BR112019018036B1 - Variante de aspartoquinase inovadora e método para produzir laminoácido com o uso da mesma - Google Patents

Abstract

A presente revelação refere-se a uma variante de aspartoquinase, a um micro-organismo que compreende a variante e a um método para produzir um L-aminoácido derivado de aspartato ou um derivado de homosserina do mesmo com o uso do micro-organismo.

Description

[CAMPO DA TÉCNICA]

[001] A presente revelação refere-se a uma variante de aspartoquinase, a um micro-organismo que compreende a variante e a um método para produzir um L- aminoácido derivado de aspartato ou um derivado de aminoácido do mesmo com o uso do micro-organismo.

[ANTECEDENTES DA TÉCNICA]

[002] Um micro-organismo do gênero Corynebacterium, particularmente Corynebacterium glutamicum, é um micro-organismo gram-positivo que é amplamente usado para a produção de L-aminoácidos e outras substâncias úteis. A fim de produzir L-aminoácidos e outras substâncias úteis, vários estudos foram conduzidos para desenvolver micro-organismos de produção de alta eficiência e tecnologia para processos de fermentação. Por exemplo, métodos para abordar especificamente substâncias-alvo aumentando-se a expressão de genes que codificam enzimas envolvidas na biossíntese de L-lisina ou realizando-se knockout de genes desnecessários para a biossíntese foram principalmente usados (patente coreana no 10-0838038).

[003] Entretanto, entre os L-aminoácidos, L- lisina, L-treonina, L-metionina, L-isoleucina e L-glicina são aminoácidos derivados de aspartato (Asp), e esses aminoácidos comumente usam fosfato de aspartila (App) produzido a partir de Asp por aspartoquinase (LysC, E.C. 2.7.2.4) (Figura 1). Portanto, a fim de produzir os aminoácidos por meio de um método de fermentação microbiana, é essencial manter as atividades de enzimas usadas na trajetória biossintética em um determinado nível ou superior e, assim, pesquisas intensivas foram realizadas a esse respeito.

[004] Em particular, sabe-se que a atividade de LysC, que atua como a primeira enzima na trajetória de biossíntese de aminoácidos derivados de aspartato, é regulada por inibição da retroalimentação de L-lisina e L- treonina (J Mol Biol. 27 de abril de 2007;368(2):521 a 536. Epub, 20 de fevereiro de 2007). Nesse sentido, embora pedidos relevantes para a inibição da retroalimentação tenham sido depositados (patente no US 8062869 B e patente japonesa no JP 3473042 B), ainda é necessário a continuação das pesquisas para aumentar a produtividade de produtos derivados de aspartato.

[005] Sob tais circunstâncias, os presentes inventores concluíram a presente revelação confirmando que a produção de L-aminoácidos derivados de aspartato ou derivados de aminoácido dos mesmos é melhorada quando se utiliza uma variante de aspartoquinase inovadora.

[REVELAÇÃO] [PROBLEMA DA TÉCNICA]

[006] Um objetivo da presente revelação é fornecer uma variante de aspartoquinase que compreende uma ou mais substituições de aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, sendo que a substituição de aminoácido compreende que o aminoácido na posição 377 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 seja substituído por L-lisina ou L-metionina.

[007] Um outro objetivo da presente revelação é fornecer um polinucleotídeo que codifica a variante.

[008] Ainda um outro objetivo da presente revelação é fornecer um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz um L-aminoácido derivado de aspartato ou um derivado de aminoácido do mesmo que compreende a variante de aspartoquinase ou tem a atividade melhorada do mesmo.

[009] Ainda um outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para produzir um L- aminoácido derivado de aspartato ou um derivado de aminoácido do mesmo que compreende: cultivar o microorganismo em um meio; e recuperar o L-aminoácido derivado de aspartato ou derivado de aminoácido do mesmo a partir do micro-organismo cultivado ou meio cultivado.

[010] Ainda um outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para produzir metionina que compreende: cultivar o micro-organismo em um meio; produzir acetil-homosserina ou succinil-homosserina a partir do micro-organismo cultivado ou meio cultivado; e converter a acetil-homosserina ou succinil-homosserina em metionina.

[SOLUÇÃO DA TÉCNICA]

[011] Doravante, a presente revelação será descrita em detalhes.

[012] Entretanto, cada uma das explicações e modalidades exemplificativas reveladas no presente documento pode ser aplicada a outras explicações e modalidades exemplificativas. Ou seja, todas as combinações de vários fatores revelados no presente documento pertencem ao escopo da presente revelação. Além disso, o escopo da presente revelação não deve ser limitado pela revelação específica fornecida doravante.

[013] Adicionalmente, um indivíduo versado na técnica terá capacidade para reconhecer ou confirmar, com base em experimentos de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da presente revelação descrita neste pedido, e tais equivalentes destinam-se a estar incluídos na presente revelação.

[014] A fim de alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece uma variante de aspartoquinase que compreende uma ou mais substituições de aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, sendo que a substituição de aminoácido compreende que o aminoácido na posição 377 seja substituído por um outro aminoácido. Especificamente, um objetivo da presente revelação é fornecer uma variante de aspartoquinase, sendo que o aminoácido na posição 377 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído por L-lisina ou L-metionina.

[015] Conforme usado no presente documento, o termo “aspartoquinase” refere-se a uma enzima que catalisa a fosforilação de um aminoácido, aspartato, e atua na primeira etapa de biossintetização de três aminoácidos essenciais, L-metionina, L-lisina e L-treonina, que são conhecidos como a família aspartato.

