CN112210521B

CN112210521B - 一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN112210521B
Application number: CN201910625231.4A
Authority: CN
Inventors: 赵广; 刘修涛; 咸漠; 高文杰; 冯新军
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2019-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2039-07-11
Also published as: CN112210521A

Abstract

一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程和蛋白质工程领域。针对丙酰辅酶A羧化酶酶活较低，以及如何对丙酰辅酶A羧化酶进行高通量筛选的问题，本发明提供了一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌，所述重组菌是以草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌为宿主菌，在所述宿主菌中过表达甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶基因mct，乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB和乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC，本发明还提供了能够提高丙酰辅酶A羧化酶pcc酶活的单一位点突变体以及多位点突变体。本发明可实现丙酰辅酶A羧化酶基因pcc的CT亚基高通量筛选。

Description

一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明具体涉及一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程和蛋白质工程领域。

背景技术

丙酰辅酶A羧化酶在微生物次级代谢产物的合成中发挥着非常重要的作用，是微生物体内脂肪酸生物合成、聚酮类物质合成、甲醇同化、乙酰辅酶A同化等途径的关键酶。人体内PCC功能低下则会引起丙酸血症、癫痫等疾病。许多大环内酯类抗生素比如红霉素，泰乐霉素，阿维菌素等的生物合成，很多药物如FK506等的生物合成，也均需要丙酰辅酶A羧化酶的参与。目前丙酰辅酶A羧化酶酶活较低，且缺少丙酰辅酶A羧化酶的简易高通量筛选方法，使得对pcc的优化难以有效的开展。

发明内容

针对丙酰辅酶A羧化酶酶活较低，以及如何对丙酰辅酶A羧化酶进行高通量筛选的问题，本发明提供了一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌，所述重组菌是以草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌为宿主菌，在所述宿主菌中过表达甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶基因mct，乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB和乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC；所述丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基在NCBI中蛋白ID为：SMX58101。

进一步地限定，所述草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌，为敲除了谷草转氨酶基因aspC，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，苹果酸脱氢酶基因mdh和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶基因pck的大肠杆菌。

进一步地限定，所述谷草转氨酶基因aspC在KEGG数据库中的查询号为EC2.6.1.1；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc在KEGG数据库中的查询号为EC 4.1.1.31；所述苹果酸脱氢酶基因mdh在KEGG数据库中的查询号为EC 1.1.1.37；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶基因pck在KEGG数据库中的查询号为EC:4.1.1.49。

进一步地限定，所述乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB在NCBI中基因ID为：947758；所述乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC在NCBI中基因ID为：947761；所述甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶基因mct的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述重组菌的构建方法，包括如下步骤：

1)构建过表达中间载体：将甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶基因mct、乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB及乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC接到pACYCDuet质粒中，获得重组载体pACYCDuet-mct-accB-accC；

2)构建草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌菌株：通过CRISP/Cas9基因编辑方法敲除大肠杆菌中谷草转氨酶基因aspC，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，苹果酸脱氢酶基因mdh和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶基因pck，获得草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌，Escherichia coliBL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck；

3)将步骤1)中所获得的重组载体，转化到步骤2)获得的宿主EscherichiacoliBL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck感受态细胞中，获得筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌Escherichia coliBL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck-pACYCDuet-mct-accB-accC。

进一步地限定，所述通过CRISP/Cas9基因编辑方法敲除大肠杆菌中谷草转氨酶基因aspC时靶标序列SEQ ID No.33所示；敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc时靶标序列SEQ ID No.34所示；敲除苹果酸脱氢酶基因mdh时靶标序列SEQ ID No.35所示；敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶基因pck时靶标序列SEQ ID No.36所示。

本发明还提供了一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基突变体的方法，构建丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的突变体文库，将丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的突变体文库导入上述制备的重组菌中，筛选获得丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的突变体。

进一步地限定，所述丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的突变体文库的构建方法为：通过易错PCR的方法将丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基进行克隆，将质粒pETDuet-1通过EcoRI进行酶切，将酶切后的pETDuet-1质粒与易错PCR扩增的丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基基因通过一步克隆的方式进行连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，构建丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基基因的突变文库。

进一步地限定，所述易错PCR所使用的引物如SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.32所示，易错PCR模板为丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基基因，来自于枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis subsp.subtilis 168，其核苷酸序列如SEQ ID.NO.2所示。

本发明还提供了上述筛选获得的丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基突变体，所述突变体为单一位点突变体或多位点突变体，所述单一位点突变体突变情况包括：

pcc(F8L)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第8位苯丙氨酸突变为亮氨酸；

pcc(D46G)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺；

pcc(L97Q)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺；

pcc(N220I)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸；

pcc(I312V)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第312位异亮氨酸突变为缬氨酸；

pcc(D345N)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第345位天冬氨酸突变为天冬酰胺；

pcc(L358P)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第358位亮氨酸突变为脯氨酸；

pcc(I391T)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第391位异亮氨酸突变为苏氨酸；

和pcc(K455E)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第455位赖氨酸突变为谷氨酸；

所述多位点突变体突变情况包括：

pcc(I391T/D46G)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第391位异亮氨酸突变为苏氨酸且第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺；

pcc(I391T/L97Q)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第391位异亮氨酸突变为苏氨酸且第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺；

pcc(I391T/N220I)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第391位异亮氨酸突变为苏氨酸且第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸；

pcc(D46G/L97Q)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺且第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺；

pcc(D46G/N220I)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺且第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸；

pcc(L97Q/N220I)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺且第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸；

pcc(I391T/D46G/L97Q)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第391位异亮氨酸突变为苏氨酸、第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺且第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺；

pcc(I391T/D46G/N220I)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第391位异亮氨酸突变为苏氨酸、第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺且第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸；

pcc(I391T/L97Q/N220I)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第391位异亮氨酸突变为苏氨酸、第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺且第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸；

pcc(D46G/L97Q/N220I)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺且第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸；

和pcc(D46G/L97Q/N220I/I391T)：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺、第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸且第391位异亮氨酸突变为苏氨酸。

定义和缩写

在本文中使用下列的缩写或简称：

乙酰辅酶A羧化酶基因：accADBC；

丙酰辅酶A羧化酶基因：pcc；

谷草转氨酶：aspC；

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶：ppc；

苹果酸脱氢酶：mdh；

磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶：pck；

大肠杆菌(Escherichia coli):E.coli；

甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶：mct。

“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平(即野生型表达水平)，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。

有益效果

本发明以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌株，通过敲除相关基因，构建草酰乙酸缺陷型菌株，同时异源表达草酰乙酸的合成通路，提出了基于草酰乙酸营养缺陷的pcc高通量筛选方案，构建pcc的CT亚基高通量筛选菌株，并通过该方案获得了提高酶活的关键位点，通过关键位点的突变和组合，在M9基本培养基中进行筛选，通过纯酶酶活的检测方法，获得了一系列单点突变和多点突变的突变体，突变体最高酶活可达9.14±0.85μmol/min/mg protein，较野生型有6.72倍的提高。本发明可实现丙酰辅酶A羧化酶基因pcc的CT亚基高通量筛选。

