CN108531518B - 一种提高大肠杆菌积累丙酮酸的方法 - Google Patents

一种提高大肠杆菌积累丙酮酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种提高丙酮酸积累的大肠杆菌基因工程菌构建方法和生产应用。本发明所提供的基因工程菌是按照包括以下步骤的方法构建的：在野生型出发大肠杆菌中删减乳酸脱氢酶的编码基因，丙酮酸氧化酶的编码基因，磷酸转乙酰酶的编码基因和乙酸激酶的编码基因，构建得到积累丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌KLPP。以KLPP出发，通过Tn5转座子建立突变库和高通量筛选获得丙酮酸积累提高的突变菌株，通过全基因组重测序发现提高丙酮酸积累的基因。

Description

一种提高大肠杆菌积累丙酮酸的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到发现的新的影响丙酮酸积累的基因及改造大肠杆菌（Escherichia coli）提高其丙酮酸积累的方法和利用该方法构建丙酮酸生产菌。
背景技术
丙酮酸是生物代谢过程中承上启下的关键中间产物，同时它为糖酵解途径和三羧酸循环提供原料，并且为生物的各项生命活动提供必需的能量。此外，它还广泛应用于医药、食品、饲料、日化、农药、生化研究与细胞培养等领域。随着我们对丙酮酸需求量的不断增加，如何找到一种环保、可持续的大量获得丙酮酸的方法显得尤为重要。
生产丙酮酸的方法主要有化学合成法，酶转化法和微生物发酵法三种。由于发酵法具有产品纯度高、成本低、转化率高、对环境污染小等优点，已成为国内外最受青睐的生产方法。对生物发酵法来讲，寻找合适的生物发酵的基因工程菌是最关键的，自然界中有很多的微生物可以合成丙酮酸，如：球拟酵母、假丝酵母、酿酒酵母、大肠杆菌属等。通过代谢工程手段有效地改造上述微生物的代谢途径，可以获得优良高产菌株。沈冬钱等[生物工程学报, 2009, 25(9): 1345-1351]敲除大肠杆菌lpdA基因后，突变菌可以在不同糖为碳源下积累丙酮酸，得率都达到了0.8 g/g以上。Yihui Zhu等[Appl Environ Microbiol,2008, 74(21): 6649-6655]在大肠杆菌中敲除多个丙酮酸副产物基因，经发酵优化后，发酵罐分批补料44 h产丙酮酸90 g/L，得率0.68 g/g。于莹等[生物技术通报, 2016, 32(8):226-232]在谷氨酸棒杆菌中敲除了丙酮酸支流代谢途径基因，利用4.5%的葡萄糖复合培养基，基因工程菌经摇瓶发酵48 h，丙酮酸的浓度达到 14.6 g/L，比野生菌提高了32.5倍。Yoshikazu Kawata等[AMB Express,2016, 6(1):22]发现在培养Halomonassp. KM-1时，当培养基中硝酸钠的浓度增加时，导致丙酮酸的分泌增强，培养48 h，野生型Halomonas sp.KM-1可以产生63.3 g/L丙酮酸。Svetlana V. Kamzolova等[Appl Microbiol Biotechnol,2016, 100(17): 7689-7697]在Blastobotrys adeninivorans发酵中限制硫胺素来干扰硫胺素依赖的丙酮酸脱氢酶功能，可以产生43.2 g/L的丙酮酸。目前代谢工程改造主要集中于丙酮酸代谢途径及副产物代谢相关基因的改造，进一步改造的靶点基因不明确，通过诱变是一种方法。
基于传统诱变的方法，难以对发生有效突变的菌株进行快速地基因位点定位，无法精确的发现控制菌株高产的关键基因。而利用Tn5转座子来构建载体进行随机突变则不然，它通常被用于发现特定功能的未知基因，能够保证单基因插入突变来进行全基因改造，而且没有大量的无效突变背景干扰，能够进行基因组水平的随机插入，Wang等[MicrobCell Fact, 2016, 15(1): 101]利用Tn5转座子插入诱变用于构建运动发酵单胞菌中的较高耐盐性菌株，诱变产生200个运动发酵单胞菌的突变体，筛选到耐盐性比野生型高达2％的突变菌株ZMT2，并且找到himA基因，这个基因的破坏在响应耐盐中起着重要的作用。因此我们把这种方法应用到菌株的遗传改造过程中，为基因工程菌的构建提供有效的改造靶点。
发明内容
本发明的一个目的是发现新的大肠杆菌中可以提高丙酮酸积累的基因。
本发明的另一个目的是提供高效积累丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌构建方法及其生产应用。
本发明的再一个目的是提供可以高效生产丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌。