[016] Na presente revelação, o termo “aspartoquinase” pode ser usado intercambiavelmente com “LysC” ou “proteína LysC”. A proteína LysC pode ser obtida a partir do GenBank do NCBI, um banco de dados conhecido. A proteína LysC pode ser LysC derivada do gênero Corynebacterium e, especificamente, pode ser um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que é derivada de Corynebacterium glutamicum, mas não se limita ao mesmo. Além disso, o LysC na presente revelação pode ser um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos que tem uma homologia ou identidade com a mesma de 80%, 85%, 90%, 95% ou 97% ou superior. Adicionalmente, é evidente que um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição ou adição de uma parte da sequência também está incluído no escopo da presente revelação, desde que a sequência de aminoácidos tenha tal homologia ou identidade e exiba um efeito correspondente àquele do polipeptídeo.

[017] Na presente revelação, vários métodos bem conhecidos na técnica podem ser usados para o método de obtenção de aspartoquinase (LysC). Exemplos de tais métodos incluem técnicas de síntese de genes, incluindo otimização de códons de modo a obter enzimas com alta eficiência em um micro-organismo do gênero Corynebacterium, que é comumente usado para a expressão de enzimas, e métodos para triar recursos enzimáticos úteis com o uso de métodos bioinformáticos com base no meta-genoma de microorganismos, mas os métodos não se limitem a esses.

[018] Conforme usado no presente documento, o termo “variante” é um polipeptídeo no qual pelo menos um aminoácido difere do polipeptídeo recitado em substituições e/ou modificações conservadoras, de modo que as funções ou propriedades do polipeptídeo sejam retidas. Polipeptídeos variantes diferem de uma sequência identificada por substituição, deleção ou adição de diversos aminoácidos. Tais variantes podem geralmente ser identificadas modificando-se uma das sequências de polipeptídeos acima e avaliando-se as propriedades do polipeptídeo modificado. Em outras palavras, a capacidade de uma variante pode ser melhorada, inalterada ou diminuída em relação à proteína nativa. Tais variantes podem geralmente ser identificadas modificando-se uma das sequências de polipeptídeos acima e avaliando-se a reatividade do polipeptídeo modificado. Adicionalmente, uma parte das variantes pode incluir aquelas nas quais uma ou mais porções, tais como sequência líder N-terminal ou domínio transmembranar, foram removidas. Outras variantes podem incluir variantes nas quais uma pequena porção foi removida do terminal N e/ou C da proteína madura.

[019] Conforme usado no presente documento, uma “substituição conservadora” significa que um aminoácido é substituído por um outro aminoácido que tem propriedades estruturais e/ou químicas similares. Por exemplo, as variantes podem ter pelo menos uma substituição conservadora com a retenção de mais uma atividade biológica. Tais substituições de aminoácido podem geralmente ser realizadas com base na similaridade na polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou na natureza anfipática dos resíduos. Por exemplo, aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos aromáticos incluem fenilalanina, triptofano e tirosina; e aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina e triptofano. Tipicamente, substituições conservadoras têm pouco a nenhum impacto na atividade de um polipeptídeo resultante.

[020] Variantes também podem conter outras modificações, incluindo a deleção ou adição de aminoácidos que têm mínima influência nas propriedades e na estrutura secundária do polipeptídeo. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser conjugado a uma sequência sinal (ou líder) na extremidade N terminal da proteína que direciona cotranslacional ou pós-translacionalmente a transferência da proteína. O polipeptídeo também pode ser conjugado a um ligante ou outra sequência para facilidade de síntese, purificação ou identificação do polipeptídeo.

[021] Por exemplo, o termo “variante de aspartoquinase”, reivindicado no presente documento, pode referir-se especificamente a um polipeptídeo modificado de LysC que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que é derivada de Corynebacterium sp., e pode compreender uma variante que compreende uma ou mais substituições de aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Especificamente, uma variante pode compreender que o resíduo de aminoácido na posição 377 seja substituído por um outro aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. O “outro aminoácido” não é limitado, desde que seja um aminoácido diferente de L-leucina, que é o aminoácido na posição 377. Especificamente, por exemplo, o resíduo de aminoácido na posição 377 pode ser substituído por lisina ou metionina. L-Lisina é um exemplo de um aminoácido básico, e o aminoácido básico pode ser uma dentre L-lisina, L-arginina e L-histidina. L-Metionina é um exemplo de um aminoácido não polar, e o aminoácido não polar pode ser um dentre L-metionina, L-fenilalanina, L-alanina, L-cisteína, L-glicina, L-isoleucina, L-leucina, L-prolina, L-triptofano e L-valina. No entanto, esses não se limitam a isso.

[022] Conforme usado no presente documento, o termo “variante de aspartoquinase” pode ser usado intercambiavelmente com “aspartoquinase modificada” ou “LysC modificado”.

[023] Tal variante de aspartoquinase é caracterizada por ter uma atividade melhorada de aspartoquinase em comparação com o polipeptídeo que tem uma atividade de aspartoquinase de SEQ ID NO: 1.

[024] Adicionalmente, mesmo que seja descrito no presente documento como uma “proteína que tem uma sequência de aminoácidos de um número específico de sequência”, é evidente que um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição ou adição de uma parte da sequência também está incluído no escopo da presente revelação, desde que a proteína tenha efeito idêntico ou equivalente àquele do peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos do número correspondente de sequência. Especificamente, tal proteína não exclui uma adição de sequências que não têm alteração na função da proteína no início ou no fim da sequência de aminoácidos do número correspondente de sequência, uma mutação de ocorrência natural, substituição conservadora ou uma mutação sinônima das mesmas. Além disso, é evidente que a proteína que tem tal adição ou mutação de sequência também está incluída no escopo da presente revelação.

