KR102245274B1 - 최소 유전체를 갖는 신규 미생물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 최소 유전체를 갖는 신규 미생물의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 미생물을 LB 브로쓰(broth)를 포함하는 배지에서 LB 브로쓰의 농도 감소에 따라 단계적으로 배양하는 단계를 포함하는, 게놈의 크기가 야생형보다 작은 신규 미생물의 제조 방법; 및 상기 방법으로 제조된 게놈의 크기가 야생형보다 작은 신규 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 신규 미생물은 작은 게놈 크기에도 불구하고 생장률, 피루베이트 생산능, 단백질 번역 효율이 높으며 돌연변이 발생율이 낮으므로, 재조합 단백질 또는 피루베이트 생산 등의 산업에서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

최소 유전체를 갖는 신규 미생물 및 이의 제조 방법 {A novel genome-reduced microorganism and a method of producing thereof}

본 발명은 최소 유전체를 갖는 신규 미생물, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 유용산물 제조방법에 관한 것이다.

자기 복제를 통해 생명을 유지하는데 필요한 유전자만을 포함하는 최소한의 게놈에 대한 연구가 진행되고 있다. 예로서, 1.08Mbp 크기를 갖는 마이코플라즈마 마이코이데스(Mycoplasma mycoides)의 경우, "상향식(bottom-up)" 접근법으로 불리는, 이의 게놈을 재설계한 버전(JCVI-syn3.0)이 드노보(de novo) 게놈 합성으로 생성되었으며, 유사 세균인 마이코플라즈마 카프리콜룸(Mycoplasma capricolum)에 상기 재설계한 게놈을 이식하여 살아있는 유기체를 만드는데 성공하였다(Science. 2016 Mar 25;351(6280):aad6253.).

상기와 같은 게놈 디자인에 있어서, 영양 성분이 풍부하여 성장 지연이 없는 배지에서부터 순차적 게놈 감소가 이루어지는, "하향식(top-down)" 접근 방식 또한 주로 이용되고 있다. 이와 관련하여는, 상기의 방식을 적용하여, 1,2-프로판디올을 생산하는 신규 미생물이 개발된바 있다(한국 등록특허공보 제10-1528943호).

그러나, 게놈이 감소한 균주가 영양 성분이 없는 최소 배지에서 생장하는 경우, 생장률이 감소되는 단점이 나타나고 있다. 감소된 생장률은 합성 치사율 및 상호 연결된 세포 구성 요소 간의 상호 작용과 같은 일부 박테리아 게놈 공정에 대한 이해의 부족에 의해 야기되는 것이므로, 상술한 순차적 방법으로는 연구에 활용되거나 산업상 이용 가능성이 높은 균주로서 사용될 수 있는, 유용한 최소 게놈을 구성하기가 쉽지 않은 실정이었다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 최소 게놈을 가지면서도 산업상 이용 가능성이 높은 신규 미생물을 개발하고자 예의 노력 연구한 결과, LB 브로쓰 및 이의 농도 구배를 이용한 적응형 실험실 진화(adaptive laboratory evolution; ALE)를 통해 게놈의 크기가 야생형보다 작은 신규 미생물을 제조하였고, 상기 신규 미생물은 작은 게놈 크기에도 불구하고 생장률이 떨어지지 않으면서 야생형에 비하여 단백질 번역 효율, 피루베이트 생산능이 높으며 돌연변이 발생율이 낮음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 최소 유전체를 갖는 신규 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 신규 미생물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 신규 미생물을 이용하여 피루베이트 또는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 게놈의 크기가 야생형보다 작은 신규 미생물을 제공한다.

본 발명자들은, 기존의 게놈이 감소된 대장균이 나타내는 낮은 성장 효율의 단점을 극복한, 게놈이 감소되었음에도 성장 효율이 높고, 나아가 mRNA의 번역 효율이 높아 단백질 생산능이 높으며, 피루베이트 생산능이 높은 신규 미생물을 개발하였다. 본 발명에서 제공하는 신규 미생물은 목적 단백질 및 피루베이트의 생산을 위한 숙주로서 매우 유용하게 활용될 수 있다.

상기 신규 미생물은 수탁번호 KCTC 13699BP로 기탁된 것일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 최소 게놈 크기를 갖는다고 알려진 대장균 MS56 균주를 LB 브로쓰의 농도를 단계적으로 감소시키면서 배양한 결과, MS56 균주보다 생장률이 우수하고 야생형과 세포 생장률이 동등한 대장균 균주 "eMS57"을 제조하였으며(도 4), 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 2018년 11월 8일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 13699BP를 부여받았다.

상기 신규 미생물은 게놈의 크기가 야생형보다 작은 것을 특징으로 하며, 구체적으로 상기 게놈의 크기는 3.5 내지 3.7Mbp일 수 있다.

현재, 야생형 대장균 균주의 게놈 크기는 약 4 내지 6Mbp으로 알려져 있다. 반면, 최소 게놈을 갖는 미생물은 대장균 균주 "MS56"로서 약 3.6Mbp의 크기를 갖는 것으로 알려져 있으며(Appl Microbiol Biotechnol. 2014 Aug;98(15):6701-13.), 본 발명의 미생물 균주는 상기 MS56 균주로부터 유래된바 이와 유사한 게놈 크기를 갖는다. 또한, 본 발명에 따른 신규 미생물은 물질 대사 등에 부담이 되어 생장률을 저하시키는 유전자나 돌연변이 일으키는 유전자 등이 제거된 상태이므로, 이에 따른 생장률 증가, 돌연변이 발생률 감소 등의 특징을 나타낼 수 있고, 목적 산물의 생산을 위한 생물공학적 조작이 간편하다는 장점이 있다.