具体实施方式

下面通过实例来进一步阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如PCR扩增，胶回收、酶切、连接等各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。

pCas质粒记载在Appl Environ Microbiol,2015,81:2506.

pETDuet-1、pACYCDuet-1均为本领域常用的载体，均可通过商业化途径购买获得。

pTarget质粒记载在Appl Environ Microbiol,2015,81:2506.，所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，定点突变实验采用天根定点突变试剂盒，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。

培养基配方：

1)种子液摇瓶培养基

LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。

2)摇瓶发酵培养基

基本改良培养基：14.04g/L三水合磷酸氢二钾，5.24g/L磷酸二氢钾，1g/L氯化钠，1g/L氯化铵，1g/L酵母粉，4g/L碳酸氢钠，40mg/L生物素，1g/L丙酸钠，0.5g/L硫酸镁，20g/L葡萄糖，0.1％(v/v)微量元素。

微量元素母液的配方：6.0g/L七水合硫酸亚铁，2.0g/L硼酸，2.0g/L四水合氯化锰，0.8g/L四水合钼酸铵，0.2g/L五水合硫酸铜。

在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100mg/L的氨苄青霉素和50μg·mL^-1氯霉素。

实施例1.筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌的构建。

本实施例所述重组菌是以草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌为宿主菌，在所述宿主菌中过表达甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶基因mct，乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB和乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC；所述丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基在NCBI中蛋白ID为：SMX58101；所述草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌，为敲除了谷草转氨酶基因aspC，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，苹果酸脱氢酶基因mdh和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶基因pck的大肠杆菌；所述谷草转氨酶基因aspC在KEGG数据库中的查询号为EC 2.6.1.1；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc在KEGG数据库中的查询号为EC 4.1.1.31；所述苹果酸脱氢酶基因mdh在KEGG数据库中的查询号为EC 1.1.1.37；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶基因pck在KEGG数据库中的查询号为EC:4.1.1.49；所述乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB在NCBI中基因ID为：947758；所述乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC在NCBI中基因ID为：947761；所述甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶基因mct的核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

下面具体描述筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌的构建方法：

1.构建过表达中间载体：将甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶基因mct、乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB及乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC连接到pACYCDuet质粒中，获得重组载体pACYCDuet-mct-accBC；具体方法如下：

载体pACYCDuet-accBC-mct的构建：

a.获取来源于大肠杆菌的乙酰辅酶A羧化酶的基因accBC(包括乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB和乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC)，是以大肠杆菌的基因组为模板，通过PCR扩增获得，所用引物序列如下：

accBC上游引物：5'-tcgctgacgtcggtaccctcgagTTAATACGACTCACTATAGGCCTGT-3'；

accBC下游引物：

5'-CGGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTATTTTTCCTGAAGACCGAGTT-3'；

PCR扩增产物利用回收试剂盒回收目的片段。将获得的accBC基因片段和质粒pACYCDuet-1用XhoI酶切，回收酶切产物，将获得的accBC基因片段与载体按照摩尔比3:1的比例，37℃连接30min，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有50μg·mL^-1氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pACYCDuet-accBC后，在通过限制性酶切和测序鉴定。

b.获取甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶的基因mct，通过基因合成的方法获得，基因序列如SEQ ID NO.1所示，该序列含有基因mct的5S亚基(Genbank中的ID分别为CBL57379.1)和12S亚基(Genbank中的ID为CBL57378.1)将合成后的该基因序列通过PCR的方法进行扩增，并连接至pACYCDuet-accBC载体上，其中PCR扩增所用引物序列如下：

上游引物1：5'-ACTTTAATAAGGAGATATACCATGAAGCTGAAAGTTACCGTGAATG-3'

下游引物2：

5'-CGGCCGATATCCAATTGAGATCTTTATGCCTGCTGAACGGTAACTTC-3'；

PCR扩增产物利用回收试剂盒回收目的片段。将获得的mct基因片段和质粒pACYCDuet-accBC用BglII和NotI酶切，回收酶切产物，将获得的mct基因片段与载体按照摩尔比3:1的比例，37℃连接30min，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有50μg·mL^-1氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pACYCDuet-accBC-mct后，再通过限制性酶切和测序鉴定。

2.构建草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌菌株：通过CRISP/Cas9基因编辑方法敲除大肠杆菌中谷草转氨酶基因aspC，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，苹果酸脱氢酶基因mdh和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶基因pck，获得草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌，Escherichia coliBL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck；具体方法如下：

a.谷草转氨酶aspC的敲除：

1)制备大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞，将pCas质粒转入该感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得BL21(DE3)-pCas菌株；

2)挑取BL21(DE3)-pCas菌株单克隆，在液体LB中进行培养，收菌前1h加入10mM阿拉伯糖，制备BL21(DE3)-pCas感受态细胞；

3)克隆aspC基因上游和下游各300bp的基因序列。

扩增上游片段，所用引物为：

上游引物3：5’-accgagtcggtgctttttttGTGATGTTGATCTGGTGAACTACTTTG-3’；

下游引物4：5’-GGCTTCATTGTTTTTAATGCGACGAGGTTCCATTATGGTTACAGA-3’；

扩增下游片段，所用引物为：

上游引物5：5’-aaccataatggaacctcgtcGCATTAAAAACAATGAAGCCCG-3’；

下游引物6：5’-TGCAGGTCGACTCTAGAGAATTCCGTGGCGATCATAATCAACTGA-3’，利用回收试剂盒回收目的片段，然后进行搭桥连接，搭桥PCR中以上述扩增出的aspC的上游片段和下游片段为模板，所述搭桥引物序列如下：

上游引物3：5’-accgagtcggtgctttttttGTGATGTTGATCTGGTGAACTACTTTG-3’；

下游引物6：’-TGCAGGTCGACTCTAGAGAATTCCGTGGCGATCATAATCAACTGA-3’

搭桥实验50μL体系为：

PCR扩增程序为：

获得的片段记为：aspC-up-down，利用回收试剂盒回收目的片段。

4)选取aspC基因中的tgaatacgcttattatgatg序列作为基因敲除用的打靶序列N20，通过将该序列作为5’引物的一部分，利用PCR扩增的方式与sgRNA进行连接，

上游引物7：

5’-AgtcctaggtataatactagttgaatacgcttattatgatgGTTTTAGAGCTAGAAATAGCaag-3’；

下游引物8：5’-AGTTCACCAGATCAACATCACAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC-3’；

获得的片段记为：aspC-N20-sgRNA，利用回收试剂盒回收目的片段。

5)将aspC-N20-sgRNA片段与aspC-up-down片段进行搭桥连接，搭桥PCR中模板为aspC-N20-sgRNA片段与aspC-up-down片段，所用引物为：