[025] Conforme usado no presente documento, o termo “substituição conservadora” refere-se à substituição de um determinado resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácidos que têm cadeias laterais similares são bem conhecidas na técnica. Exemplos de tais famílias podem incluir aminoácidos que têm uma cadeia lateral básica (por exemplo, lisina, arginina, histidina), aminoácidos que têm uma cadeia lateral ácida (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), aminoácidos que têm uma cadeia lateral polar não carregada (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), aminoácidos que têm uma cadeia lateral não polar (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), aminoácidos que têm uma cadeia lateral ramificada na posição β (por exemplo, treonina, valina, isoleucina), aminoácidos que têm uma cadeia lateral aromática (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina), aminoácidos que têm uma cadeia lateral contendo grupo hidroxila (por exemplo, alcoólico e fenólico) (por exemplo, serina, treonina, tirosina) e aminoácidos que têm uma cadeia lateral contendo enxofre (por exemplo, cisteína, metionina). De preferência, a substituição conservadora dos aminoácidos pode ser a substituição entre ácido aspártico e ácido glutâmico, a substituição entre arginina, lisina e histidina, a substituição entre triptofano e fenilalanina, a substituição entre fenilalanina e valina, a substituição entre leucina, isoleucina e alanina e a substituição entre glicina e alanina.

[026] Conforme usado no presente documento, o termo “homologia” ou “identidade” refere-se ao grau de relevância entre duas determinadas sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos e pode ser expressa como uma porcentagem.

[027] Os termos “homologia” e “identidade” são frequentemente usados de modo intercambiável entre si.

[028] A homologia ou identidade de sequência de sequências conservadas de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada por algoritmos de alinhamento padrão e pode ser usada com penalidade por lacuna predefinida estabelecida pelo programa a ser usado. Geralmente espera- se que polinucleotídeos ou polipeptídeos substancialmente homólogos ou idênticos hibridizem pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% do comprimento total dos polinucleotídeos ou polipeptídeos alvo sob altas ou moderadas condições de estringentes. Os polinucleotídeos que contêm códons degenerados em vez de códons também são considerados para a hibridização.

[029] Se quaisquer duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos têm uma homologia, similaridade ou identidade entre si, a mesma pode ser determinada com o uso de um algoritmo de computador conhecido, tal como o programa “FASTA” (por exemplo, Pearson et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85: 2.444) com o uso de parâmetros padrão. Alternativamente, a mesma pode ser determinada com o uso do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453), que é executado no programa Needleman do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277) (de preferência, versão 5.0.0 ou versões posteriores) (pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL., J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, São Diego, 1994, e [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1.073). Por exemplo, a homologia ou identidade pode ser determinada com o uso de BLAST ou ClustalW do Centro Nacional para Informações de Biotecnologia (NCBI - National Center for Biotechnology Information).

[030] A homologia, similaridade ou identidade de sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada comparando-se informações de sequência com o uso, por exemplo, do programa de computador GAP (por exemplo, Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482) conforme publicado. Em suma, o programa GAP define a homologia ou identidade como o valor obtido dividindo-se o número de símbolos similarmente alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) pelo número total dos símbolos na sequência mais curta dentre as duas sequências. Parâmetros padrão para o programa GAP podem incluir (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6.745, conforme revelado em Schwartz e Dayhoff, edições, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, páginas 353 a 358, 1979; (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada lacuna (ou uma penalidade por abertura de lacuna de 10 e uma penalidade por extensão de lacuna de 0,5); e (3) nenhuma penalidade para lacunas de extremidade. Consequentemente, conforme usado no presente documento, o termo “homologia” ou “identidade” refere-se à relevância entre sequências.

[031] Um outro aspecto da presente revelação fornece uma polinucleotídeo que codifica a variante de aspartoquinase.

[032] A variante de aspartoquinase é conforme descrito acima.

[033] Conforme usado no presente documento, o termo “polinucleotídeo” refere-se a um polímero de nucleotídeo composto por monômeros de nucleotídeo covalentemente ligados em uma cadeia, e exemplos dos mesmos são fitas de DNA ou RNA que têm um comprimento predeterminado ou mais longo. Especificamente, o polinucleotídeo refere-se a um fragmento de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo modificado.

[034] O polinucleotídeo que codifica a variante de aspartoquinase pode ser um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende uma ou mais substituições de aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, na qual a substituição de aminoácido compreende que o resíduo de aminoácido na posição 377 seja substituído por um outro aminoácido. Especificamente, como um exemplo representativo, o polinucleotídeo que codifica a variante de aspartoquinase pode ser um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo no qual o resíduo de aminoácido na posição 377 é substituído por um outro aminoácido de L-lisina ou L- metionina na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Mais especificamente, o polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo que codifica uma proteína LysC que tem a sequência de aminoácidos que consiste em SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo que consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6. Várias modificações podem ser realizadas na região de codificação, desde que as mesmas não alterem a sequência de aminoácidos da proteína expressa a partir da região de codificação, devido à degenerescência de códon ou em consideração dos códons preferidos por um organismo no qual a proteína deve ser expressa.

[035] Portanto, é evidente que, devido à degenerescência de códon, o polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5 ou o polinucleotídeo com capacidade para ser traduzido em um polinucleotídeo que tem homologia ou identidade com o mesmo também está incluído no escopo da presente revelação. Alternativamente, uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência de genes conhecida, por exemplo, uma sequência que codifica uma proteína que tem a atividade da enzima que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 hibridizando-se, sob condições estringentes, com uma sequência complementar à totalidade ou parte da sequência de polinucleotídeos, pode estar incluída sem limitação.

