KR101592671B1 - 항산화 활성이 우수한 코리네박테리움 글루타미쿰 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 벡터 및 이를 도입한 형질전환체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 서열번호 1 내지 8의 베타-케토아디페이트 경로 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나 이상을 포함하는 핵산 분자 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 숙주세포에 도입한 형질전환체에 관한 것이다. 이에 따르면, 균주의 항산화성이 증가하여 산화적 스트레스 상태에서도 생존능력이 증가하고, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같이 생합성에 사용되는 균주에 적용하여 물질 합성 능력을 현저하게 증가시킬 수 있다.

Description

항산화 활성이 우수한 코리네박테리움 글루타미쿰 및 이의 용도{Corynebacterium glutamicum having antioxidant activity and use thereof}

본 발명은 항산화 활성이 우수한 코리네박테리움 글루타미쿰 및 이의 용도에 관한 것으로, 코리네박테리움 글루타미쿰이 항산화 활성을 가질 수 있도록 상기 균주에 도입할 수 있는 재조합 벡터 및 이로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰에 관한 것이다.

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 높은 구아닌 시토신(GC) 함량을 갖고 방선균에 속하는 그램 양성균으로, 리신(Lysine), 글루타민(Glutamine), 이노신 5-모노포스페이트(inosine 5-monophosphate, IMP)와 같은 매우 다양한 아미노산 이나 핵산의 생합성에 활용되는 대표적인 균주이다.

그러나 발효과정 동안 균주들은 온도, 산도, 삼투압, 기아 및 산화 등과 같이 인위적으로 유도된 스트레스를 경험하게 되며, 이러한 스트레스 인자들은 균주의 생존과 기능을 떨어트려 결론적으로 생합성의 생산성을 감소시킨다. 이는 호흡과정동안 산소의 불완전 환원으로 인하여 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical), 과산화수소(hydrogen peroxide)나 수산기(hydroxy radical)와 같은 활성산소종(reactive oxygen species)이 생성되고, 활성산소종의 높은 산화 활성으로 인하여 초래된 산화 스트레스가 돌연변이, 대사 과정 붕괴 및 성장 장애 등을 초래하기 때문이다.

따라서 많은 상업적 유용성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 생산성을 더욱 높이기 위하여 산화적 스트레스는 감소시키는 것이 요구된다. 이와 관련된 기술로 한국특허 2013-7005790에는 티로신 페놀리아제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자를 도입하여 페놀 형성능을 향상시킨 기술이 기재되어 있으나, 이는 페놀 생성능력의 향상에 주안점을 두고 있으며, 한국특허 2008-0056856에는 기질에 산소를 첨가할 수 있는 산화 효소를 암호화하는 유전자를 도입하여 산화물 생성능을 증가시킨 기술이 기재되어 있을 뿐이다.

1. 한국공개특허 2013-7005790 2. 유럽특허 02191004 3. 한국공개특허 2008-0056856

이에 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰의 항산화성을 증가시켜 코리네박테리움 글루타미쿰의 생존력을 증진시키고 따라서 코리네박테리움 글루타미쿰의 산업 응용도를 높일 수 있는 방법을 고안함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, 베타-케토아디페이트 경로 효소 활성을 갖는 서열번호 1 내지 8의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나 이상을 포함하는 핵산 분자; 또는 상기 폴리뉴클레오타이드의 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 재조합 벡터가 발현되도록 숙주세포에 도입된 형질전환체를 이용하여 아미노산 생산을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 베타-케토아디페이트 경로 효소 활성을 갖는 서열번호 1 내지 8의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나 이상을 포함하는 핵산 분자; 또는 상기 폴리뉴클레오타이드의 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9, 서열번호 2의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10, 서열번호 3의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호11, 서열번호 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12, 서열번호 5의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13, 서열번호 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 14, 서열번호 7의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 15, 및 서열번호 8의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 16인 것 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1,2,3 및 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자; 서열번호 5 및 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 서열번호 7 및 8의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1,2,3 및 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9,10,11 및 12인 것; 서열번호 5 및 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13 및 14인 것; 및 서열번호 7 및 8의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 15 및 16일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 재조합 벡터가 발현되도록 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형질전환체는 항산화 활성을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 재조합 벡터가 발현되도록 숙주세포에 도입된 형질전환체를 이용하여 아미노산 생산을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면 균주의 항산화성이 증가하여 산화적 스트레스 상태에서도 생존능력이 증가하고, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같이 생합성에 사용되는 균주에 적용하여 물질 합성 능력을 현저하게 증가시킬 수 있다.

도 1은 베타-케토아디페이트 경로를 도식화한 도면이다.
도 2은 베타-케토아디페이트 경로 효소를 암호화하는 pca 유전자 클러스트에 대한 유전자도이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예의 과산화수소에 대한 내성을 확인한 실험결과이다. A는 과산화수소를 첨가한 경우의 균주 성장, B는 과산화수소를 첨가하지 않은 경우의 균주 성장.
도 4는 본 발명에 따른 실시예의 다양한 산화 스트레스원에 대한 내성을 확인(억제 영역)한 실험결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 실시예의 활성산소종 분해 활성을 측정한 실험 결과이다.
도 6는 본 발명에 따른 실시예의 활성산소종 분해 활성을 배양시간별로 비교한 실험결과이다.
참고로 도면에 기재된 실시예 1R은 제조예 1을 실시예 2R은 제조예 2를 실시예 3R은 제조예 3을 나타낸 것이다.

본 발명의 구체적인 내용을 기술하기에 앞서 본 명세서에 사용된 용어에 대하여 의미를 서술한다.

본 명세서에서 사용되는 '폴리펩타이드'는 해당 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알로리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 베타-케토아디페이트 경로와 관련하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 동일성 % 는 높을수록 더욱 바람직하다.

또한 상기 동일성을 가지는 폴리펩타이드는 기재된 특정 아미노산 서열의 폴리펩타이드에서 1개 이상 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하면서 베타-케토아디페이트 경로와 관련되는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가의 수는 적을수록 더욱 바람직하다.

본 명세서에 사용되는 '폴리뉴클레오타이드'는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogues)도 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 상기 기재된 특정의 아미노산 서열(폴리펩타이드)을 암호화하는 핵산 분자에 제한되지 않고, 상기에서 서술한 것처럼 특정 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 그에 상응하는 기능을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

상기 상응하는 기능을 가진 폴리펩타이드는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되는 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 포함한다. 그러한 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 1 개 이상의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 이루어지며 3-하이드록시프로피온산 합성 관련되는 폴리펩타이드를 포함하며, 아미노산 잔기의 소실,치환,삽입, 및/또는 첨가의 수가 적은 것이 바람직하다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 베타-케토아디페이트 경로와 관련하는 폴리펩타이드를 포함하며, 동일성이 높을 수록 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드가 수소 결합을 통해 결합하여 더블 스트랜드 폴리뉴클레오타이드를 형성하는 능력을 의미하며, 부분적으로 상보적인 경우도 포함한다. 하기 염기쌍이 상보성과 관련된다: 구아닌 및 시토신; 아데닌 및 티민; 및 아데닌 및 우라실. "상보적"은 상기 언급된 관계가 전장의 상기 분자에 걸쳐 2개의 싱글-스트랜드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 모든 염기쌍에 실질적으로 적용된다. "부분적으로 상보적"은 2개의 싱글-스트랜드 폴리뉴클레오타이드 중 하나의 길이가 짧기 때문에 그 분자들 중 하나의 일부가 싱글 스트랜드로 남아있는 것 관계를 의미한다.

