CN106967662A - 一种固定二氧化碳合成丁二酸的重组菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种固定二氧化碳合成丁二酸的重组菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种固定二氧化碳合成丁二酸的重组菌及其构建方法和应用，属于基因工程和发酵工程领域，重组菌宿主为大肠杆菌，表达乙酰辅酶A羧化酶基因accADBC、丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr、丙酰辅酶A合酶基因pcs、丙酰辅酶A羧化酶基因pcc、甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶基因mcE、甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶基因mcM、琥珀酰辅酶A合成酶基因sucCD。构建方法获得重组载体pACYCDuet‑accADBC‑pcs、pETDuet‑mcr‑pcc‑sucCD‑mcEM转化到宿主细胞中。本发明所构建的重组菌可以利用葡萄糖为唯一碳源合成丁二酸，发酵48h，可以得到6.06g/L的丁二酸。

Description

一种固定二氧化碳合成丁二酸的重组菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种固定CO2生产丁二酸的重组菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
当前经济的发展消耗了大量化石资源，而化石资源的过度使用造成了大量温室气体的排放，我国CO2排放量已居世界第一，占全球排放总量的1/3。与此同时我国在积极参与应对气候变化的国际行动中，将绿色低碳节能减排作为国家经济社会发展的重大战略之一，因此如何更好的控制二氧化碳的保有量，将二氧化碳进行更好地利用已迫在眉睫。
丁二酸(又名琥珀酸，succinic acid)是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。丁二酸作为一种重要的有机酸及优秀的化学平台产品，被广泛应用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、新型绿色溶剂、高分子聚合物等化工产品，位居美国能源部公布的未来全球最具开发潜力的12种高附加值生物基化工产品之首，具有广阔的应用前景和很高的经济价值。目前丁二酸的制备主要依赖化学合成手段，高污染，高耗能，而这种制备手段严重制约了丁二酸作为一种优秀的化学平台产品的发展。
现有技术中国专利CN102174455A、CN103131663A、CN102399738A等利用基因工程菌，实现了以木糖、葡萄糖等为原料合成丁二酸，但是发酵过程中需要厌氧环境。为了维持厌氧环境，需要在发酵过程中持续通入氮气或二氧化碳，加大了生产成本，不利于实现产业化。
发明内容
为解决丁二酸常规合成过程中需要厌氧环境加重生产成本问题，本发明首先提供了一种固定二氧化碳合成丁二酸的重组菌，发酵过程不需要厌氧环境，同时可以固定二氧化碳，起到节能减排的作用。
所述重组菌是以大肠杆菌为出发菌株，导入乙酰辅酶A羧化酶基因accADBC、丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr、丙酰辅酶A合酶基因pcs、丙酰辅酶A羧化酶基因pcc、甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶基因mcE、甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶基因mcM、琥珀酰辅酶A合成酶基因sucCD，得到重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述的编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accADBC各个亚基在NCBI中的基因ID分别为accA:944895、accB:947758、accC:947761、accD:946796；丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR在NCBI中的蛋白质ID为AAS20429.1；丙酰辅酶A合酶Pcs在NCBI中的蛋白质ID为AAL47820.2；编码丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc在NCBI中的基因ID为1100367；甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶McE在NCBI中的蛋白质ID为ACL23899.1；编码甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM在NCBI中的基因ID为5826972；编码琥珀酰辅酶A合成酶的基因sucCD各个亚基在NCBI中的基因ID分别为sucC:945312、sucD:945314。
本发明还提供一种构建所述重组菌的方法，包括以下步骤：
1)克隆乙酰辅酶A羧化酶基因accADBC，将所得基因与质粒pACYCDuet-1进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得重组载体pACYCDuet-accADBC；
2)克隆丙酰辅酶A合酶基因pcs，将所得基因与步骤1)所得载体pACYCDuet-accADBC进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得重组载体pACYCDuet-accADBC-pcs；
3)克隆丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr，将所得基因与质粒pETDuet进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得重组载体pETDuet-mcr；
4)克隆丙酰辅酶A羧化酶基因pcc，将所得基因与步骤3)所得pETDuet-mcr进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得重组载体pETDuet-mcr-pcc；