본 발명의 일 구현예에서는 신규 미생물의 게놈 시퀀싱, 전사체 분석 및 리보솜 프로파일링을 수행하여, 야생형 균주 MG1655와 비교하여 유전자 변이 및 단백질 발현 수준 변화를 확인하였는바, 상기와 같은 유전자 변이 및/또는 단백질 발현 수준의 변화가 본 발명의 신규 미생물의 장점을 나타내는 요인일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 상기 신규 미생물은 생장률이 야생형보다 높은 것일 수 있다.

구체적으로, LB 브로쓰 등의 영양 성분이 없는 조건에서 최소 게놈을 갖는 미생물은 거의 생육할 수 없으나, 본 발명의 신규 미생물은 최소 게놈을 가지고 있음에도 불구하고 추가의 영양 성분이 포함되지 않은 최소 배지에서도 야생형보다 유사하거나 더 높은, 빠른 성장 속도 및 충분한 세포 밀도를 나타낼 수 있다.

또한, 상기 신규 미생물은 피루베이트 생산능이 야생형보다 높은 것일 수 있다.

구체적으로, 피루베이트는 생물체 내에서 물질대사의 중간물질로서 작용한다. 따라서, 일반적인 미생물은 이를 생체 내 대사에서만 사용하며 생체 외로 배출하지 않으나, 본 발명의 신규 미생물은 야생형보다 생체 내 생산양이 높을 뿐만 아니라 생체 외로 배출하는 양이 약 9배 이상으로서, 매우 우수한 피루베이트 생산능을 나타낸다.

한편, 상기 피루베이트는 생물체 내에서 물질대사의 용도 이외에, 약리적 효과로서 NADH 생산 자극에 의한 신진 대사를 향상시키고 심장 기능을 증가시킴이 알려진바 있으며(Pflugers Arch. 2016 Jan; 468(1): 131-142.; Lancet. 353 (9161): 1321-1323.), 또한 피부 자극이 적고 피부 보습력 등이 우수한 효과가 있어 약학 및 화장료 조성물 등으로도 유용하게 활용될 가능성이 높다. 나아가, 최근 피루베이트를 전구체로 사용하여 면역 활성, 감염 에방, 뇌발달, 인지력 개선 등에 뛰어난 효능이 있는 시알릴락토스를 합성하는 방법이 개발된바(한국 공개특허공보 제2013-0062733호), 피루베이트의 활용은 더욱 증가할 것으로 예상된다.

또한, 상기 신규 미생물은 번역 효율이 야생형보다 높은 것일 수 있다.

구체적으로, 단백질의 생산은 유전자로부터 mRNA의 전사, 및 상기 mRNA로부터 단백질의 번역 과정으로 이루어진다. 따라서, 상기의 전사 과정이 잘 이루어져 mRNA의 양이 많아진다 하더라도 번역 과정에 버퍼링이 생기면 단백질의 생산 효율이 감소한다. 본 발명의 신규 미생물은 번역 버퍼링 현상을 나타내지 않으므로 높은 번역 효율을 달성할 수 있고, 이에 따라 높은 단백질 생산 효율을 나타낼 수 있다.

마지막으로, 상기 신규 미생물은 돌연변이 발생율이 낮은 것일 수 있다.

구체적으로, 상기의 낮은 돌연변이 발생율은 mutS(UniProtKB: P23909, NCBI Gene ID: 947206 등) 유전자에 의해 달성되는 것일 수 있고, 본 발명의 신규 미생물은 상기 유전자를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 미생물의 돌연변이는 미생물의 고유 특성이 손실되게 하며, 특히 병원성을 나타내는 등 인간에 해로운 특성을 나타내게 할 수도 있다. 또한, 본 발명의 신규 미생물은 이의 시작 균주 또는 야생형 균주에 비하여 산업 균주로서 이용될만한 유용한 특성을 나타내고 있는바 돌연변이 발생율을 최소화하여 불리한 특성을 나타내지 않게 함과 동시에 균주 고유의 특성을 유지하는 것이 중요하다.

본 발명에서, 상기 신규 미생물의 종류는 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다. 구체적인 예로, 에스케리키아(Escherichia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 엔테로박테리아(Enterobacteria) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 등의 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로 에스케리키아 속 미생물, 가장 구체적으로 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 신규 미생물인 eMS57 균주는 야생형 균주보다 약 9배 더 높은 정도로 세포 외 피루베이트를 배설하고(도 7), 낮은 돌연변이 발생율을 나타내며(도 10), 단백질의 번역 효율은 그 종류에 따라 더 우수하거나 유사함을 확인하였다(도 13).

이는, 본 발명의 신규 미생물은, 미생물 배양을 통해 단백질, 피루베이트 등의 목적 산물을 제조하는 산업에서 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

다른 하나의 양태는 상기 신규 미생물의 제조 방법을 제공한다.