"외래"는 일반적으로 야생형 세포 또는 유기체에서 자연적으로 발생하는 것이 아니고, 전형적으로 분자생물학 기술, 즉, 재조합 미생물을 생성하기 위한 공학적 처리로 세포에 도입된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드를 의미한다.

"재조합" 미생물은 전형적으로, 예컨대 플라스미드 또는 벡터에 하나 이상의 외래 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

"벡터"라는 용어는 숙주세포에 삽입되어 숙주세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.

"형질전환 또는 트랜스펙션"은 세포 외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다.

"숙주 세포"는 본 발명의 임의의 재조합 벡터(들) 또는 단리된 폴리뉴클레오티드의 수용체일 수 있거나, 수용체인 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일숙주 세포의 자손일 수 있으며, 자손은 자연적, 우발적 또는 인공 돌연변이 및/또는 변화로 인해 원래의 모 세포와 완전히 동일하지 않아도 된다(형태 또는 총 DNA 상보면에서). 숙주 세포는 생체내 또는 시험관 내에서 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드로 형질감염되거나, 형질전환되거나 또는 감염된 세포를 포함한다. 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포는 재조합 숙주 세포, 재조합 세포 또는 재조합 미생물이다.

상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, (a) 서열번호 1 내지 8의 베타-케토아디페이트 경로 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나 이상을 포함하는 핵산 분자; 또는 (b) 상기 (a)의 상보적 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.

상기 베타-케토아디페이트 경로는 도 1에 도시되어 있으며, 상기 서열번호 1 내지 8의 폴리펩타이드를 도면 2에 도시된 유전자도를 함께 참고하여 상술하면 다음과 같다.

서열번호 1의 폴리펩타이드(PcaH)와 서열번호 2의 폴리펩타이드(PcaG)는 프로토카테큐에이트(protocatechuate)를 베타-카르복시-시스,시스-뮤코네이트(β-carboxy-cis,cis-muconate)로 전환하는 프로토카테큐에이트 3,4-디옥시지네이즈(protocatechuate 3,4-dioxygenase, PcaHG)에 해당한다. 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열번호 9에 기재된 pcaH 및 서열번호 10에 기재된 pcaG 일 수 있다.

서열번호 3의 폴리펩타이드는 베타-카르복시-시스,시스-뮤코네이트(β-carboxy-cis,cis-muconate)를 감마-카르복시뮤코락톤(γ-carbosymucolactone)으로 전환하는 베타-카르복시-시스,시스-뮤코네이트 사이클로아이소머레이즈(β-carboxy-cis,cis-muconate cycloisomerase, PcaB)에 해당한다. 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열번호 11에 기재된 pcaB 일 수 있다.

서열번호 4의 폴리펩타이드는 감마-카르복시뮤코락톤(γ-carbosymucolactone)을 베타-케토아디페이트-이놀락톤(β-ketoadipate-enol-lactone)으로 전환하는 감마-카르복시뮤코락톤 디카르복실레이즈(γ-carbosymucolactone decarboxylase, PcaC)에 해당한다. 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열번호 12에 기재된 pcaC 일 수 있다.

서열번호 5의 폴리펩타이드는 베타-케토아디필-코에이(β-ketoadipyl-CoA)를 숙시닐-코에이(succinyl-CoA)로 전환하는 베타-케토아디필-코에이 디올레이즈(β-ketoadipyl-CoA thiolase, PcaF)에 해당한다. 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열번호 13에 기재된 pcaF 일 수 있다.

서열번호 6의 폴리펩타이드는 베타-케토아디페이트-이놀락톤(β-ketoadipate-enol-lactone)을 베타-케토아디페이트(β-ketoadipate)로 전환하는 베타-케토아디페이트-이놀락톤 하이드로레이즈(β-ketoadipate-enol-lactone hydrolase, PcaD)에 해당한다. 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열번호 14에 기재된 pcaD 일 수 있다.

서열번호 7의 폴리펩타이드(PcaI)와 서열번호 8의 폴리펩타이드(PcaJ)는 베타-케토아디페이트(β-ketoadipate)를 베타-케토아디필-코에이(β-ketoadipyl-CoA)로 전환하는 베타-케토아디페이트 숙시닐-코에이 트랜스퍼레이즈(β-ketoadipate succinyl-CoA transferase, PcaIJ)에 해당한다. 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드는 서열번호 15에 기재된 pcaI 및 서열번호 16에 기재된 pcaJ 일 수 있다.

따라서 본 발명의 일례에 따르면, 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9, 서열번호 2의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10, 서열번호 3의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호11, 서열번호 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12, 서열번호 5의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13, 서열번호 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 14, 서열번호 7의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 15, 및 서열번호 8의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 16인 것 중에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 핵산 분자는 서열번호 1,2,3 및 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자; 서열번호 5 및 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 서열번호 7 및 8의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 서열번호 1,2,3 및 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9,10,11 및 12인 것; 서열번호 5 및 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13 및 14인 것; 및 서열번호 7 및 8의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 15 및 16일 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 상술한 재조합 벡터 중 어느 하나가 발현되도록 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 상기 유전자의 발현 조절을 위하여 항시성(constitutive) 또는 유도성 프로모터, 전사 인핸서(enhancer), 전사 터미네이터 등을 포함할 수 있다. 복수의 외인성 유전자를 발현시키는 경우 여러 유전자가 하나의 재조합 벡터에 삽입되거나 별도의 재조합 벡터에 삽입될 수도 있다. 상기 재조합 벡터는 알려진 방법으로 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 각 폴리뉴클레오타이드는 동일 또는 상이한 프로모터에 각각 작동되도록 연결될 수 있다.

일례로 글리세롤 데하이라타제 및 그 활성화 인자는 동일 프로모터에 작동되도록 연결될 수 있다. 일례로 본 발명에서는 상기 글리세롤 데하이드라타제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터는 혐기성 조건에서 작동이 유도되는 혐기성 프로모터, 예를 들어 nar, PadhE, Nirb, fdhF, phTERT, PnirB 프로모터를 포함할 수 있다(Kim et. al., J. Biotechnology, Vol.151, Issue 1, pp.102-107; Wei et. al., Applied Microbiology and Biotechnology March 2009, Volume 82, Issue 4, pp 703-712 ; Oxer et. al., Peakman TC, Charles IG, et al. (1991)).

본 발명의 재조합 미생물은 재조합 벡터와 같은 발현카세트로 숙주 세포에 도입하는 형질전환 방법에 의하여 만들어질 수 있으며, 상기 도입 방법 역시 공지의 기술, 예컨데 염화칼슘법, 열 충격법, 전기충격법 등의 형질전환방법이나 재조합 파지 바이러스를 통한 형질주입을 통해 도입할 수 있다. 상기의 숙주 세포 이외에도 발현의 목적에 따라 달라지는 벡터에 의존하여 다양한 균주를 용이하게 이용할 수 있음은 당업자에게 명백한 일이다.