上游引物7：

5’-AgtcctaggtataatactagttgaatacgcttattatgatgGTTTTAGAGCTAGAAATAGCaag-3’；

下游引物6：5’-TGCAGGTCGACTCTAGAGAATTCCGTGGCGATCATAATCAACTGA-3’；

搭桥实验50μL体系为：

PCR扩增程序为：

获得aspC-N20-sgRNA-aspC-up-down片段，利用回收试剂盒回收目的片段。

6)，将pTarget质粒用SpeI和EcoRI进行酶切，并回收酶切产物。将获得的aspC-N20-sgRNA-aspC-up-down基因片段与双酶切后的pTarget载体，按照摩尔比3:1的比例，利用一步克隆试剂盒，37℃连接30min，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布在加有50μg·mL^-1Spectinomycin的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pTarget-aspC-N20-sgRNA-aspC-up-down后，在通过限制性酶切和测序鉴定。

7)将pTarget-aspC-N20-sgRNA-aspC-up-down重组载体转化入BL21(DE3)-pCas感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得BL21(DE3)△aspC-pCas-pTarget-aspC-N20-sgRNA-aspC-up-down菌株。

8)上述BL21(DE3)△aspC-pCas-pTarget-aspC-N20-sgRNA-aspC-up-down菌株中加入0.5mM的IPTG，消除pTarget-aspC-N20-sgRNA-aspC-up-down质粒(加入IPTG后，pTarget-aspC-N20-sgRNA-aspC-up-down质粒丢失，然后继续引入下一轮的pTarget质粒进行敲除，为一个连续敲除的过程)，获得BL21(DE3)△aspC-pCas菌株。BL21(DE3)△aspC-pCas菌株置于42℃培养箱中进行培养，消除pCas质粒，获得BL21(DE3)△aspC菌株。

b.磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc的敲除：

1)克隆ppc基因上游和下游各300bp的基因序列。

扩增上游片段，所用引物为：

上游引物9：5’-accgagtcggtgctttttttcatccggcaccgttgccaaact-3’；

下游引物10：5’-GGGTTTGCAGAAGAGGAAGAATTACCCCAGACACCCCATC-3’；

扩增下游片段，所用引物为：

上游引物11：5’-gatggggtgtctggggtaattcttcctcttctgcaaaccctcg-3’；

下游引物12：5’-AGGTCGACTCTAGAGAATTCGCGAATGCCGTTAGTGCCACTA-3’，

利用回收试剂盒回收目的片段，然后进行搭桥连接，搭桥PCR中以上述扩增出的ppc基

因的上游片段和下游片段为模板，所述搭桥引物序列如下：

上游引物9：5’-accgagtcggtgctttttttcatccggcaccgttgccaaact-3’；

下游引物12：5’-AGGTCGACTCTAGAGAATTCGCGAATGCCGTTAGTGCCACTA-3’

搭桥实验50μL体系为：

PCR扩增程序为：

获得的片段记为：ppc-up-down，利用回收试剂盒回收目的片段。

2)选取ppc基因中的aagagaacctcggctacaaa序列作为基因敲除用的打靶序列N20，通过将该序列作为5’引物的一部分，利用PCR扩增的方式与sgRNA进行连接，

上游引物13：5’-AgtcctaggtataatactagtaagagaacctcggctacaaaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCaag-3’；

下游引物14：

5’-AGTTTGGCAACGGTGCCGGATGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA-3’；

获得的片段记为：ppc-N20-sgRNA，利用回收试剂盒回收目的片段。

3)将ppc-N20-sgRNA片段与ppc-up-down片段进行搭桥连接，搭桥PCR中模板为ppc-N20-sgRNA片段与ppc-up-down片段，所用引物为：

上游引物13：

5’-AgtcctaggtataatactagtaagagaacctcggctacaaaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCaag-3’；

下游引物12：

5’-AGGTCGACTCTAGAGAATTCGCGAATGCCGTTAGTGCCACTA-3’；

搭桥实验50μL体系为：

PCR扩增程序为：

获得ppc-N20-sgRNA-ppc-up-down片段，利用回收试剂盒回收目的片段。

4)将pTarget质粒用SpeI和EcoRI进行酶切，并回收酶切产物。将获得的ppc-N20-sgRNA-ppc-up-down基因片段与双酶切后的pTarget载体按照摩尔比3:1的比例，利用一步克隆试剂盒37℃连接30min，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有50μg·mL^- ¹Spectinomycin的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pTarget-ppc-N20-sgRNA-ppc-up-down后，在通过限制性酶切和测序鉴定。

5)将pTarget-ppc-N20-sgRNA-ppc-up-down重组载体转化入BL21(DE3)△aspC-pCas感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得BL21(DE3)△aspC△ppc-pCas-pTarget-ppc-N20-sgRNA-ppc-up-down菌株。

6)上述BL21(DE3)△aspC△ppc-pCas-pTarget-ppc-N20-sgRNA-ppc-up-down菌株中加入0.5mM的IPTG，消除pTarget-ppc-N20-sgRNA-ppc-up-down质粒，获得BL21(DE3)△aspC△ppc-pCas菌株。BL21(DE3)△aspC△ppc-pCas菌株置于42℃培养箱中进行培养，消除pCas质粒，获得BL21(DE3)△aspC△ppc菌株。

c.苹果酸脱氢酶基因mdh的敲除：

1)克隆mdh基因上游和下游各300bp的基因序列，

扩增上游片段，所用引物为：

上游引物15：5’-accgagtcggtgctttttttgatggtggttgatacaacattatt-3’；

下游引物16：5’-TTTTATTATTCGCTAATCAACCTAAACTCCTTATTATATTGATA-3’；

扩增下游片段，所用引物为：

上游引物17：5’-aatataataaggagtttaggttgattagcgaataataaaaaa-3’；

下游引物18：5’-AGGTCGACTCTAGAGAATTCCGATTCCTTTCCAGTTAGCAAC-3’，利用回收试剂盒回收目的片段，然后进行搭桥连接，搭桥PCR中以上述扩增出的mdh的上游片段和下游片段为模板，所述搭桥引物序列如下：

上游引物15：5’-accgagtcggtgctttttttgatggtggttgatacaacattatt-3’；

下游引物18：5’-AGGTCGACTCTAGAGAATTCCGATTCCTTTCCAGTTAGCAAC-3’

搭桥实验50μL体系为：

PCR扩增程序为：

获得的片段记为：mdh-up-down，利用回收试剂盒回收目的片段。

2)选取mdh基因中的gctgaagtgctgaaaaaagc序列作为基因敲除用的打靶序列N20，通过将该序列作为5’引物的一部分，利用PCR扩增的方式与sgRNA进行连接，

上游引物19：

5’-AgtcctaggtataatactagtgctgaagtgctgaaaaaagcGTTTTAGAGCTAGAAATAGCaag-3’；

下游引物20：

5’-AATGTTGTATCAACCACCATCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA-3’；

获得的片段记为：mdh-N20-sgRNA，利用回收试剂盒回收目的片段。

3)将mdh-N20-sgRNA片段与mdh-up-down片段进行搭桥连接，搭桥PCR中模板为mdh-N20-sgRNA片段与mdh-up-down片段，所用引物为：

