BR112020012963A2 - variante de proteína de receptor de camp e método de produção de l-aminoácido com uso do mesmo - Google Patents
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Abstract
A presente invenção se refere a uma variante de proteína de receptor de cAMP, um microrganismo que inclui o mesmo e um método de produção de um L-aminoácido com uso do mesmo.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “VARIANTE DE PROTEÍNA DE RECEPTOR DE cAMP E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE L- AMINOÁCIDO COM USO DO MESMO” [CAMPO DA TÉCNICA]
[001] A presente invenção refere-se a uma variante de proteína de receptor de cAMP, um microrganismo que inclui o mesmo e um método de produção de um L-aminoácido com uso do mesmo.
[002] CRP (proteína receptora cíclica de AMP), também chamada CAP (proteína ativadora de catabolito), é o regulador de transcrição mais conhecido em E. coli. CRP é caracterizada por ter um mecanismo de regulação dependente da fonte de carbono, representado pela “repressão por catabolito”. Essa ação é desencadeada por uma concentração intracelular de AMP cíclico (daqui em diante, chamada de “cAMP”). Na presença de uma fonte de carbono preferida, como a glicose, a atividade da adenilato ciclase é inibida para diminuir a cAMP, e esse sinal inibe a expressão de genes catabólicos. No caso oposto, a atividade da adenilato ciclase é aumentada e, como resultado, os repressores são suprimidos e a expressão dos genes catabólicos é iniciada. Além disso, sabe-se que a PCR desempenha vários papéis, como transdução de sinal intracelular através de cAMP, regulação osmótica, respostas a situações urgentes de células, geração de biofilme, fixação de nitrogênio, transporte de ferro etc.
[003] Sabe-se que 418 genes de E. coli são regulados por PCR, mas os mecanismos correspondentes ainda não foram claramente revelados (J Biol Eng. (2009) 24;3:13). Com uma gama tão ampla de habilidades regulatórias, a CRP tem o potencial de mostrar uma variedade de fenótipos por mutações. Devido às suas vantagens, a CRP foi estudada como um alvo adequado para o redesenho de cepas no nível celular, aplicáveis a vários ambientes. Recentemente, várias experiências foram conduzidas, como um método de alterar a expressão de genes a serem regulados, alterando-se o grau de ligação ao DNA pela variação de aminoácidos da CRP selecionada pela bioinformática (Nucleic Acids Research, (2009) 37: 2493 a 2503), um método de seleção de E. coli resistente ao calor, osmose e baixa temperatura com uso de um fator de transcrição artificial (ATF) preparado pela fusão de um local de ligação ao DNA do dedo de zinco e da PCR ((Nucleic Acids Research, (2008) 36: el0o2) etc. Em outras palavras, uma vez que as alterações na expressão de CRP promovem uma vasta gama de alterações na expressão dos genes a jusante, é provável que a CRP seja uma boa ferramenta para preparar microrganismos com características úteis.
[004] Os presentes inventores desenvolveram uma nova variante de proteína que inclui uma ou mais substituições de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, e descobriram que essa variante de proteína pode aumentar a produtividade de L-aminoácido, completando assim a presente invenção.
[005] Um objetivo da presente invenção é fornecer uma variante de proteína de receptor de cAMP.
[006] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um polinucleotídeo que codifica a variante da proteína de receptor de cAMP.
[007] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um vetor que inclui o polinucleotídeo.
[008] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um microrganismo do gênero Escherichia que inclui a variante.
[009] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um método de produção de um L-aminoácido, o método incluindo a cultura do microrganismo do gênero Escherichia em um meio.
[010] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer o uso da variante ou do microrganismo do gênero Escherichia que inclui a variante na produção de L-aminoácido.
[011] Quando um microrganismo do gênero Escherichia que produz um L-aminoácido, sendo que o microrganismo inclui uma variante de proteína receptora cAMP da presente invenção, é cultivado, é possível produzir o L-aminoácido com um alto rendimento. Consequentemente, em aspectos industriais, pode ser esperada redução dos custos de produção, além da conveniência da produção.
[012] A presente invenção será descrita em detalhes a seguir. Enquanto isso, cada descrição e modalidade revelada nessa invenção também pode ser aplicada a outras descrições e modalidades. Ou seja, todas as combinações de vários elementos revelados nessa invenção se enquadram no escopo da presente invenção. Ademais, o escopo do presente invenção é limitado pela descrição específica descrita abaixo.
[013] Para alcançar os objetos acima, um aspecto da presente invenção fornece uma variante de proteína de receptor de cAMP que inclui uma ou mais substituições de aminoácidos em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Especificamente, a presente invenção fornece a variante de proteína de receptor de cAMP, que inclui uma ou mais substituições de aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, em que as substituições de aminoácidos incluem a substituição de alanina por um aminoácido na posição 35 do terminal N. Mais especificamente, a presente invenção fornece a variante de proteína de receptor de cAMP que inclui a substituição de alanina pelo aminoácido na posição 35 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[014] Conforme usado no presente documento, o termo "proteína de receptor de cAMP (CRP)" é o regulador de transcrição mais conhecido em £. coli, e o CRP também é chamado de “regulador duplo”, devido ao próprio CRP tem ambas as funções de ativador e inibidor. CRP geralmente se liga a uma sequência de DNA simétrica com 22 bases a montante de um gene estrutural para induzir a flexão de DNA, e o CRP atua como ativador, o que permite que um primeiro local ativo no terminal C e um segundo local ativo no terminal N interajam com RNA polimerase responsável pela transcrição, e atua como inibidor, ocupando-se a posição de impedir a ligação da proteína ativa ao local ativo ou ligando-se à proteína ativa para converter a estrutura em uma estrutura que não se liga ao local ativo. A proteína de receptor de cAMP é uma proteína de receptor de cAMP codificada por um gene crp.
[015] A "proteína de receptor de cAMP (proteína de receptor de AMP cíclico, CRP)" da presente invenção pode ser usada de forma intercambiável com uma proteína ativadora de catabolito (CAP), uma proteína CRP, uma proteína CAP etc.
[016] Na presente invenção, uma sequência do CRP pode ser obtida de um banco de dados conhecido GenBank em NCBI. Por exemplo, o CRP pode ser um CRP derivado do gênero Escherichia (Escherichia sp.) e, mais especificamente, um polipeptídio/proteína que inclui a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, mas não é limitada a isso. Além disso, uma sequência que tem a mesma atividade que a sequência de aminoácidos acima pode ser incluída sem limitação. Além disso, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com 80% ou mais de homologia ou identidade a mesma pode ser incluída, mas não está limitada a mesma. Especificamente, o aminoácido pode incluir o aminoácido de SEQ ID NO: 1 e um aminoácido que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais homologia ou identidade com a SEQ ID NO: 1l. Além disso, é aparente que uma proteína com uma sequência de aminoácidos, parte da qual é excluída, modificada, substituída ou adicionada, pode estar dentro do escopo da presente invenção, desde que a sequência de aminoácidos tenha a homologia Ou identidade acima e exibe eficácia correspondente à proteína acima.