본 발명의 형질전환체 제조에 사용 가능한 숙주세포는 박테리아, 효모, 곰팡이 등 제한되지 않으며, 일례로 에스케리키아 (Escherichia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 엔테로박테리아 (Enterobacteria) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 크렙시엘라(Klebsiella) 속, 시트로박터(Citrobacter) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속, 바실러스 (Bacillus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 사카로마이세스 (Saccharomyces)속 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 미생물 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 대장균, 클렙시엘라, 락토바실러스, 등과 같은 박테리아일 수 있다. 가장 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.

본 발명에 따르면, 서열번호 1 내지 8의 베타-케토아디페이트 경로 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나 이상을 포함하는 외인성 핵산 분자를 포함하고 항산화성을 갖는 형질전환체를 제공한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

< 실시예1 > 항산화 활성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 제조

<1-1> 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 유래 재조합 벡터의 제작

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032 균주로부터 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA 추출은 TRIzol 용액(인비트로젠, 미국)과 NucleoSpin RNA 키트(마체레이-나겔, 독일)를 사용하여 제조사의 안내대로 진행하되, 아래와 같은 변경을 가하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주를 흡광도(OD₆₀₀)=15 까지 배양한 다음, TRIzol 용액에 현탁한 후, 유리구슬(산 세척, 213-230㎛, 시그마-알드리치, 미국)이 담겨 있는 바이얼로 옮겼다. Mini-Beadbeater-16(바이오스펙, 미국)을 사용하여 균주를 파괴한 다음, 원심분리하여 상청액을 NucleoSpinRNAⅡ 키트(마체레이-나겔, 독일)에 적용하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서 분리된 총 RNA 중 50ng을 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성은 ReverTra Ace-α(도요보, 일본)을 제조사의 안내에 따라 사용하여 수행하였다.

THNUDERBIRD^TMSYBRqPCR MIX(도요보, 일본) 및 Mx3005P QPCR 시스템(아질렌트 테크놀로지, 미국)을 사용하여 유전자 발현 분석을 수행하였으며, RT-qPCR 과정은 MxPro-Mx3005P 소프트웨어 4.10(아질렌트 테크놀로지, 미국)을 사용하여 계산하여 검증하였다.

Pca 유전자 전사 정도를 확인하기 위하여 하기 표와 같은 프라이머쌍을 사용하였다.

프라이머 서열

유전자	5'-3'
pcaI	acccagatgcagcaatga gacgcggttgacgtaaattc
pcaJ	atcggcatgcctacacttatc gttcctcttcagttgggtaagg
pcaF	ccactgggttccggtattt gcgaaagcttcgttgagttc
pcaD	aacttccgacaacaccttgg cgatgacgcggaaatccttat
pcaH	ggaccgttatgccaggtaat ccgtaaactgacgaccatagag
pcaG	cgctacgagcagtcgaatatc aaaccgatgtggacgtaagg
pcaB	ccgatctttatactccgaccttg gcctccacgacaagaagatt
pcaC	tcgctatgaaaccggaatgaa cctgaaacttctcagtcacctc
16S rRNA	acccttgtcttatgttgccag tgtaccgaccattgtagcatg

<1-2> 플라스미드 구성

P₁₈₀ 프로모터를 운반하고 클론된 유전자의 과발현을 유도하기 위하여 빈 발현벡터 플라스미드 pSL360(Park SD 등(2004) Isolation and Characterization of Transcriptional Elements from Corynebacterium glutamicum. J Microbiol Biotechnol 14 (4):789-795)를 사용하여 pca 유전자를 발현시켰다(도 2 참조).

하기 표와 같은 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 게놈 DNA를 주형으로 하여 pca 유전자 클러스터를 PCR 증폭하였다. 클로닝을 위한 PCR은 denaturation-95℃, 30초/ annealing-60℃, pcaIJ, 40초; 63℃, pcaFD, 30초; 59℃, pcaHGBC, 30초/ extension 72℃, pcaIJ, pcaFD, 2분 30초; pcaHGBC, 4분)으로 구성된 과정을 30회 반복 수행하였다.

유전자 클러스터	올리고뉴클레오타이드 (5'-3')	밑줄 부분
pcaIJ	gactgcagtgaacattacgttagcatgt ggctgcagttaagcaactttgaaatc	PstI site
pcaFD	ggatgcattaaggatcaaaaaatgaaccctc ggatgcatttaagcgaaatgctgtgc	NsiI site
pcaHGBC	aactgcagagacgcagaaaggtctc ggctgcagttactgaaggtctgacac	NsiI site

^{* 볼드 부분은 높은 발현을 위하여 변이시킨 리보솜 결합 부위( RBS , ribosome binding site 이다.}

각각 증폭한 pcaIJ(1,404bp), pcaFD(1,998bp), pcaHGBC(2,799bp)유전자를 PstI, NsiI 로 절단한 후, PstI-digested pSL360으로 접합(NsiI에 대해서도 동일하게 수행)하여 pSL360-pcaIJ, pSL360-pcaFD, and pSL360-pcaHGBC 벡터를 제조하였다.

상기에서 제조된 벡터들은 ECM 630 electroporation system(BTX, 미국)으로 전기충격법(2 mm cuvette, 25㎌ , 200Ω 2.5 kV)을 수행하여 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰에 도입하였다. 하기와 같이 실시예를 구분하였다.

발현 유전자	재조합 벡터	형질전환체
pcaHGBC	제조예 1	제조예 1R
pcaFD	제조예 2	제조예 2R
pcaIJ	제조예 3	제조예 3R

<1-3> 균주의 배양

본 발명에 따른 상기 제조예 1R 내지 3R을 각각 MCGC 최소 배지(1ℓ당 glucose 10 g, (NH₄)₂SO₄ 4 g, KH₂PO₄ 3 g, Na₂HPO₄ 6 g, NaCl 1 g, sodium citrate dehydrate 1 g, biotin 200 mg, thiamineㆍCl 1 mg, FeSO₄ㆍH₂O 20 mg, MgSO₄ㆍH₂O 0.2 g, MnSO₄ㆍ₂O 2 mg, FeCl₃ 2 mg, ZnSO₄ㆍH₂O 0.5 mg, CuCl₂ㆍH₂O 0.2 mg, (NH₄)₆Mo₇O₂₄ㆍH₂O 0.1 mg, Na₂B₄O₇ㆍ0H₂O 0.2 mg, and CaCl₂ 70 mg)에서 배양하였다.

과산화수소 2mM을 가하여 산화 스트레스에 대한 성장을 실험하였다. 배양은 250mL 삼각플라스크에 배지 50mL를 담아 30℃, 230rpm에서 수행하였다. 세포 성장은 흡광도 600nm에서 측정하였고, 흡광계수 0.250을 적용하여 바이오매스로 전환하였다.

< 실험예 >

1. 아가 확산 실험

아가 확산 실험을 통해 상기 제조예 1R 내지 3R의 다양한 산화 스트레스원에 대한 저항성을 확인하였다.