이때, 상기 "신규 미생물"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어, "LB 브로쓰(broth)"는 미생물의 배양에 사용되는, 배지를 구성하는 영양 성분을 의미한다. LB 브로쓰, 리소제니 브로쓰(Lysogeny broth), 루리아 브로쓰(Luria broth), 레녹스 브로쓰(Lennox broth) 등으로도 불리며, 일반적으로 효모로부터 추출되어 미생물이 생장하는데 필요한 여러가지 영양물질이 함유된 효모 추출물(yeast extract), 단백질 공급원이 되는 트립톤(Tryptone), 배양할 세포가 삼투에 의하여 터지지 않도록 해주는 염화 나트륨(NaCl)으로 구성된다.

구체적으로, 상기 LB 브로쓰는 8 내지 12%(w/v) 트립톤, 3 내지 7%(w/v) 효모 추출물(yeast extract) 및 8 내지 12%(w/v)　NaCl을 포함할 수 있고; 더욱 구체적으로, 10%(w/v) 트립톤(tryptone), 5%(w/v) 효모 추출물(yeast extract) 및 10%(w/v)　NaCl을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 상기 LB 브로쓰를 포함하는 배지는 액상 또는 고형일 수 있으며, 본 발명의 신규 미생물을 제조하기 위하여 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.

구체적으로, 액상 배지인 경우, 증류수에 상기 범위의 트립톤, 효모 추출물 및 NaCl을 각각을 혼합하여 제조할 수 있고, 또한 증류수에 상기 범위의 트립톤, 효모 추출물 및 NaCl이 혼합된 것을 혼합하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 고형 배지인 경우, 상기 액상 배지에 젤라틴, 한천, 실리카겔 등의 적절한 물질을 첨가하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 목적상, 상기 제조 방법은 미생물을 상기 LB 브로쓰를 포함하는 배지에서, LB 브로쓰의 농도 감소에 따라 단계적으로 배양하는 단계를 필수 구성으로써 포함한다.

구체적으로, 상기 단계는 적응형 실험실 진화(adaptive laboratory evolution; ALE)의 과정일 수 있다. 상기 ALE는 미생물의 돌연변이를 얻기 위하여 사용되는 방법으로, 미생물의 생장 시 적당한 스트레스를 가하여 유전형 및 표현형의 변화를 야기한다. 본 발명은 최소의 게놈을 가지면서도 생존율이 증가된 미생물을 제조하는 것이 하나의 목적인바, 배지에 포함된 영양 성분인 LB 브로쓰를 점차 고갈시켜 적은 영양에서도 효율적으로 생육할 수 있는 미생물을 제조하였다.

구체적으로, 상기 LB 브로쓰의 농도 감소는 0.12 내지 0.08%(v/v), 0.07 내지 0.03%(v/v), 0.015 내지 0.005%(v/v), 0.003 내지 0.001%(v/v), 및 0%로 이루어질 수 있고; 더욱 구체적으로, 0.1%(v/v), 0.05%(v/v), 0.01%(v/v), 0.002%(v/v), 및 0%로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 신규 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 피루베이트 또는 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 본 출원의 미생물 배양에 사용할 수 있는 배지라면 특별한 제한 없이 사용할 수 있으며, 당업자라면 당업계에 공지된 내용을 토대로 적절히 선택하여 사용할 수 있고, 구체적으로는 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 또는 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.

상기 제조 방법은 미생물을 배양하는 단계 이후 배지 또는 미생물로부터 피루베이트 또는 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 회수 단계는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적 물질을 적절하게 회수하는 것일 수 잇다.

상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.