上游引物19：5’-AgtcctaggtataatactagtgctgaagtgctgaaaaaagcGTTTTAGAGCTAGAAATAGCaag-3’；

下游引物18：5’-AGGTCGACTCTAGAGAATTCCGATTCCTTTCCAGTTAGCAAC-3’；

搭桥实验50μL体系为：

PCR扩增程序为：

获得mdh-N20-sgRNA-mdh-up-down片段，利用回收试剂盒回收目的片段。

4)将pTarget质粒用SpeI和EcoRI进行酶切，并回收酶切产物。将获得的mdh-N20-sgRNA-mdh-up-down基因片段与双酶切后的pTarget载体按照摩尔比3:1的比例，利用一步克隆试剂盒37℃连接30min，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有50μg·mL^- ¹Spectinomycin的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pTarget-mdh-N20-sgRNA-mdh-up-down后，在通过限制性酶切和测序鉴定。

5)将pTarget-mdh-N20-sgRNA-mdh-up-down重组载体转化入BL21(DE3)△ppc△aspC-pCas感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得BL21(DE3)△ppc△aspC△mdh-pCas-pTarget-mdh-N20-sgRNA-mdh-up-down菌株。

6)上述BL21(DE3)△ppc△aspC△mdh-pCas-pTarget-mdh-N20-sgRNA-mdh-up-down菌株中加入0.5mM的IPTG，消除pTarget-mdh-N20-sgRNA-mdh-up-down质粒，获得BL21(DE3)△ppc△aspC△mdh-pCas菌株。BL21(DE3)△ppc△aspC△mdh-pCas菌株置于42℃培养箱中进行培养，消除pCas质粒，获得BL21(DE3)△ppc△aspC△mdh菌株。

d.磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶基因pck的敲除：

1)克隆pck基因上游和下游各300bp的基因序列。

扩增上游片段，所用引物为：

上游引物21：5’-accgagtcggtgctttttttaaaaagttagcgtggtgaatcgat-3’；

下游引物22：5’-TATTCTCCAGCTTCAAATCATTCACTGCTCCTTAGCCAATATG-3’；

扩增下游片段，所用引物为：

上游引物23：5’-attggctaaggagcagtgaatgatttgaagctggagaatatct-3’；

下游引物24：5’-AGGTCGACTCTAGAGAATTCGGAATTGCGCCGGAACAACGTAA-3’，

利用回收试剂盒回收目的片段，然后进行搭桥连接，搭桥PCR中以上述扩增出的pck的上游片段和下游片段为模板，所述搭桥引物序列如下：

上游引物21：5’-accgagtcggtgctttttttaaaaagttagcgtggtgaatcgat-3’；

下游引物24：5’-AGGTCGACTCTAGAGAATTCGGAATTGCGCCGGAACAACGTAA-3’

搭桥实验50μL体系为：

PCR扩增程序为：

获得的片段记为：pck-up-down，利用回收试剂盒回收目的片段。

2)选取pck基因中的tcgttcaccaaaagataagt序列作为基因敲除用的打靶序列N20，通过将该序列作为5’引物的一部分，利用PCR扩增的方式与sgRNA进行连接。

上游引物25：

5’-AgtcctaggtataatactagttcgttcaccaaaagataagtGTTTTAGAGCTAGAAATAGCaag-3’；

下游引物26：

5’-ATTCACCACGCTAACTTTTTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’；

获得的片段记为：pck-N20-sgRNA，利用回收试剂盒回收目的片段。

3)将pck-N20-sgRNA片段与pck-up-down片段进行搭桥连接，搭桥PCR中模板为pck-N20-sgRNA片段与pck-up-down片段，所用引物为：

上游引物25：

5’-AgtcctaggtataatactagttcgttcaccaaaagataagtGTTTTAGAGCTAGAAATAGCaag-3’；

下游引物24：

5’-AGGTCGACTCTAGAGAATTCGGAATTGCGCCGGAACAACGTAA-3’；

搭桥实验50μL体系为：

PCR扩增程序为：

获得pck-N20-sgRNA-pck-up-down片段，利用回收试剂盒回收目的片段。

4)将pTarget质粒用SpeI和EcoRI进行酶切，并回收酶切产物。将获得的pck-N20-sgRNA-pck-up-down基因片段与双酶切后的pTarget载体按照摩尔比3:1的比例，利用一步克隆试剂盒37℃连接30min，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有50μg·mL^- ¹Spectinomycin的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pTarget-pck-N20-sgRNA-pck-up-down后，在通过限制性酶切和测序鉴定。

5)将pTarget-pck-N20-sgRNA-pck-up-down重组载体转化入BL21(DE3)△aspC△ppc△mdh-pCas感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得BL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck-pCas-pTarget-pck-N20-sgRNA-pck-up-down菌株。

6)上述BL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck-pCas-pTarget-pck-N20-sgRNA-pck-up-down菌株中加入0.5mM的IPTG，消除pTarget-pck-N20-sgRNA-pck-up-down质粒，获得BL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck-pCas菌株。BL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck-pCas菌株置于42℃培养箱中进行培养，消除pCas质粒，获得BL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck菌株。

3.将步骤1)中所获得的重组载体，转化到宿主Escherichia coli BL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck感受态细胞中，获得筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌Escherichia coliBL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck-pACYCDuet-mct-accB-accC。

实施例2.筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基突变体的方法。

本发明所述的筛选方法是以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株，将编码谷草转氨酶aspC，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc，苹果酸脱氢酶mdh，磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶pck进行敲除，构建草酰乙酸营养缺陷型菌株，同时将甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶mct，乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB，乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC导入上述草酰乙酸营养缺陷型大肠杆菌中，构建丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基筛选用重组菌。宿主菌由于草酰乙酸营养缺陷限制，在无机盐培养基中的生长会受到严重的抑制，而通过pcc的CT亚基以及mct异源构建表达，可实现草酰乙酸的回补，从而恢复部分生长。通过易错PCR的方法将丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基进行克隆，构建其突变文库。利用上述方案，通过重组菌的生长情况对丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的突变体文库进行筛选，并进行突变体酶活的测定，从而获得高催化效率的丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基蛋白。

构建丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的突变体文库，将丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的突变体文库导入实施例1制备的重组菌中，筛选获得丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的突变体。所述的编码丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基突变体文库的模板基因序列如SEQIDNO.2，通过基因合成方法获得上述丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基基因。具体方法如下：

pcc突变文库的构建及筛选：采用易错PCR的方法构建突变文库，步骤如下：

1)易错PCR的体系为：100微升易错PCR扩增体系中含有2微升浓度为10mM的dATP，2微升浓度为10mM的dGTP，10微升浓度为10mM的dTTP，10微升浓度为10mM的dCTP，2微升浓度为10μM的5’端引物(引物27)：序列为：5’-ccacagccaggatccgaattcgatgaacgaacatatggatcatttc-3’；2微升浓度为10μM的3’端引物(引物28)：序列为：5’-GCAGGCGCGCCGAGCTCTTACAGCGGAATATTGCCATGTTTC-3’，4微升浓度为25mM的MgCl₂，6微升浓度为5mM的MnCl₂，1微升的Taq酶，10微升的Taq buffer(buffer中含有20mM的Mg²⁺)，0.5微升的浓度为35ng/μL的模板。