로그기에 있는 균주를 0.7% 아가 용액에 혼합한 후, 이 혼합액 3mL를 BHI 배지(Bacto^TM Brain heart infusion 37 g/L, 코케이스빌, 미국) 20mL를 포함하는 1.6% bottom 아가 접시에 부었다.

산화 스트레스원(14% 및 28% 과산화수소, 1M 다이아미드, 또는 10% 큐멘하이드로퍼옥사이드 각각) 20㎕를 흡수시킨 종이 디스크(직경 6mm, 아벤텍, 일본)를 아가 접시위에 올려 놓은 후 30℃에서 24시간 동안 배양하였다.

2. 라디칼 분해 활성 평가

2.2-디페닐-1-피크릴하이드라질(2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH)을 사용하여 세포 추출물에서의 자유 라디칼 분해 활성을 측정하였다. 2.2-디페닐-1-피크릴하이드라질은 안정적인 자유 라디칼이고, 전자를 얻으면 탈색된다.

박테리아 세포는 600nm에서 흡광도가 10이 될 때까지 BHI 배지에서 배양한 후, 수거하여(5,000rpm, 4℃, 30분) 분쇄하여 세포추출액을 마련하였다.

상청액을 동일한 부피의 에틸아세테이트와 혼합하고 잘 섞은 후, 원심분리하고 0.22㎛ 기공의 여과지를 사용하여 여과하였다. 세포가 제거된 추출물로 자유 라디칼 분해활성을 평가하였다.

구체적으로는, 5mg/100㎖(에탄올) 농도로 신선하게 준비한 DPPH 용액 2.8㎖ 를 세포추출액 200㎕와 혼합하여 암전의 실온에서 30분동안 배양하였다. 대조군으로는 에탄올 200㎕를 사용하였다.

배양하는 동안 5분 간격으로 시료의 흡광도를 517nm에서 측정하였고, 하기의 식(수학식 1)에 따라 자유 라디칼 분해 활성을 산출하였다.

<수학식 1>

활성산소종분해활성(%)=[(흡광도대조군-흡광도시료)/흡광도대조군] x 100

3. 실험 결과

1) 과산화수소에 대한 내성 획득과 pca 유전자 클러스터 발현

산화 스트레스 상태에서 pca 유전자 클러스터 발현이 균주의 성장에 미치는 영향을 규명하기 위하여, 본 발명에 따른 상기 제조예 1R 내지 3R을 2mM 과산화수소를 포함 또는 비포함하는 MCGC 최소 배지에서 배양하여 결과를 도 3에 도시하였다.

배양 결과, 대조군인 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 과산화수소가 없는 상태에서는 18시간 배양에 흡광도 18까지 균주가 성장하였으나, 2mM 과산화수소가 존재하는 상태에서는 성장하지 못하였다.

그러나, 본 발명에 따른 상기 제조예 1R 내지 3R은 산화 스트레스 상태에서 균주가 성장하였다. 그 중에서도 제조예 1R은 30시간 배양에 흡광도 10.1까지 도달하여 균주 성장의 회복이 가장 우수하였다.

pca 유전자 클러스터 발현을 검증하기 위하여, 산화 스트레스가 없는 상태에서의 pca 유전자 발현(mRNA 전사)을 RT-qPCR 방법을 통하여 분석하였다. 그 결과는 하기 표 3에 도시하였다. 각 균주는 과산화수소 없는 MCGC 최소 배지에서 배양한 후 로그기에 도달하면 수득하여 mRNA 분석을 수행하였다.

Target gene	RNA-seqa (RPKM)	RT-qPCRb (relative fold)
	대조군 (야생형)	대조군 (야생형)	제조예3R	제조예2R	제조예1R
pcaI	135.7	1.00±0.39	1.75±0.36	1.55±0.50	0.61±0.17
pcaJ	134.8	1.00±0.15	1.23±0.14	2.56±0.27	1.10±0.12
pcaF	220.9	1.00±0.05	0.24±0.03	40.2±0.6	1.00±0.15
pcaD	183.6	1.00±0.18	0.25±0.05	42.5±0.9	1.00±0.13
pcaH	172.0	1.00±0.02	0.23±0.01	2.61±0.12	10.1±0.95
pcaG	116.7	1.00±0.01	0.23±0.02	2.45±0.16	8.83±0.60
pcaB	217.5	1.00±0.22	0.19±0.04	2.31±0.39	7.72±0.42
pcaC	77.7	1.00±0.02	0.21±0.02	2.52±0.23	11.9±0.71

^{a) Lee JY 등의 문헌에서 적용함(Lee JY, Seo J, Kim ES, Lee HS, Kim P, Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling. Biotechnol Lett 35 (5):709-717. doi:10.1007/s10529-012-1135-9) ( NCBI Gene Expression Omnibus access code : GSE41232 ) RPKM ( reads per kilo base per million )}

^{b) 본 결과는 3번의 독립된 실험결과에 대한 평균±표준편차임}

상기 결과에 의하면, 본 발명에 따른 재조합 백터(pca 유전자 클러스터 발현)를 포함하는 모든 균주가 대조군인 야생형 균주에 비하여 pca 유전자의 mRNA 수준이 높은 것을 확인하였다. 또한 각 pca 유전자 세부 클러스터마다 발현 정도가 상이하여, pcaJ 유전자의 발현은 야생형에 비하여 1.23배 증가하였으나, pcaD 유전자의 발현은 야생형에 비하여 42배나 증가하였다.

2) 다른 산에 대한 내성 획득과 pca 유전자 클러스터 발현

다른 산에 대한 내성을 확인하기 위한 아가 확산 실험 결과를 도 4에 도시하였다.

실험 결과에 따르면, 본 발명에 따른 상기 제조예 1R 내지 3R이 다양한 산화 스트레스원을 가한 모든 경우(14 % and 28 % H₂O₂, 1 M diamide, and 10 % cumene hydroperoxide)에서 대조군인 야생형 균주에 비하여 생장 억제 영역(inhibition zone)이 작게 나타났다.

상기 억제 영역은 균주의 성장과 연관되어 있으며, 특히 본 발명에 따른 실시예 1R의 경우 가장 작은 억제 영역을 보여 우수한 항산화성을 나타냈다.