본 발명의 신규 미생물은 작은 게놈 크기에도 불구하고 야생형에 비하여 생장률, 피루베이트 생산능, 단백질 번역 효율이 높으며 돌연변이 발생율이 낮으므로, 재조합 단백질의 또는 피루베이트 생산 등의 산업에서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 MG1655 및 MS56의 성장 프로파일을 보여주는 그래프로서, A는 LB 배지에서의 성장 프로파일, 및 B는 M9 최소배지(M9 minimal medium)에서의 성장 프로파일에 관한 것이다. 이때, MG1655는 야생형 대장균 균주, MS56는 최소 게놈을 갖는 대장균 균주이다.
도 2는 LB가 보충된 M9 최소 배지에서의 MG1655 및 MS56의 생장률을 보여주는 그래프이다.
도 3은 LB 농도 및 시간에 따른 MS56의 세포 밀도를 보여주는 그래프로서, LB가 보충된 M9 최소 배지에서의 적응 진화된 MS56에 관한 것이다. LB 보충물은 0.1%에서 0%까지 시간의 흐름에 따라 단계별로 감소시켰다.
도 4는 상기 MS56으로부터 ALE을 통해 제조한, 진화된 균주인 eMS57 및 야생형 균주인 MG1655의 세포 밀도를 보여주는 그래프이다.
도 5는 MG1655, MS56 및 eMS57의 형태학적 변화를 보여주는 전자 현미경 이미지이다.
도 6은 MG1655 및 eMS57의 표현형 마이크로어레이 분석 결과에 관한 것으로서, 서로 다른 영양소에 대한 생장률을 보여주는 그래프이다.
도 7은 MG1655 및 eMG57의 최종 세포 밀도 및 세포 내/외의 피루베이트(pyruvate) 농도를 보여주는 그래프이다.
도 8은 피루베이트 유도체(3-플루로피루베이트; FP) 어세이 결과에 관한 것으로서, eMS57의 피루베이트 흡수 시스템에 관한 것이다. 이때, PDH는 피루베이트 이히드로게나제(pyruvate dehydrogenase)를 의미하며, 오차막대는 표준편차를 나타낸다.
도 9는 eMS57mutS⁺ 균주(#1, #2 및 #3)의 mutS 유전자의 발현량에 관한 것으로서, A는 mutS 유전자가 도입된 eMS57mutS⁺에서 mutS 유전자의 발현량을 보여주는 그래프, 및 B는 상기 유전자의 발현량을 보여주는 이미지에 관한 것이다.
도 10은 eMS57 및 eMS57mutS⁺의 돌연변이 수를 보여주는 그래프이다.
도 11은 MG1655 및 eMS57의 형광 단백질 생산 정도를 유세포 분석기를 이용하여 측정한 결과를 보여주는 크로마토그램이다.
도 12는 MG1655(A) 및 eMS57(B)의 번역 버퍼링 및 이에 따른 번역 효율을 보여주는 그래프이다. 각 균주의 유전자를 발현 수준에 따라 백분위 수로 나누었을 때 나타나는 762개 유전자의 번역 버퍼링에 관한 것으로, T는 총 유전자를 나타내고, 적색의 선은 백분위 수의 평균값에 대한 선형 회귀를 나타낸다.
도 13은 RNA-seq 및 Ribo-Seq의 프로파일을 비교한 크로마토그램으로서, A는 murQ 유전자, B는 gapA 유전자에 관한 것이다. A에서 MG1655 및 eMS57의 murQ의 발현 수준(expression levels)은 각각 12.18 및 10.20; 번역 수준(translation level)은 16.02 및 9.54; 및 번역 효율(translational efficiency)은 1.32 및 0.94를 나타내고, B에서 MG1655 및 eMS57의 gapA의 발현 수준은 각각 3484.22 및 3719.73; 번역 수준은 2223.45 및 3213.62; 및 번역 효율은 0.64 및 0.86을 나타낸다.
도 14는 eMS57의 게놈 시퀀싱 결과를 나타낸 것으로, 도 14a는 eMS57 게놈에서 삭제된 21 kb 영역을 나타낸 것이며, 도 14b는 MG1655, MS56, eMS57 및 MS56에 eMS57에서 삭제된 게놈 영역(21 kb) 삭제를 도입하거나 rpoS 삭제를 도입한 균주의 성장률을 나타낸 그래프이고, 도 14c는 ALE 수행에 따른 돌연변이 빈도를 히트맵으로 나타낸 것이다.
도 15는 eMS57의 전사체 분석 결과로, 도 15a는 MG1655 또는 eMS57의 σ⁷⁰ 결합 부위(프로모터)를 나타낸 것으로 S는 야생형(MG1655) 및 변이형(eMS57) σ⁷⁰ 모두 결합, D는 eMS57에서 삭제된 영역, M은 야생형만 E는 변이형만 특이적으로 결합하는 프로모터 개수고, 도 15b는 σ⁷⁰ 변이로 인해 변화된 유전자 발현 수준, 도 15c는 해당경로 및 TCA 사이클에서의 유전자 발현수준을 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 최소 게놈 및 우수한 생장률을 나타내는 eMS57 균주의 제조

최소 게놈을 가지면서도 높은 생장률을 나타내는 균주를 제조하기 위하여, ALE를 이용하였다. 구체적으로, 야생형 대장균 'MG1655' 균주로부터 55개 게놈 부위를 체계적으로 결실시켜 최소의 게놈 크기(약 3.6Mbp)를 갖는 'MS56' 균주를 ALE의 시작 균주로 사용하였다.

한편, 대장균 MS56은 37℃의 M9 포도당 배지에서 교반하여 성장시켰다. 매 12시간 마다 초기 OD_600nm가 약 0.005일 때 배양물을 새로운 배지로 옮겼다. MS56 및 MG1655의 생장률을 확인한 결과, MS56은 영양분이 풍부한 배지에서는 MG1655와 비슷한 성장 속도를 보였으나, 최소 배지에서는 심각한 성장 감소를 보임을 확인하였다(도 1).

이와 같이, MS56이 M9 최소 배지에서 낮은 성장 속도를 나타냄에 따라, 최소 게놈을 가지면서도 최소 배지에서 높은 성장 속도를 나타내는 균주를 제조하고자 하였다. 먼저, 배지에 0.1%(v/v) LB 브로쓰를 보충하여 MS56의 성장 속도를 MG1655의 2/3 수준으로 회복시켰다(도 2). 이후, 보충된 LB 브로쓰의 양을 0.1%(v/v), 0.05%(v/v), 0.01%(v/v), 0.002%(v/v)로 단계적으로 감소시켜 LB 없이도 성장이 이루어질 수 있도록 하였으며(도 3), 807 세대의 ALE(adaptive laboratory evolution) 후 LB를 최종적으로 제거하였다. 한편, ALE 중 세포 분열의 수는 하기 수학식 1에 따라 최종 및 초기 세포 밀도로부터 계산하였다. 한편, 상기 LB 브로쓰는 1 ℓ의 증류수에 10 g의 트립톤(tryptone), 5 g의 효모 추출물(yeast extract), 10 g의 NaCl을 혼합하여 제조하였다.

[수학식 1]

세대 수 = log₂(최종 세포 밀도/초기 세포 밀도)

그 결과, LB 영양소의 보충 없이 M9 최소 배지에서 MG1655에 필적하는 수준으로 최종 세포 밀도와 생장률을 회복한 진화된 균주를 제조할 수 있었으며, 이를 'eMS57'로 명명하였다(도 4).