2)易错PCR的扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸95s，循环数为30个，最后72℃充分延伸5min，通过胶回收试剂盒，获得易错PCR扩增后的丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基基因。

3)将质粒pETDuet通过EcoRI进行酶切，与步骤2)中的丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基基因通过一步克隆的方式进行连接，并转化到宿主DH5α中，涂布到含有氨苄青霉素的LB平板中，培养至才长出单菌落，获得pcc的CT亚基的突变文库。

4)将pcc的CT亚基突变文库在平板上洗下，接种至LB培养基中，氨苄青霉素抗性，37℃培养6h，浓缩收菌提质粒备用；

5)制备宿主菌Escherichia coliBL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck-pACYCDuet-mct-accB-accC感受态，将步骤4)中的质粒转化入该宿主菌中，涂布至氨苄青霉素抗性的M9培养基中，添加50μM的IPTG进行生长；

6)将步骤5)中长出的菌斑较大的菌落挑至96深孔板中进行培养，所用培养基为氨苄青霉素抗性的M9培养基，添加50μM的IPTG，24h后测OD，挑选OD值较高的菌落保菌备用。所述M9发酵培养基的碳源为葡萄糖，氮源为无机氮源，如氯化铵或硫酸铵等，其他成分为无机盐。

本发明共获得2000个突变体克隆，按OD值从大到小顺序排列，选择排位前200的突变体克隆按照上述方法再次进行筛选，然后按照OD值从大到小的顺序，选择排位前7的突变体克隆，经测序分析，发现其中包括单一位点突变和多位点突变，将上述7个突变体进行酶活测定。

pcc突变体的纯化及纯酶酶活的测定：

1)活化经OD值筛选后的重组菌即突变体克隆，接种子液。

2)将步骤1)所得的种子液，与含有氨苄青霉素的LB液体培养基，按照体积比种子液：LB培养基＝(1～2):(100～130)的比例接种后，35℃～37℃，180～220rpm条件下培养至OD₆₀₀在0.6～0.8，获得培养液。

3)向所得的培养液中加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.01～0.1mM，然后转入25～30℃，180～220rpm条件下继续培养12～24小时。

4)结束生长后，将菌液10000rpm离心10min，温度4℃，弃掉上清液，获得菌体沉淀。

5)将步骤4)中获得的菌体沉淀用30ml的Binding buffer溶液清洗两遍后，最后悬浮于5ml的Binding buffer溶液中，所述Binding buffer中含有20mM的咪唑。

6)将步骤5)中获得的菌体悬液用超声破碎仪进行破碎，破碎功率为40％，破碎时间为40min。

7)取步骤6)中获得的破碎后的菌液，12000rpm离心20min，温度4℃，留取上清液，上清液即为粗酶溶液。

8)取蛋白纯化用的镍柱，首先采用10倍柱体积的binding buffer活化，然后加入步骤7)中的蛋白上清液，反复挂柱三次，然后加入10倍柱体积的washing buffer洗柱，最后加入10倍柱体积的Elution buffer洗脱目标蛋白，所述washing buffer中含有80mM的咪唑；所述Elutionbuffer中含有500mM的咪唑。

9)将步骤8)纯化后的目标蛋白进行超滤浓缩。采用10KDa超滤管离心力5000g进行超滤，每次超滤浓缩后的体积在500微升至1毫升时，补PBS至50ml，并继续进行超滤，反复三次，最后浓缩蛋白至500微升至1毫升之间。将最终纯化好的蛋白添加甘油至50％，并保存至-20℃中备用。

10)在冰上配置纯酶酶活的反应体系。

11)步骤10)中的酶活反应体系包括：100mM的pH＝7.5的Tris-HCl、5mM的MgCl₂、1mM的DTT、10mM的KCl、40mM的NaHCO₃、1mM的生物素、6mM的ATP、1mM的丙酰辅酶A、5μM的乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基蛋白、5μM的乙酰辅酶A羧化酶BC亚基蛋白、500nM的丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基蛋白。

12)将反应物置于37℃金属浴中预热2min，2min后通过加入1mM的丙酰辅酶A启动反应，37℃反应2min，最后通过加入50微升的200mM的甲酸终止反应。

13)将步骤12)中的反应体系13000rpm离心15min，取上清，通过HPLC-MS检测不同突变体中甲基丙二酸单酰辅酶A的产量。

酶反应产物的测定方法：

采用HPLC-MS方法对甲基丙二酸单酰辅酶A进行定性和定量。

HPLC采用Thermo-Acclaim RSLC 120 C18 2.1×100mm柱子，流速为0.25ml/min，柱温为30℃，进样量为2微升，梯度洗脱方法为：

洗脱时间	5mM甲酸铵+0.1％FA(％)	乙腈+0.1％FA(％)
			0-1.5min	95％	5％
1.5-3min	95％→85％	5％→15％
			3-5.5min	85％→5％	15％→95％
5.5-14.5min	5％	95％
			14.5-15min	5％→95％	95％→5％
15min-25min	95％	5％

ESI离子源的compact-QTOF质谱仪，检测采用的离子模式为正离子模式，电压为4500V，检测范围为100-1300m/z，离子源温度为200℃，干燥气流速为2.0L/min。

通过抽提分子量868±0.2的甲基丙二酸单酰辅酶A的离子峰图，可以对产物进行定性；通过进行积分，可以获得产物甲基丙二酸单酰辅酶A的产量。

将纯酶活检测排在前4位的单一位点突变体通过定点突变试剂盒将突变的情况进行组合得到多位点突变体，然后按照上述方法进行菌种纯化以及酶活检测，结果如下：

氨基酸单点突变：

纯酶酶活由大到小的排列顺序为：pcc(I391T)酶活为6.97±0.31μmol/min/mgprotein、pcc(D46G)酶活为6.32±0.20μmol/min/mg protein、pcc(L97Q)酶活为4.23±0.65μmol/min/mg protein、pcc(N220I)酶活为3.21±0.17μmol/min/mg protein、pcc(K455E)酶活为2.40±0.51μmol/min/mg protein、pcc(F8L)酶活为2.35±0.19μmol/min/mg protein、pcc(L358P)酶活为1.71±0.11μmol/min/mg protein、pcc(I312V)酶活为1.70±0.53μmol/min/mg protein、pcc(D345N)酶活为1.42±0.28μmol/min/mg protein。

组合后的氨基酸突变情况为：

未突变的pcc酶活为1.36±0.08μmol/min/mg protein，组合突变体纯酶酶活高于野生型的，由大到小的排列顺序为：pcc(I391T/N220I)(核苷酸序列如SEQ ID NO.37)酶活为9.14±0.85μmol/min/mg protein、pcc(I391T/D46G)酶活为5.4±0.73μmol/min/mgprotein、pcc(D46G/N220I)酶活为3.53±0.53μmol/min/mg protein、pcc(I391T/D46G/N220I)酶活为3.31±0.34μmol/min/mg protein、pcc(I391T/L97Q)酶活为3.19±0.43μmol/min/mg protein。