3) 세포내 활성산소종 활성과 pca 유전자 클러스터 발현

본 발명에 따른 제조예 1R 내지 3R에 대한 활성산소종 분해 활성 측정 결과는 도 4 및 도 5에 도시하였다. 실험 결과, 본 발명의 제조예 1R은 47.7±1.6%의 활성을 보여, 대조군인 야생형 균주보다 약 3배 높은 것을 확인하였다. 한편, 제조예 2R은 39.1±2.3%, 제조예 3R은 30.9±1.4%의 활성을 나타냈다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Corynebacterium glutamicum having antioxidant activity and use thereof <130> PN1402-044 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 230 <212> PRT <213> PcaH polypeptide <400> 1 Met Asp Ile Pro His Phe Ala Pro Thr Gly Gly Glu Tyr Ser Pro Leu 1 5 10 15 His Phe Pro Glu Tyr Arg Thr Thr Ile Lys Arg Asn Pro Ser Asn Asp 20 25 30 Leu Ile Met Val Pro Ser Arg Leu Gly Glu Ser Thr Gly Pro Val Phe 35 40 45 Gly Asp Arg Asp Leu Gly Asp Ile Asp Asn Asp Met Thr Lys Val Asn 50 55 60 Gly Gly Glu Ala Ile Gly Gln Arg Ile Phe Val His Gly Arg Val Leu 65 70 75 80 Gly Phe Asp Gly Lys Pro Val Pro His Thr Leu Val Glu Ala Trp Gln 85 90 95 Ala Asn Ala Ala Gly Arg Tyr Arg His Lys Asn Asp Ser Trp Pro Ala 100 105 110 Pro Leu Asp Pro His Phe Asn Gly Val Ala Arg Thr Leu Thr Asp Lys 115 120 125 Asp Gly Gln Tyr His Phe Trp Thr Val Met Pro Gly Asn Tyr Pro Trp 130 135 140 Gly Asn His His Asn Ala Trp Arg Pro Ala His Ile His Phe Ser Leu 145 150 155 160 Tyr Gly Arg Gln Phe Thr Glu Arg Leu Val Thr Gln Met Tyr Phe Pro 165 170 175 Asn Asp Pro Leu Phe Phe Gln Asp Pro Ile Tyr Asn Ala Val Pro Lys 180 185 190 Gly Ala Arg Glu Arg Met Ile Ala Thr Phe Asp Tyr Asp Glu Thr Arg 195 200 205 Glu Asn Phe Ala Leu Gly Tyr Lys Phe Asp Ile Val Leu Arg Gly Arg 210 215 220 Asn Ala Thr Pro Phe Glu 225 230 <210> 2 <211> 204 <212> PRT <213> PcaG polypeptide <400> 2 Met Ile Asp Thr Gly Lys Asn Gly Glu Phe Arg Tyr Glu Gln Ser Asn 1 5 10 15 Ile Ile Asp Gln Asn Glu Ala Glu Phe Gly Ile Thr Pro Ser Gln Thr 20 25 30 Val Gly Pro Tyr Val His Ile Gly Leu Thr Leu Glu Gly Ala Glu His 35 40 45 Leu Val Glu Pro Gly Ser Glu Gly Ala Val Ser Phe Thr Val Ser Ala 50 55 60 Thr Asp Gly Asn Gly Asp Pro Ile Ala Asp Ala Met Phe Glu Leu Trp 65 70 75 80 Gln Ala Asp Pro Glu Gly Ile His Asn Ser Asp Leu Asp Pro Asn Arg 85 90 95 Thr Ala Pro Ala Thr Ala Asp Gly Phe Arg Gly Leu Gly Arg Ala Met 100 105 110 Ala Asn Ala Gln Gly Glu Ala Thr Phe Thr Thr Leu Val Pro Gly Ala 115 120 125 Phe Ala Asp Glu Ala Pro His Phe Lys Val Gly Val Phe Ala Arg Gly 130 135 140 Met Leu Glu Arg Leu Tyr Thr Arg Ala Tyr Leu Pro Asp Ala Asp Leu 145 150 155 160 Ser Thr Asp Pro Val Leu Ala Val Val Pro Ala Asp Arg Arg Asp Leu 165 170 175 Leu Val Ala Gln Lys Thr Asp Asp Gly Phe Arg Phe Asp Ile Thr Val 180 185 190 Gln Ala Glu Asp Asn Glu Thr Pro Phe Phe Gly Leu 195 200 <210> 3 <211> 372 <212> PRT <213> PcaB polypeptide <400> 3 Met Lys Pro His Phe Leu Asp Ser Lys Leu Thr Arg Ser Leu Tyr Ser 1 5 10 15 Asp Leu Ala Gly Ser Gly Glu His Leu Ser Ser Leu Ser Asp Glu Thr 20 25 30 Phe Leu Lys Asn Leu Leu Val Val Glu Ala Ala Leu Ala Val Ala Ala 35 40 45 Ala Pro Glu His Ala Ala Met Ala Lys Ala Thr Ile Asp Ser Tyr Gln 50 55 60 Leu Asp Val Glu Glu Leu Ser Arg Arg Ala Ala Glu Gly Gly Asn Pro 65 70 75 80 Leu Ile Pro Leu Val Thr Asp Leu Lys Ala Ile Asn Pro Ala Gly Ile 85 90 95 His Ile Gly Ala Thr Ser Gln Asp Ile Ile Asp Ser Ala Leu Met Leu 100 105 110 Cys Met Lys Glu Gly Val Gly Glu Val Val Asp Lys Leu Lys Lys Leu 115 120 125 Ala Arg Asp Leu Ala Glu Leu Thr Ala Glu His Lys Ala Thr Pro Ile 130 135 140 Met Gly Arg Thr Leu Gly Gln Ile Ala Thr Pro Thr Thr Phe Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Gly Gly Trp Leu Val Ala Val Asp Asn Ala Ala Arg Ala Leu 165 170 175 Glu Ala Leu Glu Phe Pro Val Ser Tyr Gly Gly Ala Ser Gly Asn Met 180 185 190 Thr Ala Val His Pro Arg Gly Phe Glu Ile Gln Ala Lys Leu Ala Glu 195 200 205 Glu Leu Gly Leu Phe Asp Pro Gln Trp Val Trp His Ser Asp Arg Thr 210 215 220 Pro Ile Thr Ala Ile Ala Ser Ala Leu Ala Thr Ala Ala Gly Val Val 225 230 235 240 Arg Lys Ile Ala Gly Asp Val Val Phe Tyr Ser Gln Thr Glu Val Gly 245 250 255 Glu Leu Arg Glu Lys Ser Pro Gly Gly Ser Ser Ala Met Pro His Lys 260 265 270 Ala Asn Pro Ala Ala Ala Ile Ala Cys Asp Gly Tyr Ala Arg Arg Ala 275 280 285 Pro Gly Leu Leu Ala Thr Leu Phe Asp Ala Leu Asp Cys Arg Leu Gln 290 295 300 Arg Gly Thr Gly Ser Trp His Ala Glu Trp Ala Thr Leu Arg Glu Leu 305 310 315 320 Ala Ala Val Thr His Ser Ala Val Ser Arg Ala Ala Thr Ser Ile Asp 325 330 335 Gly Ile Thr Val Asn Val Asp Val Met Ala Ser Arg Val Asn Gly Pro 340 345 350 Thr Gly His Ala Glu Asp Leu Ala Glu Arg Ala Leu Glu Ile Tyr Gly 355 360 365 Lys Gly Arg Ser 370 <210> 4 <211> 122 <212> PRT <213> PcaC polypeptide <400> 4 Met Asp Arg Tyr Glu Thr Gly Met Lys Asn Arg Arg Glu Val Leu Gly 1 5 10 15 Asp Ala His Val Asp Arg