[017] Conforme usado no presente documento, o termo "variante" se refere a um polipeptídio, um ou mais aminoácidos dos quais são diferentes da sequência recitada em substituições e/ou modificações conservadoras, mas mantém funções ou propriedades da proteína. os polipeptídios variantes são diferentes de uma sequência identificada por substituição, exclusão ou adição de vários aminoácidos. Tais variantes podem ser geralmente identificadas modificando-se uma das sequências de polipeptídio acima e avaliando-se as propriedades do polipeptídio modificado. Em outras palavras, a capacidade de uma variante pode ser aumentada, inalterada ou diminuída, em comparação com a de uma proteína nativa. Tais variantes podem ser geralmente identificadas modificando-se uma das sequências de polipeptídio acima e avaliando-se a reatividade do polipeptídio modificado. Além disso, algumas variantes podem incluir aquelas nas quais uma ou mais porções, tais como uma sequência líder de terminal N ou domínio transmembranar, foram removidas. Outras variantes podem incluir variantes nas quais uma porção foi removida do terminal N e/ou C de uma proteína madura.
[018] Conforme usado no presente documento, o termo "substituição conservadora" significa substituição de um aminoácido por outro aminoácido que tem propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes. A variante pode ter, por exemplo, uma ou mais substituições conservadoras, enquanto retém uma ou mais atividades biológicas. Tais substituições de aminoácidos podem geralmente ser feitas com base na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos. Por exemplo, aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; aminoácido carregados negativamente (ácidos) incluem ácido glutâmico e ácido aspártico; aminoácidos aromáticos incluem fenilalanina,
triptofano e tirosina; e aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina, prolina, glicina e triptofano.
[019] Além disso, as variantes podem incluir a deleção ou adição de aminoácidos que têm influência mínima nas propriedades e uma estrutura secundária do polipeptídio. Por exemplo, um polipeptídio pode ser conjugado com uma sequência de sinal (ou líder) no terminal N da proteína, que direciona de forma translacional ou pós-translacional a transferência da proteína. O polipeptídio também pode ser conjugado com outra sequência ou um ligante para identificação, purificação Ou síntese do polipeptídio.
[020] Conforme usado no presente documento, o termo "variante de proteína de receptor de cAMP" é uma variante de proteína de receptor de cAMP que inclui uma ou mais substituições de aminoácido em uma sequência de aminoácidos de um polipeptídio com atividade da proteína de receptor de cAMP, em que as substituições de aminoácido incluem a substituição de outro aminoácido para o aminoácido na posição 35 do terminal N. Especificamente, a variante pode incluir uma variante de proteína, na qual outro aminoácido é substituído pelo aminoácido na posição 35 na sequência de aminoácidos do polipeptídio com atividade da proteína de receptor de AMP. Por exemplo, a variante de proteína pode incluir uma variante de proteína na qual a variação ocorre na posição 35 do terminal N da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Mais especificamente, a variante de proteína pode ser uma proteína na qual outro aminoácido é substituído pelo aminoácido na posição 35 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. O “outro aminoácido” não é limitado, desde que seja um aminoácido que não seja o ácido L-glutâmico, que é o aminoácido na posição 35. Especificamente, a variante pode ser uma proteína na qual um aminoácido hidrofóbico é substituído pelo aminoácido na posição 35 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: l. O aminoácido hidrofóbico pode ser um de L- alanina, L-glicina, L-valina, L-isoleucina, L-leucina, L- metionina, L-prolina, L-fenilalanina e L-triptofano. Mais especificamente, a variante pode ser uma proteína na qual a alanina é substituída pelo aminoácido na posição 35 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, mas não é limitada a isso.
[021] Além disso, a variante significa uma variante que tem uma variação de aminoácido na posição 35 do terminal N na sequência de aminoácidos acima descrita da SEQ ID NO: 1 e/ou a sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais homologia ou identidade com a SEQ ID NO: 1.
[022] Conforme usado no presente documento, o termo "variante de proteína de receptor de cAMP" pode ser usado de forma intercambiável com uma proteína CRP variante, uma variante CRP, uma proteína de receptor de cAMP variante, uma proteína CAP variante, uma proteína CAP, uma variante CAP, uma proteína ativadora de catabolito variante, uma variante de proteína de ativador de catabolito etc.
[023] Com relação aos objetos da presente invenção, um microrganismo que inclui a variante de proteína de receptor de CAMP é caracterizado por ter alta produtividade de L- aminoácido, em comparação com um microrganismo que não inclui variante de proteína de receptor de cAMP. A variante de CRP é caracterizada por ter uma atividade reguladora de gene para aumentar a produtividade de L-aminoácido, em comparação com uma proteína de receptor de nativa de tipo selvagem ou não variante de cAMP. Isso é significativo, pois a produtividade de L-aminoácido pode ser aumentada pelo microrganismo introduzido com a variante de CRP da presente invenção. Especificamente, o L-aminoácido pode ser L-treonina ou L- triptofano. No entanto, qualquer “L-aminoácido pode ser incluído sem limitação, desde que possa ser produzido introduzindo-se ou incluindo-se a proteína de receptor de cAMP variante.
[024] A variante de proteína de receptor de cAMP pode ser, por exemplo, uma variante que inclui uma sequência de aminoácidos na qual outro aminoácido é substituído pelo aminoácido na posição 35 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, a variante composta pela SEQ
ID NO: 3. A variante na qual a alanina é substituída pelo aminoácido na posição 35 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 pode ser composto de SEQ ID NO: 3, mas não é limitada a isso. Além disso, a variante de CRP pode incluir a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos que tem 80% ou mais homologia ou identidade com a mesma, mas não é limitada a isso. Especificamente, a variante de CRP da presente invenção pode incluir a proteína que tem a SEQ ID NO: 3 e uma proteína que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de homologia ou identidade à mesma. Além disso, é aparente que uma proteína com uma sequência de aminoácidos, parte da qual é excluída, modificada, substituída ou adicionada, além da sequência de aminoácidos na posição 35, pode estar dentro do escopo da presente invenção, desde que uma vez que a sequência de aminoácidos tem a homologia ou identidade acima e exibe eficácia correspondente à proteína acima.