5)克隆琥珀酰辅酶A合成酶基因sucCD，将所得基因与步骤4)所得pETDuet-mcr-pcc进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得重组载体pETDuet-mcr-pcc-sucCD；
6)克隆甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶基因mcE，克隆甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶基因mcM，将所得基因进行搭桥连接，获得基因片段mcEM；
7)将步骤6)获得的mcEM基因片段与步骤5)所得pETDuet-mcr-pcc-sucCD进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得重组载体pETDuet-mcr-pcc-sucCD-mcM；
8)将步骤2)与步骤7)所获得的重组载体，转化到宿主Escherichia coliBL21(DE3)感受态细胞中，获得大肠杆菌重组菌。
上述方法中，所述的乙酰辅酶A羧化酶基因accADBC不同亚基在NCBI中基因ID分别为accA:944895、accB:947758、accC:947761、accD:946796；丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr在NCBI中的基因ID为5827083；丙酰辅酶A合酶基因pcs在NCBI中的编号为GenBank:AF445079.2；丙酰辅酶A羧化酶基因pcc在NCBI中的基因ID为1100367；甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶mcE在NCBI中的基因ID为5827511；甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶基因mcM在NCBI中的基因ID为5826972；琥珀酰辅酶A合成酶基因sucCD不同亚基在NCBI中的基因ID分别为sucC:945312、sucD:945314。
本发明还提供一种应用所述重组菌发酵生产丁二酸的方法，步骤如下：
1)活化重组菌，获得种子液；
2)将步骤1)所得的种子液，与含有氨苄青霉素与氯霉素的发酵培养基，按照体积比种子液：发酵培养基＝(1～2):(100～130)的比例接种后，35℃～37℃，180～220rpm条件下培养至OD600在0.6～0.8，获得培养液；
3)向所得的培养液中加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.01～0.1mM，然后转入30～33℃，180～220rpm条件下继续培养24～48小时；
在本发明的一种实施方式中，步骤2)所述培养条件为：37℃，180rpm。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基的碳源为葡萄糖，氮源为无机氮源，如氯化铵或硫酸铵等，其他成分为无机盐。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基的配方为：20g/L葡萄糖，15.2g/L十二水合磷酸氢二钠，3g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，1g/L氯化铵，3g/L酵母粉，0.4g/L碳13标记的碳酸氢钠，0.5g/L硫酸镁，0.1％(v/v)微量元素。
在本发明的一种实施方式中，微量元素母液的配方为：6.0g/L七水合硫酸亚铁，2.0g/L硼酸，2.0g/L四水合氯化锰，0.8g/L四水合钼酸铵，0.2g/L五水合硫酸铜。
在本发明的一种实施方式中，所用的碳酸氢钠为碳13标记的碳酸氢钠
在本发明的一种实施方式中，将重组菌活化后，按1％的接种量接种到含100μg·mL-1氨苄青霉素和100μg·mL-1氯霉素的发酵培养基中，37℃、180rpm条件下振荡培养，待OD600达到0.6时，温度调节至30℃，并加入0.05mM IPTG进行诱导，每隔12h用氨水调节pH至7，初次诱导后48h终止发酵。
本发明所获得的的有益效果如下：
基于现有的丁二酸合成过程中需要厌氧环境，加重了生产成本问题，本发明提出构建工程菌进行二氧化碳的固定，并以产生丁二酸为目标的生物合成方案。本发明所设计的代谢途径在发酵过程中不需要通入维持厌氧环境，同时可以起到固定二氧化碳的目的。在本发明中，通过该途径每生产一分子丁二酸可固定两分子二氧化碳，在一定程度上可减少温效应，避免对石化原料的过度依赖，大大提高了对原料的利用率，因此具有广阔的发展前景及应用潜力。
本发明以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌株，通过过表达关键合成基因乙酰辅酶A羧化酶基因accADBC、丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr、丙酰辅酶A合酶基因pcs、丙酰辅酶A羧化酶基因pcc、甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶基因mcE、甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶基因mcM和琥珀酰辅酶A合成酶基因sucCD，构建获得工程菌，以葡萄糖为碳源，实现了丁二酸合成的一种新方法。本发明所构建的重组菌可以利用葡萄糖为唯一碳源合成丁二酸，具有合成一分子丁二酸的同时固定两分子CO2的特点，发酵48h，可以得到6.06g/L的丁二酸。
定义和缩写
在本文中使用下列的缩写或简称：
乙酰辅酶A羧化酶基因：accADBC
丙二酸单酰辅酶A还原酶基因：mcr
丙酰辅酶A合酶基因：pcs
丙酰辅酶A羧化酶基因：pcc
甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶基因：mcE
甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶基因：mcM
琥珀酰辅酶A合成酶基因：sucCD
大肠杆菌(Escherichia coli):E.coli
“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平(即，野生型表达水平)，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