本发明通过从大肠杆菌（Escherichia coli）野生型菌株出发，通过定向基因编辑删减乳酸脱氢酶的编码基因（ldhA）得到重组大肠杆菌KL，进一步删减丙酮酸氧化酶的编码基因（poxB）得到重组大肠杆菌KLP，再进一步删减磷酸转乙酰酶的编码基因（pta）和乙酸激酶的编码基因（ackA）获得了积累丙酮酸的重组大肠杆菌基因工程菌KLPP。所述出发大肠杆菌优选使用现有的大肠杆菌MG1655。定向基因编辑方法使用一种基于重复引物和同源重组技术的编辑大肠杆菌染色体基因的方法。使用这种方法，只需要一步转化，基因编辑后没有抗性基因或者其它序列存在于染色体上。基因删减过程以ldhA的敲除为例说明。引物设计用以PCR扩增cat-sacB序列，正向引物Sens-ldhA-CS包含ldhA的50bp上游序列和50bp的下游序列，之后是cat-sacB的扩增序列TCCTGGTGTCCCTGTTGATA，反向引物包含ldhA的50bp下游序列，之后是cat-sacB的扩增序列ATAGATACATCAGAGCTTTTACGAG。扩增后DNA片段经过胶回收后电击转化到含有pKD46的感受态细胞中。使用氯霉素抗性筛选克隆，并进一步进行PCR验证。正确的克隆接入含有10%葡萄糖的LB培养基中通过胞内重组以消除cat-sacB基因。使用氯霉素抗性和引物检测cat-sacB的去除。
本发明以KLPP菌株出发，进一步使用Tn5转座子对大肠杆菌KLPP进行突变构建突变库，通过高通量筛选，获得了丙酮酸产量提高的菌株。
本发明具体提供了使用上述方法构建高产丙酮酸菌株的过程，具体方法包括对大肠杆菌的代谢工程改造，突变体库的构建和高通量筛选流程，使用高产丙酮酸菌株的发酵方法。具体内容包括培养基，菌种培养，发酵生产工艺。
本发明进行大肠杆菌基因工程菌突变库构建及其高通量筛选的方法包括：
1）将pUT Mini-Tn5 Cm质粒转入到大肠杆菌S17-1λpir中，涂布于含有氯霉素的平板，然后于37℃ 的培养箱中培养，挑选正确克隆。
2）以含有pUT Mini-Tn5 Cm大肠杆菌S17-1λpir为供体，受体为KLPP菌株（带有卡那霉素抗性）。这两种细菌分别在含氯霉素和卡那霉素的LB培养基中，37℃，220 r/min条件下培养5 h。
3）将两株菌株在5000 g条件下离心2 min以后，用10 mmol/L MgSO4溶液重新悬浮并离心，重复洗涤三次，并最终用MgSO4悬浮并调整到合适的浓度后将二者混合。
4）在含有0.1M柠檬酸钠的LB平板中心放置一张0.45 μm的无菌滤膜，将上述混合菌液添加至无菌滤膜上，放置于超净台中，吹干后于37℃ 的培养箱中培养10 h。
5）将滤膜上的菌苔刮下，并用少量无菌水进行清洗，菌液稀释适合浓度涂布于含有卡那霉素和氯霉素的平板上进行选择培养，得到每个平板有100个左右的单菌落的专座插入突变库用于后续筛选。
6）筛选流程：（1）突变库单克隆接种至96孔深孔板培养，摇床培养20 h；（2）菌体吹吸均匀后，先后加入40 uL菌液， 40 uL 0.033％的二硝基苯肼和40 uL 2.81 mol/L NaOH进行显色反应，测定反应液的OD 520值；（3）根据丙酮酸标准曲线计算出发酵液中丙酮酸的浓度，最后根据突变菌株与对照菌株丙酮酸的浓度比筛选出丙酮酸产量提高的菌株。
本发明包括对大肠杆菌基因工程突变库高通量筛选丙酮酸产量提高菌株的进一步产量检测方法及放大发酵罐生产方法，包括发酵培养基。具体包括：
1）将最终筛选到的菌株进行摇瓶发酵验证：首先将保存于−80°C的突变菌在加有氯霉素和卡那抗生素的平板划线，培养过夜，挑取单菌落到含有3 mL LB的试管中，37℃ 、220 r/min培养12 h，测OD 600值，保证起始OD一致，按相应比例接种到15 mL摇瓶无机盐发酵培养基中(100 mL摇瓶)，37°C、220 r/min培养24 h。取1 mL发酵液12 000 g下离心10 min，将上清液稀释10倍后利用HPLC（高效液相色谱仪）检测丙酮酸的含量，确定丙酮酸产量明显提高的菌株，对高产丙酮酸的菌株进行3轮发酵重复实验，每轮3个平行。
2）5 L发酵系统，装2 L发酵液。挑高产丙酮酸大肠杆菌基因工程菌单克隆到装有3ml LB试管37 ℃ 培养OD 600长至3.0，转接到装量200 ml LB的1 L摇瓶中，37 °C培养过夜后，以10%接种量转接入发酵罐，发酵罐pH控制在6.5，通气量1 v/v·min，控制溶氧不低于30%。
3）每升LB培养基包括10 g胰蛋白胨, 5 g酵母提取物和10 g氯化钠(固体LB加入1.5%的琼脂粉) ；发酵培养基为M9培养基，其1L组成为：85.5 g Na2HPO4·12H2O，15 gKH2PO4，2.5 g NaCl，5 g NH4Cl，2 mmol MgSO4，0.1 mol CaCl2。氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素终浓度分别为100 μg/mL、50 μg/mL和34 μg/mL。
本发明再一个目的是提供新的大肠杆菌可以提高丙酮酸积累的基因。通过对丙酮酸产量提高的菌株进行全基因组重测序，通过分析及实验确定了新的影响丙酮酸积累的基因，包括N-乙酰神经氨酸外膜通道蛋白nanC，其序列记作SEQ No.1，DUFF1440家族内膜酸阻抗蛋白yagU，其序列记作SEQ No.2，噬菌体相关MFS转运家族蛋白ydfJ，其序列记作SEQNo.3和Rac原噬菌体整合酶intR，其序列记作SEQ No.4。
cat-sacB序列