本发明通过深入挖掘和研究获得高效的PCC，提供了一种基于草酰乙酸营养缺陷的pcc高通量筛选方案，并通过该方案获得了提高酶活的关键位点，通过关键位点的突变和组合，获得了酶活6.72倍提升的突变体，本发明可实现丙酰辅酶A羧化酶基因pcc的CT亚基高通量筛选。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

核苷酸序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌及其构建方法与应用

<130>

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3244

<212> DNA

<213> 甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶基因mct

<400> 1

atggcagaaa ataacaacct gaaactggcc agtaccatgg aaggccgtgt tgaacagctg 60

gccgaacagc gtcaggttat tgaagcaggc ggcggcgaac gccgcgttga aaaacagcat 120

agtcagggta aacagaccgc ccgcgaacgc ctgaataatc tgctggaccc tcatagcttt 180

gatgaagtgg gtgcatttcg caaacatcgt accaccctgt ttggtatgga taaagcagtt 240

gttccggccg atggtgtggt taccggccgc ggtaccattc tgggtcgccc ggttcatgca 300

gccagtcagg attttaccgt gatgggtggt agtgccggcg aaacccagag taccaaagtg 360

gttgaaacca tggaacaggc cctgctgacc ggcaccccgt ttctgttttt ctatgatagc 420

ggtggtgcac gcattcagga aggtattgat agcctgagtg gttatggtaa aatgtttttc 480

gccaatgtga aactgagtgg tgttgtgccg cagattgcaa ttattgccgg tccgtgtgca 540

ggtggcgcaa gctatagccc ggccctgacc gattttatta ttatgaccaa aaaggcacac 600

atgtttatta ccggtccgca ggttattaag agtgttaccg gtgaagatgt taccgcagat 660

gaactgggtg gtgcagaagc acacatggcc attagcggta atattcattt tgtggccgaa 720

gatgatgatg cagcagaact gattgccaaa aaactgctga gctttctgcc gcagaataat 780

accgaagaag ccagttttgt taatccgaat aatgatgtta gcccgaatac cgaactgcgc 840

gatattgtgc cgattgatgg caaaaaaggt tatgatgtgc gtgatgtgat tgccaaaatt 900

gtggattggg gtgactatct ggaagttaaa gccggctatg caaccaatct ggtgaccgcc 960

tttgcccgcg ttaatggccg cagtgtgggt attgtggcaa atcagccgag cgttatgagt 1020

ggctgcctgg atattaatgc cagcgataaa gccgcagaat ttgtgaattt ttgtgatagc 1080

tttaacatcc cgctggttca gctggtggat gttccgggtt ttctgccggg tgttcagcag 1140

gaatatggcg gtattattcg ccatggcgcc aaaatgctgt atgcctatag tgaagccacc 1200

gttccgaaaa ttaccgttgt gctgcgcaaa gcatacggtg gtagttatct ggcaatgtgc 1260

aatcgcgatc tgggtgcaga tgcagtttat gcctggccga gtgcagaaat tgcagtgatg 1320

ggtgcagaag gcgccgccaa tgtgattttt cgcaaagaaa ttaaggcagc agatgatccg 1380

gatgccatgc gcgcagaaaa aattgaagaa tatcagaatg cattcaacac cccgtatgtt 1440

gccgcagccc gtggtcaggt ggatgatgtg attgatccgg cagatacccg ccgtaaaatt 1500

gcaagtgccc tggaaatgta tgcaaccaaa cgccagaccc gtccggccaa aaaacatggt 1560

aattttccgt gttaagcggc cgcataatgc ttaagtcgaa cagaaagtaa tcgtattgta 1620

cacggccgca taatcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 1680

ttccccatct tagtatatta gttaagtata agaaggagat atacatatga gcccgcgcga 1740

aattgaagtt agtgaaccgc gcgaagtggg tattaccgaa ctggtgctgc gcgatgccca 1800

tcagagcctg atggccaccc gtatggccat ggaagatatg gtgggcgcat gtgccgatat 1860

tgatgcagcc ggctattgga gtgttgaatg ctggggtggt gccacctatg atagctgtat 1920

tcgctttctg aatgaagatc cgtgggaacg tctgcgtacc tttcgcaaac tgatgccgaa 1980

tagtcgcctg cagatgctgc tgcgtggtca gaatctgctg ggttatcgcc attataatga 2040

tgaagttgtt gatcgctttg tggataaaag cgcagaaaat ggtatggatg tgtttcgtgt 2100

gtttgatgca atgaatgatc cgcgtaatat ggcccatgca atggcagccg tgaaaaaagc 2160

cggcaaacat gcccagggca ccatttgtta taccattagc ccggtgcata ccgttgaagg 2220

ttatgtgaaa ctggccggtc agctgctgga tatgggcgcc gatagtattg cactgaaaga 2280

tatggccgca ctgctgaaac cgcagccggc ctatgatatt attaaggcaa ttaaggatac 2340

ctacggtcag aaaacccaga ttaatctgca ttgccatagt accaccggcg ttaccgaagt 2400

tagcctgatg aaagcaattg aagccggtgt ggatgtggtg gataccgcaa ttagcagcat 2460

gagtctgggt ccgggccata atccgaccga aagcgttgcc gaaatgctgg aaggcaccgg 2520

ctataccacc aatctggatt atgatcgcct gcataaaatt cgtgatcatt ttaaagcaat 2580

ccgtccgaaa tataaaaagt ttgaaagcaa aaccctggtg gataccagta tttttaaaag 2640

ccagattccg ggcggtatgc tgagcaatat ggaaagccag ctgcgcgcac agggtgcaga 2700

agataaaatg gatgaagtta tggccgaagt gccgcgcgtg cgtaaagccg caggttttcc 2760

gccgctggtg accccgagta gtcagattgt tggtacccag gcagtgttta atgtgatgat 2820

gggcgaatat aaacgtatga ccggtgaatt tgcagatatt atgctgggct attatggtgc 2880

aagtccggcc gatcgtgatc cgaaagtggt gaaactggca gaagaacaga gcggcaaaaa 2940

accgattacc cagcgtccgg cagatttgct gccgccggaa tgggaagaac agtcaaaaga 3000

agccgcagca ctgaaaggct ttaatggcac cgatgaagat gttctgacct atgcactgtt 3060

tccgcaggtt gccccggtgt ttttcgaaca tcgcgcagaa ggcccgcata gtgtggcact 3120

gaccgatgcc cagctgaaag ccgaagcaga aggtgacgaa aaaagtctgg cagttgccgg 3180

tccggtgacc tataatgtta atgtgggtgg caccgtgcgt gaagttaccg ttcagcaggc 3240

ataa 3244

<210> 2

<211> 1524

<212> DNA

<213> 丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基

<400> 2

atgaacgaac atatggatca tttctacacc aaacgtaaac aggcagaaga aggtggcggc 60

cgtgaaaaac tggcacagca gcgtcagaaa ggtaaactga ccgcccgcga acgcattatt 120

tttctgctgg atcaggatag ttttattgaa ctgcatccgt ttatggaaag ccaggtgctg 180

acccgtgaac agcgtatgct gggtgacggt gttgttaccg gttatggtac cattgatggt 240

cgcagcgttt atgtttttgc acaggatttt accgtgtatg gtggtgccct gggtgaaacc 300

catgcccgca aaatttgcgc actgatggat ctggccgcca aaaataaggc accgattatt 360

ggtctgaatg atagcggtgg tgcccgtatt caggaaggtg ttctgagcct ggatggttat 420

ggccatattt tctatcgtaa tgttctgtat agcggtgtta ttccgcagat tagcgttatt 480

ctgggtccgt gtgcaggcgg tgccgtttat agcccggccc tgaccgattt tatttttatg 540

gccgaacaga ccggtcgtat gtttattacc ggcccgaaag ttattgaaaa agttaccggt 600