실시예 2. eMS57의 표현형 확인

eMS57의 표현형을 확인하기 위하여, 먼저 eMS57, MS56 및 MG1655간의 형태를 전자현미경을 이용하여 비교하였다.

0.1M 인산 완충액 (pH 7.2)으로 완충된 2.5% 파라포름알데히드- 글루타르알데하이드 혼합물에 4℃에서 2시간 동안 1mL의 지수상 배양물(exponential phase culture)을 고정하였다. 고정한 시료를 실온 (25℃)에서 1시간 동안 0.1M 인산 완충액 (pH 7.2)으로 완충된 1% 오스뮴 테트록사이드 용액으로 처리하였다. 고정된 시료를 에탄올에서 탈수시키고, 이소아밀 아세테이트로 치환하여 액체 CO₂에서 임계점 건조(critical point-dried)하였다. 시료는 최종적으로 스퍼터 코팅기 SC502 (Polaron, Quorum Technologies, East Sussex, UK)에서 20nm 두께의 금으로 스퍼터 코팅되었고, SEM 이미지는 한국 생명공학연구원에 설치된 FEI Quanta 250 FEG 주사 전자현미경 (FEI, Hillsboro, OR, USA)에서 10 kV의 가속 전압으로 수득하였다. 투과 전자현미경 검사를 위해, SEM 이미지 측정에 사용된 것과 동일한 방법을 사용하여 고정된 샘플을 에탄올에서 탈수시킨 다음 프로필렌 옥사이드로 대체하고 60℃에서 36시간 동안 Epon-812 수지에 묻었다. 묻은 샘플을 Ultracut E Ultramicrotome (Leica, Wetzlar, Germany)을 사용하여 울트라-섹션 (ultra-section)을 수행하고 우라닐 아세테이트 및 리드 시트레이트로 이중 염색하였다. 한국 생명공학연구원에 설치한 CM20 투과형 전자현미경 (Philips, Amsterdam, Netherlands)에서 100kV의 가속 전압으로 시료를 검사하였다.

그 결과, eMS57은 야생형인 MG1655와 비슷한 세포 크기 및 길이를 나타냄을 확인하였고, 최소 게놈을 갖는 MS56보다는 길이가 더 짧은 것을 확인하였다(도 5).

실시예 3. 사용하는 영양원 확인

eMS57가 이용하는 영양원의 종류를 확인하기 위하여, eMS57, MS56 및 MG1655 각 균주에서 특성을 확인하였다.

먼저, 표현형 마이크로어레이는 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 균주를 BUG(Biolog Universal Growth) 아가에 분주하고, 37℃에서 하룻밤 성장시켰다. 이후, 세포를 접종 용액 A(80% IF-0a GN/GP Base)에 희석하였고, 투과율은 42%가 되도록 하였다. 42% 투과율의 세포 현탁액을 5X 접종 용액 B(83.33% IF-0a GN/GP Base 및 1.2% Biolog Redox Dye mix A)에 희석하였고, 85% 투과율을 갖는 세포 현탁액을 제조하였다. 이후, 상기 접종 용액 B에 탄소원으로서 19.8 mM 숙신산 나트륨(sodium succinate) 및 1.98 nM 구연산철(ferric citrate)을 첨가하였고, 100 ㎕의 상기 85% 투과율을 갖는 세포 현탁액을 PM 플레이트에 접종하고 세포 호흡을 측정하였다.

그 결과, 영양학적인 측면에서, eMS57은 MG1655보다 탄소, 질소, 인, 황 공급원에 대한 이용의 폭이 좁은 것을 확인하였다(도 6). 글리코레이트(glycolate)와 글리옥실레이트(glyoxylate)를 유일한 탄소원으로 사용하는 경우 eMS57의 세포 호흡은 관찰되지 않았고, MG1655와 eMS57은 질소 이용에 대하여 다른 선호도를 보였으나, eMS57의 경우 인과 황의 이용에는 큰 변화가 없음을 확인하였다. 또한, 시티딘(cytidine)에 대한 MG1655의 생장률은 eMS57보다 훨씬 높았으며, eMS57은 요산을 유일한 질소원으로 선호하는 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해, eMS57은 세포 호흡 시 피루베이트를 탄소원으로, 요산을 질소원으로 사용하는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. 피루베이트 생산능 확인

eMS57의 피루베이트 생산능을 확인하기 위하여, eMS57, MS56 및 MG1655 각 균주에서 특성을 확인하였다.

한편, 피루베이트 흡수능은 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 균주를 37℃의 LB 배지에서 8시간 동안 성장시키고, M9 피루베이트 배지(2 g/ℓ)의 피루베이트가 보충된 M9 최소 배지)로 2회 세척하였다. 이후, 세척한 세포를 37℃에서 M9 피루베이트 배지에서 밤새 성장시켰고 M9 소르비톨 배지(2 g/ℓ의 소르비톨이 보충된 M9 최소 배지)로 2회 세척한 뒤 초기 OD600nm가 0.05일 때 30 ㎖의 M9 소르비톨 배지에 접종하였으며, 균주의 수가 2배(OD600nm 0.1)가 될때까지 배양하였다. 그 후, 배양액 400 ㎕를 48-웰 마이크로 플레이트에 옮기고 3-플루오로피루베이트(3-FP)를 최종 농도 1 mM가 되도록 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 진탕배양한 뒤 마이크로 플레이트 판독기(BioTek)를 사용하여 OD600nm를 측정하였다.