tcctggtgtccctgttgataccgggaagccctgggccaacttttggcgaaaatgagacgttgatcggcacgtaagaggttccaactttcaccataatgaaataagatcactaccgggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagttattggtgcccttaaacgcctggtgctacgcctgaataagtgataataagcggatgaatggcagaaattcgaaagcaaattcgacccggtcgtcggttcagggcagggtcgttaaatagccgctagatctaagtaaatcgcgcgggtttgttactgataaagcaggcaagacctaaaatgtgtaaagggcaaagtgtatactttggcgtcaccccttacatattttaggtctttttttattgtgcgtaactaacttgccatcttcaaacaggagggctggaagaagcagaccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgaacatcaaaaagtttgcaaaacaagcaacagtattaacctttactaccgcactgctggcaggaggcgcaactcaagcgtttgcgaaagaaacgaaccaaaagccatataaggaaacatacggcatttcccatattacacgccatgatatgctgcaaatccctgaacagcaaaaaaatgaaaaatatcaagttcctgaattcgattcgtccacaattaaaaatatctcttctgcaaaaggcctggacgtttgggacagctggccattacaaaacgctgacggcactgtcgcaaactatcacggctaccacatcgtctttgcattagccggagatcctaaaaatgcggatgacacatcgatttacatgttctatcaaaaagtcggcgaaacttctattgacagctggaaaaacgctggccgcgtctttaaagacagcgacaaattcgatgcaaatgattctatcctaaaagaccaaacacaagaatggtcaggttcagccacatttacatctgacggaaaaatccgtttattctacactgatttctccggtaaacattacggcaaacaaacactgacaactgcacaagttaacgtatcagcatcagacagctctttgaacatcaacggtgtagaggattataaatcaatctttgacggtgacggaaaaacgtatcaaaatgtacagcagttcatcgatgaaggcaactacagctcaggcgacaaccatacgctgagagatcctcactacgtagaagataaaggccacaaatacttagtatttgaagcaaacactggaactgaagatggctaccaaggcgaagaatctttatttaacaaagcatactatggcaaaagcacatcattcttccgtcaagaaagtcaaaaacttctgcaaagcgataaaaaacgcacggctgagttagcaaacggcgctctcggtatgattgagctaaacgatgattacacactgaaaaaagtgatgaaaccgctgattgcatctaacacagtaacagatgaaattgaacgcgcgaacgtctttaaaatgaacggcaaatggtacctgttcactgactcccgcggatcaaaaatgacgattgacggcattacgtctaacgatatttacatgcttggttatgtttctaattctttaactggcccatacaagccgctgaacaaaactggccttgtgttaaaaatggatcttgatcctaacgatgtaacctttacttactcacacttcgctgtacctcaagcgaaaggaaacaatgtcgtgattacaagctatatgacaaacagaggattctacgcagacaaacaatcaacgtttgcgccaagcttcctgctgaacatcaaaggcaagaaaacatctgttgtcaaagacagcatccttgaacaaggacaattaacagttaacaaataaaaacgcaaaagaaaatgccgatattgactaccggaagcagtgtgaccgtgtgcttctcaaatgcctgattcaggctgtctatgtgtgactgttgagctgtaacaagttgtctcaggtgttcaatttcatgttctagttgctttgttttactggtttcacctgttctattaggtgttacatgctgttcatctgttacattgtcgatctgttcatggtgaacagctttaaatgcaccaaaaactcgtaaaagctctgatgtatctat
