CN115895989B - 一株高产丁二酸的大肠杆菌及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株高产丁二酸的大肠杆菌及其制备方法与应用，保藏编号为CCTCC NO：M 20221093。本发明还提供了所述产高丁二酸的工程菌在发酵产高丁二酸中的应用；改进了nahR/Psal::xylS2/Pm的启动子，将染色体上的启动子元件和载体上的启动子元件整合到一个质粒上，具有很强的转录放大倍数，受葡萄糖效应影响小，且其诱导物水杨酸价格便宜便于工业化放大。相对于对照，该重组大肠杆菌HBUT‑WSPM在发酵20h时葡萄糖消耗完全，发酵液中丁二酸含量为73.25g/L，糖酸转化率为97.67％，较对照菌株WS100分别提高了6.38％和8.87％。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学、生物化学和发酵工程技术领域，特别涉及一株高产丁二酸的大肠杆菌及其制备方法与应用。
背景技术
丁二酸，也称为琥珀酸，其作为前体物可用于生产许多高附加值衍生物，广泛应用于食品、制药、离子螯合剂、去污剂和表面活性剂的生产领域，被认为是最有潜力的大宗生物基化学品之一。传统的丁二酸合成法有石蜡法、顺反二丁烯加氢法、电化学合成法和环烯氧化法等方法，这些方法存在催化剂昂贵、生产过程中排出大量有毒害的副产物和产率不高等缺点。生物合成法不但具有原料属于可再生资源的特点，而且发酵过程还能吸收二氧化碳，拥有绿色环保的优势。
生物法发酵丁二酸，主要选育一些革兰阴性菌来作生产菌株，如产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes、产琥珀酸厌氧螺菌Anaerobiospirillumsucciniproducens、曼海姆产琥珀酸菌Mannheimia succiniciproducens等。它们都拥有一些好的生产性能，如对葡萄糖和丁二酸的耐受性高，产生较高浓度的丁二酸，但也存在一些缺点，如严格要求厌氧环境，营养条件复杂和生产成本较高。相比而言，大肠杆菌(Escherchia coli)具有营养要求低的特点，在无机盐培养基即能良好生长，对原料中酵母粉和蛋白胨的需求少从而降低了生产成本，再加上大肠杆菌遗传背景清晰容易进行改造，近年来大肠杆菌生产丁二酸已成为丁二酸发酵的一个重要方法。
目前大肠杆菌发酵产丁二酸，工程菌的构建工作主要集中在如下几个方面：(1)通过RED基因敲除技术或者CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除副产物代谢相关基因，从而提高丁二酸的产量。如敲除poxB(编码丙酮酸氧化酶)、pta(编码磷酸转乙酰基酶)、ldhA(编码乳酸脱氢酶)、adhE(编码乙醇脱氢酶)、pflB(编码丙酮酸-甲酸裂解酶)等基因可有效减少乙酸、乳酸、乙醇和甲酸等副产物的生成。(2)丁二酸发酵时还原力不平衡，厌氧发酵时葡萄糖转化为丁二酸需要4个NADH分子而只产生了2个NADH分子。，可以通过增强还原力的手段，如表达NAD+合成相关基因(CN 101274458 A)，或者表达亚磷酸脱氢酶来实现还原力的平衡(CN112280725A)。(3)通过强化二氧化碳的固定来增强丙酮酸/磷酸烯醇式丙酮酸转化成草酰乙酸的能力，从而促进丁二酸的生成。主要手段是表达pckA基因(编码PEP羧化激酶)，ppc基因(编码PEP羧化酶)，pyc基因(编码丙酮酸羧化酶)，其中pyc基因在计算机模拟中被认为在二氧化碳的固定时扮演十分重要的角色。
然而现有的工程菌在丁二酸发酵产量及糖酸转化率上均有待提高。因此，为了解决上述技术问题，有必要提供开发一种高产丁二酸的大肠杆菌及发酵生产丁二酸的方法。
发明内容
本发明目的是提供一株高产丁二酸的大肠杆菌及其制备方法与应用，该菌株能够实现丁二酸发酵产量的提高。
在本发明的第一方面，提供了一株高产丁二酸的大肠杆菌，所述高产丁二酸的大肠杆菌为Escherichia coli HBUT-WSPM，保藏编号为：CCTCC NO：M 20221093。
在本发明的第二方面，提供了所述的高产丁二酸的大肠杆菌在发酵高产丁二酸中的应用。
在本发明的第三方面，提供了一种发酵菌剂，所述发酵菌剂包括：
将所述的高产丁二酸的大肠杆菌进行发酵获得的发酵液；
或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。
在本发明的第四方面，提供了所述工程菌的制备方法，所述方法包括：
以质粒pBBR1MCS-1为模板，以SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示的引物对进行反向PCR扩增，获得线性化的质粒pBBR1MCS-1；
以质粒pUC57-nahR-Psal-xyS2为模板，以SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的引物对进行扩增，获得基因片段nahR-Psal-xyS2；