[025] Em outras palavras, mesmo que “uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO particular” seja descrita no presente documento, é aparente que uma proteína com uma sequência de aminoácidos, parte da qual é excluída, modificada, substituída, substituída conservativamente, ou adicionado, pode ser usado na presente invenção, desde que tenha atividade idêntica ou correspondente à da proteína composta da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO correspondente. Por exemplo, desde que uma proteína tenha atividade idêntica ou correspondente à da proteína variante, a adição de uma sequência que não altera a função da proteína antes e depois da sequência de aminoácidos, mutações que ocorrem naturalmente, mutações silenciosas ou substituições conservadoras não são excluídos. É aparente que, embora a proteína tenha tal adição ou mutação de sequência, se enquadra no escopo da presente invenção.
[026] Conforme usado no presente documento, o termo “homologia” ou “identidade” significa o grau de relevância entre duas sequências de aminoácidos ou sequências nucleotídicas fornecidas e pode ser expresso como uma porcentagem.
[027] Os termos “homologia” e “identidade” podem ser frequentemente usados de forma intercambiável.
[028] A homologia ou identidade de sequência do polinucleotídeo ou polipeptídio conservado pode ser determinada por algoritmos de alinhamento padrão e pode ser usada com penalidades de intervalo padrão estabelecidas pelo programa usado. Substancialmente, sequências homólogas ou idênticas podem hibridar sob condições moderadas ou altamente rigorosas, de modo que o comprimento total da sequência ou pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% ou mais do comprimento total possa hibridar. Também são contemplados polinucleotídeos que contêm códons degenerados no lugar de códons na hibridação.
[029] Se duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídios têm ou não homologia, similaridade ou identidade podem ser determinadas com uso de algoritmos de computador conhecidos, como o programa "FASTA", com uso, por exemplo, dos parâmetros padrão como em Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444, ou determinadamente com o uso do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, 4. Mol. Biol. 48: 443 a 453) conforme implementado no programa Needleman do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277) (versão 5.0.0 ou posterior) (incluindo o pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, São Diego, 1994, e [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1.073). Por exemplo, o BLAST do banco de dados do National Center for Biotechnology Information, ou ClustalW, pode ser usado para determinar a homologia, similaridade ou identidade.
[030] A homologia, similaridade ou identidade de polinucleotídeos ou polipeptídios pode ser determinada, por exemplo, comparando-se informações de sequência com uso de um programa de computador GAP, como Needleman et al. (1970), 3
Mol Biol.48: 443, conforme revelado em Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Brevemente, o programa GAP define semelhança como o número de símbolos alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) que são semelhantes, dividido pelo número total de símbolos na menor das duas sequências. Parâmetros padrão para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (que contém um valor de 1 para identidades e O para não-identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, conforme revelado em Schwartz e Davyhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, Fundação Nacional de Pesquisa Biomédica, páginas 353 a 358 (1979) (ou matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4)); (2) uma penalidade de 3,0 para cada intervalo e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada intervalo (ou penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão do intervalo de 0,5); e (3) nenhuma penalidade por intervalos finais. Portanto, conforme usado no presente documento, o termo “homologia” ou “identidade” representa relevância entre sequências.
[031] Outro aspecto da presente invenção se refere a um polinucleotídeo que codifica a variante de CRP, ou um vetor que inclui o polinucleotídeo.
[032] Conforme usado no presente documento, o termo "polinucleotídeo" se refere a um DNA ou fio RAN com um comprimento predeterminado ou mais, que é um polímero de cadeia longa de nucleotídeos formado ligando-se monômeros de nucleotídeos por meio de ligações covalentes. Mais especificamente, o polinucleotídeo se refere a um fragmento de proteína que codifica o polipeptídio variante.
[033] O polinucleotídeo que codifica a variante de CRP da presente invenção pode incluir qualquer sequência de polinucleotídeo sem limitação, desde que seja uma sequência de polinucleotídeo que codifica a variante de proteína de receptor de cAMP da presente invenção. O polinucleotídeo que codifica a variante de CRP pode incluir qualquer sequência sem limitação, desde que seja uma sequência que codifique a proteína variante na qual outro aminoácido é substituído pelo aminoácido na posição 35 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Especificamente, o polinucleotideo pode ser uma sequência polinucleotídica que codifica a variante na qual a alanina é substituída pelo aminoácido na posição 35 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1l. Por exemplo, o polinucleotídeo que codifica a variante CRP da presente invenção pode ser uma sequência polinucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, mas não é limitada a isso. Mais especificamente, o polinucleotídeo pode ser composto de uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 4, mas não é limitada a isso. No polinucleotídeo, várias modificações podem ser feitas na região de codificação, desde que não alterem a sequência de aminoácidos da proteína, devido à degenerescência do códon ou à consideração dos códons preferidos pelo organismo no qual a proteína deve ser expressa. Portanto, é aparente que, devido à degeneração do códon, um polinucleotídeo que pode ser traduzido no polipeptídio composto pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou o polipeptídio que tem homologia ou identidade ao mesmo também pode ser incluído.
[034] Além disso, uma sonda que pode ser produzida a partir de uma sequência nucleotídica conhecida, por exemplo, uma sequência que hibrida com uma sequência complementar a toda ou parte da sequência nucleotídica sob condições rigorosas para codificar a variante de CRP na qual outro aminoácido é substituído por o aminoácido na posição 35 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 também pode ser incluída sem limitação.
[035] o termo "condições rigorosas" significa condições sob as quais é permitida a hibridação específica entre polinucleotídeos. Tais condições são descritas em detalhes em uma literatura (por exemplo, J. Sambrook et al., supra). Por exemplo, as condições rigorosas podem incluir, por exemplo, condições sob as quais genes com alta homologia ou identidade, 80% ou mais, 85% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, muito mais especificamente 97% ou mais, particularmente especificamente
99% ou mais de homologia ou identidade são hibridizados entre si e genes com homologia ou identidade inferior à homologia ou identidade acima não são hibridados entre si ou condições de lavagem comuns da hibridação Southern, isto é, lavagem uma vez, especificamente, duas ou três vezes em uma concentração de sal e uma temperatura correspondente a 60 ºC, 1xSSC, 0,1% SDS, especificamente, 60 om 0,1xSSC, 0,1% SDS e, mais especificamente 68 ºC, 0,1xSSC, 0,1% SDS.