Ala Val Ala Asn Thr Thr Glu Val Thr Glu 20 25 30 Lys Phe Gln Asp Phe Ile Thr Arg Thr Ala Trp Gly Asp Ile Trp Glu 35 40 45 Arg Pro Gly Leu Asp His Thr Gln Arg Arg Leu Leu Thr Ile Ala Ile 50 55 60 Leu Thr Ala Val Gly Asn Asp Gly Glu Leu Asp Met His Ile Arg Ala 65 70 75 80 Ala Leu Arg Ala Gly Val Asp Gln Glu Thr Ile Gly Glu Val Ile Leu 85 90 95 His Thr Ala Val Tyr Ala Gly Val Pro Asn Ser Asn His Gly Phe Lys 100 105 110 Leu Leu Asn Asn Ala Val Ser Asp Leu Gln 115 120 <210> 5 <211> 408 <212> PRT <213> PcaF polypeptide <400> 5 Met Asn Pro Gln Asp Ile Val Ile Cys Ser Pro Leu Arg Thr Pro Val 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Gly Ser Phe Thr Gly Val Pro Val Glu Glu Leu Ala 20 25 30 Thr Thr Val Ile Asn Ala Ile Val Glu Ala Thr Gly Ile Thr Gly Asp 35 40 45 Asp Val Asp Asp Leu Ile Leu Gly Gln Ala Ser Pro Asn Gly Ala Ala 50 55 60 Pro Ala Leu Gly Arg Val Val Ala Leu Asp Ser Lys Leu Gly Gln Asn 65 70 75 80 Val Pro Gly Met Gln Leu Asp Arg Arg Cys Gly Ser Gly Leu Gln Ala 85 90 95 Ile Val Thr Ala Ala Ala His Val Ala Ser Gly Ala Ala Asp Leu Ile 100 105 110 Ile Ala Gly Gly Ala Glu Ser Met Ser Arg Val Glu Tyr Thr Val Ser 115 120 125 Gly Asp Ile Arg Trp Gly Val Lys Gly Gly Asp Met Gln Leu Arg Asp 130 135 140 Arg Leu Ala Glu Ala Arg Glu Thr Ala Gly Gly Arg Asn His Pro Ile 145 150 155 160 Pro Gly Gly Met Ile Glu Thr Ala Glu Asn Leu Arg Arg Glu Tyr Gly 165 170 175 Ile Ser Arg Glu Glu Gln Asp Lys Ile Ser Ala Ala Ser Gln Gln Arg 180 185 190 Trp Gly Lys Ala Ala Asp Ala Gly Leu Phe Asp Asp Glu Ile Val Pro 195 200 205 Val Thr Val Pro Ala Lys Lys Arg Gly Gln Glu Pro Thr Ile Val Ser 210 215 220 Arg Asp Glu His Gly Arg Pro Gly Thr Thr Val Glu Lys Leu Ala Ala 225 230 235 240 Leu Arg Pro Ile Met Gly Arg Gln Asp Ala Glu Ala Thr Val Thr Ala 245 250 255 Gly Asn Ala Ser Gly Gln Asn Asp Gly Ala Ala Ala Val Ile Val Thr 260 265 270 Thr Arg Ala Lys Ala Glu Glu Lys Gly Leu Arg Pro Val Met Arg Leu 275 280 285 Ala Gly Trp Ser Val Ala Ala Val Pro Pro Glu Thr Met Gly Ile Gly 290 295 300 Pro Val Pro Ala Thr Lys Lys Val Leu Asp Arg Leu Gly Leu Thr Leu 305 310 315 320 Glu Asp Ile Gly Ala Ile Glu Leu Asn Glu Ala Phe Ala Ala Gln Ala 325 330 335 Leu Ser Val Leu Lys Glu Trp Asn Ile Ser Trp Glu Asp Glu Arg Val 340 345 350 Asn Pro Leu Gly Ser Gly Ile Ser Met Gly His Pro Val Gly Ala Thr 355 360 365 Gly Ala Arg Met Ala Val Thr Leu Ala His Arg Met Gln Arg Glu Asn 370 375 380 Thr Gln Tyr Gly Leu Ala Thr Met Cys Ile Gly Gly Gly Gln Gly Leu 385 390 395 400 Ala Ala Val Phe Glu Lys Glu Asn 405 <210> 6 <211> 251 <212> PRT <213> PcaD polypeptide <400> 6 Met Ala Ile Leu His Ser Val Ser Tyr Gly Thr Ser Asp Asn Thr Leu 1 5 10 15 Val Phe Ile Gly Ser Leu Gly Ser Thr Thr Asp Met Trp Leu Pro Gln 20 25 30 Leu Asp Ala Leu His Lys Asp Phe Arg Val Ile Ala Val Asp His Arg 35 40 45 Gly His Gly Leu Ser Glu Leu Ile Glu Gly Thr Pro Thr Val Ala Asp 50 55 60 Leu Ala Gln Asp Val Leu Asp Thr Leu Asp Asp Leu Gly Val Gly Asn 65 70 75 80 Phe Gly Val Ile Gly Leu Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Gln Tyr Leu 85 90 95 Ala Ala Thr Ser Asp Arg Val Thr Lys Ala Ala Phe Met Cys Thr Ala 100 105 110 Ala Lys Phe Gly Glu Pro Gln Gly Trp Leu Asp Arg Ala Ala Ala Cys 115 120 125 Arg Glu Asn Gly Thr Gly Ser Leu Ser Glu Ala Val Ile Gln Arg Trp 130 135 140 Phe Ser Pro Thr Trp Leu Glu Asn Asn Pro Ala Ser Arg Glu His Phe 145 150 155 160 Glu Ala Met Val Ala Gly Thr Pro Ser Glu Gly Tyr Ala Leu Cys Cys 165 170 175 Glu Ala Leu Ala Thr Trp Asp Phe Thr Asp Arg Leu Gly Glu Ile Thr 180 185 190 Val Pro Val Leu Thr Ile Ala Gly Ala Asp Asp Pro Ser Thr Pro Pro 195 200 205 Ala Thr Val Gln Ile Ile Ala Asp Gly Val Gly Gly Glu Ser Arg Ala 210 215 220 Glu Val Leu Ser Pro Ala Ala His Val Pro Thr Val Glu Arg Pro Asn 225 230 235 240 Glu Val Asn Glu Leu Leu Ala Gln His Phe Ala 245 250 <210> 7 <211> 250 <212> PRT <213> PcaI polypeptide <400> 7 Met Ser His Met Ile Asn Lys Ser Ile Ser Ser Thr Ala Glu Ala Val 1 5 10 15 Ala Asp Ile Pro Asp Gly Ala Ser Ile Ala Val Gly Gly Phe Gly Leu 20 25 30 Val Gly Ile Pro Thr Ala Leu Ile Leu Ala Leu Arg Glu Gln Gly Ala 35 40 45 Gly Asp Leu Thr Ile Ile Ser Asn Asn Leu Gly Thr Asp Gly Phe Gly 50 55 60 Leu Gly Leu Leu Leu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Lys Ser Ile Gly Ser 65 70 75 80 Tyr Leu Gly Ser Asn Lys Glu Tyr Ala Arg Gln Tyr Leu Glu Gly Glu 85 90 95 Leu Thr Val Glu Phe Thr Pro Gln Gly Thr Leu Ala Glu Arg Leu Arg 100 105 110 Ala Gly Gly Ala Gly Ile Pro Ala Phe Tyr Thr Thr Ala Gly Val Gly 115 120 125 Thr Gln Val Ala Glu Gly Gly Leu Pro Gln Arg Tyr Asn Thr Asp Gly 130 135 140 Thr Val Ala Val Val Ser Gln Pro Lys Glu Thr Arg