将所述线性化的质粒pBBR1MCS-1和所述基因片段nahR-Psal-xyS2通过无缝克隆进行连接，获得重组质粒pBBR1MCS-nahR-Psal-xyS2；
以所述重组质粒pBBR1MCS-nahR-Psal-xyS2为模板，以SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示的引物对进行反向PCR扩增，获得线性化的质粒pBBR1MCS-nahR-Psal-xyS2；
以质粒pUC57-Pm-TcR为模板，以SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10所示的引物对进行扩增，获得基因片段Pm-TcR；
线性化的质粒pBBR1MCS-nahR-Psal-xyS2和所述基因片段Pm-TcR通过无缝克隆进行连接，获得重组质粒pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-TcR；
以所述重组质粒pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-TcR为模板，以SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14所示的引物对进行反向PCR扩增，获得线性化的质粒pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-TcR；
以以菌株Bacillus subtilis subsp.spizizenii ATCC 6633基因组为模板，以SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.16所示的引物对进行扩增，获得基因片段pyc；
线性化的质粒pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-TcR和所述基因片段pyc通过无缝克隆进行连接，获得重组质粒pBBR1MCS-nahR-Psal-xyS2-Pm-pyc；
将所述重组质粒pBBR1MCS-nahR-Psal-xyS2-Pm-pyc转化入大肠杆菌WS100，获得所述高产丁二酸的大肠杆菌。
在本发明的第五方面，提供了采用所述的高产丁二酸的大肠杆菌发酵高产丁二酸的方法，所述方法包括：
将所述的高产丁二酸的大肠杆菌进行摇瓶发酵或者发酵罐发酵培养，获得丁二酸。
进一步地，所述摇瓶发酵的条件为：
将所述的高产丁二酸的大肠杆菌在48-52mg/L氯霉素抗性的LB固体平板上划线培养，挑取单菌落接种于装有含有48-52mg/L氯霉素抗性45-55ml LB培养基的培养瓶中37℃、150-250r/min培养2-5h后，加入终浓度为30-40mg/L的水杨酸，30℃，150-250r/min诱导4-8h，诱导结束后将菌液倾倒至装有140-160ml发酵培养基的培养瓶中，37℃，150-250r/min培养40-55h；
所述摇瓶发酵培养基组分为：40g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，20g/L胰蛋白胨，1.14g/L KH2PO4，0.9g/L K2HPO4·12H2O，3.0g/L(NH4)2SO4，0.5g/L MgSO4·12H2O，0.25g/L CaCl2·2H2O及单独灭菌的40g/LMgCO3和玻璃珠。
进一步地，所述发酵罐发酵的条件为：
将所述的高产丁二酸的大肠杆菌在48-52mg/L氯霉素抗性的LB固体平板上划线培养，取单菌落接种于含有48-52mg/L氯霉素抗性180-220ml LB培养基的培养瓶中，37℃，150-250r/min培养8-16h，以12-17％的接种量接种于2.8-3.2L发酵培养基中进行发酵，发酵5-7h后，加入终浓度为36mg/L的水杨酸进行诱导；
所述发酵培养基配方为：10％葡萄糖，0.2％酵母粉，0.3％玉米浆，0.35％KH2PO4，0.5％K2HPO4，0.35％(NH4)2HPO4，0.25％MgSO4·7H2O；所述发酵条件为：发酵温度为37℃，搅拌转速300r/min，10％MgCO3和10％NaOH混合溶液作为中和剂维持pH为6.80。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
(1)所采用nahR/Psal::xylS2/Pm启动子具有很强的转录放大倍数，相对于常见的Plac启动子及其类似启动子Ptac或Ptrc，本启动子受葡萄糖效应影响小，且其诱导物水杨酸价格便宜便于工业化放大。相对于对照，重组大肠杆菌HBUT-WSPM在发酵20h时葡萄糖消耗完全，发酵液中丁二酸含量为73.25g/L，糖酸转化率为97.67％，较对照菌株WS100分别提高了6.38％和8.87％。