SEQ No.1：
Atgaaaaaggctaaaatactttctggcgtattattactgtgcttttcgtccccattaatttctcaggctgcgacactggacgtacgtggtggatatcgtagtggaagccacgcctatgagactcgactcaaagtcagtgagggatggcaaaatggatggtgggcaagcatggaaagtaatacctggaataccattcatgataataaaaaggaaaatgccgcactcaatgatgttcaggttgaagttaattacgcgattaaacttgatgatcaatggacggtgcgcccgggaatgttaacgcattttagcagcaacggcacacgctacggaccctacgtaaaactgtcctgggacgcgacaaaagatcttaattttggcattcgctatcgttacgactggaaagcttaccgacaacaagacttatccggtgatatgtctcgtgataacgttcatcgttgggatggatatgtcacttaccatattaatagtgatttcaccttcgcatggcaaacgacgctatacagcaaacagaacgattatcgctatgcaaaccataagaaatgggcgacggaaaatgcatttgttctacaataccatatgacgcccgatattacgccatacatagaatatgactaccttgaccgtcagggtgtttacaacggcagagataatttatcggaaaacagttatcgcattggtgtgtcatttaaactgtag
SEQ No.2：
atgaatatatttgaacaaactccaccgaaccgcagacgttatggtcttgctgcattcattgggctgattgctggcgttgtttccgcattcgtgaagtggggggctgaagttccattgccgccacgtagcccggtggatatgtttaatgcagcgtgtggcccggaatcattaatcagggctgcaggccaaattgattgctcgcgtaattttctcaatccaccgtatatttttcttcgagactggttggggctgacagatcccaatgcggctgtttatacctttgccgggcatgtctttaactgggttggtgttacgcacattatcttttcgatagtgtttgctgtcggttattgtgtggtcgctgaagtatttccaaaaattaaactctggcagggcttactggcaggtgctttagcccaactttttgttcatatgatttcattccctctcatgggactgacgccacctctgtttgatctcccgtggtatgagaatgtttctgaaatttttggacatttagtctggttctggtctattgaaattattcgcagagatttacgaaacagaattactcatgagccagaccctgagatccctttaggctcaaacagataa
SEQ No.3:
atgacaatagaaaaacacgaaagaagcactaaggatttggtgaaagcagcagtatcgggatggctgggcactgcgcttgaatttatggatttccagttatattcgctcggcgcagcgttagtgtttcatgaaatattttttcctgaatcatcaacggcaatggcgttaattctggcaatgggaacctacggtgcaggttatgtggcgcgtattgtcggagcatttattttcggcaaaatgggcgacagaatagggcgtaaaaaagtgctctttattaccatcaccatgatggggatctgtaccaccttaattggtgtgttaccgacctatgcacagattggtgtttttgcacccatcttgctggtgacgttgcgtattattcaggggttgggtgcaggtgcggaaatttccggtgccggt acgatgctggcggaatatgcgccaaaaggtaagcgcggaattatctcctcatttgtggctatgggaactaactgcggaaccttgagcgcaacggcaatctgggcctttatgttcttcattctcagtaaagaggaactgctggcgtggggatggcgtataccgttcctggcgagtgttgtcgtgatggtctttgctatctggttgcgtatgaatctgaaagaaagcccggtctttgagaaggttaacgacagtaaccaaccgacagcaaaacctgcacctgctggtagcatgttccagagcaaatccttctggctggcaacagggctgcgttttggtcaggcgggtaactccgggttaattcagactttccttgcaggctatttagtgcagacgttattgtttaacaaagcaattccaacagatgcattgatgatcagttcgattctcggctttatgaccattccgttccttggttggttatccgataaaattggtcgccggatcccgtatattattatgaatacctccgcgattgtgctggcatggccaatgctttctatcattgtagataaaagctatgccccgagcaccattatggttgcactgattgtgattcataactgtgcggtgctgggattatttgctctggaaaacattaccatggcagaaatgttcggctgtaaaaaccgctttacccggatggctatttctaaagaaattggtggtcttatcgcttccggttttggtcctatcctggcgggtattttctgcaccatgacggaatcctggtatccgatcgccattatgatcatggcatattcagtgattggtttaatctctgcgctgaaaatgccagaggtgaaagaccgtgatttaagtgcgctggaagacgctgcggaagatcaaccgcgtgttgtaagagctgcgcaaccttccagaagtctgtaa
SEQ No.4:
atgtctaaattaccaacaggtgtcgagattagaggtagatacattcgcatctggttcatgtttcgaggaaaacgatgtcgggaaacattaaaaggctgggagattacaaacagtaatattaaaaaggccggaaatttaagagcgctgatagttcatgaaataaactccggtgaatttgagtatttaagacgttttccccagtccagcactggggcaaaaatggtgacaacgagagtcataaaaacgttcggagagctttgtgatatctggacaaaaattaaagagacagagttaacaacaaacacaatgaagaaaacgaaatcacaattaaaaacactcagaataataatttgtgaaagtaccccgatatcacatattcgttatagcgatatcttaaactaccggaatgaactgctgcatggagaaacgctttacctggataatccaagatccaacaaaaaaggaagaaccgtgcgcacagttgataactatatcgccctgctctgttcgctgttgcgttttgcgtatcagtcgggatttatatcaaccaaaccatttgaaggagtaaaaaaattacagcgaaacagaataaagcctgatccgttatctaaaacagaattcaatgcattaatggaaagtgaaaaaggacagagccagaacttgtggaaatttgccgtttactcaggacttcgtcacggggaactggcagctctggcgtgggaggatgtggatctcgaaaagggaatagtgaatgtcagaagaaacctgacgatacttgatatgttcggtcccccaaaaacaaatgccgggatccgaacagtaacactactgcagcctgctcttgaagcactgaaggagcaatacaaactgaccgggcatcatcgcaaaagcgaaatcaccttttatcatcgggagtacggcagaaccgaaaagcaaaaactgcattttgttttcatgcccagggtgtgtaacggaaaacaaaaaccttattactcggtaagcagtttgggggcaaggtggaatgcagcagtaaaacgtgctggtattcgccgccgtaatccgtaccatacgcggcatacttttgcctgctggctgttgacggcaggagcgaacccggcatttatagccagccaaatggggcatgaaactgcgcagatggtgtatgaaatttacggtatgtggattgatgacatgaacgacgaacagatagccatgttgaatgcgcggttatcgtag。
附图说明
图1：重组大肠杆菌KLPP改造示意图。
图2：高通量筛选示意图。
图3：高通量筛选突变株相对丙酮酸产量。
图4：高产突变株丙酮酸产量。
图5：K30分批补料发酵。
具体实施
以下为列举的实施例，以便更好的理解本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J .萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 大肠杆菌基因工程菌KLPP的构建：
本发明大肠杆菌工程菌KLPP改造示意图如图1所示。
1）第一步，使用热激转化法法把pKD46质粒导入大肠杆菌K-12MG1655中，得到大肠杆菌K。具体操作步骤为，吸取1uL pKD46质粒与大肠杆菌K-12MG1655感受态细胞混合，在冰上放置20min后置于42°C水浴热激90s，然后放置冰上2min，加入1mL LB培养基，然后30℃培养40min，涂布于Amp抗性的LB平板，30°C培养过夜后挑选生长的克隆即为大肠杆菌K。