Glu Phe Asn Gly 145 150 155 160 Gln Leu Tyr Val Met Glu Glu Gly Ile Arg Ala Asp Tyr Ala Leu Val 165 170 175 His Ala His Lys Ala Asp Arg Phe Gly Asn Leu Val Phe Arg Lys Thr 180 185 190 Ala Gln Asn Phe Asn Pro Asp Ala Ala Met Ser Gly Lys Ile Thr Ile 195 200 205 Ala Gln Val Glu His Phe Val Asp Glu Leu His Pro Asp Glu Ile Asp 210 215 220 Leu Pro Gly Ile Tyr Val Asn Arg Val Val His Val Gly Pro Gln Glu 225 230 235 240 Thr Gly Ile Glu Asn Arg Thr Val Ser Asn 245 250 <210> 8 <211> 211 <212> PRT <213> PcaJ polypeptide <400> 8 Met Thr Trp Asp His Asn Gln Met Ala Ala Arg Val Ala Gln Glu Leu 1 5 10 15 Glu Asp Gly Gln Tyr Val Asn Leu Gly Ile Gly Met Pro Thr Leu Ile 20 25 30 Pro Gly Tyr Leu Pro Glu Gly Leu Glu Val Ile Leu His Ser Glu Asn 35 40 45 Gly Val Leu Gly Val Gly Pro Tyr Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asp Pro 50 55 60 Glu Leu Ile Asn Ala Gly Lys Glu Thr Ile Thr Val Ala Pro Gly Ala 65 70 75 80 Ser Tyr Phe Ser Ser Ser Asp Ser Phe Ala Met Ile Arg Ser Lys Ser 85 90 95 Val Asp Val Ala Val Leu Gly Val Met Glu Val Ser Gln Tyr Gly Asp 100 105 110 Leu Ala Asn Trp Met Ile Pro Gly Lys Leu Val Lys Gly Met Gly Gly 115 120 125 Ala Met Asp Leu Val His Gly Ala Ser Lys Ile Ile Ala Met Thr Asp 130 135 140 His Ile Thr Lys Lys Gly Ala Pro Lys Ile Leu Lys Glu Cys Arg Leu 145 150 155 160 Pro Leu Thr Gly Ala Lys Cys Val Asp Met Ile Val Thr Thr His Ala 165 170 175 Val Phe Ser Val Asp Pro Glu Glu Gly Leu Thr Leu Ile Glu Cys Ala 180 185 190 Asp Gly Val Thr Val Glu Glu Leu Arg Glu Ile Thr Glu Ala Asp Phe 195 200 205 Lys Val Ala 210 <210> 9 <211> 693 <212> DNA <213> pcaH polynucleotide <400> 9 atggacatcc cacacttcgc cccgacggga ggcgaatact ccccactgca cttcccggag 60 taccggacca ccatcaagcg caacccaagc aacgatctca tcatggttcc tagtcgcctc 120 ggcgagtcca cgggacctgt cttcggcgac cgcgacttgg gagacatcga caacgacatg 180 accaaggtga acggtggcga ggctatcggc cagcgcatct tcgttcacgg ccgtgtcctc 240 ggtttcgatg gcaagccagt tccgcacacc ttggtcgagg cgtggcaggc aaacgccgca 300 ggccgttacc gccacaagaa tgactcctgg ccagcgccac tggatccaca cttcaacggt 360 gttgcacgta ctctcaccga caaggacggc cagtaccact tctggaccgt tatgccaggt 420 aattaccctt ggggtaacca ccacaacgca tggcgcccgg cgcacattca cttctcgctc 480 tatggtcgtc agtttacgga gcgtctggtc acccagatgt acttcccgaa cgatccattg 540 ttcttccagg atccgatcta caacgcggtg ccaaagggtg cacgtgagcg catgatcgca 600 acgttcgact atgacgagac ccgtgaaaac ttcgcgcttg gttacaagtt cgacatcgtc 660 cttcgtggcc gcaacgccac cccatttgag taa 693 <210> 10 <211> 615 <212> DNA <213> pcaG polynucleotide <400> 10 atgattgata cagggaagaa cggcgagttc cgctacgagc agtcgaatat catcgatcag 60 aacgaagccg agttcggcat cactccttca cagaccgtgg gcccttacgt ccacatcggt 120 ttgacccttg aaggtgcgga gcatctcgtg gagccaggtt cggaaggcgc ggtgtccttt 180 actgtttccg caactgatgg caacggcgac cccatcgcgg atgccatgtt tgaactgtgg 240 caggccgatc cagagggcat ccacaactct gatttggatc caaaccgcac agcaccagca 300 accgcagatg gcttccgcgg gcttggtcgc gcgatggcaa acgcgcaggg tgaggcaacg 360 ttcaccactt tggttccggg agcattcgca gatgaggcac cacacttcaa ggttggtgtg 420 ttcgcccgtg gcatgctgga gcgtctgtac actcgcgcat acctgccaga cgccgatttg 480 agcaccgacc cagttttggc tgtggtccca gctgatcgac gtgacctcct ggtggctcaa 540 aagaccgatg atggattccg cttcgacatc actgtccagg ctgaagacaa tgaaacccca 600 ttttttggac tctaa 615 <210> 11 <211> 1119 <212> DNA <213> pcaB polynucleotide <400> 11 atgaaacccc attttttgga ctctaaattg acccgatctt tatactccga ccttgctggt 60 agtggagaac acctcagcag cctttccgac gagactttcc taaagaatct tcttgtcgtg 120 gaggccgctt tggcggttgc agctgccccc gagcacgcag caatggcgaa ggccaccatt 180 gattcttatc agttggatgt ggaggagctt tcccgtcgcg cagccgaggg cggtaatccg 240 ctcattccgc tggtcactga cctcaaggcc atcaatccgg caggcatcca cattggcgca 300 acgagccagg acatcattga ttctgcgtta atgctgtgca tgaaggaagg ggtgggggag 360 gtcgtcgaca agcttaaaaa gcttgcgcga gatttggccg agctcaccgc ggagcataaa 420 gcaaccccga tcatggggcg cacgttgggg cagatcgcga cgccgacgac gttcggcgcg 480 ctgaccggcg gctggctggt tgcggtggac aatgcggcac gcgccctgga ggcgctggag 540 tttccggtgt cgtatggcgg tgccagcgga aatatgacgg cggtgcaccc gcgtggcttc 600 gagattcagg cgaagctggc cgaggagttg ggcctttttg atccgcagtg ggtgtggcat 660 tccgatcgca cgccgatcac tgcgatcgcg tcggcgctgg caacggccgc tggtgtggta 720 cgcaaaattg ctggtgacgt ggtgttttac tcacaaaccg aggtcggcga gttgcgggag 780 aaatcccccg gcggcagctc cgcgatgccc cacaaagcca atccggccgc tgcgattgcg 840 tgcgacggtt acgcgcgccg ggcacctggc cttcttgcaa cgcttttcga cgccctcgac 900 tgccgtttgc agcgcggcac cggcagctgg cacgcggagt gggcaacgct gcgcgagttg 960 gctgctgtca ctcactcagc agtgagcagg gctgcaacca gcatcgatgg catcaccgtc 1020 aacgttgatg tgatggcaag tcgcgtcaat ggaccaaccg ggcacgccga agatttggcg 1080 gagcgggcac tagaaattta tggaaaagga