具体实施方式
下面通过实例来进一步阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
培养基配方：
1)种子液摇瓶培养基
LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。
2)摇瓶发酵培养基
基本改良培养基：20g/L葡萄糖，15.2g/L十二水合磷酸氢二钠，3g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，1g/L氯化铵，3g/L酵母粉，0.4g/L碳13标记的碳酸氢钠，0.5g/L硫酸镁，0.1％(v/v)微量元素。
微量元素母液的配方：6.0g/L七水合硫酸亚铁，2.0g/L硼酸，2.0g/L四水合氯化锰，0.8g/L四水合钼酸铵，0.2g/L五水合硫酸铜。
在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100mg/L的氨苄青霉素和100μg·mL-1氯霉素。
实施例1固定二氧化碳合成丁二酸的重组菌的构建
1)-2)载体pACYCDuet-accADBC-pcs的构建
1)获取来源于大肠杆菌的乙酰辅酶A羧化酶的基因accADBC(各个亚基在NCBI中基因ID分别为accA:944895、accB:947758、accC:947761、accD:946796)，是以大肠杆菌的基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'-caggatccgatgagtctgaatttcctt-3'和5'-CGGAATTCTTATTTTTCCTGAAGACCGAGTTT-3')，具体扩增程序如下：
PCR结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA GelExtraction Kit)回收大小为4000bp左右的目的片段。
将获得的accADBC基因片段和质粒pACYCDuet-1用BamHI和XhoI限制性内切酶在37℃条件下进行双酶切3.5h，酶切产物进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA Gel Extraction Kit)回收酶切产物。将回收的载体与accADBC基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL-1氯霉素的LB固体平板上，PCR(程序与基因扩增相同)筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pACYCDuet-accADBC后，再通过限制性酶切和测序鉴定，确认基因片段已经正确插入到pACYCDuet-1载体上。
2)获取来源于橙色绿曲挠菌的丙酰辅酶A合酶基因pcs(在NCBI中编号为GenBank:AF445079.2)，是以橙色绿曲挠菌的基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'-CCGCTCGAGtaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattccccatcttagtatattagttaagtataagaaggagat atacatgatcgacactgcgccccttgc-3'和5'-CCGCTCGAGctaccgctcgccggccgtcca-3')，具体扩增程序如下：
PCR结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA GelExtraction Kit)回收大小为5500bp左右的目的片段。
将获得的pcs基因片段和质粒pACYCDuet-accADBC用XhoI限制性内切酶在在37℃条件下酶切3.5h，酶切产物进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA GelExtraction Kit)回收酶切产物。将回收的载体与pcs基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL-1氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pACYCDuet-accADBC-pcs后，再通过限制性酶切和测序鉴定，确认基因片段已经正确插入到表达载体上。
3)-7)载体pETDuet-mcr-pcc-sucCD-mcEM的构建
获取来源于橙色绿曲挠菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶mcr(在NCBI中蛋白的ID为AAS20429.1)，是以橙色绿曲挠菌的基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'-taccatgggcagcagccatcaccatcatcaccacag-3'和5'-GAATTTACACGGTAATCGCCCGTC-3')，)，具体扩增程序如下：
PCR结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA GelExtraction Kit)回收大小为3700bp左右的目的片段。
将获得的mcr基因片段和质粒pETDue-1t用NotI和XhoI限制性内切酶在37℃条件下进行双酶切3.5h，酶切产物进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGAGel Extraction Kit)回收酶切产物，将回收的载体与mcr基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL-1氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pETDuet-mcr后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定，确认基因片段已经正确插入到表达载体上。
获取来源于橙色绿曲挠菌的丙酰辅酶A羧化酶基因pcc(在NCBI中基因ID为1100367)，是以橙色绿曲挠菌的基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物5'-CGGAATTCATGTCTGAACCGGAAGAACAG-3和5'-CGGAATTCTTACAGCGGGATGTTACCGTG-3')，具体扩增程序如下：