gaacaggtgg atgccgaaag tctgggcggc gcaggtattc ataatgcagt gagtggtaat 660

gcacatttta gcggccatac cgaaaaagaa gttctgaccg gtgtgcgtaa actgctgagt 720

tatctgccgc tgaatggccg taccaccgaa ccgaaaccgg aaaaagaagc aagccgtccg 780

ctgctgaatc gtctggttcc ggccgatacc accaaaccgt atgatgtgcg taaagttatt 840

cgcgaactgg ccgatccgca gagctttttc gaaattcagc cgtttttcgc aaaaaatatt 900

gttattggtt tcgcacgtct gggtgaaaaa gccattggta ttgtggcaag tcagccgaaa 960

catctggcag gtagtctgac cattgatgcc gcagataaag cagcacgttt tattcgtttt 1020

tgtgatgcat ttgatatccc gctgctgacc gtggaagatg tgccgggttt tctgccgggc 1080

attcagcagg aacataatgg tattattcgc catggcgcaa aactgctgtt tgcctatgca 1140

gaagcaaccg tgccgaaagt taccctgatt attcgcaaag cctatggtgg cgcatatgtg 1200

gccatgaata gcaaagccat tggcgccgat ctggtttttg cctggccgaa tgccgaaatt 1260

gcagttatgg gtccggaagg tgcagcaagc attctgtatg aaaaagaaat taaggccagc 1320

gccgatccgc aaaaaaccaa acgtgaaaaa accgcagaat ataaaaagca gaatgcaggc 1380

ccgtataaag cagccgcatg cggcatggtg gatgatatta ttctgccgga agaaagtcgc 1440

ggtcgtctga ttcaggcatt tcatatgctg acccataaaa ccgaagaacg tccgaaaaag 1500

aaacatggca atattccgct gtaa 1524

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> accBC上游引物

<400> 3

tcgctgacgt cggtaccctc gagttaatac gactcactat aggcctgt 48

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> accBC下游引物

<400> 4

cggtttcttt accagactcg agttattttt cctgaagacc gagtt 45

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 上游引物1

<400> 5

actttaataa ggagatatac catgaagctg aaagttaccg tgaatg 46

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 下游引物2

<400> 6

cggccgatat ccaattgaga tctttatgcc tgctgaacgg taacttc 47

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 上游引物3

<400> 7

accgagtcgg tgcttttttt gtgatgttga tctggtgaac tactttg 47

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 下游引物4

<400> 8

ggcttcattg tttttaatgc gacgaggttc cattatggtt acaga 45

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 上游引物5

<400> 9

aaccataatg gaacctcgtc gcattaaaaa caatgaagcc cg 42

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 下游引物6

<400> 10

tgcaggtcga ctctagagaa ttccgtggcg atcataatca actga 45

<210> 11

<211> 64

<212> DNA

<213> 上游引物7

<400> 11

agtcctaggt ataatactag ttgaatacgc ttattatgat ggttttagag ctagaaatag 60

caag 64

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 下游引物8

<400> 12

agttcaccag atcaacatca caaaaaaagc accgactcgg tgcc 44

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 上游引物9

<400> 13

accgagtcgg tgcttttttt catccggcac cgttgccaaa ct 42

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 下游引物10

<400> 14

gggtttgcag aagaggaaga attaccccag acaccccatc 40

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 上游引物11

<400> 15

gatggggtgt ctggggtaat tcttcctctt ctgcaaaccc tcg 43

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 下游引物12

<400> 16

aggtcgactc tagagaattc gcgaatgccg ttagtgccac ta 42

<210> 17

<211> 64

<212> DNA

<213> 上游引物13

<400> 17

agtcctaggt ataatactag taagagaacc tcggctacaa agttttagag ctagaaatag 60

caag 64

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 下游引物14

<400> 18

agtttggcaa cggtgccgga tgaaaaaaag caccgactcg gtgcca 46

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> 上游引物15

<400> 19

accgagtcgg tgcttttttt gatggtggtt gatacaacat tatt 44

<210> 20

<211> 44

<212> DNA

<213> 下游引物16

<400> 20

ttttattatt cgctaatcaa cctaaactcc ttattatatt gata 44

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 上游引物17

<400> 21

aatataataa ggagtttagg ttgattagcg aataataaaa aa 42

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 下游引物18

<400> 22

aggtcgactc tagagaattc cgattccttt ccagttagca ac 42

<210> 23

<211> 64

<212> DNA

<213> 上游引物19

<400> 23

agtcctaggt ataatactag tgctgaagtg ctgaaaaaag cgttttagag ctagaaatag 60

caag 64

<210> 24

<211> 45

<212> DNA

<213> 下游引物20

<400> 24

aatgttgtat caaccaccat caaaaaaagc accgactcgg tgcca 45

<210> 25

<211> 44

<212> DNA

<213> 上游引物21

<400> 25

accgagtcgg tgcttttttt aaaaagttag cgtggtgaat cgat 44

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> 下游引物22

<400> 26

tattctccag cttcaaatca ttcactgctc cttagccaat atg 43

<210> 27

<211> 43

<212> DNA

<213> 上游引物23

<400> 27

attggctaag gagcagtgaa tgatttgaag ctggagaata tct 43

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213> 下游引物24

<400> 28

aggtcgactc tagagaattc ggaattgcgc cggaacaacg taa 43

<210> 29

<211> 64

<212> DNA

<213> 上游引物25

<400> 29

agtcctaggt ataatactag ttcgttcacc aaaagataag tgttttagag ctagaaatag 60

caag 64

<210> 30

<211> 45

<212> DNA

<213> 下游引物26

<400> 30

attcaccacg ctaacttttt aaaaaaagca ccgactcggt gccac 45

<210> 31

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物27

<400> 31

ccacagccag gatccgaatt cgatgaacga acatatggat catttc 46

<210> 32

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物28

<400> 32

gcaggcgcgc cgagctctta cagcggaata ttgccatgtt tc 42

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> aspC打靶序列

<400> 33

tgaatacgct tattatgatg 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> ppc打靶序列

<400> 34

aagagaacct cggctacaaa 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> mdh打靶序列

<400> 35

gctgaagtgc tgaaaaaagc 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> pck打靶序列