2）第二步，NCBI下载大肠杆菌基因组序列，从中查找ldhA基因序列，设计引物用以PCR扩增cat-sacB序列，正向引物Sens-ldhA-CS包含ldhA上游50bp（ATG之前）序列和ldhA下游50bp（TAA之后）序列，之后是cat-sacB上游20bp序列。反向引物Anti-ldhA-CS包含ldhA下游50bp序列和cat-sacB下游25bp序列
Sens-ldhA-CS：AAATATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCAACATCACTGGAGAAAGTCTTTCTTGCCGCTCCCCTGCATTCCAGGGGAGCTGATTCAGATAATCCCCAATTCCTGGTGTCCCTGTTGATA
Anti-ldhA-CS：ATTGGGGATTATCTGAATCAGCTCCCCTGGAATGCAGGGGAGCGGCAAGAATAGATACATCAGAGCTTTTACGAG
使用fast pfu，PCR体系为
Primer Sens-ldhA-CS 2 uL
Primer Anti-ldhA-CS 2 uL
5×TransStart TM FastPfu Buffer 10 uL
dNTP 4 uL
Template 0.5 uL
Fast pfu 1 uL
Distilled and deionized water 30.5 uL
Total 50 uL
PCR程序为：95°C预变性3min，（95°C变性15s，55°C退火15s，72°C延伸2min）35循环），72°C延伸5min。得到带有ldhA上下游同源臂序列和cat-sacB序列的DNA片段，记作DNA片段I。
3）第三步，将DNA片段I电转化导入大肠杆菌K中。电转化条件为：取80uL大肠杆菌K的电转化感受态细胞，加入100ngDNA片段I，在冰上混合静置5min，转移入2cm的Bio-rad电转杯中，使用2.5KV电压电击。电击后迅速加入1mL预冷的LB培养基，混匀后转入1.5mL EP管中，30°C孵育2小时，5000rpm离心2min收集细胞，用200uL LB培养基重悬涂布于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上在30°C培养过夜。挑选平板生长出的克隆进行PCR检测，选取一个正确的克隆命名为大肠杆菌KL01。
4）第四步，重组大肠杆菌KL01的自身同源重组，删除cat-sacB基因片段。具体操作为：将重组大肠杆菌KL01活化于LB液体培养基，过夜培养；取1mL培养物接种于10mL含有10%蔗糖的LB液体培养基，过夜培养；取一环菌液划线培养于LB固体培养基，过夜培养；每个菌株挑取30个单克隆点对点划线于含有氯霉素和不含氯霉素的固体培养基，过夜培养；PCR检测失去氯霉素抗性的菌落，测定序列验证正确的即为大肠杆菌基因工程菌KL。
5）第五步，从大肠杆菌基因组序列查找poxB基因序列，设计引物用以PCR扩增cat- sacB序列，正向引物Sens-poxB-CS包含poxB上游50bp（ATG之前）序列和poxB下游50bp（TAA之后）序列，之后是cat-sacB上游20bp序列。反向引物Anti-poxB-CS包含poxB下游50bp序列和cat-sacB下游25bp序列
Sens-poxB-CS：TCAGATGAACTAAACTTGTTACCGTTATCACATTCAGGAGATGGAGAACCAAAGGGTGGCATTTCCCGTCATAATAAGGACATGCCATGATTGATTTACGTCCTGGTGTCCCTGTTGATA
Anti-poxB-CS：CGTAAATCAATCATGGCATGTCCTTATTATGACGGGAAATGCCACCCTTTATAGATACATCAGAGCTTTTACGAG
PCR体系和PCR程序和步骤2相同。得到带有poxB上下游同源臂序列和cat-sacB序列的DNA片段，记作DNA片段II。
6）第六步，将DNA片段II电转化导入大肠杆菌KL中。电转化条件为：取80uL大肠杆菌KL的电转化感受态细胞，加入100ngDNA片段II，在冰上混合静置5min，转移入2cm的Bio-rad电转杯中，使用2.5KV电压电击。电击后迅速加入1mL预冷的LB培养基，混匀后转入1.5mLEP管中，30°C孵育2小时，5000rpm离心2min收集细胞，用200uL LB培养基重悬涂布于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上在30°C培养过夜。挑选平板生长出的克隆进行PCR检测，选取一个正确的克隆命名为大肠杆菌KLP01。
7）第七步，重组大肠杆菌KLP01的自身同源重组，删除cat-sacB基因片段。具体操作为：将重组大肠杆菌KLP01活化于LB液体培养基，过夜培养；取1mL培养物接种于10mL含有10%蔗糖的LB液体培养基，过夜培养；取一环菌液划线培养于LB固体培养基，过夜培养；每个菌株挑取30个单克隆点对点划线于含有氯霉素和不含氯霉素的固体培养基，过夜培养；PCR检测失去氯霉素抗性的菌落，测定序列验证正确的即为大肠杆菌基因工程菌KLP。