[036] As “condições estringentes” referem-se às condições que permitem a hibridização específica entre os polinucleotídeos. Tais condições são especificamente reveladas na literatura (por exemplo, J. Sambrook et al.). Por exemplo, as condições estringentes podem incluir uma condição na qual genes que têm uma alta homologia ou identidade (por exemplo, 80% ou mais, 85% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente, 95% ou mais, ainda mais especificamente, 97% ou mais e, ainda mais especificamente, 99% ou mais) podem hibridizar entre si, enquanto genes que têm uma menor homologia ou identidade não podem hibridizar entre si; ou condições para hibridização southern convencional (isto é, condições para lavagem uma vez e, especificamente, duas ou três vezes sob uma concentração salina e temperatura correspondente a 60 °C, IxSSC e SDS a 0,1%; especificamente sob 60 °C, 0,1*SSC e SDS a 0,1%; e mais especificamente sob 68 °C, 0,1*SSC e SDS a 0,1%).

[037] A hibridização requer que dois ácidos nucleicos tenham sequências complementares, embora disparidades entre bases sejam possíveis dependendo da severidade da hibridização. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases nucleotídicas que têm capacidade para serem hibridizadas entre si. Por exemplo, com relação ao DNA, adenosina é complementar à timina e citosina é complementa à guanina. Portanto, a presente revelação também pode incluir sequências de ácidos nucleicos substancialmente similares, bem como fragmentos de ácido nucleico isolados complementares à sequência total.

[038] Especificamente, o polinucleotídeo que tem homologia ou identidade pode ser detectado com o uso de condições de hibridização, incluindo uma etapa de hibridização a um valor Tm de 55 °C e com o uso das condições descritas acima. Além disso, o valor Tm pode ser 60 °C, 63 °C ou 65 °C, mas não se limita a esses. Um indivíduo versado na técnica pode ajustar apropriadamente o valor Tm de acordo com seu propósito.

[039] A estringência apropriada para hibridizar os polinucleotídeos depende do comprimento e do grau de complementaridade dos polinucleotídeos, e as variáveis são bem conhecidas na técnica (Sambrook et al., supra, 9,50 a 9,51, 11,7 a 11,8).

[040] Ainda um outro aspecto da presente revelação fornece uma célula hospedeira que contém a variante de aspartoquinase e um micro-organismo transformado com um vetor que contém um polinucleotídeo que codifica a variante de aspartoquinase. Especificamente, a presente revelação fornece um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz um L-aminoácido derivado de aspartato ou um derivado de aminoácido do mesmo que compreende a variante de aspartoquinase.

[041] O micro-organismo que contém a variante de aspartoquinase da presente revelação é caracterizado pela atividade de aspartoquinase ser melhorada em comparação com o micro-organismo de tipo selvagem ou não modificado.

[042] Conforme usado no presente documento, o termo “melhoramento da atividade” significa que a atividade de uma proteína é introduzida, ou que a atividade é melhorada em comparação com a atividade intrínseca ou a atividade de pré-modificação de um micro-organismo. A “introdução” da atividade significa que a atividade de uma proteína específica que o micro-organismo não tinha originalmente é natural ou artificialmente expressa. A “atividade intrínseca” refere-se à atividade de uma proteína específica, que está originalmente presente em uma cepa progenitora antes da transformação, quando traços microbianos são alterados por variação genética por fatores naturais ou artificiais.

[043] Conforme usado no presente documento, o termo “vetor” refere-se ao construto de DNA que compreende a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo que codifica a proteína-alvo ligada operacionalmente à sequência reguladora apropriada para expressar a proteína-alvo no hospedeiro apropriado. A sequência reguladora pode incluir o promotor que pode iniciar a transcrição, qualquer sequência operadora para controlar a transcrição, a sequência para codificar o sítio de ligação ao ribossoma de mRNA apropriado e a sequência para controlar a terminação de transcrição e tradução. O vetor pode ser transfectado em um hospedeiro adequado e, então, pode ser replicado ou funcionar independentemente do genoma do hospedeiro, e pode ser integrado ao próprio genoma.

[044] O vetor usado na presente revelação não é particularmente limitado, desde que possa ser expresso no hospedeiro, e qualquer vetor que seja conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de vetores comumente usados são um plasmídeo, cosmídeo, vírus e bacteriófago em um estado natural ou estado recombinante. Por exemplo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A e Charon21A podem ser usados como um vetor de fago ou vetor de cosmídeo; e sistema pBR, sistema pUC, sistema pBluescriptII, sistema pGEM, sistema pTZ, sistema pCL e sistema pET podem ser usados como um vetor de plasmídeo. Especificamente, vetores pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 e pCC1BAC podem ser usados, mas esses não estão limitados a isso.

[045] O vetor que pode ser usado na presente revelação não é particularmente limitado, e um vetor de expressão conhecido pode ser usado. Além disso, um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo pode ser inserido em um cromossomo através de um vetor para inserção de cromossomo intracelular. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada por meio de qualquer método conhecido na técnica, tal como recombinação homóloga, sem ser particularmente limitado a isso. O vetor pode incluir, ainda, um marcador de seleção para indicar a inserção do vetor no cromossomo hospedeiro. O marcador de seleção é usado para selecionar as células transformadas com o vetor, isto é, para confirmar se uma molécula-alvo de ácido nucleico foi inserida. Portanto, o marcador de seleção pode dotar a célula com uma capacidade para mostrar resistência a fármacos, resistência a agente citotóxico, autotrofia ou expressão de fenótipo selecionável, tal como a expressão de uma proteína superficial. Na presença de um agente seletivo, as células transformadas podem ser selecionadas, visto que apenas as células que expressam renderização do marcador de seleção sobrevivem ou mostram um outro fenótipo.