또한, 피루베이트의 세포 내 및 외 생산능은 다음과 같이 측정하였다. 균주를 37℃의 M9 포도당 배지에서 성장시켰고, 1 ㎖의 배양액을 원심분리하여 세포 외로 배출된 피루베이트를 분석하기 위해 상등액을 수집하였다. 5 ㎖ 배양액에 -35℃로 미리 냉각시킨 5 ㎖ ??칭 용액(40% 에탄올; v/v, 0.8% NaCl; w/v)을 첨가하여 ??칭하였다. ??칭한 세포를 -11℃에서 원심분리하여 온도가 -5℃ 되었을 때 ??칭된 세포를 수득하였다. 이후, 상기 세포를 -80℃에서 미리 냉각한 500 ㎕로 재현탁하였다. 상기 재현탁한 용액을 동결시킨 후 액체질소로 3번 해동하였고, 원심분리한 후 상등액을 수집하였다. 펠렛으로부터 피루베이트를 완전히 추출하기 위하여 메탄올 추출을 수행하였으며, 피루베이트의 농도를 EnzyChrom^TM Pyruvate 어세이 키트(Bioassay Systems)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, eMS57는 MS1655보다 약 9배 더 높은 정도로 세포 외 피루베이트(pyruvate)를 배설하는 것을 확인하였다(도 7). 또한, eMS57은 유일한 탄소원으로 피루브베이트를 공급할 때 잘 성장하는 것을 확인하였고, MG1655와 유사하게 3-플루로피루베이트(3-flouropyruvate)에 의해 성장이 억제되는 것을 확인한바, eMS57는 손상되지 않은 피루베이트 흡수 기능을 가지고 있음을 확인하였다(도 8).

상기 결과를 통해, eMS57은 피루베이트의 흡수능 및 배설능이 우수하며, 이에 따른 생산능이 우수함을 알 수 있었다.

실시예 5. eMS57의 돌연변이 비율 확인

eMS57의 돌연변이율 확인하기 위하여, eMS57, MS56 및 MG1655간의 돌연변이 정도를 비교하였다.

그 결과, MS56은 6.9 세대 당 하나의 돌연변이를 나타내어, 매우 높은 변이율을 가짐을 확인하였다.

다만, 상기와 같은 높은 돌연변이 비율은 mutS 유전자의 결실에 의한 것임을 확인한바, mutS가 복원된 eMS57 균주(eMS57mutS⁺를 추가의 300세대 ALE를 통해 제조하였다.

구체적으로, eMS57mutS⁺를 제조하기 위하여, 다음과 같은 방법을 이용하였다. MutS_Tn_F(서열번호 1) 및 MutS_neo_R(서열번호 2) 프라이머를 사용하여 MG1655 게놈 DNA로부터 천연 mutS 유전자좌를 PCR을 통해 증폭하였다. 증폭한 mutS DNA 단편을 중첩 확장 PCR(OE-PCR)을 사용하여 pKD13(MutS_neo_F 및 Neo_Tn_R 프라이머로 증폭된 PCR 산물)의 카나마이신 저항성 DNA 카세트와 연결하였다. 각각의 MutS 카세트 및 카나마이신 카세트 417ng을 96℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 3분 조건으로 15 사이클 동안 PCR을 수행하였다. 이후, MutS_neo_F(서열번호 3) 및 Neo_Tn_R(서열번호 4)의 최외곽 프라이머를 이용하여 96℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 4분의 조건으로 20 사이클 동안 PCR을 수행하였다. 결합된 PCR 생성물을 EcoRI 및 XbaI 제한 결합으로 pMOD3에 클로닝하였고, 대장균 BW25113 균주에서 pMOD3-MutS 플라스미드를 생성시켰다. 모자이크 말단(ME) 서열을 함유하는 트랜스포존 DNA를 ME_plus_3'(서열번호 5) 및 ME_plus_5'(서열번호 6) 프라이머를 사용하여 pMOD3-MutS로부터 PCR 증폭시켰다. 이어서 50 ng의 트랜스포존 DNA와 1U의 EZ-Tn5 트랜스포아제(transposase)를 혼합하였고, 실온에서 30분 동안 배양하여 트랜스포솜 복합체를 제조하고, 이를 eMS57에 도입하여 상기 복합체가 도입된 균주를 카나마이신 선택 배지로 선별하였다. MutS의 발현은 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다(도 9). MG1655와 비교했을 때 가장 유사한 MutS 발현 수준을 갖는 클론을 선택하여 eMS57mutS⁺로 명명하였으며, 트랜스포존 삽입 위치는 Tn_confirm_F(서열번호 7) 및 Random_R1(서열번호 8) 프라이머를 사용하는 세미-랜덤 PCR을 통해 확인하였다.

그 결과, 두 번의 반복된 배양에서, mutS가 결핍된 eMS57은 총 102개의 새로운 돌연변이를 축적하는 반면에, eMS57mutS⁺ 균주는 26개의 낮은 수의 돌연변이만을 얻은 것을 확인하였다(도 10).

즉, 균주의 돌연변이의 비율을 감소시기 위해서는 자발적인 DNA 복구 시스템을 활성화가 필요함을 알 수 있었고, 상기 mutS가 복원된 eMS57 균주는 돌연변이 비율이 현저히 낮으므로 추가적인 돌연변이 없이 타겟 단백질 또는 효소를 안정적으로 생산하기 위한 숙주로서 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 6. eMS57의 단백질 생산능 확인

eMS57의 단백질 번역 효율 및 이에 따른 단백질 생산능을 확인하고자 하였다.