8）第八步，在大肠杆菌基因组上ackA和pta基因相邻，因此可以一起敲除。从大肠杆菌基因组序列查找ackA-pta基因序列，设计引物用以PCR扩增cat-sacB序列，正向引物Sens-AP-CS包含ackA上游50bp（ATG之前）序列和pta下游50bp（TAA之后）序列，之后是cat- sacB上游20bp序列。反向引物Anti-AP-CS包含pta下游50bp序列和cat-sacB下游25bp序列
Sens-AP-CS：
CTATGGCTCCCTGACGTTTTTTTAGCCACGTATCAATTATAGGTACTTCCTCTCGTCATCATCCGCAGCTTTGCGCTGCGGATATCTGAACCGGAAATAATCCTGGTGTCCCTGTTGATA
Anti-poxB-CS：TTATTTCCGGTTCAGATATCCGCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGAATAGATACATCAGAGCTTTTACGAG
PCR体系和PCR程序和第二步相同。得到带有ackA-pta上下游同源臂序列和cat- sacB序列的DNA片段，记作DNA片段III。
9）第九步，将DNA片段III电转化导入大肠杆菌KLP中。电转化条件为：取80uL大肠杆菌KLP的电转化感受态细胞，加入100ngDNA片段III，在冰上混合静置5min，转移入2cm的Bio-rad电转杯中，使用2.5KV电压电击。电击后迅速加入1mL预冷的LB培养基，混匀后转入1.5mL EP管中，30℃ 孵育2小时，5000rpm离心2min收集细胞，用200uL LB培养基重悬涂布于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上在30°C培养过夜。挑选平板生长出的克隆进行PCR检测，选取一个正确的克隆命名为大肠杆菌KLPP01。
10）第十步，重组大肠杆菌KLPP01的自身同源重组，删除cat-sacB基因片段。具体操作为：将重组大肠杆菌KLPP01活化于LB液体培养基，过夜培养；取1mL培养物接种于10mL含有10%蔗糖的LB液体培养基，过夜培养；取一环菌液划线培养于LB固体培养基，过夜培养；每个菌株挑取30个单克隆点对点划线于含有氯霉素和不含氯霉素的固体培养基，过夜培养；PCR检测失去氯霉素抗性的菌落，测定序列验证正确的即为大肠杆菌基因工程菌KLPP。
实施例2 大肠杆菌基因工程菌KLPP突变体库的建立及高通量筛选
本发明的高通量筛选示意图如图2所示。
1)丙酮酸的高通量检测方法：丙酮酸在酸性条件下与2,4-二硝基苯肼发生缩合反应形成丙酮酸二硝基苯腙。二硝基苯腙在碱性条件下呈现红色，可在520 nm处比色后灵敏地反映出丙酮酸的含量。配置6.25 g/L 的丙酮酸母液，再稀释成0、0.625、1.250、1.875、2.5、3.125、3.75、5 g/L的溶液，取40 μL不同稀释度丙酮酸溶液、40 μL 0.033%的二硝基苯肼、40 μL 2.81 mol/L NaOH 混合，静置反应10 min，利用Molecular Device Spectra MaxM2 酶标仪在520 nm的波长下测定吸光度。每个梯度设置3个平行。酶标仪可以直接测定0-140 mg/L浓度范围内的丙酮酸，并呈现良好的线性关系，线性回归方程为：y=0.005x－0.007，R2=0.993，用该法测出的发酵丙酮酸浓度与HPLC测定浓度一致，说明菌体及发酵液其他成分不对丙酮酸测定形成干扰。
2）突变的建立：
（1）供体菌的构建：使用热激转化法法把pUT Mini-Tn5 Cm质粒导入大肠杆菌S17-1λpir中，得到供体大肠杆菌S1。具体操作步骤为，吸取1uL pUT Mini-Tn5 Cm质粒与大肠杆菌S17-1λpir感受态细胞混合，在冰上放置20min后置于42°C水浴热激90s，然后放置冰上2min，加入1mL LB培养基，然后30°C培养40min，涂布于氨苄青霉素和氯霉素抗性的LB平板，37℃ 培养过夜后挑选生长的克隆即为大肠杆菌S1。
（2）突变库的建立：将供体菌S1和受体菌KLPP菌株（带有卡那霉素抗性）分别在含氯霉素和卡那霉素的LB培养基中，37°C，220 r/min条件下培养5 h。将两株菌株在5000 g条件下离心2 min以后，用10 mmol/L MgSO4溶液重新悬浮并离心，重复洗涤三次，并最终用MgSO4悬浮并调整到合适的浓度后将二者混合。在含有0.1M柠檬酸钠的LB平板中心放置一张0.45 μm的无菌滤膜，将上述混合菌液添加至无菌滤膜上，放置于超净台中，吹干后于37°C的培养箱中培养10 h。
（3）将滤膜上的菌苔刮下，并用少量无菌水进行清洗，菌液稀释适合浓度涂布于含有卡那霉素和氯霉素的平板上进行选择培养，得到每个平板有100个左右的单菌落的专座插入突变库用于后续筛选，我们供得到筛选7197个突变单克隆。
3）突变库筛选：