[046] Conforme usado no presente documento, o termo “transformação” refere-se à introdução de um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína- alvo em uma célula hospedeira de tal modo que a proteína codificada pelo polinucleotídeo seja expressa na célula hospedeira. Desde que o polinucleotídeo transformado possa ser expresso na célula hospedeira, o mesmo pode ser integrado ou colocado no cromossomo da célula hospedeira, ou existir extracomossomicamente. Adicionalmente, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína- alvo. O polinucleotídeo pode ser introduzido em qualquer forma, desde que possa ser introduzido na célula hospedeira e expresso na mesma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira sob a forma de um cassete de expressão, que é um construto gênico que inclui todos os elementos necessários para sua expressão autônoma. O cassete de expressão pode incluir um promotor ligado operacionalmente ao polinucleotídeo, um terminador de transcrição, sítios de ligação ao ribossoma ou terminador de tradução. O cassete de expressão pode estar sob a forma de um vetor de expressão autorreplicável. Além disso, o polinucleotídeo tal como é pode ser introduzido na célula hospedeira e ligado operacionalmente às sequências necessárias para expressão na célula hospedeira, mas não se limita a isso. O método de transformação inclui qualquer método de introdução de um ácido nucleico em uma célula e pode ser realizada selecionando-se uma técnica padrão adequada conhecida na arte, dependendo de uma célula hospedeira. Exemplos do método incluem eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio (CaPO4), precipitação com cloreto de cálcio (CaCl2), microinjeção, uma técnica com base em polietilenoglicol (PEG), uma técnica com base em DEAE-dextrano, uma técnica com base em lipossoma catiônico, uma técnica com base em acetato de lítio-DMSO, etc., mas não se limita a isso.

[047] Adicionalmente, o termo “ligação operável” significa que a sequência de polinucleotídeos é funcionalmente ligada a uma sequência promotora que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo que codifica a proteína-alvo da presente revelação. A ligação operável pode ser preparada com o uso de uma técnica recombinante de genes conhecida na arte, e a ligação e clivagem de DNA específico de sítio podem ser preparadas com o uso de uma liase e ligase conhecidas, mas as mesmas não se limitam a isso.

[048] Conforme usado no presente documento, o termo “micro-organismo que produz um L-aminoácido derivado de aspartato ou derivado de aminoácido do mesmo” refere-se a um micro-organismo que produz naturalmente um L- aminoácido derivado de aspartato ou um derivado de aminoácido do mesmo ou refere-se a um micro-organismo no qual a produtividade de um L-aminoácido derivado de aspartato ou derivado de aminoácido do mesmo é conferida a uma cepa progenitora que carece da capacidade para produzir um L-aminoácido derivado de aspartato ou um derivado de aminoácido do mesmo.

[049] Conforme usado no presente documento, o termo “L-aminoácido derivado de aspartato ou derivado de aminoácido do mesmo” refere-se a um material com capacidade para ser biossintetizado com o uso de ácido aspártico (aspartato) como um precursor, e pode ser usado intercambiavelmente com o termo “produto derivado de aspartato”. O “derivado de aminoácido” refere-se a um material que pode ser produzido a partir de um L-aminoácido e um material que inclui um precursor de um L-aminoácido. Além disso, o derivado de aminoácido não é limitado, desde que seja um material que pode ser produzido por biossíntese com o uso de aspartato como um precursor. Especificamente, materiais sintetizados comumente com o uso de acetilfosfato estão incluídos sem limitação. Por exemplo, o derivado de aminoácido pode ser L-lisina, L-treonina, L-metionina, L- glicina, homosserina, O-acetil-homosserina, O-succinil- homosserina, O-fosfo-homosserina, L-isoleucina e cadaverina, mas não se limita a isso.

[050] Cadaverina pode ser diretamente biossintetizada com o uso de aspartato como um precursor ou pode ser produzida a partir de lisina por meio de lisina decarboxilase. A L-metionina pode ser diretamente biossintetizada com o uso de aspartato como um precursor ou pode ser produzida por meio de conversão de O-acetil- homosserina ou O-succinil-homosserina.

[051] Conforme usado no presente documento, o termo “aspartato (ácido aspártico)” é abreviado como Asp ou D e refere-se ao ácido aspártico, que é um a-aminoácido usado para biossíntese de proteínas. Assim como todos os outros aminoácidos, aspartato inclui um grupo amino e um grupo ácido carboxílico. Geralmente, o aspartato é produzido como fosfato de aspartila por meio de aspartoquinase (LysC) e, então, convertido em L-lisina, L- metionina, L-homosserina, L-treonina, L-isoleucina, etc. na célula.

[052] A fim de melhorar a biossíntese do produto derivado de aspartato, a variante de aspartoquinase da presente revelação pode ser usada. Por exemplo, a fim de melhorar a biossíntese de L-lisina, L-treonina, L- metionina, L-glicina, homosserina, O-acetil-homosserina, O- succinil-homosserina, O-fosfo-homosserina, L-isoleucina e cadaverina, a variante de aspartoquinase da presente revelação pode ser introduzida ou a atividade da mesma pode ser melhorada. Além disso, a produtividade do produto derivado de aspartato pode ser ainda mais melhorada introduzindo-se ou melhorando-se a atividade de uma proteína específica ou inativando-se a atividade de uma proteína específica.

[053] O método de introdução, melhoramento e inativação da atividade de uma proteína específica pode ser realizado com o uso de um método adequado conhecido na técnica, dependendo das características dos microorganismos.