PCR结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒再利用回收试剂盒(OMEGA Gel Extraction Kit)回收大小为1700bp左右的目的片段。
将获得的pcc基因片段和质粒pETDuet-mcr用EcoRI在37℃条件下酶切3.5h，酶切产物进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA Gel Extraction Kit)回收酶切产物，将回收的载体与pcc基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL-1氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pETDuet-mcr-pcc后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定，确认pcc基因片段已经正确插入到pETDuet-mcr载体上。
获取来源于橙色绿曲挠菌的甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶基因mcE(在NCBI中基因ID为5827511)和甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶基因mcM(在NCBI中基因ID为5826972)，是以橙色绿曲挠菌基因组为模板，通过PCR扩增获得(mcE引物：5'-CGGAATTCtaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattccccatcttagtatattagttaagtataagaaggagatatacATGTTCACCGCTGTTGACCAC-3'和5'-GTATATCTCCTTCTTTTAAGCGTGGTGCGGGGTACG-3'；mcM引物5'-CACGCTTAAAAGAAGGAGATATACATGACCCACGACGCTCAGGAA-3'和5'-CGCGAGCTCTTAAGCAGCAACACCTTTCAGAC-3')，具体扩增程序如下：
mcE扩增程序
mcM扩增程序
PCR结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA GelExtraction Kit)回收大小分别为500bp和2200bp左右的目的片段。
以回收获得的mcE和mcM基因片段为模板，通过搭桥PCR扩增获得mcEM(引物5'-CGGAATTCtaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattccccatcttagtatattagttaagtataagaaggagatatacATGTTCACCGCTGTTGACCAC-3'和5'-CGCGAGCTCTTAAGCAGCAACACCTTTCAGAC-3')，具体扩增程序如下：
mcE扩增程序
PCR结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA GelExtraction Kit)回收大小为2500bp左右的目的片段。
将获得的mcEM基因片段和质粒pETDuet-mcr用EcoRI和SacI在37℃水浴锅中酶切3.5h，酶切产物进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA GelExtraction Kit)回收酶切产物。将回收的载体与mcEM基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL-1氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pETDuet-mcrpcc-mcEM后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定，确认mcEM基因片段已经正确插入到表达载体上。
获取来源于大肠杆菌的琥珀酰辅酶A合成酶基因sucCD(两个亚基在NCBI中基因ID分别为sucC:945312、sucD:945314)，是以大肠杆菌的基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物5'-AACTGCAGtaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattccccatcttagtatattagttaagtataagaaggagatatacATGAACTTACATGAATATCAG-3'和5'-CCCAAGCTTTTATTTCAGAACAGTTTTCAGTGC-3')，具体扩增程序如下：
mcE扩增程序
PCR结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA GelExtraction Kit)回收大小为2100bp左右的目的片段。
将获得的sucCD基因片段和质粒pETDuet-mcr-pcc-mcEM用PstI和HindIII限制性内切酶在37℃条件下进行双酶切3.5h，酶切产物进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA Gel Extraction Kit)回收酶切产物。将回收的载体与sucCD基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL-1氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pETDuet-mcr-pcc-mcEM-sucCD后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定，确认sucCD基因片段已经正确插入到表达载体上。
8)将pACYCDuet-accADBC-pcs和pETDuet-mcr-mcEM-pcc-sucCD导入E.coli BL21(DE3)合成丁二酸