[036] Embora possa ocorrer uma incompatibilidade entre nucleotídeos devido ao rigor da hibridação, é necessário que os dois ácidos nucleicos tenham uma sequência complementar. O termo "complementar" é usado para descrever a relação entre bases nucleotídicas que podem hibridar entre si. Por exemplo, com relação ao DNA, adenosina é complementar à timina e citosina é complementa à guanina. Consequentemente, a presente invenção pode incluir não apenas as sequências de ácido nucleico substancialmente semelhantes, mas também fragmentos de ácido nucleico isolados que são complementares a toda a sequência.
[037] Especificamente, o polinucleotídeo que tem homologia ou identidade pode ser detectado com uso de condições de hibridação, incluindo a hibridação com um valor de Tm de 55 ºC e as condições descritas acima. Além disso, o valor de Tm pode ser de 60 “ºC, 63 ºC ou 65 ºC, mas não está limitado a isso, e pode ser adequadamente controlado por uma pessoa versada na técnica de acordo com os propósitos.
[038] O rigor apropriado para a hibridação dos polinucleotídeos depende do comprimento e do grau de complementaridade dos polinucleotídeos, e as variáveissão bem conhecidas na técnica (consulte Sambrook et al., Supra, 9.50-
9.51, 11.7-11.8).
[039] Conforme usado no presente documento, o termo "vetor" se refere a uma construção de DNA que inclui uma sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que codifica uma variante de proteína alvo operacionalmente ligada a uma sequência reguladora apropriada para permitir a expressão da variante de proteína alvo em uma célula hospedeira apropriada. A sequência reguladora pode incluir um promotor com capacidade de iniciar a transcrição, qualquer sequência de operador para regulação de tal transcrição, uma sequência que codifica um domínio de ligação de ribossomo de mRNA apropriado e uma sequência que regula o término da transcrição e da tradução. Após o vetor ser transformado na célula hospedeira apropriada, pode se replicar ou funcionar independentemente do genoma hospedeiro e pode ser integrado ao próprio genoma.
[040] O vetor usado na presente invenção não é particularmente limitado, desde que tenha capacidade de se replicar na célula hospedeira, e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de vetores comumente usados podem incluir um plasmídeo natural ou recombinante, cosmídeo,
vírus e bacteriófago. Por exemplo, pWEl5, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, tl0, tll, Charon4A, Charon21A etc., podem ser usados como um vetor de fago ou vetor de cosmídeo. Como vetor de plasmídeo, pode ser usado o tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptII, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL e tipo pET etc. Especificamente, podem ser utilizados pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUCl9, pBR322, pMW1l18, vetor pCClBAC etc.
[041] Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma variante de proteína alvo no cromossomo pode ser substituída por um polinucleotídeo mutado com uso de um vetor para inserção cromossômica intracelular. A inserção cromossômica do polinucleotídeo pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, recombinação homóloga, mas não está limitado a isso. Um marcador de seleção para confirmar a inserção cromossômica pode ser adicionalmente incluído. O marcador de seleção deve selecionar células transformadas com o vetor, ou seja, para confirmar a inserção do polinucleotídeo desejado, e o marcador de seleção pode incluir marcadores que fornecem fenótipos selecionáveis, como resistência a drogas, auxotrofia, resistência a agentes citotóxicos ou expressão da superfície proteínas modificadas. Uma vez que apenas as células que expressam o marcador de seleção têm capacidade de sobreviver ou mostrar diferentes fenótipos sob o ambiente tratado com um agente seletivo, as células transformadas podem ser selecionadas. Como ainda outro aspecto da presente invenção, a presente invenção fornece um microrganismo que produz o Lr-aminoácido, sendo —que o microrganismo inclui a proteína variante ou o polinucleotídeo que codifica a proteína variante. Especificamente, o microrganismo que inclui a proteína variante e/ou o polinucleotídeo que codifica a proteína variante pode ser um microrganismo preparado por transformação com o vetor que inclui o polinucleotídeo que codifica a proteína variante, mas não está limitado ao mesmo.
[042] Conforme usado no presente documento, o termo "transformação" significa a introdução de um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo em uma célula hospedeira de maneira que a proteína codificada pelo polinucleotídeo é expressa na célula hospedeira. Desde que o polinucleotídeo transformado possa ser expresso na célula hospedeira, pode ser integrado e colocado no cromossomo da célula hospedeira, ou pode existir extracromossômica Ou independentemente dele. Adicionalmente, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína-alvo. o polinucleotídeo pode ser introduzido em qualquer forma desde que possa ser introduzido na célula hospedeira e expresso na mesma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira sob a forma de um cassete de expressão, que é um construto gênico que inclui todos os elementos necessários para sua expressão autônoma. Comumente, o cassete de expressão pode incluir um promotor operacionalmente ligado ao polinucleotídeo, sinais de terminação transcricional, locais de ligação ao ribossomo e sinais de terminação da tradução. O cassete de expressão pode ser na forma de um vetor de expressão autorreplicável. Adicionalmente, o polinucleotídeo tal como está pode ser introduzido na célula hospedeira e operacionalmente ligado às sequências necessárias para expressão na célula hospedeira, mas não está limitado a isso.
[043] Conforme usado no presente documento, o termo "operacionalmente ligado" significa uma ligação funcional entre a sequência de polinucleotídeos que codifica a variante de proteína desejada da presente invenção e uma sequência promotora que inicia e medeia a transcrição de sequência de polinucleotídeo.
[044] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um microrganismo do gênero Escherichia (Escherichia sp.), que inclui a variante de proteína de receptor cAMP.
[045] Conforme usado no presente documento, o termo "microrganismo que inclui a variante de CRP" pode se referir a um microrganismo recombinante para expressar a variante de CRP da presente invenção. Por exemplo, o microrganismo se refere a uma célula hospedeira ou um microrganismo com capacidade para expressar a variante que inclui o polinucleotídeo que codifica a variante de CRP ou que transforma com o vetor que inclui o polinucleotídeo que codifica a variante de CRP. Com relação aos objetos da presente invenção, o microrganismo é um microrganismo que expressa a variante de proteína de receptor de cAMP, que inclui uma ou mais substituições de aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e o microrganismo pode ser um microrganismo que expressa a proteína variante que tem a atividade de proteína de receptor de cAMP, em que a substituição de aminoácido é a substituição de alanina pelo aminoácido na posição 35 do terminal N, mas não está limitado a isso.
[046] O microrganismo que inclui a variante de CRP pode ser qualquer microrganismo, desde que inclua a variante de CRP para expressar um L-aminoácido, por exemplo, L-treonina ou L-triptofano, mas não está limitado ao mesmo. Por exemplo, o microrganismo que inclui a variante de CRP pode ser um microrganismo recombinante com produtividade aumentada de L- aminoácido, que é preparado pela expressão da variante de CRP em um microrganismo natural do tipo selvagem ou em um microrganismo que produz o L-aminoácido. O microrganismo recombinante com produtividade aumentada de L-aminoácido pode ser um microrganismo com produtividade aumentada de L- aminoácido, em comparação com o microrganismo natural do tipo selvagen ou o microrganismo não modificado, em que o L- aminoácido pode ser L-treonina ou L-triptofano, mas não está limitado a isso.