(2)改进了nahR/Psal::xylS2/Pm的启动子，将染色体上的启动子元件和载体上的启动子元件整合到一个质粒上。nahR/Psal::xylS2/Pm是一个能将转录信号级联放大的启动子，诱导物结合到阻遏蛋白nahR上，使聚合酶能结合到Psal启动子使xyS2蛋白大量转录，同时诱导物还结合到xyS2蛋白上以正调控方式促进Pm启动子转录下游的基因。Santero E.等人将nahR-Pasl-xyS2等启动子组件通过转座方式转移到染色体上，Pm启动子则放置在载体上，这样放置的好处是质粒小构建容易，只需要把目标基因放置在Pm下即可。这样的放置方式也带来了新的问题：首先转座方式必须有转座成功的筛选标记，通常将kan抗性基因和nahR-Pasl-xyS2等组件连接在一起，这样会带来抗性标记必需回收的问题，否则后续基因操作变得困难；其次，nahR-Pasl-xyS2等启动子组件位于染色体组上只有一个拷贝，在一定程度上影响Pm的重复启动。考虑到随着无缝克隆技术发展，载体构建已变得更为便利，因此本发明将所有启动子组件整合在一起，解决了原有技术带来的困扰。
(3)本发明将Pm/xyS2的启动子整合到广宿主载体pBBR1MCS-1上，为其它革兰氏阴性菌产丁二酸提供一种通用的方法和材料。
本发明的高产丁二酸的大肠杆菌的保藏日期为2022年7月12日，保藏编号为CCTCCNO：M20221093。其分类学命名为Escherichia coli HBUT-WSPM，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为实施例1中质粒构建示意图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一株高产丁二酸的大肠杆菌及其制备方法与应用进行详细说明。
实施例1、高产丁二酸的大肠杆菌HBUT-WSPM
一、含nahR/Psal::xylS2/Pm启动子载体的构建
(1)pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2质粒构建
表1相关引物序列及编号
以质粒pBBR1MCS-1为模板，以表1中pBBR1MCS-1-p1(序列如SEQ ID NO.1所示)和pBBR1MCS-1-p2(序列如SEQ ID NO.2所示)为引物进行PCR扩增。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收线性化的质粒pBBR1MCS-1。
核酸片段nahR-Psal-xyS2为昆泰锐生物公司合成(序列如SEQ ID NO.32所示)，并放置在质粒pUC57上(酶切位点BamHI和HindIII之间)，以质粒pUC57-nahR-Psal-xyS2为模板，以表1中nahR-Psal-xyS2-p1(序列如SEQ ID NO.3所示)和nahR-Psal-xyS2-p2(序列如SEQ ID NO.4所示)为引物进行PCR扩增。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并用PCR产物回收试剂盒回收。
将pBBR1MCS-1载体片段和nahR-Pasl-xyS2基因片段按照摩尔比1:3进行添加，加入1U T5核酸外切酶，10X Reaction Buffer 1μl,补水至总体积至10μl，放置于冰水混合物中处理5min，热击法化转入DH5α感受态细胞，细胞复苏后，取200μl涂布于含50mg/L氯霉素抗性的LB固体平板，37℃培养16h，挑取单菌落对克隆子进行验证。以表1中Verify△nahR-Psal-xyS2-p1(序列如SEQ ID NO.5所示)和Verify△nahR-Psal-xyS2-p2(序列如SEQ IDNO.6所示)为验证引物，进行菌落PCR验证。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，正确条带大小约为2110bp。进一步提取质粒送测序公司测序验证，验证正确后的质粒命名为pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2。
(2)pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-TcR质粒构建
以质粒pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2为模板，以表1中pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-p1(序列如SEQ ID NO.7所示)和pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-p2(序列如SEQ IDNO.8所示)为引物进行PCR扩增。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收线性化的质粒pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2。