将上述步骤中获得的载体pACYCDuet-accADBC-pcs与载体pETDuet-mcr-mcEM-pcc-sucCD导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布在含有100μg·mL-1氨苄青霉素和100μg·mL-1氯霉素的LB固体平板；涂布后的平板置于37℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆。
实施例2发酵生产丁二酸
将实施例1获得的工程菌株单克隆在LB培养中进行活化，活化后的种子液按种子液：基本改良液体培养基1:100的体积比例接种到含有100mL的基本改良液体培养基的500mL挡板摇瓶中(内含100μg·mL-1氨苄青霉素和100μg·mL-1氯霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD600达到0.6左右时，温度调节至30℃，并加入0.05mM IPTG进行诱导。每隔12h用氨水调节pH至7左右，初次诱导后48h终止发酵。
产物的检测：
发酵结束后，取发酵液，10000rpm离心2min，上清通过0.22μm水相滤膜过滤至液相自动进样瓶，通过液相色谱-三重四级杆质谱联用仪进行定性检测，表明该发酵产品中丁二酸含有13C标记，确认了产物的生成是通过上述新构建途径生成。
取发酵液，10000rpm离心2min，上清通过0.22μm水相滤膜过滤至液相自动进样瓶，通过高效液相色谱进行定量检测。检测条件：色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H column(300mm×7.8mm)，柱温为60℃，检测波长为紫外210nm，流动相为0.5mM稀硫酸溶液，流速为0.4ml/min，时间40min/样品，产量为6.06g/L。
实施例3发酵生产丁二酸
将实施例1获得的工程菌株单克隆在LB培养中进行活化，活化后的种子液按种子液：基本改良液体培养基2:100的体积比例接种到含有100mL的基本改良液体培养基的500mL挡板摇瓶中(内含100μg·mL-1氨苄青霉素和100μg·mL-1氯霉素)，37℃、220rpm条件下振荡培养。OD600达到0.8左右时，温度调节至33℃，并加入0.1mM IPTG进行诱导。每隔12h用氨水调节pH至7左右，初次诱导后24h终止发酵。
发酵结束后，取发酵液，10000rpm离心2min，上清通过0.22μm水相滤膜过滤至液相自动进样瓶，通过液相色谱-三重四级杆质谱联用仪进行定性检测，表明该发酵产品中丁二酸含有13C标记，确认了产物的生成是通过上述新构建途径生成。
取发酵液，10000rpm离心2min，上清通过0.22μm水相滤膜过滤至液相自动进样瓶，通过高效液相色谱进行定量检测。检测条件：色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H column(300mm×7.8mm)，柱温为60℃，检测波长为紫外210nm，流动相为0.5mM稀硫酸溶液，流速为0.4ml/min，时间40min/样品，产量为4.37g/L。
实施例4发酵生产丁二酸
将实施例1获得的工程菌株单克隆在LB培养中进行活化，活化后的种子液按种子液：基本改良液体培养基1:130的体积比例接种到含有100mL的基本改良液体培养基的500mL挡板摇瓶中(内含100μg·mL-1氨苄青霉素和100μg·mL-1氯霉素)，35℃、180rpm条件下振荡培养。OD600达到0.6左右时，温度调节至30℃，并加入0.01mM IPTG进行诱导。每隔12h用氨水调节pH至7左右，初次诱导后48h终止发酵。
发酵结束后，取发酵液，10000rpm离心2min，上清通过0.22μm水相滤膜过滤至液相自动进样瓶，通过液相色谱-三重四级杆质谱联用仪进行定性检测，表明该发酵产品中丁二酸含有13C标记，确认了产物的生成是通过上述新构建途径生成。
取发酵液，10000rpm离心2min，上清通过0.22μm水相滤膜过滤至液相自动进样瓶，通过高效液相色谱进行定量检测。检测条件：色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H column(300mm×7.8mm)，柱温为60℃，检测波长为紫外210nm，流动相为0.5mM稀硫酸溶液，流速为0.4ml/min，时间40min/样品，产量为5.09g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种固定二氧化碳合成丁二酸的重组菌及其构建方法和应用
<130>
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物1
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(27)
<400> 1
caggatccga tgagtctgaa tttcctt 27
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 引物2
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(32)
<400> 2
cggaattctt atttttcctg aagaccgagt tt 32
<210> 3
<211> 116
<212> DNA
<213> 引物3
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(116)
<400> 3
ccgctcgagt aatacgactc actatagggg aattgtgagc ggataacaat tccccatctt 60
agtatattag ttaagtataa gaaggagata tacatgatcg acactgcgcc ccttgc 116
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物4
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(30)
<400> 4
ccgctcgagc taccgctcgc cggccgtcca 30
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 引物5
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(36)
<400> 5
taccatgggc agcagccatc accatcatca ccacag 36