[047] Conforme usado no presente documento, o termo "microrganismo que produz o L-aminoácido" inclui um microrganismo do tipo selvagem ou um microrganismo no qual ocorre modificação genética natural ou artificial, e pode ser um microrganismo com um mecanismo enfraquecido ou aprimorado devido à inserção de um gene estranho ou devido ao aprimoramento ou inativação da atividade de um gene endógeno, no qual ocorre uma variação genética ou a atividade é aprimorada para produzir o L-aminoácido desejado. No que diz respeito aos objetos da presente invenção, o microrganismo que produz o L-aminoácido pode incluir a proteína variante para aumentar a produtividade do L-aminoácido desejado. Especificamente, o microrganismo que produz o L-aminoácido ou o microrganismo com produtividade de L-aminoácido na presente invenção pode ser um microrganismo no qual parte dos genes envolvidos na via de biossíntese de L-aminoácido é aprimorada ou enfraquecida, ou parte de genes envolvidos na via de degradação do L-aminoácido são aumentados ou enfraquecidos.
[048] O "microrganismo não modificado" se refere a uma cepa natural como é, ou a um microrganismo que não inclui nenhuma variante de CRP ou a um microrganismo que não é transformado com o vetor, que inclui o polinucleotídeo que codifica a variante de CRP. O "microrganismo" pode incluir qualquer um dos microrganismos procarióticos e microrganismos eucarióticos, desde que tenha capacidade para produzir o L-
aminoácido. Por exemplo, o microrganismo pode incluir microrganismos do gênero Escherichia, do gênero Erwinia, do gênero Serratia, do gênero Providencia, do gênero Corynebacterium e do gênero Brevibacterium. Especificamente, o microrganismo pode ser um microrganismo do gênero Escherichiae, mais especificamente, E. coli, mas não está limitado ao mesmo.
[049] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um método para produzir o L-aminocácido, sendo que o método inclui a cultura de um microrganismo do gênero Escherichia em um meio, o microrganismo que produz o L-aminoácido que inclui a variante de proteína de receptor de cAMP.
[050] Os termos “variante de proteína de receptor de cAMP” e “L-aminoácido” são os mesmos que os descritos acima.
[051] No método, a cultura do microrganismo pode ser, mas sem limitação, realizada por cultura de batelada conhecida, cultura contínua, cultura de batelada alimentada etc. Nesse sentido, as condições de cultura não são particularmente limitadas, mas um pH ideal (por exemplo, pH 5 a 9, especificamente pH 6 a 8 e, mais especificamente pH 6,8) pode ser mantido usando um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico). Além disso, as condições aeróbicas podem ser mantidas introduzindo-se oxigênio ou mistura gasosa de oxigênio em uma cultura de células. A temperatura de cultura pode ser mantida entre 20 ºC e 45 ºC, e especificamente entre ºC e 40 ºC. A cultura pode ser realizada por cerca de 10 horas a cerca de 160 horas, mas não está limitada a isso. O L- aminoácido produzido pela cultura acima pode ser excretado para um meio de cultura ou pode permanecer dentro das células.
[052] Além disso, o meio de cultura a ser usado pode incluir, como fontes de carbono, açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), óleo e gordura (por exemplo, óleo de soja, semente de girassol óleo, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoléico), álcoois (por exemplo, glicerol e etanol) e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético) individualmente ou em combinação, mas não está limitado a isso. Como fontes de nitrogênio, compostos orgânicos que contêm nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, caldo de carne, extrato de malte, aguardente de milho, farelo de soja e ureia) ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, amônio carbonato e nitrato de amônio) podem ser usados individualmente ou em combinação, mas não se limitam a isso. Como fontes de fósforo, o hidrogenofosfato dipotássico, o di-hidrogenofosfato de potássio e os seus sais de sódio correspondentes podem ser usados individualmente ou em combinação, mas não estão limitados a isso. Além disso, o meio pode incluir substâncias essenciais para estimular o crescimento, que inclui outros sais de metais (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos e vitaminas.
[053] O método pode ainda incluir a coleta do L- aminoácido do microrganismo ou do meio.
[054] Um método de coleta do L-aminoácido produzido na cultura da presente invenção pode coletar o L-aminoácido desejado do caldo de cultura com uso de um método apropriado conhecido na técnica de acordo com o método de cultura. Por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização, HPLC etc., podem ser usados, e o L- aminoácido desejado pode ser coletado do meio ou microrganismo com uso de um método apropriado conhecido na técnica.
[055] Além disso, a coleta pode incluir um processo de purificação e pode ser realizada com uso de um método apropriado conhecido na técnica. Portanto, o L-aminoácido a ser coletado pode ser uma forma purificada ou um caldo de fermentação do microrganismo, que inclui o L-aminoácido (Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. O. Nair., 2008).
[056] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece o uso da variante de proteína de receptor de cAMP na produção de L-aminoácido, a variante de proteína de receptor de cAMP que inclui uma ou mais substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[057] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece o uso do microrganismo do gênero Escherichia na produção de L- aminoácido, o microrganismo do gênero Escherichia que inclui a variante de proteína de receptor de cAMP.
[058] O termo “variante de proteína de receptor de CAMP” e “L-aminoácido” são os mesmos que os descritos acima.
[059] Doravante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, é evidente aos versados na técnica que esses Exemplos são para propósitos ilustrativos apenas e o escopo da presente invenção não se destina a ser limitado por esses Exemplos.
EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE pCC1BAC-crp 1-1. PREPARAÇÃO DE fragmento de gene crp
[060] Para obter cerca de 0,96 kb de um fragmento de DNA da SEQ ID NO: 5, que inclui o gene crp e uma região reguladora de expressão, o DNA genômico (gDNA) de uma E. coli W3110 de tipo selvagem foi extraído com uso de um sistema de ponta genômica de Qiagen (empresa) e a PCR (reação em cadeia de polimerase) foi realizada com uso do gDNA como modelo e um kit de pré-mistura PCR HL (fabricado pela BIONEER Co., o mesmo se aplica a seguir). A PCR para amplificação do fragmento do gene crp foi realizada com uso de iniciadores da SEQ ID NOS: 6 e 7 para 27 ciclos que consiste em desnaturação a 95 *C por 30
Ss, recozimento a 56 “ºC por 30 s e alongamento a 72 ºC por 2 min.