먼저, 단백질의 생산능을 확인하기 위하여 타겟 단백질로서 형광단백질(mRFP1)을 사용하였다.

구체적으로, 상기 형광단백질을 암호화하는 유전자를 eMS57 또는 MG1655 균주에 도입하였고, 상기 유전자의 단백질 발현 정도, 즉 형광 강도를 확인하였다.

그 결과, eMS57은 MG1655보다 3.1배 높은 형광 강도를 나타냄을 확인하였다(도 11).

한편, 미생물의 번역은 '전사 후 버퍼링(post transcriptional buffering)' 또는 '번역 버퍼링(translational buffering)'이라고 불리는 현상을 나타내는데, 이는 리보솜과 결합된 RNA는 일정한 수준을 유지하는 반면에 전사체의 양은 동적으로 변화하는 것을 의미한다. 결과적으로, 번역 효율(TE; Translation Efficiency), 즉 리보솜과 결합된 전사체의 수준을 전사체 총 양으로 나눈 값은 전사체의 양이 증가할수록 감소하게 된다. 이는, 박테리아에서 전사 후 조절 기전이 복잡하게 발생되고 있음을 의미한다.

이에 따라, eMS57의 증가된 단백질 생산 능력의 메커니즘을 규명하기 위하여, 전사체 시퀀싱(Transcriptome sequencing; RNA-Seq) 및 리보솜 프로파일링(Ribo-Seq)을 수행하였다.

구체적으로, 전사체 시퀀싱은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 중간 성장 단계(MG1655는 OD 600 nm ~ 0.55, eMS57은 ~ 0.50)의 배지로부터 시료(10 ㎖)를 수확하였다. 이후, RNAsnap^TM 방법을 사용하여 토탈 RNA를 분리하였고, DNA 오염물을 제거하기 위하여 DNase I을 처리하였다. 이후, RNA 샘플을 페놀-클로로포름-이소아밀알코올(phenol-chloroform-isoamyl alcohol)로 추출한 후 에탄올 침전으로 정제하였다. 이후, Ribo-Zero rRNA 제거 키트를 사용하여 전체 RNA 샘플에서 리보솜 RNA(Ribosomal RNA; rRNA)를 제거하였다. RNA 시퀀싱 라이브러리는 TruSeq Stranded mRNA LT 샘플 준비 키트(Illumina)를 사용하여 rRNA가 제거된 RNA로 제조하였고, Qubit dsDNA HS 어세이 키트(Thermo)를 사용하여 구축된 시퀀싱 라이브러리를 정량화하였다. 라이브러리의 품질은 고감도 D1000 스크린 테이프(Agilent)가 장착된 TapeStation 2200(애질런트)을 사용하여 분석하였고, 시퀀싱 라이브러리는 MiSeq Reagent Kit v2(Illumina)를 사용하여 시퀀싱하였다.

한편, 리보솜 프로파일링은 tRNA의 제거없이 수행하였다. 지수 성장 단계에서 클로람페니콜(34 ㎎/㎖)을 5분 동안 처리한 후 50 ㎖의 대장균 배양물을 수집하였다. 세포를 0.5 ㎖의 용해 완충액(1% 트리톤 X100, 34 ㎍/㎖ 클로람페니콜, 133 mM NaCl, 4.75 mM MgCl₂ 및 19 mM 트리스-HCl, pH 7.5)으로 동결시키고 막자사발을 이용하여 용해하였다. 이후, 상층액을 분리하고 NEB(micrococcal nuclease)로 처리하였다. 폴리솜은 Illustra MicroSpin S-400 HR 칼럼(GE Healthcare)을 사용하여 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(phenol-chloroform-isoamyl alcohol)로 추출한 후 MNase 분해 샘플에서 회수하였다. RiboZero rRNA 제거 키트(Illumina)를 사용하여 리보솜 RNA를 제거하였고, rRNA가 제거된 RNA 샘플을 NEB(T4 Polynucleotide Kinase)를 사용하여 인산화시키고 RNeasy MinElute 컬럼(Qiagen)으로 정제하였다. 시퀀싱 라이브러리는 인산화된 RNA 샘플을 이용하여, NEB용 NEBNext Small RNA 라이브러리 프렙 세트를 사용하여 준비하였다. HySeq 2500 장비에서 V4 시퀀싱-하합성(sequencing-by-synthesis) 시약을 사용하여 고출력 모드로 ChunLab(서울, 대한민국)에서 차세대 시퀀싱을 수행하였다.

그 결과, MG1655의 번역 효율은 유전자의 전사가 잘 이루어졌음에도 번역 버퍼링에 의해 번역 효율이 낮아짐을 확인하였다. 반면에, eMS57은 번역 효율이 유전자의 발현 및 이에 다른 전사체 수준에 관계없이 일정하기 때문에 어떠한 번역 버퍼링도 나타내지 않음을 확인하였다(도 12). 예로서, MurQ(N-acetylmuramic acid 6-phosphate etherase) 유전자의 경우, MG1655 및 eMS57는 각각 24.8% 및 23.9%로서 비슷한 유전자 발현 수준을 나타내었으나, 번역 효율은 eMS57이 월등히 높음을 확인하였다. 또한, gapA(encoding G3P dehydrogenase) 유전자의 발현은 eMS57보다 MG1655에서 더 높았으나, 번역 효율은 각각 98.8% 및 98.7%로서 비슷함을 확인하였다(도 13).