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物6
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(24)
<400> 6
gaatttacac ggtaatcgcc cgtc 24
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物7
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(29)
<400> 7
cggaattcat gtctgaaccg gaagaacag 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物8
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(29)
<400> 8
cggaattctt acagcgggat gttaccgtg 29
<210> 9
<211> 113
<212> DNA
<213> 引物9
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(113)
<400> 9
cggaattcta atacgactca ctatagggga attgtgagcg gataacaatt ccccatctta 60
gtatattagt taagtataag aaggagatat acatgttcac cgctgttgac cac 113
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 引物10
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(36)
<400> 10
gtatatctcc ttcttttaag cgtggtgcgg ggtacg 36
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 引物11
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(45)
<400> 11
cacgcttaaa agaaggagat atacatgacc cacgacgctc aggaa 45
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 引物12
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(32)
<400> 12
cgcgagctct taagcagcaa cacctttcag ac 32
<210> 13
<211> 113
<212> DNA
<213> 引物13
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(113)
<400> 13
cggaattcta atacgactca ctatagggga attgtgagcg gataacaatt ccccatctta 60
gtatattagt taagtataag aaggagatat acatgttcac cgctgttgac cac 113
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 引物14
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(32)
<400> 14
cgcgagctct taagcagcaa cacctttcag ac 32
<210> 15
<211> 113
<212> DNA
<213> 引物15
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(113)
<400> 15
aactgcagta atacgactca ctatagggga attgtgagcg gataacaatt ccccatctta 60
gtatattagt taagtataag aaggagatat acatgaactt acatgaatat cag 113
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物16
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(33)
<400> 16
cccaagcttt tatttcagaa cagttttcag tgc 33

Claims (10)

1.一种固定二氧化碳合成丁二酸的重组菌，其特征在于，宿主菌为大肠杆菌，表达编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accADBC、编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr、编码丙酰辅酶A合酶的基因pcs、编码丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc、编码甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的基因mcE、编码甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM、编码琥珀酰辅酶A合成酶的基因sucCD。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accADBC来自大肠杆菌，丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr来自橙色绿曲挠菌，丙酰辅酶A合酶基因pcs来自橙色绿曲挠菌，丙酰辅酶A羧化酶基因pcc来自链霉菌，甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶基因mcE来自橙色绿曲挠菌，甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶基因mcM来自橙色绿曲挠菌，琥珀酰辅酶A合成酶基因sucCD来自大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accADBC不同亚基在NCBI中基因ID分别为accA:944895、accB:947758、accC:947761、accD:946796；丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr在NCBI中的基因ID为5827083；丙酰辅酶A合酶基因pcs在NCBI中的编号为GenBank:AF445079.2；编码丙酰辅酶A羧化酶的基因pcc在NCBI中的基因ID为1100367；甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶基因mcE在NCBI中的基因ID为5827511；编码甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的基因mcM在NCBI中的基因ID为5826972；编码琥珀酰辅酶A合成酶的基因sucCD不同亚基在NCBI中的基因ID分别为sucC:945312、sucD:945314。