筛选流程：（1）在96孔深孔板每个孔中加入发酵培养基900uL，突变库单克隆接种至96孔深孔板培养，37°C，在孔板摇床中500rpm培养20 h；（2）培养结束，发酵液吹吸均匀后取40uL菌液加入96孔板，再依次加入 40 uL 0.033％的二硝基苯肼和40 uL 2.81 mol/LNaOH进行显色反应，测定反应液的OD 520值；（3）根据丙酮酸标准曲线计算出发酵液中丙酮酸的浓度，最后根据突变菌株与对照菌株丙酮酸的浓度比筛选出丙酮酸产量提高的菌株。
第一轮筛选：以KLPP为出发菌株，基于转座子突变的方法筛选到了7197个突变体（图3A），以突变菌株和出发菌株中丙酮酸浓度的比值评价菌株。在7197个样本中，筛选到的突变菌株与KLPP的丙酮酸比值大于8％的共有661个，占文库的9%。
第二轮筛选：经过第一轮的筛选后，得到了661个突变菌株（图3B），选择比值大于8％的菌株进行第二轮筛选，通过96深孔板进行第二轮筛选到了50个菌株。对这50个菌株，我们再次评价其发酵生产丙酮酸的能力，筛选出了丙酮酸产量得到稳定提高的6个菌株进行后续评价。
4）高产菌株的发酵能力评价
把上述实施例2筛选到的6个菌株进行摇瓶发酵验证。首先将保存于−80°C的突变菌在加有氯霉素和卡那霉素的平板划线以及出发菌株KLPP在卡那霉素平板划线，培养过夜，挑取单菌落到含有3 mL LB的试管中，37°C、220 r/min培养12 h，测OD 600值，保证起始OD一致，按相应比例接种到15 mL摇瓶发酵培养基中(100 mL摇瓶)，37°C、220 r/min培养24h。取1 mL发酵液12000 g下离心10 min，将上清液稀释10倍后利用HPLC（高效液相色谱仪）检测丙酮酸的含量，对每个菌株进行3轮发酵重复实验，每轮3个平行。发现这6株菌丙酮酸的产量确实得到了稳定的提高。记作重组大肠杆菌K5、K12、K13、K22、K30、K36，丙酮酸产量分别提高了38%、31%、19%、28%、44%、14%，其结果如图4所示。
HPLC丙酮酸检测条件：所用色谱柱为Aminex HPX-87H色谱柱，流动相为5 mmol/L硫酸溶液，流速为0.6 mL/min，柱温是63°C；检测器为紫外检测器，检测时间为30 min。
5）高产丙酮酸菌株突变基因的鉴定
选择重组大肠杆菌K5、K12、K13、K22、K30、K36六株菌进行基因组重测序，将筛选到的突变菌株经过培养离心后，去掉上清液，将菌体送至广州基迪奥生物科技有限公司进行全基因组重测序，基因组重测序后获得原始数据，经过过滤去污染、比对参考基因组，来确定转座子插入位点。经过对重测序数据的分析和与出发菌株基因组进行对比，我们找到了其中五株菌的插入位点分别为intR基因（K5）、nanC基因(K12和K13插入位点的基因是同一个)、yagU基因（K30）、ydfJ基因（K36），K22的插入位点未找到。
实施例3 突变菌株K30的放大发酵评价
挑选重组大肠杆菌K30单克隆到装有3 ml LB试管37 ℃ 培养OD 600长至3.0，转接到装量200 ml LB的1 L摇瓶，37 °C培养过夜后，以10%接种量转接入发酵罐，发酵罐使用上海保兴BioTech-5BG全自动5 L发酵系统，装2 L发酵液。发酵罐pH控制在6.5，通气量1 v/v·min，控制溶氧不低于30%。发酵过程中取样测定发酵液OD 600和发酵液中的丙酮酸含量，发酵47小时丙酮酸产量可以达到63g/L（如图5所示）。
Figure IDA0001376842110000011
Figure IDA0001376842110000021
Figure IDA0001376842110000031
Figure IDA0001376842110000041
Figure IDA0001376842110000051

Claims (3)

1.一种强化丙酮酸积累的方法，其特征在于，通过定向基因编辑删减大肠杆菌宿主细胞中乳酸脱氢酶的编码基因，丙酮酸氧化酶的编码基因，磷酸转乙酰酶的编码基因和乙酸激酶编码基因得到积累丙酮酸的大肠杆菌基因工程菌株，命名为大肠杆菌KLPP；以大肠杆菌KLPP为出发菌株，利用Tn5转座子对nanC基因、yagU基因、ydfJ基因或intR基因的插入失活，获得的菌株与大肠杆菌KLPP相比，丙酮酸积累提高。
2.权利要求1所述的方法在发酵生产丙酮酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
发酵温度为30-38°C；
发酵体系的pH值为6.0-7.5；
发酵时间为16-72小时；
发酵接种量的体积百分比为0.1％-20％；
发酵培养基中的碳源是葡萄糖、淀粉、木糖、生物质中的一种或几种；
发酵培养基中的氮源是酵母膏、蛋白胨、玉米浆、糖蜜、氨水、铵盐和尿素中的一种或几种；
发酵培养基中的无机盐是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钙、硫酸铵、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸钠、氯化钴和硫酸铜中的一种或几种。
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