JP6997327B2 - Camp受容タンパク質変異体及びそれを用いたl-アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Description
前記方法は、前記微生物または培地からL-アミノ酸を回収する段階をさらに含んでもよい。
1-1.遺伝子crp断片の準備
遺伝子crpと発現調節部位を含む配列番号5のDNA断片約0.96kbを得るために、Qiagen(社)のGenomic-tipシステムを用いて大腸菌野生株であるW3110の染色体DNA(gDNA)を抽出し、前記gDNAを鋳型としてPCR HL premix kit(BIONEER社製、以下同じ)を用いてPCR(polymerase chain reaction)を行った。遺伝子crp断片部位を増幅させるためのPCRは、配列番号6及び7のプライマーを用いて95℃で30秒の変性(denaturation)、56℃で30秒のアニーリング(annealing)、及び72℃で2分の伸長(elongation )からなるサイクルを27回繰り返し行った。
Copycontrol pCC1BACベクター(EPICENTRE、USA)をEcoRIで処理して0.8%アガロースゲル(agarose gel)で電気泳動した後、溶出して収得し、実施例1-1で得られたcrp断片をライゲーション(ligation)させて pCC1BAC-crpプラスミドを作製した。
2-1.error-prone PCRを用いた突然変異crp断片の準備
野生型大腸菌であるW3110染色体DNAを鋳型にclonetech社diversify PCR random mutagenesis kit(catalog#:K1830-1、TableIII、mutagenesis reactions 4)を用いてPCRを行った。具体的には、PCRは実施例1-1で用いられた配列番号6及び7のプライマーを用い、94℃で30秒の変性(denaturation)、68℃で1分の伸長(elongation)からなるサイクルを27回繰り返して行った。
ベクターpCC1BACを制限酵素EcoRIで処理した後、アルカリホスファターゼ(alkaline phosphatase(NEB))を処理して準備した。用意されたベクターに実施例2-1で収得したcrpm断片をライゲーション(ligation)させてTransforMax EPI300 Electrocompetent E.coli(EPICENTRE、USA)に電気穿孔法を用いて形質転換した。形質転換させた菌株は、クロラムフェニコールを含むLB固体培地(15μg/ml)でコロニー(colony)を選別した。このように獲得されたコロニーを集めてプラスミドプレップ(plasmid prep)を行い、pCC1BAC-crpmlibraryを作製した。
3-1.pCC1BAC-crpmlibraryのトレオニン生産菌株の導入
実施例2で収得したpCC1BAC-crpmlibraryをトレオニンを生産する微生物KCCM10541のelectroコンピテントセルに電気穿孔法を用いて形質転換(transformation)させて導入した。本実施例で用いられた大腸菌KCCM10541(特許文献1)は、L-トレオニンを生産する大腸菌KFCC10718(特許文献2)からgalR遺伝子が不活性化された大腸菌である。
1%グルコース(glucose)、0.2g/Lの酵母抽出物(yeast extract)が含まれたM9最小培地をディープウェルマイクロプレートに分注した後、前記実施例3-1で作られた形質転換体及び対照群菌株を接種した。マイクロサイズ恒温培養器シェーカー(Micro size constant temperature incubator shaker、TAITEC、Japan)を用いて(37℃、200rpmの条件)、HTS(High Throughput Screening)の方法で20時間、前記菌株を培養して成長が改善された菌株を選別し、そのうち、最終的に1種の菌株を選別した(表2)。
前記実施例3-2で選別された組換え微生物のトレオニン力価を測定するために、下記表3の組成に従って製造されたトレオニン力価培地で培養し、L-トレオニン生産性の向上を確認した。
実施例4.pCC1BAC-crpTM4変異体のトリプトファン生産菌株の導入
4-1.pCC1BAC-crpTM4のスクリーニング菌株の導入
実施例3で得られたpCC1BAC-crpTM4をトリプトファンを生産する菌株KCCM11166Pのelectroコンピテントセルに電気穿孔法を用いて形質転換(transformation)させて導入した。本実施例で用いられたKCCM11166PはtehB遺伝子が欠失され、NADキナーゼの活性が強化されたL-トリプトファン生産大腸菌である( 特許文献3)。
1%グルコース、0.2g/Lの酵母抽出物が含まれたM9最小培地をディープウェルマイクロプレートに分注した後、前記実施例4-1で記述したように作られた形質転換体及び対照群菌株を接種した。マイクロサイズ恒温培養器シェーカー(Micro size constant temperature incubator shaker、TAITEC、Japan)を用いて(37℃、200rpmの条件)、HTS(High Throughput Screening)の方法で16時間前記菌株を培養して、KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM4形質転換体の成長が改善されることを確認した(表5)。
前記実施例4-2で製造した組換え微生物のトリプトファン力価を測定するために、下記表6の組成に従って製造されたトリプトファン力価培地で培養し、L-トリプトファン生産効率の向上を確認した。
実施例5.有効crp変異型内在ベクターの野生型大腸菌の導入
5-1.有効pCC1BAC-crp変異型の野生型由来のトレオニン生産菌株の導入
前記実施例3でスクリーニングされたcrp変異型を含むベクターが野生型菌株でも同等の効果を示すかを確認するために、pCC1BAC-crp(WT)及びpCC1BAC-crpTM4のベクターをトレオニンを生成できる野生型由来の菌株に電気穿孔法を用いて形質転換(transformation)させて導入した。また、対照群としてpCC1BAC-crp(WT)を導入した菌株も製作した。
前記実施例4でスクリーニングされたcrp変異型を含むベクターが野生型菌株でも同等の効果を示すかを確認するために、pCC1BAC-crp(WT)及びpCC1BAC-crpTM4のベクターをトリプトファンを生産できる野生型由来菌株に形質転換(transformation)させて導入した。
Claims (10)
- 配列番号1のアミノ酸配列で35番目のアミノ酸がアラニンに置換された、cAMP受容タンパク質(cAMP receptor protein)変異体。
- 請求項1に記載のcAMP受容タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載のcAMP受容タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
- 配列番号1のアミノ酸配列で35番目のアミノ酸がアラニンに置換されたcAMP受容タンパク質変異体を含む、エシェリキア属(Escherichia sp.)微生物。
- 前記エシェリキア属微生物が大腸菌である、請求項4に記載のエシェリキア属微生物。
- 前記エシェリキア属微生物が、L-アミノ酸を生産するものである、請求項4に記載のエシェリキア属微生物。
- 前記L-アミノ酸が、L-トレオニンまたはL-トリプトファンである、請求項6に記載のエシェリキア属微生物。
- 配列番号1のアミノ酸配列で35番目のアミノ酸がアラニンに置換されたcAMP受容タンパク質変異体を含む、エシェリキア属微生物を培地で培養する段階を含む、L-アミノ酸を生産する方法。
- 前記微生物または培地からL-アミノ酸を回収する段階をさらに含む、請求項8に記載のL-アミノ酸を生産する方法。
- 前記L-アミノ酸が、L-トレオニンまたはL-トリプトファンである、請求項8に記載のL-アミノ酸を生産する方法。
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