核酸片段Pm-TcR为昆泰锐生物公司合成(序列如SEQ ID NO.33所示)，并放置在质粒pUC57上(酶切位点BamHI和HindIII之间)，以质粒pUC57-Pm-TcR为模板，以表1中Pm-TcR-p1(序列如SEQ ID NO.9所示)和Pm-TcR-p2(序列如SEQ ID NO.10所示)为引物进行PCR扩增。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并用PCR产物回收试剂盒回收获得基因片段Pm-TcR。
将pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2载体片段和Pm-TcR基因片段按照摩尔比1:3进行添加，加入1U T5核酸外切酶，10X Reaction Buffer 1μl,补水至总体积至10μl，放置于冰水混合物中处理5min，热击法化转入DH5α感受态细胞。复苏后，取200μl涂布于含50mg/L氯霉素抗性的LB固体平板。以表1中Verify△Pm-TcR-p1(序列如SEQ ID NO.11所示)和Verify△Pm-TcR-p2(序列如SEQ ID NO.12所示)为验证引物，挑取克隆子进行菌落PCR验证。PCR产物进行0.8％凝胶电泳，正确条带大小约为3371bp，阴性对照条带约为1443bp。进一步提取质粒送测序公司测序验证，验证正确后的质粒命名为pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-TcR。
(3)pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-pyc质粒构建
以质粒pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-TcR为模板，以表1中pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-TcR-p1(序列如SEQ ID NO.13所示)和pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-TcR-p2(序列如SEQ ID NO.14所示)为引物进行PCR扩增。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收线性化的质粒pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-TcR。
以菌株Bacillus subtilis subsp.spizizenii ATCC 6633为模板，以表1中Pm-pyc-p1(序列如SEQ ID NO.15所示)和Pm-pyc-p2(序列如SEQ ID NO.16所示)为引物进行PCR扩增。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并用PCR产物回收试剂盒回收获得基因片段pyc。
将pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-TcR载体片段和pyc基因片段按照摩尔比1:3进行添加，加入1U T5核酸外切酶，10X Reaction Buffer 1μl,补水至总体积至10μl，放置于冰水混合物中处理5min，热击法化转入DH5α感受态细胞。复苏后，取200μl涂布于含50mg/L氯霉素抗性的LB固体平板。
处理结束后，立即进行克隆转化。将10μl反应体系于冰上与100μl E.coli DH5α感受态细胞混合，并冰浴30min，然后在42℃水浴锅中热激90s，立即放入冰上，5min后在体系中加入1ml LB培养基，在37℃摇床中复苏1h后，取200μl涂布于含50mg/L氯霉素抗性的LB固体平板，37℃培养16h，挑取克隆子进行验证。以表1中Verify△Pm-pyc-p1(序列如SEQ IDNO.17所示)和Verify△Pm-pyc-p2(序列如SEQ ID NO.18所示)为验证引物，挑取单菌落进行菌落PCR验证。PCR产物进行0.8％凝胶电泳，正确条带大小约为4915bp，阴性对照没有条带。进一步提取质粒送测序公司测序验证，验证正确后的质粒命名pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-pyc，其序列为SEQ ID NO.29。
二、重组质粒的转化
采用CaCl2法制备大肠杆菌WS100感受态细胞。将pBBR1MCS-nahR-Psal-xyS2-Pm-pyc质粒采用热击法化转入大肠杆菌WS100(选用产丁二酸的大肠杆菌WS100为出发菌株，记载于文献高产琥珀酸重组大肠杆菌的构建及厌氧发酵.食品与发酵工业.2013,31(1):6～10)感受态细胞中，将复苏好的菌液涂布于含有50mg/L氯霉素抗性的LB固体培养基中，37℃培养箱培养16h。挑取单菌落在含有50mg/L氯霉素抗性LB固体培养基中划线传代培养，菌株命名为重组大肠杆菌HBUT-WSPM。