[061] O produto de PCR foi digerido com EcoR I e a eletroforese em gel de agarose a 0,8% e a eluição foram realizadas para obter um fragmento de DNA de 0,96 Kb (daqui em diante, chamado de "fragmento de crp").
[TABELA 1] [E es face. | 1-2. PREPARAÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE pCCI1BAC-crp
[062] O vetor copycontrol pCClBAC (EPICENTER, EUA) foi tratado com EcoR I e a eletroforese em gel de agarose a 0,8% e eluição foram realizadas para obter um produto, o qual foi então ligado ao fragmento crp obtido no Exemplo 1-1, preparando assim um pCClBAC-crp plasmídeo.
EXEMPLO 2. PREPARAÇÃO DE BIBLIOTECA DE VARIANTES DE VETOR RECOMBINANTE pCC1BAC-crp 2-1. PREPARAÇÃO DE FRAGMENTO DE MUTANTE crp POR PCR propenso a erros
[063] PCR foi realizado com uso do DNA genômico de uma E. coli W3110 de tipo selvagem como modelo e um kit de mutagênese aleatória de PCR diversificada (número de catálogo: K1830-1, Tabela III, reações de mutagênese 4) de clonetech. Em detalhes, PCR foi realizado com uso dos iniciadores da SEQ ID
NOS: 6 e 7, conforme usado no Exemplo 1-1, durante 27 ciclos que consiste em desnaturação a 94 ºC por 30 s e alongamento a 68 ºC por 1 min.
[064] O produto de PCR foi digerido com EcoR LI, e a eletroforese em gel de agarose a 0,8% e a eluição foram realizadas para obter um fragmento de mutação crp de 0,96 Kb (doravante, denominado "fragmento de crpm ").
2-2. PREPARAÇÃO DE BIBLIOTECA DE VARIANTES DE VETOR RECOMBINANTE pCC1BAC-CRP
[065] Um vetor pCClIBAC foi tratado com uma enzima de restrição EcoR I e depois tratado com fosfatase alcalina (NEB). O vetor preparado foi ligado ao fragmento de crpm obtido no Exemplo 2-1 e o produto de ligação foi transformado em £E. coli Eletrocompetente TransforMax EPI300 (EPICENTER, EUA) por eletroforese. A cepa transformada foi cultivada em meio sólido LB (15 pg/ml) que contém cloranfenicol para selecionar colônias. As colônias assim obtidas foram coletadas e submetidas a preparação de plasmídeo, preparando assim uma biblioteca de pCClIBAC-crpm .
EXEMPLO 3. INTRODUÇÃO DE BIBLIOTECA DE VARIANTE DE crp EM
MELHORADO 3-1. INTRODUÇÃO DE BIBLIOTECA DE pCCIBAC-crpm EM CEPA
[066] A biblioteca de pCClBAC-crpm obtida no Exemplo 2 foi transformada em células eletro-competentes de KCCM10541, que é um microrganismo produtor de treonina por eletroporação. E. coli KCCMI0541 (Patente número KR 10-0576342) usada nesse Exemplo é E. coli preparada inativando-se o gene galR em uma E. coli produtora de L-treonina KFCC10718 (Patente número KR 10-0058286).
[067] como um grupo de controle do microrganismo introduzido na biblioteca PpCCIBAC-crpm, O PpCCIBAC-crp foi transformado em KCCM10541 da mesma maneira que acima para preparar KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT).
3-2. COMPARAÇÃO DA TAXA DE CRESCIMENTO DE MICRORGANISMO
[068] Um meio mínimo M9 que contém glicose a 1% e 0,2 g/1 de extrato de levedura foi dispensado em uma microplaca de poço profundo e, em seguida, o transformante e a cepa de controle preparada no Exemplo 3-1 foram semeados, respectivamente. As cepas foram cultivadas com uso de um agitador de incubadora de temperatura constante de tamanho micro (TAITEC, Japão) sob condições de 37 ºC e 200 rpm por um método HTS (Rastreio de alto rendimento) por 20 horas, e as cepas com melhor crescimento foram selecionadas. Entre os mesmos, um tipo de cepa foi finalmente selecionado (Tabela 2).
[069] A cepa KCCMI0541 introduzida com o gene crp do tipo selvagem mostrou um ligeiro aumento no valor de OD devido à introdução adicional de crp, enquanto o transformante com melhor crescimento apresentou um alto valor de OD após o mesmo tempo de cultura, em comparação com a cepa crp do tipo selvagem não introduzida. Além disso, a variante de crp selecionada foi submetida a mini preparação de plasmídeo, seguida por análise de sequenciação. Os resultados estão resumidos na Tabela 2.
[TABELA 2]
INFORMAÇÕES DE TRANSFORMANTE COM CRESCIMENTO MELHORADO APÓS INTRODUÇÃO DE BIBLIOTECA DE crpn EM CEPA PRODUTORA DE
TREONINA |ecemosas/peersae das E | [rcomosan /peemmme nem o fe E 3-3. COMPARAÇÃO —DE CONCENTRAÇÃO DE TREONINA DE
[070] Para medir a concentração de treonina do microrganismo recombinante selecionado no Exemplo 3-2, o microrganismo "recombinante foi cultivado em um meio de concentração de treonina preparado como na composição da Tabela 3 a seguir para examinar a melhoria de produtividade de L-treonina.
[TABELA 3]
[071] Em detalhes, cada um dos laços de platina de £E. coli KCCM1I0541/pCCIBAC-crp(WT) e E. coli KCCM10541/pCC1BAC- crpTM4 cultivados durante a noite em um meio sólido LB em uma incubadora a 33 ºC foi inoculada em 25 ml da titulação meio da Tabela 3, respectivamente, e depois cultivadas em uma incubadora a 33 ºC e 200 rpm por 48 horas para comparar as taxas de consumo de açúcar e as concentrações de treonina.
[072] Como resultado, conforme descrito na Tabela 4 a seguir, a cepa KCCM10541/pCC1IBAC-crp(WT) como grupo de controle apresentou consumo de açúcar de 26,1 g/1 às 24 horas, enquanto a cepa introduzida mutante crpTM4 mostrou cerca de 16% e melhoria de 11% na taxa de consumo de açúcar, em comparação com a cepa mãe e a cepa introduzida por crp do tipo selvagem, respectivamente.
[073] Além disso, quando cultivada por 48 horas, a cepa introduzida por crp do tipo selvagem mostrou 29,0 g/1 de produção de L-treonina, enquanto a produção de L-treonina da cepa mutante obtida acima aumentou para 31,0 g/l, mesmo que a cultura a velocidade foi aumentada, o que mostra uma melhoria de cerca de 8% e 7% na concertação, em comparação com a cepa mãe e a cepa introduzida por crp do tipo selvagem, respectivamente.