<400> 36

tcgttcacca aaagataagt 20

<210> 37

<211> 1524

<212> DNA

<213> pcc的CT亚基（N220I/I391T）

<400> 37

atgaacgaac atatggatca tttctacacc aaacgtaaac aggcagaaga aggtggcggc 60

cgtgaaaaac tggcacagca gcgtcagaaa ggtaaactga ccgcccgcga acgcattatt 120

tttctgctgg atcaggatag ttttattgaa ctgcatccgt ttatggaaag ccaggtgctg 180

acccgtgaac agcgtatgct gggtgacggt gttgttaccg gttatggtac cattgatggt 240

cgcagcgttt atgtttttgc acaggatttt accgtgtatg gtggtgccct gggtgaaacc 300

catgcccgca aaatttgcgc actgatggat ctggccgcca aaaataaggc accgattatt 360

ggtctgaatg atagcggtgg tgcccgtatt caggaaggtg ttctgagcct ggatggttat 420

ggccatattt tctatcgtaa tgttctgtat agcggtgtta ttccgcagat tagcgttatt 480

ctgggtccgt gtgcaggcgg tgccgtttat agcccggccc tgaccgattt tatttttatg 540

gccgaacaga ccggtcgtat gtttattacc ggcccgaaag ttattgaaaa agttaccggt 600

gaacaggtgg atgccgaaag tctgggcggc gcaggtattc ataatgcagt gagtggtatt 660

gcacatttta gcggccatac cgaaaaagaa gttctgaccg gtgtgcgtaa actgctgagt 720

tatctgccgc tgaatggccg taccaccgaa ccgaaaccgg aaaaagaagc aagccgtccg 780

ctgctgaatc gtctggttcc ggccgatacc accaaaccgt atgatgtgcg taaagttatt 840

cgcgaactgg ccgatccgca gagctttttc gaaattcagc cgtttttcgc aaaaaatatt 900

gttattggtt tcgcacgtct gggtgaaaaa gccattggta ttgtggcaag tcagccgaaa 960

catctggcag gtagtctgac cattgatgcc gcagataaag cagcacgttt tattcgtttt 1020

tgtgatgcat ttgatatccc gctgctgacc gtggaagatg tgccgggttt tctgccgggc 1080

attcagcagg aacataatgg tattattcgc catggcgcaa aactgctgtt tgcctatgca 1140

gaagcaaccg tgccgaaagt taccctgatt actcgcaaag cctatggtgg cgcatatgtg 1200

gccatgaata gcaaagccat tggcgccgat ctggtttttg cctggccgaa tgccgaaatt 1260

gcagttatgg gtccggaagg tgcagcaagc attctgtatg aaaaagaaat taaggccagc 1320

gccgatccgc aaaaaaccaa acgtgaaaaa accgcagaat ataaaaagca gaatgcaggc 1380

ccgtataaag cagccgcatg cggcatggtg gatgatatta ttctgccgga agaaagtcgc 1440

ggtcgtctga ttcaggcatt tcatatgctg acccataaaa ccgaagaacg tccgaaaaag 1500

aaacatggca atattccgct gtaa 1524

Claims

1.一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌为宿主菌，在所述宿主菌中过表达甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶基因mct，乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB和乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC；所述丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基在NCBI中蛋白ID为：SMX58101；所述草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌，为敲除了谷草转氨酶基因aspC，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，苹果酸脱氢酶基因mdh和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶基因pck的大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述谷草转氨酶基因aspC在KEGG数据库中的查询号为EC2.6.1.1；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc在KEGG数据库中的查询号为EC4.1.1.31；所述苹果酸脱氢酶基因mdh在KEGG数据库中的查询号为EC1.1.1.37；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶基因pck在KEGG数据库中的查询号为EC:4.1.1.49。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB在NCBI中基因ID为：947758；所述乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC在NCBI中基因ID为：947761；所述甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶基因mct的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1-3任意一项所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)构建过表达中间载体：将甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶基因mct、乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB及乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC连接到pACYCDuet质粒中，获得重组载体pACYCDuet-mct-accB-accC；

2)构建草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌菌株：通过CRISP/Cas9基因编辑方法敲除大肠杆菌中谷草转氨酶基因aspC，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，苹果酸脱氢酶基因mdh和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶基因pck，获得草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌，EscherichiacoliBL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck；

3)将步骤1)中所获得的重组载体，转化到步骤2)获得的宿主Escherichia coliBL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck感受态细胞中，获得筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌Escherichia coliBL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck-pACYCDuet-mct-accB-accC。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述通过CRISP/Cas9基因编辑方法敲除大肠杆菌中谷草转氨酶基因aspC时靶标序列SEQ ID No.33所示；敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc时靶标序列SEQ ID No.34所示；敲除苹果酸脱氢酶基因mdh时靶标序列SEQID No.35所示；敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶基因pck时靶标序列SEQ ID No.36所示。

6.一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基突变体的方法，其特征在于，构建丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的突变体文库，将丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的突变体文库导入权利要求1-3任意一项所述的重组菌中，筛选获得丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的突变体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的突变体文库的构建方法为：通过易错PCR的方法将丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基进行克隆，将质粒pETDuet-1通过EcoRI进行酶切，将酶切后的pETDuet-1质粒与易错PCR扩增的丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基基因通过一步克隆的方式进行连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，构建丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基基因的突变文库。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述易错PCR所使用的引物如SEQIDNO.31-SEQ ID NO.32所示；易错PCR模板为丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基基因，来自于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis 168，其核苷酸序列如SEQ ID.NO.2所示。

9.权利要求6所述的方法筛选获得的丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基突变体，其特征在于，所述突变体为单一位点突变体或多位点突变体，所述单一位点突变体突变情况包括：

pcc-F8L：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第8位苯丙氨酸突变为亮氨酸；

pcc-D46G：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺；

pcc-L97Q：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺；

pcc-N220I：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸；

pcc-I312V：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第312位异亮氨酸突变为缬氨酸；

pcc-D345N：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第345位天冬氨酸突变为天冬酰胺；

pcc-L358P：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第358位亮氨酸突变为脯氨酸；

pcc-I391T：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第391位异亮氨酸突变为苏氨酸；

和pcc-K455E：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第455位赖氨酸突变为谷氨酸；

所述多位点突变体突变情况包括：

pcc-I391T/D46G：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第391位异亮氨酸突变为苏氨酸且第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺；

pcc-I391T/L97Q：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第391位异亮氨酸突变为苏氨酸且第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺；

pcc-I391T/N220I：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第391位异亮氨酸突变为苏氨酸且第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸；

pcc-D46G/L97Q：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺且第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺；

pcc-D46G/N220I：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺且第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸；

pcc-L97Q/N220I：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺且第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸；

pcc-I391T/D46G/L97Q：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第391位异亮氨酸突变为苏氨酸、第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺且第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺；

pcc-I391T/D46G/N220I：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第391位异亮氨酸突变为苏氨酸、第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺且第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸；

pcc-I391T/L97Q/N220I：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第391位异亮氨酸突变为苏氨酸、第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺且第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸；

pcc -D46G/L97Q/N220I：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺且第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸；

和pcc -D46G/L97Q/N220I/I391T：丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的第46位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第97位亮氨酸突变为谷氨酰胺、第220位天冬酰胺突变为异亮氨酸且第391位异亮氨酸突变为苏氨酸。