对比例1、pyc基因使用其它启动子表达的重组大肠杆菌WS100/pTrc99a-pyc
一、pTrc99a-pyc质粒构建
以质粒pTrc99a为模板，以表1中pTrc99a-p1(序列如SEQ ID NO.19所示)和pTrc99a-p2(序列如SEQ ID NO.20所示)为引物进行PCR扩增。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收线性化的质粒pTrc99a。
以菌株Bacillus subtilis subsp.spizizenii ATCC 6633全基因组为模板，以表1中Trc-pyc-p1(序列如SEQ ID NO.21所示)和Trc-pyc-p2(序列如SEQ ID NO.22所示)为引物进行PCR扩增。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并用PCR产物回收试剂盒回收获得基因片段pyc。
将pTrc99a载体片段和pyc基因片段按照摩尔比1:3进行添加，加入1U T5核酸外切酶，10X Reaction Buffer 1μl,补水至总体积至10μl，放置于冰水混合物中处理5min，热击法化转入DH5α感受态细胞。复苏后，取200μl涂布于含50mg/L氨苄抗性的LB固体平板。
处理结束后，立即进行克隆转化。将10μl反应体系于冰上与100μl E.coli DH5α感受态细胞混合，并冰浴30min，然后在42℃水浴锅中热激90s，立即放入冰上，5min后在体系中加入1ml LB培养基，在37℃摇床中复苏1h后，取200μl涂布于含50mg/L氨苄抗性的LB固体平板，37℃培养16h，挑取克隆子进行验证。以表1中Verify△Trc-pyc-p1(序列如SEQ IDNO.23所示)和Verify△Trc-pyc-p2(序列如SEQ ID NO.24所示)为验证引物，挑取单菌落进行菌落PCR验证。PCR产物进行0.8％凝胶电泳，正确条带大小约为1392bp，阴性对照没有条带。进一步提取质粒送测序公司测序验证，验证正确后的质粒命名pTrc99a-pyc，其序列为SEQ ID NO.30。
二、重组质粒的转化
采用CaCl2法制备大肠杆菌WS100感受态细胞。将pTrc99a-pyc质粒采用热击法化转入大肠杆菌WS100感受态细胞中，将复苏好的菌液涂布于含有50mg/L氨苄抗性的LB固体培养基中，37℃培养箱培养16h。挑取单菌落在含有50mg/L氨苄抗性的LB固体培养基中划线传代培养，菌株命名为重组大肠杆菌WS100/pTrc99a-pyc。
对比例2、pyc基因使用其它启动子表达的重组大肠杆菌WS100/J23119-pyc
一、pTrc99a-J23119-pyc质粒构建
以质粒pTrc99a-pyc为模板，以表1中pTrc99a-J23119-pyc-p1(序列如SEQ IDNO.25所示)和pTrc99a-J23119-pyc-p2(序列如SEQ ID NO.26所示)为引物进行PCR扩增。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收线性化的质粒pTrc99a-pyc。
在pTrc99a-pyc载体片段中加入1U T5核酸外切酶，10X Reaction Buffer 1μl,补水至总体积至10μl，放置于冰水混合物中处理5min，热击法化转入DH5α感受态细胞。复苏后，取200μl涂布于含50mg/L氨苄抗性的LB固体平板。
处理结束后，立即进行克隆转化。将10μl反应体系于冰上与100μl E.coli DH5α感受态细胞混合，并冰浴30min，然后在42℃水浴锅中热激90s，立即放入冰上，5min后在体系中加入1ml LB培养基，在37℃摇床中复苏1h后，取200μl涂布于含50mg/L氨苄抗性的LB固体平板，37℃培养16h，挑取克隆子进行验证。以表1中Verify△J23119-pyc-p1(序列如SEQ IDNO.27所示)和Verify△J23119-pyc-p2(序列如SEQ ID NO.28所示)为验证引物，挑取单菌落进行菌落PCR验证。PCR产物进行0.8％凝胶电泳，正确条带大小约为1413bp，阴性对照没有条带。进一步提取质粒送测序公司测序验证，验证正确后的质粒命名pTrc99a-J23119-pyc，其序列为SEQ ID NO.31。
二、重组质粒的转化
采用CaCl2法制备大肠杆菌WS100感受态细胞。将pTrc99a-J23119-pyc质粒采用热击法化转入大肠杆菌WS100感受态细胞中，将复苏好的菌液涂布于含有50mg/L氨苄抗性的LB固体培养基中，37℃培养箱培养16h。挑取单菌落分别在含有50mg/L氨苄抗性的LB固体培养基中划线传代培养，菌株命名为重组大肠杆菌WS100/J23119-pyc。
实验例1、不同启动子对丁二酸发酵的影响
将实施例1、对比例1、对比例2的菌株进行发酵培养并测定丁二酸产量，方法如下：