[074] Visto que a introdução da variante de crp aumentou o rendimento e o consumo de açúcar da cepa, parece ser uma boa característica de variante, o que pode contribuir muito para melhorar a eficiência de produção durante a fermentação.
[Tabela 4] Comparação entre concentração de cepa de treonina que inclui variante de crp.
Consumo de ; 7 Treonina Cepa açúcar (9/1) ** (9/1) * * valor medido em 24 h ** valor medido em 48 h EXEMPLO 4. INTRODUÇÃO DE VARIANTE pCCIBAC-crpTM4 EM CEPA
PRODUTORA DE TRIPTOFANO 4-1. INTRODUÇÃO DE pCCIBAC-crpTM4 EM CEPA DE TRIAGEM
[075] O pCClIBAC-crpTM4 obtido no Exemplo 3 foi transformado em células eletro-competentes de uma cepa produtora de triptofano KCCMl1166P por eletroporação. o KCCM11166P usado nesse exemplo é uma E. coli produtora de L- triptofano, na qual o gene tehB foi excluído e a atividade da NAD cinase foi aumentada (Patente número KR 10-1261147).
[076] Como um grupo de controle do microrganismo introduzido no PpCC1BAC-crpTM4, o PCC1BAC-crp (WT) foi transformado em KCCMl1166P da mesma maneira que acima para preparar KCCM11166P/pCC1IBAC-crp(WT).
4-2. COMPARAÇÃO DA TAXA DE CRESCIMENTO DE MICRORGANISMO
[077] Um meio M9 mínimo que contém 1% de glicose e 0,2 g/1 de extrato de levedura foi dispensado em uma microplaca de poço profundo e, em seguida, o transformante e a cepa de controle preparados como no Exemplo 4-l foram semeados, respectivamente. As cepas foram cultivadas com uso de um agitador de incubadora de temperatura constante de tamanho micro (TAITEC, Japão) sob condições de 37 ºC e 200 rpm por um método HTS (Rastreio de alto rendimento) por 16 horas para confirmar a melhoria do crescimento de transformante KCCM11166P/pCCl1BAC-crpTM4 (Tabela 5).
[078] A cepa KCCM11166P introduzida com o gene crp do tipo selvagem mostrou um nível equivalente de OD devido à introdução adicional de crp após o mesmo tempo de cultura, enquanto o transformante com crescimento melhorado mostrou um alto valor de OD, em comparação com o crp do tipo selvagem.
[TABELA 5]
INFORMAÇÕES DE TRANSFORMANTE COM CRESCIMENTO MELHORADO APÓS INTRODUÇÃO DE CrpTM4 NA CEPA PRODUTORA DE TRIPTOFANO
KCCM11166P/pCC1BAC-crp (NT) 3,5 Fo 4-3. COMPARAÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE TRIPTOFANO DE
[079] Para medir a concentração de triptofano do microrganismo recombinante preparado no Exemplo 4-2, o microrganismo —“recombinante foi cultivado em um meio de concentração de triptofano preparado como na composição da Tabela 6 a seguir para examinar a melhoria de produtividade de L-triptofano.
[TABELA 6]
COMPOSIÇÃO DE MEIO DE TITULAÇÃO DE TRIPTOFANO [geo eg Fenitatania — = | os
[080] Em detalhes, cada um dos laços de platina def. coli KCCM11166P/pCCIBAC-crp(WT) e E. coli KCCM11166P/pCC1BAC-
crpTM4 cultivados durante a noite em um meio sólido LB em uma incubadora a 37 ºC foi inoculada em 25 ml da titulação meio da Tabela 6, respectivamente, e depois cultivadas em uma incubadora a 37 ºC e 200 rpm por 48 horas para comparar as taxas de consumo de açúcar e as concentrações de triptofano.
[081] Como resultado, conforme descrito na Tabela 7 a seguir, a cepa KCCM1I1166P/pCC1BAC-crp(WT) como grupo de controle apresentou consumo de açúcar de 30,2 9/1 às 22 horas, enquanto a cepa introduzida mutante crpTM4 mostrou cerca de 146% e melhoria de 9% na taxa de consumo de açúcar, em comparação com a cepa mãe e a cepa introduzida por crp do tipo selvagem, respectivamente.
[082] Quando cultivada por 48 horas, a cepa introduzida por crp do tipo selvagem mostrou 8,4 g9g/l de produção de L-triptofano, enquanto a produção de L-triptofano da cepa mutante obtida acima aumentou para 9,7 g/l, mesmo que a cultura a velocidade foi aumentada, o que mostra uma melhoria de cerca de 18% e 15% na concertação, em comparação com a cepa mãe e a cepa introduzida por crp do tipo selvagem, respectivamente.
[083] Visto que a introdução da variante de crp aumentou o consumo de açúcar da cepa e o rendimento, parece ser uma boa característica de variante, o que pode contribuir muito para melhorar a eficiência de produção durante a fermentação.
[TABELA 7]
COMPARAÇÃO ENTRE CONCENTRAÇÃO DE CEPA DE TRIPTOFANO QUE INCLUI variante de crp Consumo de Triptofano Cepa açúcar (9/1) ** (9/1) * 7 * valor medido em 22 h ** valor medido em 48 h EXEMPLO 5. INTRODUÇÃO DE VETOR ENDÓGENO DE VARIANTE crp EFICAZ EM E. COLI de tipo selvagem 5-1. INTRODUÇÃO DE VARIANTE pCCIBAC-crp EFICAZ EM CEPA
[084] Para examinar se o vetor que inclui a variante de crp rastreada no Exemplo 3 também mostrou efeitos equivalentes na cepa do tipo selvagem, o vetor pCC1BAC-crp(WT) ou pCCIBAC-crpTM4 foi transformado na cepa derivada do tipo selvagem com capacidade para produzir treonina por eletroporação, respectivamente. Além disso, uma cepa induzida por pCClBAC-crp(WT)- foi preparada como um grupo controle.
[085] A cepa derivada do tipo selvagem com capacidade para produzir treonina usada nesse Exemplo é W3110::PcysK- ppc/pACYC184-thraABC. W3110::PcysK-ppc/pACYC1I84-thraBC é uma cepa na qual um promotor nativo de um gene ppc que codifica fosfoenolpiruvato carboxilase no cromossomo foi substituído por um promotor de um gene cysK e um gene de operão de biossíntese de treonina foi introduzido na forma de um vetor para aumentar o número de cópias, aumentando assim à produtividade de treonina. Em detalhes, uma cepa W3110::PcycK- ppc foi preparada com uso de pUCpcycKmloxP da mesma maneira descrita na patente número KR 10-0966324, e pACYCl184-thrABC (patente número KR 10-1865998) foi transformada na cepa por eletroporação.