[054] O micro-organismo que produz o produto derivado de aspartato, o L-aminoácido ou o derivado de aminoácido do mesmo pode ser qualquer micro-organismo com capacidade para produzir o “aminoácido” derivado de aspartato ou derivado de aminoácido do mesmo, incluindo-se a variante de aspartato da presente revelação. Um exemplo específico do mesmo pode incluir Escherichia sp., Serratia sp., Erwinia sp., Enterobacteria sp., Salmonella sp., Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp. ou Corynebacterium sp. e, mais especificamente, o microorganismo pode ser Corynebacterium glutamicum, mas não se limita a isso.

[055] Ainda um outro aspecto da presente revelação fornece um método para produzir um L-aminoácido derivado de aspartato ou um derivado de aminoácido do mesmo que compreende: cultivar o micro-organismo descrito acima; e recuperar o L-aminoácido derivado de aspartato ou derivado de aminoácido do mesmo a partir do micro-organismo cultivado ou meio cultivado.

[056] O método para produzir o L-aminoácido derivado de aspartato ou derivado de aminoácido do mesmo pode ser facilmente determinado por um indivíduo versado na técnica sob condições de cultura otimizadas e condições de atividade enzimática conhecidas na técnica. Especificamente, embora particularmente não limitado a isso, a etapa de cultivar o micro-organismo pode ser realizada por cultura em batelada, cultura contínua e cultura em batelada alimentada conhecidas na técnica. No presente documento, as condições de cultura não são particularmente limitadas, mas um pH ideal (por exemplo, pH 5 a 9, especificamente, pH 6 a 8 e, com a máxima especificidade, pH 6,8) pode ser mantido com o uso de um produto químico básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou um produto químico ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico). Além disso, uma condição aeróbica pode ser mantida adicionando-se oxigênio ou uma mistura de gases contendo oxigênio a uma cultura celular. A temperatura de cultura pode ser mantida a 20 °C a 45 °C e, especificamente, a 25 °C a 40 °C, e o cultivo pode ser realizado por cerca de 10 horas a 160 horas, mas os mesmos não se limitam a isso. O aminoácido derivado de aspartato ou derivado de aminoácido do mesmo produzido pela cultura pode ser secretado em um meio ou pode permanecer nas células.

[057] Adicionalmente, um meio a ser usado para cultura pode incluir açúcar e carboidrato (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), óleo de gordura (por exemplo, óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), ácido graxo (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcool (por exemplo, glicerol e etanol) e ácido orgânico (por exemplo, ácido acético) individualmente ou em combinação como uma fonte de carbono; um composto orgânico contendo nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, suco de carne, extrato de malte, solução de milho, farelo de soja em pó e ureia) ou um composto inorgânico (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio) individualmente ou em combinação como uma fonte de nitrogênio; e fosfato di-hidrogênio de potássio, fosfato dipotássico ou um sal contendo sódio que corresponde ao mesmo individualmente ou em combinação como uma fonte de fósforo; mas os mesmos não se limitam a isso. Além disso, o meio pode conter materiais essenciais promotores de crescimento, tais como outros sais metálicos (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos e vitaminas.

[058] O método para recuperar o aminoácido derivado de aspartato ou derivado de aminoácido do mesmo produzido no método de cultura da presente revelação pode ser realizado para coletar um aminoácido-alvo do meio cultivado com o uso de um método adequado conhecido na técnica de acordo com o método de cultura. Por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização e HPLC podem ser usadas, e o aminoácido-alvo derivado de aspartato ou derivado de aminoácido do mesmo pode ser recuperado do meio ou micro-organismo com o uso de um método adequado conhecido na técnica.

[059] Adicionalmente, o método de recuperação pode incluir, ainda, uma etapa de purificação e pode ser realizado com o uso de um método adequado conhecido na técnica.

[060] Ainda um outro aspecto da presente revelação fornece um método para produzir L-metionina que compreende: cultivar o micro-organismo da presente revelação; produzir O-acetil-homosserina ou O-succinil-homosserina a partir do micro-organismo cultivado ou meio cultivado; e converter O- acetil-homosserina ou O-succinil-homosserina em L- metionina.

[061] Especificamente, a “etapa de conversão em L- metionina” pode incluir uma etapa de reagir O-acetil- homosserina ou O-succinil-homosserina com O-acetil- homosserina sulfidrilase ou O-succinil-homosserina sulfidrilase na presença de um sulfeto. A “O-acetil- homosserina ou O-succinil-homosserina” pode ser um caldo de fermentação que contém O-acetil-homosserina ou O-succinil- homosserina produzido pelo micro-organismo da presente revelação, ou pode estar em uma forma purificada. Além disso, o “sulfeto” pode ser, por exemplo, metilmercaptano, e o metilmercaptano pode se referir à forma de metilmercaptano sódico (CH3S-Na), bem como metilmercaptano (CH3SH) e um estado gasoso ou liquefeito e metilmercaptano contendo dimetilsulfeto (DMS) na forma descrita na publicação de patente internacional no WO2010/098629; e o metilmercaptano também pode se referir a um derivado de metilmercaptano que contém uma forma com capacidade para fornecer átomos de enxofre. Além disso, a “O-acetil- homosserina sulfidrilase ou O-succinil-homosserina sulfidrilase” pode ser um caldo de fermentação do microorganismo que produz o mesmo ou pode ser uma forma purificada.

[062] O método para produzir L-metionina pode ser facilmente determinado por um indivíduo versado na técnica sob condições de cultura otimizadas e condições de atividade enzimática conhecidas na técnica. O método e o meio de cultura específicos são descritos acima.

