하였다.

[수학식 1]

수퍼옥시드 디스무타아제 활성(SOD activity, U/ml)=[{(LR-y절편)/기울기}*23]*희석배수

예)표준샘플 A의 선형비율 값(Std A LR) = 표준샘플 A의 O.D./표준샘플 A의 O.D.

표준샘플 B의 선형비율 값(Std B LR) = 표준샘플 A의 O.D./표준샘플 B의 O.D.

본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주 (B. amyloliquefaciens GF423)에 의해서 생산된 수퍼옥시드 디스무타아제(GF423 SOD)와 타제품들의 SOD 활성을 측정하여 그 결과를 하기 표 5에 함께 나타내었다. 비교를 위해 본 발명의 균주에 의해 생산된 GF423 SOD, 부채선인장 SOD (Xi'an Hao-Xuan Bio-Tech Co., Ltd.), 식물 허브 SOD (Xi'an Hao-Xuan Bio-Tech Co., Ltd.), 멜론 SOD (BioNov)의 SOD 활성을 비교하여 하기 표 6에 나타내었다.

	SOD	활성 농도 (unit/ml)
실시예 1	B. a GF423 SOD	1413.1
비교예 1	Hao Xuan 부채선인장 SOD	99.24
비교예 2	식물 허브 SOD	10.34
비교예 3	BioNov 멜론 SOD	93.6

실시예 7- 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 으로부터 정제한 SOD의 대장암 세포주 증식 억제 효과

이하에서 설명하는 방법에 따라서 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주에 의해 생산/정제된 SOD를 대장암 세포에 처리하였을 때 세포증식의 저해 정도를 확인하였다.

대장암세포 HT-29와 SW480을 96웰에 1x10⁴개로 깔아 준 후 24시간 동안 37℃, 5% CO₂인큐베이터(incubator)에서 배양하였다. 24시간 후 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 (B. amyloliquefaciens GF423)에 의해 생산된 SOD와 상업화된 슈퍼옥시드 디스무타아제(부채선인장 SOD (Xi'an Hao-Xuan Bio-Tech Co., Ltd.), 식물 허브 SOD (Xi'an Hao-Xuan Bio-Tech Co., Ltd.), 멜론 SOD (BioNov))를 농도(0, 10, 25, 50, 100, 200, 400, 800 U/ml)로 처리하고 48시간 동안 37℃, 5% CO₂인큐베이터(incubator)에서 인큐베이션하였다. 그 다음 WST-8(WST-8 세포 증식 키트, Cayman 10010199) 혼합물을 10 ㎕씩 분주한 후 1시간 동안 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 인큐베이션한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하고 대조군의 흡광도 값과 비교하여 하기 수학식 2에 따라서 세포증식 저해 정도를 퍼센트(%)값으로 계산하여 그 결과를 도 6a-b에 나타내었다.

[수학식 2]

세포 증식(%) = (각 농도별O.D./대조군 O.D.)*100

도 6a를 참조하면, 상업화된 부채선인장 SOD, 식물 허브 SOD, 멜론 SOD 보다 본 발명의 균주에 의해서 생산된 SOD가 대장암 세포에 대한 세포 증식 저해 효과가 더 우수한 것을 확인할 수 있다. 특히 저농도 10 U/ml, 25 U/ml에서 효과의 차이가 현저하였다. 즉 대장암세포 SW480의 경우, SOD 10 U/ml의 농도에서 부채선인장 SOD, 멜론 SOD는 대장암 세포에 대한 증식 저해 효과가 없는 반면, 식물 허브 SOD와 GF423 SOD의 경우 약10%의 저해 효과를 보였고, SOD 25 U/ml의 경우 식물 허브 SOD는 약 10%, 본 발명의 GF423 SOD의 경우 약 40%의 우수한 저해 효과를 보였다.

도 6b를 참조하면, 대장암세포 HT 29의 경우에도, 부채선인장 SOD, 식물 허브 SOD, 멜론 SOD (BioNov)는 100 U/ml의 농도까지 대장암 세포의 증식 억제 효과가 적은 반면(약 10% 이하), 본 발명의 GF423 SOD의 경우 25 U/ml 농도에서부터 효과를 보이기 시작하여 25 U/ml에서는 약 15%, 50 U/ml에서는 30%, 100 U/ml의 농도에서는 50%의 매우 우수한 대장암 세포 증식 억제효과를 보였다.

이상의 결과로부터 확인되는 바와 같이, 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주에 의해 생산되는 SOD 활성을 갖는 폴리펩티드는 대장암 세포에 대해서는 암세포 증식 저해 효과를 나타내는 것을 확인하였고 상업화된 SOD에 비해 낮은 농도에서 월등한 효과를 보였다.

이상에서 본 발명에 대해서 상세하게 설명하였으나, 이는 단지 본 발명의 구체적인 구현예를 예시한 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 본 발명이 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 및/또는 변경하여 실시될 수 있다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 보호는 첨부된 청구범위 및 그와 균등한 범위에 의하여 정해져야 할 것이다.