种子液制备：将用甘油保藏的大肠杆菌WS100和重组大肠杆菌HBUT-WSPM、WS100/pTrc99a-pyc、WS100/J23119-pyc分别在相应抗生素的抗性平板划线培养，挑取单菌落分别接种于装有50ml LB液体培养基、含有50mg/L氯霉素抗性的50ml LB液体培养基和含有50mg/L氨苄抗性的的50ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，37℃，200r/min过夜培养12h。
发酵培养基：40g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，20g/L胰蛋白胨，1.14g/L KH2PO4，0.9g/LK2HPO4·12H2O，3.0g/L(NH4)2SO4，0.5g/L MgSO4·12H2O，0.25g/L CaCl2·2H2O及单独灭菌的40g/LMgCO3和少量玻璃珠。
发酵条件：将种子液以2％的接种量接种于50ml发酵培养基中，37℃，200r/min培养2～3h，菌体OD600 0.6时加入相应诱导剂进行诱导，其中，WS100/pTrc99a-pyc和菌株HBUT-WSPM分别添加终浓度为1mmol/L的IPTG以及终浓度为12mg/L的水杨酸，30℃，200r/min诱导6h。诱导结束后，将50ml菌液倾倒至装有150ml发酵培养基的250ml三角瓶中，37℃，200r/min培养48h。
结果分析：发酵过程中在24h，48h各取一次样，发酵液pH测定使用pH计。测生物量时将样品和12％HCl溶液按体积比1:1混合处理后，稀释一定倍数使用分光光度计测定OD600。测丁二酸含量时，将样品与6％H2SO4溶液按体积比1:1处理后12000r/min离心5min后，0.22μm滤膜过滤，用流动相稀释一定倍数后测定。液相色谱检测条件为：色谱柱为Bio-RadHPX 87H，流动相为5mmol/L H2SO4溶液，流动相为0.5ml/min，柱温45℃，进样量10μl，PDA检测器检测，检测波长254nm，运行时间20min。
在构建的不同启动子载体中，pBBR1MCS-nahR-Psal-xyS2-Pm-pyc使大肠杆菌WS100有较高的琥珀酸产量。重组大肠杆菌HBUT-WSPM丁二酸产量为35.82g/L，糖酸转化率为89.6％。相对于Ptrc和J23119启动子，丁二酸产量分别提高了5.6％和6.5％。
表2不同启动子对丁二酸发酵的影响结果
实验例2、诱导剂添加时机对丁二酸发酵的影响
种子液制备：将用甘油保藏的重组大肠杆菌HBUT-WSPM于含50mg/L氯霉素抗性的LB固体平板上划线，挑取单菌落接种于装有含有50mg/L氯霉素抗性50ml LB培养基的250ml三角瓶中，37℃，200r/min过夜培养12h。
发酵培养基：40g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，20g/L胰蛋白胨，1.14g/L KH2PO4，0.9g/LK2HPO4·12H2O，3.0g/L(NH4)2SO4，0.5g/L MgSO4·12H2O，0.25g/L CaCl2·2H2O及单独灭菌的40g/LMgCO3和少量玻璃珠。
发酵条件：将种子液以2％的接种量接种于50ml发酵培养基中，37℃，200r/min培养8h(好氧阶段)。然后将50ml菌液倾倒至装有150ml发酵培养基的250ml三角瓶中，37℃，200r/min培养48h(厌氧阶段)。分别在好氧阶段0h、菌体OD6000.6、厌氧发酵0h、厌氧发酵12h添加终浓度为36mg/L的水杨酸进行诱导。
重组大肠杆菌HBUT-WSPM在菌体OD6000.6时加入36mg/L的水杨酸进行诱导，效果最为明显，丁二酸产量为35.07g/L，糖酸转化率为87.7％(表3)。而大肠杆菌WS100在菌体OD600为0.6时加入水杨酸诱导，丁二酸产量以及糖酸转化率没有明显变化。
表3摇瓶发酵时诱导剂添加时机对丁二酸发酵的影响结果
实验例3、10％葡萄糖发酵罐批次发酵丁二酸发酵的结果
发酵培养基：10％葡萄糖，0.2％酵母粉，0.3％玉米浆，0.35％KH2PO4，0.5％K2HPO4，0.35％(NH4)2HPO4，0.25％MgSO4·7H2O
种子液制备：将大肠杆菌WS100和重组大肠杆菌HBUT-WSPM分别于LB固体平板和含50mg/L氯霉素抗性的LB固体平板上划线培养，挑取单菌落分别接种于装有200ml具有相应抗性LB培养基中，37℃，200r/min培养12h。
发酵条件为：发酵温度为37℃，搅拌转速300r/min，10％MgCO3和10％NaOH混合溶液作为中和剂维持pH为6.80。发酵6h后，加入终浓度为36mg/L的水杨酸进行诱导。
表4 10％葡萄糖批次发酵产丁二酸的结果
由表4可知：