[086] As cepas preparadas foram cultivadas em um meio de teste de treonina preparado como na composição da Tabela 8 a seguir, e as taxas de crescimento e produtividades de L- treonina foram comparadas.
[TABELA 8]
COMPOSIÇÃO DE MEIO DE TESTE DE TREONINA Mass TH2O nas TO Estrato de levedura BB Bj
[087] Em detalhes, cada uma dos laços de platina de W3110 e as respectivas cepas cultivadas durante a noite em um meio sólido LB em uma incubadora a 33 ºC foi inoculada em 25 ml do meio de titulação da Tabela 8, respectivamente, e depois cultivadas em uma incubadora a 33 ºC e 200 rpm por 48 horas. Os resultados dos mesmos são mostrados na seguinte Tabela 9. Conforme mostrado nos resultados a seguir, a proteína variante selecionada na presente invenção também tem capacidade para produzir eficientemente treonina com um alto rendimento na cepa do tipo selvagem.
[TABELA 9]
TREONINA DE CEPA DERIVADA DO TIPO SELVAGEM Cepa Treonina ? (9/1) ** W3110::PcysK-ppce/pACYC184-thrABC/pCC1BAC W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC/pCC1BAC- 11,0 1,6 crp (WT) W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC/pCC1BAC- 13,0 2,2 crpTM4 5-2. INTRODUÇÃO DE VARIANTE EFICAZ DE pCCIBAC-crp NA CEPA
[088] Para examinar se o vetor que inclui a variante de crp rastreada no Exemplo 4 também mostrou efeitos equivalentes na cepa do tipo selvagem, o vetor pCC1BAC-crp (WT) ou pCClIBAC-crpTM4 foi transformado na cepa derivada do tipo selvagem com capacidade para produzir triptofano, respectivamente.
[089] A cepa derivada do tipo selvagem com capacidade para produzir triptofano usado neste exemplo é W3110 trpA2/pCL-Dtrp att-trpEDCBA. W3110 trpA2/pCL-Dtrp att-trpEDCBA é uma cepa introduzida com um vetor no qual um mecanismo regulador de uma região reguladora de operão de triptofano foi liberado e a expressão do operão de triptofano foi aprimorada para superexpressar triptofano (Patente número KR 10-1532129). As cepas introduzidas com vetor foram cultivadas em um meio de teste de triptofano preparado como na composição da Tabela 10 a seguir, e suas produtividades de L-triptofano foram comparadas.
[TABELA 10]
COMPOSIÇÃO DE MEIO DE TESTE DE TRIPTOFANO (NÃo) 2806 Na?HPOs "HO Mas0s Tão diiaiadbia Extrato de levedura BB Bj
[090] Em detalhes, cada uma dos laços de platina das cepas cultivadas durante a noite em um meio sólido LB em uma incubadora a 37 ºC foi inoculada em 25 ml do meio de teste da
Tabela 9, respectivamente, e depois cultivadas em uma incubadora a 37 ºC e 200 rpm por 48 horas. Valores de OD e concentrações de triptofano foram comparados e mostrados na Tabela 11. Conforme mostrado nos resultados a seguir, a proteína variante selecionada na presente invenção também tem capacidade para produzir eficientemente triptofano com um alto rendimento na cepa do tipo selvagem.
[TABELA 11]
TRIPTOFANO DE CEPA DERIVADA DO TIPO SELVAGEM BB e ES a emita 1 crp (WT) crpTM4
[091] Os presentes inventores designaram a cepa introduzida com pCC1IlBAC-crpTM4 com base em KCCM11166P, com produtividade aprimorada de triptofano e taxa de consumo de açúcar (KCCM11166P/PpCC1IBAC-crpTM41) como "CA0O4-2809" e, em seguida, depositaram a cepa no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (KCCM) , que é a autoridade depositária internacional sob o Tratado de Budapeste, em 7 de novembro de 2018 com o número de acesso KCCM12375P.
[092] Esses resultados indicam que a taxa de consumo de açúcar foi aprimorada e a produtividade de L-aminoácido foi aumentada no microrganismo introduzido pela variante de crp do gênero Escherichia da presente invenção e, consequentemente, a produtividade de L-aminoácido foi aumentada, em comparação com a cepa não modificada.
[093] Com base na descrição acima, será compreendido pelas pessoas versadas na técnica que a presente revelação pode ser implantada em uma forma específica diferente sem mudar o espírito técnico ou características essenciais da mesma. Portanto, deve ser compreendido que a modalidade acima não é limitante, mas ilustrativas em todos os aspectos. O escopo da invenção é definido pelas reivindicações anexas, e não pela descrição que as precede, e, portanto, todas as alterações e modificações que se enquadram dentro das métricas e limites das reivindicações, ou equivalentes de tais métricas e limites são, portanto, destinadas a serem abrangidas pelas reivindicações.
Claims (11)
1. Variante de proteína de receptor de cAMP caracterizada por alanina ser substituída por um aminoácido na posição 35 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
2. Polinucleotídeo caracterizado por codificar a variante de proteína de receptor de cAMP, de acordo com a reivindicação
1.
3. Vetor caracterizado por compreender um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína de receptor de cAMP, de acordo com a reivindicação 1.
4, Microrganismo do gênero Escherichia (Escherichia sp.) caracterizado por compreender uma variante de proteína de receptor de cAMP em que alanina é substituída por um aminoácido na posição 35 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
5. Microrganismo do gênero Escherichia, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o microrganismo do gênero Escherichia ser E. coli.
6. Microrganismo do gênero Escherichia, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o microrganismo do gênero Escherichia produzir um L-aminoácido.
7. Microrganismo do gênero Escherichia, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o L-aminoácido ser L- treonina ou L-triptofano.
8. Método de produção um L-aminoácido, sendo que o método é caracterizado por compreender: cultivar um microrganismo do gênero Escherichia em um meio, sendo que o microrganismo compreende uma variante de proteína de receptor de cAMP em que alanina é substituída por um aminoácido na posição 35 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender ainda coletar o L-aminoácido do microrganismo ou do meio.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o L-aminoácido ser L-treonina ou L-triptofano.
11. Uso de uma variante de proteína de receptor de cAMP, caracterizado por alanina ser substituída por um aminoácido na posição 35 em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um microrganismo do gênero Escherichia que inclui a variante na produção de L-aminoácido.
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