본 발명의 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드는 항산화 및 항암 활성이 우수하고, 효소 활성의 안정성 및 생체 내에서의 안정성이 우수하여, 기존의 SOD를 포함하는 식품, 건강보조식품, 의약품, 화장품 등의 재료로서 유리하게 사용될 수 있다.

한국생명공학연구원 KCTC13222BP 20170306

<110> GenoFocus, Inc. <120> POLYPEPTIDES WITH SUPEROXIDE DISMUTASE ACTIVITY DERIVED FROM BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS AND PREPARATION METHOD THEREOF <130> P17-GF-01 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 606 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 1 atggcttaca aacttccaga attgccttac gcttatgatg ctttagaacc tcatatcgat 60 aaggaaacga tgacgattca ccatacgaag caccataaca catacgtgac aaacctcaac 120 aaagcgatcg aaggatctgc gcttgcagag aaatctgtag atgagcttgt tgctgatttg 180 aacgcagtgc cggaggacat ccgcacggca gtccgcaaca atggcggcgg acatgcaaac 240 cactctttat tctggactct tttatctccg aacggcggag gcgaaccgac tggtgagctt 300 gctgaagaga tcaaaagcac gttcggaagc ttcgatcaat ttaaagaaaa attcgccgca 360 gcagctgcag gccgtttcgg ttcaggctgg gcttggctcg ttgtaaacaa cggcaaactt 420 gaaattacaa gcacgccaaa ccaagattca ccgctttcag aaggtaaaac acctgttctc 480 ggtcttgatg tttgggagca tgcgtactac ctgaactacc aaaaccgccg tcctgattac 540 atttcagctt tctggaatgt tgtgaactgg gatgaagttg cccgtcttta cagcgaagca 600 aaataa 606 <210> 2 <211> 201 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 2 Met Ala Tyr Lys Leu Pro Glu Leu Pro Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu 1 5 10 15 Pro His Ile Asp Lys Glu Thr Met Thr Ile His His Thr Lys His His 20 25 30 Asn Thr Tyr Val Thr Asn Leu Asn Lys Ala Ile Glu Gly Ser Ala Leu 35 40 45 Ala Glu Lys Ser Val Asp Glu Leu Val Ala Asp Leu Asn Ala Val Pro 50 55 60 Glu Asp Ile Arg Thr Ala Val Arg Asn Asn Gly Gly Gly His Ala Asn 65 70 75 80 His Ser Leu Phe Trp Thr Leu Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Glu Pro 85 90 95 Thr Gly Glu Leu Ala Glu Glu Ile Lys Ser Thr Phe Gly Ser Phe Asp 100 105 110 Gln Phe Lys Glu Lys Phe Ala Ala Ala Ala Ala Gly Arg Phe Gly Ser 115 120 125 Gly Trp Ala Trp Leu Val Val Asn Asn Gly Lys Leu Glu Ile Thr Ser 130 135 140 Thr Pro Asn Gln Asp Ser Pro Leu Ser Glu Gly Lys Thr Pro Val Leu 145 150 155 160 Gly Leu Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Asn Tyr Gln Asn Arg 165 170 175 Arg Pro Asp Tyr Ile Ser Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp Asp Glu 180 185 190 Val Ala Arg Leu Tyr Ser Glu Ala Lys 195 200 <210> 3 <211> 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agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500 acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctcc ttt 1543 <210> 11 <211> 1543 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 11 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60 ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120 cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccagat ggttgtctga 180 accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240 cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300 ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420 cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480 gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540 gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600 gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660 gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720 agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780 aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840 tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900 aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960 ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020 gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080 agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140 tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200 atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg 1260 aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320 tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380 tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440 gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500 acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctcc ttt 1543

Claims (8)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. D-글루코스, D-프럭토스, D-만노스, 소르비톨, 아르부틴, 에스쿨린, 살리신, 셀로비오스, 사카로스 및 트레할로스를 탄소원으로 이용하는 균학적 특성을 나타내고, 수퍼옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase; SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드를 생산하고, 대장암 세포 증식 억제 효과를 갖는 한국생명공학 연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 13222BP로서 국제기탁된 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주 (Bacillus amyloliquefaciens GF423).
   
6. 제5항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 3 내지 서열번호 11 가운데 어느 하나의 유전자 서열로 이루어지는 16S ribosomal RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주 (Bacillus amyloliquefaciens GF423).
   
7. D-글루코스, D-프럭토스, D-만노스, 소르비톨, 아르부틴, 에스쿨린, 살리신, 셀로비오스, 사카로스 및 트레할로스를 탄소원으로 이용하는 균학적 특성을 나타내고, 수퍼옥시드 디스무타아제 (superoxide dismutase; SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드를 생산하고, 대장암 세포 증식 억제 효과를 갖는 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 13222BP로서 국제기탁된 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주 (Bacillus amyloliquefaciens GF423)를 배양하여 수득한 배양액으로부터 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드를 분리하는 단계; 및
   바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GF423 균주로부터 생산된 수퍼옥시드 디스무타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 정제한 정제 용액과 쉘락이 함유된 완충액을 혼합하여 동결건조하는 단계를 포함하는 것을 포함하는 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD) 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법.
   
   
8. 삭제

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