重组大肠杆菌HBUT-WSPM在发酵20h时葡萄糖消耗完全，发酵液中丁二酸含量为73.25g/L，糖酸转化率为97.67％，较对照菌株WS100分别提高了6.38％和8.87％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一株高产丁二酸的大肠杆菌，其特征在于，所述高产丁二酸的大肠杆菌为重组大肠杆菌（Escherichia coli）WS100/pBBR1MCS-nahR-Psal-xyS2-Pm-pyc，命名为HBUT-WSPM，保藏号为CCTCC M 20221093。
2.一种权利要求1所述的高产丁二酸的大肠杆菌在发酵高产丁二酸中的应用。
3.一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包括：
将如权利要求1所述的高产丁二酸的大肠杆菌进行发酵获得的发酵液；
或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。
4.一种权利要求1所述的高产丁二酸的大肠杆菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
以质粒pBBR1MCS-1为模板，以SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示的引物对进行反向PCR扩增，获得线性化的质粒pBBR1MCS-1；
以质粒pUC57-nahR-Psal-xyS2为模板，以SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的引物对进行扩增，获得基因片段nahR-Psal-xyS2；
将所述线性化的质粒pBBR1MCS-1和所述基因片段nahR-Psal-xyS2通过无缝克隆进行连接，获得重组质粒pBBR1MCS-nahR-Psal-xyS2；
以所述重组质粒pBBR1MCS-nahR-Psal-xyS2为模板，以SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示的引物对进行反向PCR扩增，获得线性化的质粒pBBR1MCS-nahR-Psal-xyS2；
以质粒pUC57-Pm-TcR为模板，以SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10所示的引物对进行扩增，获得基因片段Pm-TcR；
线性化的质粒pBBR1MCS-nahR-Psal-xyS2和所述基因片段Pm-TcR通过无缝克隆进行连接，获得重组质粒pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-TcR；
以所述重组质粒pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-TcR为模板，以SEQ ID NO.13-SEQID NO.14所示的引物对进行反向PCR扩增，获得线性化的质粒pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-TcR；
以菌株Bacillus subtilis subsp.spizizenii ATCC 6633基因组为模板，以SEQ IDNO.15-SEQ ID NO.16所示的引物对进行扩增，获得基因片段pyc；
线性化的质粒pBBR1MCS-1-nahR-Psal-xyS2-Pm-TcR和所述基因片段pyc通过无缝克隆进行连接，获得重组质粒pBBR1MCS-nahR-Psal-xyS2-Pm-pyc；
将所述重组质粒pBBR1MCS-nahR-Psal-xyS2-Pm-pyc转化入大肠杆菌WS100，获得所述高产丁二酸的大肠杆菌。
5.一种利用权利要求1所述的高产丁二酸的大肠杆菌发酵高产丁二酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
将权利要求1所述的高产丁二酸的大肠杆菌进行摇瓶发酵或者发酵罐发酵培养，获得丁二酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述摇瓶发酵的条件为：
将所述的高产丁二酸的大肠杆菌在48-52mg/L氯霉素抗性的LB固体平板上划线培养，挑取单菌落接种于装有含有48-52mg/L氯霉素抗性45-55ml LB培养基的培养瓶中37℃、150-250r/min培养2-5h后，加入终浓度为30-40mg/L的水杨酸，30℃，150-250r/min诱导4-8h，诱导结束后将菌液倾倒至装有140-160ml发酵培养基的培养瓶中，37℃，150-250r/min培养40-55h；
所述摇瓶发酵培养基组分为：40g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，20g/L胰蛋白胨，1.14g/LKH2PO4，0.9g/L K2HPO4·12H2O，3.0g/L(NH4)2SO4，0.5g/L MgSO4·12H2O，0.25g/L CaCl2·2H2O及单独灭菌的40g/LMgCO3和玻璃珠。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵罐发酵的条件为：