cgcagttaa 1119 <210> 12 <211> 369 <212> DNA <213> pcaC polynucleotide <400> 12 atggatcgct atgaaaccgg aatgaaaaac cgccgcgagg tactgggaga tgcccatgtg 60 gatcgcgccg tggcgaacac caccgaggtg actgagaagt ttcaggattt catcactcgc 120 acagcgtggg gcgatatttg ggaacgtcca ggccttgatc acactcagcg tcgcctgctc 180 accatcgcga ttttgaccgc ggtgggcaat gacggcgagt tggacatgca cattcgtgct 240 gctctgcgcg ctggcgtgga tcaggaaacc atcggcgagg tcatcctgca cactgcggtg 300 tatgcgggtg tgccgaactc caaccatggt ttcaagctgc tgaacaacgc tgtgtcagac 360 cttcagtaa 369 <210> 13 <211> 1227 <212> DNA <213> pcaF polynucleotide <400> 13 atgaaccctc aagatattgt catctgttcc ccattgcgca ccccagttgg tgcttacggc 60 ggatccttca ccggcgtccc tgttgaagaa ttggccacca ccgtgatcaa cgcgatcgtt 120 gaggcaaccg gcatcaccgg cgacgatgtg gacgatctga tcctcggcca ggcatccccc 180 aacggtgcgg ctccagcact gggccgtgtt gttgctctag attccaagct tggccaaaac 240 gttccaggca tgcagcttga tcgccgctgt ggttccggcc tgcaggcaat cgtcaccgct 300 gctgcacacg ttgcatccgg cgctgctgat ctgatcatcg caggtggcgc agaatccatg 360 agccgcgttg agtacaccgt gtccggcgat atccgttggg gtgtcaaggg cggcgacatg 420 cagcttcgtg accgccttgc agaagcacgc gaaaccgctg gcggacgcaa ccacccgatc 480 cctggtggca tgatcgagac cgctgagaac ctgcgtcgcg aatacggcat ctcccgcgag 540 gagcaggaca agatctccgc agcgtcccag cagcgttggg gcaaggctgc tgatgcgggg 600 cttttcgacg acgagatcgt gccagtcacc gtccctgcca agaagcgcgg ccaggagcca 660 accatcgttt ctcgagacga gcatggtcga ccaggaacaa ccgtcgaaaa gcttgctgct 720 ttgcgcccca tcatgggccg ccaggatgcg gaagcaaccg tcaccgctgg caacgcgtcc 780 ggccaaaatg atggcgctgc tgccgtcatc gtgaccactc gcgccaaggc cgaggagaag 840 ggcctgcgcc cagtcatgcg tttggctggc tggtctgtgg ctgctgttcc cccagagacc 900 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cgagcacttc 480 gaagccatgg ttgccggcac cccatctgag ggttacgcgc tgtgctgcga ggcgttggca 540 acctgggatt tcaccgatcg cctgggagaa atcaccgtgc cagtgctcac catcgcaggt 600 gccgatgacc cctccactcc tccagcaacc gtgcagatca ttgccgatgg cgttggcggc 660 gagtcccgcg cagaggtcct aagcccagcc gcgcacgtac caaccgtgga acgtccaaac 720 gaggtaaatg aactgctagc acagcatttc gcttaa 756 <210> 15 <211> 753 <212> DNA <213> pcaI polynucleotide <400> 15 atgtctcaca tgattaacaa gagcatttct tccactgctg aagcggtggc cgatatccca 60 gacggtgcgt ccatcgccgt cggtggtttc ggcctcgtgg gcatccccac tgcattgatc 120 ctcgccctcc gcgaacaagg cgcaggcgat ctgaccatca tttccaacaa cctaggcacc 180 gacggtttcg gcctcggact gttgcttttg gataagaaga tctccaagtc catcggctcc 240 taccttggct ccaacaagga atatgcacgc cagtacctgg aaggagaact caccgtcgag 300 ttcaccccgc agggcacctt ggctgaacgc ctccgcgcag gtggcgccgg catccctgcg 360 ttttacacca ccgcaggcgt gggcacccag gtcgcagaag gcggactccc acagcgctac 420 aacaccgacg gcaccgtcgc cgtggtgtcc cagccaaagg aaacccgcga attcaacggc 480 cagctctacg tcatggaaga gggcatccgc gccgattacg cactcgtgca cgcacacaaa 540 gcagatcgct ttggcaacct ggtgttccgc aagaccgcgc agaacttcaa cccagatgca 600 gcaatgagcg gcaagatcac cattgctcag gtcgagcact ttgtagacga actccaccca 660 gatgagatcg atctgccagg aatttacgtc aaccgcgtcg tccacgttgg accgcaggaa 720 accggaatcg aaaacaggac ggtgtctaac taa 753 <210> 16 <211> 636 <212> DNA <213> pcaJ polynucleotide <400> 16 atgacttggg atcataacca aatggcagcc cgcgttgccc aggaacttga agacggccag 60 tacgtcaacc tcggcatcgg catgcctaca cttatccccg gctacctgcc tgagggacta 120 gaggttatcc ttcactccga aaacggtgtg ctgggcgttg gaccttaccc aactgaagag 180 gaacttgatc ctgagctgat caacgccggc aaggaaacca tcacggttgc acctggcgca 240 tcctacttct cctcttctga ttctttcgcc atgatccgct ccaagtctgt cgacgttgca 300 gtcttgggcg ttatggaagt ctcccagtac ggcgacctgg ccaactggat gattcccggc 360 aagctggtca agggtatggg tggcgcaatg gatctggtgc acggcgcatc caagatcatc 420 gccatgaccg atcacatcac caagaagggc gctccgaaga tccttaagga gtgtcgcctc 480 ccactgactg gcgcgaagtg cgtggacatg attgtcacca cccacgctgt gttctctgtg 540 gaccctgaag aaggcctcac gctcatcgag tgcgccgacg gtgtcaccgt tgaggaactc 600 cgcgaaatca ccgaagccga tttcaaagtt gcttaa 636

Claims (8)

1. i) 서열번호 1, 2, 3 및 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 도입된 재조합 벡터; ii) 서열번호 5 및 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 도입된 재조합 벡터; 및 iii) 서열번호 7 및 8의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 도입된 재조합 벡터;로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 재조합 벡터가 코리네박테리움 글루타미쿰에 형질 도입되어 만들어진 항산화 활성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 서열번호 1, 2, 3 및 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 9, 10, 11 및 12인 것; 서열번호 5 및 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 13 및 14인 것; 및 서열번호 7 및 8의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 15 및 16인 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항 또는 제4항의 형질전환체를 이용하여 아미노산 생산을 증가시키는 방법.

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