[EFEITOS VANTAJOSOS]

[063] O micro-organismo que contém a variante de aspartoquinase de acordo com a presente revelação pode obter o L-aminoácido derivado de aspartato ou o produto derivado de aspartato em alto rendimento sem inibir o crescimento de células hospedeiras, em comparação com um micro-organismo que inclui o LysC do tipo selvagem.

[BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS]

[064] A Figura 1 mostra uma trajetória para a biossíntese do aminoácido derivado de aspartato e derivado de aminoácido do mesmo de Corynebacterium glutamicum.

[DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO]

[065] Doravante, a presente revelação será descrita em detalhes com as modalidades exemplificativas anexas. No entanto, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento têm apenas propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitantes do escopo da presente revelação. EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE CEPA DE INTRODUÇÃO DA VARIANTE LYSC

[066] Uma variação, cuja atividade pode ser melhorada em comparação com o tipo selvagem, foi selecionada através da modelagem estrutural de uma aspartoquinase, e uma cepa introduzida com a variante foi preparada conforme descrito abaixo.

[067] No gene lysC (SEQ ID NO: 2) que codifica aspartoquinase (SEQ ID NO: 1) derivada de ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum (doravante denominado WT), o aminoácido na posição 377 foi selecionado como o sítio de variação, e L-lisina, que é um aminoácido básico, e L- metionina, que é um aminoácido não polar, foram selecionadas como exemplos representativos de outros aminoácidos para substituição.

[068] A fim de preparar um vetor introduzido com a variação, a centralização no sítio de variação, um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 7 e 8 ou SEQ ID NOS: 7 e 10) para amplificar a região a montante 5‘ e um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 9 e 12 ou SEQ ID NOS: 11 e 12) para amplificar a região a jusante 3‘ foram desenvolvidos (Tabela 1) . Nos iniciadores de SEQ ID NOS: 7 e 12, um sítio de enzima de restrição Xbal (sublinhado) foi inserido em cada extremidade. Adicionalmente, em um par dos iniciadores de SEQ ID NOS: 8 e 9 ou um par dos iniciadores de SEQ ID NOS: 10 e 11, uma variação de substituição de nucleotídeos (sublinhada) foi colocada no sítio projetado para cruzar um com o outro. [TABELA 1]

[069] PCR foi realizada com os iniciadores de SEQ ID NOS: 7 e 8, SEQ ID NOS: 7 e 10, SEQ ID NOS: 9 e 12 ou SEQ ID NOS: 11 e 12 com o uso do cromossomo de WT conforme um modelo. Após a desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi realizada por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 30 segundos. Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, a centralização no sítio de variação do gene lysC, um fragmento de a DNA (509 bp) da região a montante 5‘ e um fragmento de DNA (520 bp) da região a jusante 3‘ foram obtidos, respectivamente.

[070] PCR foi realizada com os iniciadores de SEQ ID NOS: 7 e 12 com o uso de dois fragmentos de DNA amplificados como um modelo. Após a desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi realizada por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 60 segundos. Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA (1.011 bp) incluindo a variante (SEQ ID NO: 4) do gene lysC que codifica a variante de aspartoquinase (SEQ ID NO: 3), na qual a leucina na posição 377 é substituída por lisina, foi amplificado. Além disso, a fim de confirmar a importância do aminoácido na posição 377, um fragmento de DNA (1.011 bp) incluindo a variação (SEQ ID NO: 6) do gene lysC que codifica a variante de aspartoquinase (SEQ ID NO: 5), na qual a leucina na posição 377 é substituída por metionina, foi obtido.

[071] O vetor pDZ (patente coreana no 0924065), que não pode ser replicado em Corynebacterium glutamicum, e o fragmento de DNA (1.011 bp) foram tratados com uma enzima de restrição, XbaI, e esses foram ligados com o uso de uma ligase de DNA e, então, clonados para obter plasmídeos. Os plasmídeos foram nomeados como pDZ-lysC(L377K) e pDZ- lysC(L377M).

[072] Os vetores, pDZ-lysC(L377K) e pDZ- lysC(L377M), foram, cada um, transformados em WT com o uso de um método de pulso elétrico (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541 a 545) e, então, cepas transformantes foram obtidas em um meio LB contendo canamicina (25 mg/l). WT::lysC(L377K) e WT::lysC(L377M), as cepas nas quais a variação de nucleotídeo é introduzida no gene lysC pelos fragmentos de DNA inseridos no cromossomo por meio de um processo recombinante secundário (cruzamento), foram obtidas, e essas foram nomeadas como CA01-2307 e CA01-2308 de Corynebacterium glutamicum, respectivamente. CA01-2307 e CA01-2308 foram depositados no Centro Coreano de Cultura de Micro-organismos, que é uma autoridade internacional depositária sob o tratado de Budapeste, em 29 de março de 2017, e receberam os números de acesso KCCM12000P e KCCM12001P. EXEMPLO 2: CONFIRMAÇÃO DA CAPACIDADE DA CEPA DE INTRODUÇÃO DA VARIANTE LYSC PARA PRODUZIR AMINOÁCIDO DERIVADO DE ASPARTATO

[073] A fim de comparar as capacidades das cepas CA01-2307 e CA01-2308 obtidas no Exemplo 1 e a cepa WT para produzir importantes aminoácidos derivados de aspartato, as cepas foram cultivadas com o uso do método a seguir, e os componentes no meio de cultura foram analisados.