将所述的高产丁二酸的大肠杆菌在48-52mg/L氯霉素抗性的LB固体平板上划线培养，取单菌落接种于含有48-52mg/L氯霉素抗性180-220ml LB培养基的培养瓶中，37℃，150-250r/min培养8-16h，以12-17％的接种量接种于2.8-3.2L发酵培养基中进行发酵，发酵5-7h后，加入终浓度为36mg/L的水杨酸进行诱导；
所述发酵培养基配方为：10％葡萄糖，0.2％酵母粉，0.3％玉米浆，0.35％KH2PO4，0.5％K2HPO4，0.35％(NH4)2HPO4，0.25％MgSO4·7H2O；所述发酵条件为：发酵温度为37℃，搅拌转速300r/min，10％MgCO3和10％NaOH混合溶液作为中和剂维持pH为6.80。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533626A (zh) * | 2011-12-13 | 2012-07-04 | 南京工业大学 | 利用葡萄糖产丁二酸的基因工程菌株及其发酵产酸方法 |
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Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE278786T1 (de) * | 1999-06-22 | 2004-10-15 | Consejo Superior Investigacion | Genetische kaskaderegulierte expression von klonierten genen |
| ES2260985B1 (es) * | 2003-12-04 | 2007-11-01 | Universidad Pablo De Olavide | Procedimiento de regulacion de la expresion de proteinas heterologas controladas por derivados salicilicos en microorganismos asociados a organismos superiores. |
| ES2299284B1 (es) * | 2004-11-04 | 2009-04-16 | Universidad Pablo De Olavide | Control de la expresion genica mediante el uso de un atenuador de la transcripcion. |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533626A (zh) * | 2011-12-13 | 2012-07-04 | 南京工业大学 | 利用葡萄糖产丁二酸的基因工程菌株及其发酵产酸方法 |
| CN102604880A (zh) * | 2012-04-05 | 2012-07-25 | 南京工业大学 | 一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法 |
| CN102864116A (zh) * | 2012-10-16 | 2013-01-09 | 南京工业大学 | 产丁二酸基因工程菌及其构建及应用 |
| CN111246865A (zh) * | 2017-07-12 | 2020-06-05 | 同生运营公司 | 程序化以在肿瘤细胞中产生免疫调节剂和抗癌治疗剂的微生物 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Exploitation of prokaryotic expression systems based on the salicylate-dependent control circuit encompassing nahR/Psal;Pablo D. Becker et al.;《Bioengineered Bugs 》;20100701;第1卷(第4期);244-251 * |
| Rational design of a bacterial transcriptional cascade for anplifying gene expression capacity;Angel Cebolla et al.;《Nucleic acids research》;20011231;第29卷(第3期);759-766 * |
| 重组大肠杆菌产琥珀酸研究进展;姜岷等;《微生物学通报》;20090120;第36卷(第1期);120-124 * |
| 重组大肠杆菌利用不同培养基发酵产琥珀酸的研究;华渤文等;《食品工业科技》;20131231;第34卷(第6期);227-230 * |
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