상기 결과를 통해, 유전자의 발현이 잘 이루어져 전사체의 양이 많아지더라도, 해당 전사체를 번역하는 번역 효율이 높아야 단백질의 생산성이 증가됨을 알 수 있었고, eMS57은 번역 효율이 높으므로 표적 단백질의 생산에 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 7. eMS57과 야생형 균주의 비교

실시예 2 내지 6에서 확인한 eMS57의 특성을 부여하는 유전자 또는 단백질을 확인하기 위해 게놈 시퀀싱, 전사체 분석을 수행하였다.

게놈 분석 결과, ALE 과정에서 21kb 정도의 게놈 영역이 삭제되었으며, 이 영역은 rpoS를 포함하고 있었다(도 14a). MS56에 rpoS의 넉아웃 또는 삭제를 도입한 결과, eMS57의 생장속도의 약 80% 정도의 생장률을 나타내는 것을 확인하여(도 14b), rpoS 유전자가 eMS57의 높은 생장률에 기여하기는 하지만 이것이 유일한 요인은 아니라는 것을 확인하였다. 또한, ALE 과정에서 SNV(single nucleotide variation), MNV(multi nucleotide variation) 및 INS(insert)/DEL(deletion) 등의 변이가 도입되었음을 확인하였다(도 14c).

이어서 ChIP-Seq 및 RNA-Seq로 전사체 수준에서의 변화를 확인하였다. 구체적으로 상기 게놈 시퀀싱으로 확인한 변이인, rpoD 유전자의 SNV로 인해 253번 세린이 프롤린으로 변이된 σ⁷⁰ 과 MG1655의 σ⁷⁰ (야생형 σ⁷⁰)의 활성을 측정한 결과, 변이된 σ⁷⁰이 E 프로모터에 결합 특이성이 증가하고 M 프로모터에 대한 특이성은 증가하지 않는 것을 확인하였다. 또한 상기 변화가 다른 유전자 발현에 영향을 줄 것으로 판단하여 전사체 분석을 수행하여 변이 σ⁷⁰에 의해 발현 수준이 변화하는 유전자를 도 15에 나타내었다. 이와 같은 발현 수준의 변화로 인해 eMS57이 최소배지에 적응할 수 있을 것으로 추측하였다.

이를 통해, 도 14 내지 15에 나타난 유전자 변이가 eMS57의 특성에 관여할 것임을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원 KCTC13699BP 20181108

<110> Intelligent Synthetic Biology Center Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> A novel genome-reduced microorganism and a method of producing thereof <130> KPA170996-KR <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MutS_Tn_F <400> 1 gcatattggc tcgaattcca accgatacaa ttttgcgt 38 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MutS_neo_R <400> 2 taataagggg atcttttaca ccaggctctt caagc 35 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MutS_neo_F <400> 3 aagagcctgg tgtaaaagat ccccttatta gaaga 35 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Neo_Tn_R <400> 4 ctgcaggtcg actctagaag agcgcttttg aagctcac 38 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ME_plus_3' <400> 5 ctgtctctta tacacatctc aaccatca 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ME_plus_5' <400> 6 ctgtctctta tacacatctc aaccctga 28 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tn_confirm_F <400> 7 gacgggacgg cggctttgtt gaata 25 <210> 8 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Random_R1 <400> 8 ctcggcattc ctgctgaacc gctcttccga tctnnnnnnn ngctgg 46

Claims (10)

1. 수탁번호 KCTC13699BP로 기탁된, 게놈의 크기가 MS56 균주보다 작은 대장균(Escherichia coli) eMS57 mutS+ 균주.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 게놈의 크기는 3.6Mbp 이하인 것인, 대장균(Escherichia coli) eMS57 mutS+ 균주.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 대장균(Escherichia coli) eMS57 mutS+ 균주는 생장률이 MS56 균주보다 높은 것인, 대장균(Escherichia coli) eMS57 mutS+ 균주.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 대장균(Escherichia coli) eMS57 mutS+ 균주는 피루베이트 생산능이 MG1655 균주보다 높은 것인, 대장균(Escherichia coli) eMS57 mutS+ 균주.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 대장균(Escherichia coli) eMS57 mutS+ 균주는 돌연변이 발생율이 MS56 균주보다 낮은 것인, 대장균(Escherichia coli) eMS57 mutS+ 균주.
   
6. 대장균(Escherichia coli) MS56을 LB 브로쓰(broth)를 포함하는 배지에서 LB 브로쓰의 농도 감소에 따라 단계적으로 배양하는 단계를 포함하는, 게놈의 크기가 MS56 균주보다 작은 신규 미생물의 제조 방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 제조 방법은 상기 배양하는 단계 이후 수득된 대장균에 mutS 유전자를 도입하는 단계를 더 포함하는 것인, 신규 미생물의 제조 방법.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 LB 브로쓰는 10%(w/v) 트립톤(tryptone), 5%(w/v) 효모 추출물(yeast extract) 및 10%(w/v)　NaCl을 포함하는 것인, 신규 미생물의 제조 방법.
   
9. 제6항에 있어서, 상기 LB 브로쓰의 농도 감소는 0.1%(v/v), 0.05%(v/v), 0.01%(v/v), 0.002%(v/v) 및 0%로 이루어지는 것인, 신규 미생물의 제조 방법.
   
10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 피루베이트 또는 단백질 제조 방법.

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