4.一种构建权利要求1-3任一所述重组菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)克隆乙酰辅酶A羧化酶基因accADBC，将所得基因与质粒pACYCDuet-1进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，获得重组载体pACYCDuet-accADBC；
2)克隆丙酰辅酶A合酶基因pcs，将所得基因与步骤1)所得载体pACYCDuet-accADBC进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，获得重组载体pACYCDuet-accADBC-pcs；
3)克隆丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr，将所得基因与质粒pETDuet进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆提取质粒，，获得重组载体pETDuet-mcr；
4)克隆丙酰辅酶A羧化酶基因pcc，将所得基因与步骤3)所得pETDuet-mcr进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，获得重组载体pETDuet-mcr-pcc；
5)克隆琥珀酰辅酶A合成酶基因sucCD，将所得基因与步骤4)所得pETDuet-mcr-pcc进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，获得重组载体pETDuet-mcr-pcc-sucCD；
6)克隆甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶基因mcE，克隆甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶基因mcM，将所得基因进行搭桥连接，获得基因mcEM；
7)将步骤6)所得mcEM基因与步骤5)所得pETDuet-mcr-pcc-sucCD进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，获得重组载体pETDuet-mcr-pcc-sucCD-mcEM；
8)将步骤2)与步骤7)所获得的重组载体，转化到宿主Escherichia coliBL21(DE3)感受态细胞中，获得大肠杆菌重组菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的乙酰辅酶A羧化酶基因accADBC不同亚基在NCBI中基因ID分别为accA:944895、accB:947758、accC:947761、accD:946796；丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr在NCBI中的基因ID为5827083；丙酰辅酶A合酶基因pcs在NCBI中的编号为GenBank:AF445079.2；丙酰辅酶A羧化酶基因pcc在NCBI中的基因ID为1100367；甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶基因mcE在NCBI中的基因ID为5827511；甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶基因mcM在NCBI中的基因ID为5826972；琥珀酰辅酶A合成酶基因sucCD不同亚基在NCBI中的基因ID分别为sucC:945312、sucD:945314。
6.一种应用权利要求1-3任一所述的重组菌发酵生产丁二酸的方法，其特征在于，步骤如下：
1)活化重组菌，获得种子液；
2)将步骤1)所得的种子液，与含有氨苄青霉素与氯霉素的发酵培养基，按照体积比种子液：发酵培养基＝(1～2):(100～130)的比例接种后，35℃～37℃，180～220rpm条件下培养至OD600在0.6～0.8，获得培养液；
3)向所得的培养液中加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.01～0.1mM，然后转入30～33℃，180～220rpm条件下继续培养24～48小时。
7.根据权要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)所述培养条件为：37℃，180rpm。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵培养基的碳源为葡萄糖，氮源为无机氮源，其他成分为无机盐。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，氮源为氯化铵和/或硫酸铵。
10.根据权利要求6～9任一所述的方法，其特征在于，发酵培养基的配方为：20g/L葡萄糖，15.2g/L十二水合磷酸氢二钠，3g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，1g/L氯化铵，3g/L酵母粉，0.4g/L碳13标记的碳酸氢钠，0.5g/L硫酸镁，0.1％(v/v)微量元素母液；所述微量元素母液的配方为：6.0g/L七水合硫酸亚铁，2.0g/L硼酸，2.0g/L四水合氯化锰，0.8g/L四水合钼酸铵，0.2g/L五水合硫酸铜。
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