[074] Cada cepa foi inoculada em um frasco com reentrâncias nos cantos (250 ml) contendo um meio de semeio (25 ml) e cultivada a 37 °C por 20 horas com agitação a 200 rpm. A solução de cultura de sementes (1 ml) foi inoculada em um frasco com reentrâncias nos cantos (250 ml) contendo um meio de produção (24 ml) e, então, cultivada a 37 °C por 24 horas com agitação a 200 rpm. As concentrações de L- lisina e L-treonina, que são aminoácidos representativos derivados de L-aspartato e aspartato, foram analisadas por HPLC, e as concentrações analisadas são mostradas na Tabela 2. <MEIO DE SEMEIO (pH 7,0)>

[075] Glicose (20 g), peptona (10 g), extrato de levedura (5 g), ureia (1,5 g), KH2PO4 (4 g), K2HPO4 (8 g), MgSO4^7H2O (0,5 g), biotina (100 μg), HCl de tiamina (1.000 μg), pantotenato de cálcio (2.000 μg), nicotinamida (2.000 μg) (em 1 l de água destilada) <MEIO DE PRODUÇÃO (pH 7,0)>

[076] Glicose (100 g), (NH4)2SO4 (40 g), proteína de soja (2,5 g), sólidos macerados de milho (5 g), ureia (3 g), KH2PO4 (1 g), MgSO4^7H2O (0,5 g), biotina (100 μg), cloreto de tiamina (1.000 μg), pantotenato de cálcio (2.000 μg), nicotinamida (3.000 μg), CaCO3 (30 g) (em 1 l de água destilada) [TABELA 2] CONCENTRAÇÕES DE AMINOÁCIDOS DERIVADOS DE ASPARTATO PRODUZIDOS A PARTIR DE CA01-2307 E CA01-2308

[077] Como resultado da análise das concentrações dos aminoácidos derivados de aspartato, confirmou-se que, quando a variação lysC foi introduzida, a concentração de L-lisina foi drasticamente aumentada e aquelas de L- aspartato e L-treonina também foram aumentadas em comparação com WT. Com base nos resultados acima, as cepas CA01-2307, CA01-2308 e WT foram cultivadas da mesma maneira que a descrita acima a fim de comparar, em detalhes, as capacidades das mesmas para produzir lisina. Adicionalmente, a concentração de L-lisina no meio de cultura foi analisada da mesma maneira que a descrita acima (Tabela 3). [TABELA 3] CONCENTRAÇÕES DE L-LISINA PRODUZIDA A

[078] Como resultado da análise da concentração de L-lisina, confirmou-se que a produtividade de L-lisina produzida a partir de CA01-2307, incluindo a variação lysC(L377K), foi amplamente aumentada como na avaliação anterior em comparação com aquela produzida a partir da cepa WT. Além disso, confirmou-se que a produtividade de L- lisina produzida a partir de CA01-2308, incluindo a variação lysC(L377M), também aumentou em comparação com aquela produzida a partir da cepa WT. Com base nos resultados acima, confirmou-se que a produtividade de L- lisina nos aminoácidos derivados de aspartato foi amplamente aumentada devido à variante de aspartoquinase (SEQ ID NO: 3), na qual a leucina na posição 377, que é selecionada na presente revelação, é substituída por lisina, e devido à variante de aspartoquinase (SEQ ID NO: 5), na qual a leucina na posição 377 é substituída por metionina. EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE CEPA MELHORADA COM L-TREONINA E CONFIRMAÇÃO DE PRODUTIVIDADE DE L-TREONINA

[079] A fim de confirmar claramente a mudança na produtividade de L-treonina pela introdução da variação lysC(L377K), que tem a maior produtividade de lisina confirmada no Exemplo 2, uma variação foi introduzida no gene que codifica homosserina desidrogenase que produz homosserina, que é um intermediário comum na trajetória biossintética de derivados de L-treonina, L-isoleucina, L- metionina e homosserina. Especificamente, uma cepa foi preparada introduzindo-se a variação hom(G378E) conhecida na técnica (Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 612 a 620 (1996)) na cepa CA01-2307, que foi preparada no Exemplo 1. Além disso, uma cepa na qual a variação hom(G378E) é introduzido em WT também foi preparada como um grupo de controle. A fim de preparar um vetor que introduz o hom(G378E), PCR foi realizada com SEQ ID NOS: 13 e 14 e SEQ ID NOS: 15 e 16 com o uso de DNA genômico de WT como um modelo. Após a desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi realizada por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 30 segundos. Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos.

[080] Como resultado, a centralização na variação do gene hom, um fragmento de DNA (220 bp) da região a montante 5‘ e um fragmento de DNA (220 bp) da região a jusante 3‘ foram obtidos. PCR foi realizada com SEQ ID NOS: 13 e 16 com o uso desses dois produtos de PCR como um modelo. Após a desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi realizada por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 30 segundos. Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA (440 bp), incluindo a variação do gene hom, foi amplificado.

[081] O vetor pDZ, que foi anteriormente usado no Exemplo 1, e o fragmento de DNA (440 bp) foram tratados com uma enzima de restrição, XbaI, e esses foram ligados com o uso de uma ligase de DNA e, então, clonados para obter um plasmídeo. O plasmídeo foi nomeado como pDZ-hom(G378E).

[082] O vetor, pDZ-hom(G378E), foi introduzido nas cepas WT e CA01-2307 com o uso de um método de pulso elétrico (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999, 52:541 a 545)) e, então, as cepas transformantes foram obtidas em um meio seletivo contendo canamicina (25 mg/l). WT::hom(G378E) e CA01-2307::hom(G378E), as cepas nas quais a variação de nucleotídeo foi introduzida no gene hom pelo fragmento de DNA inserido no cromossomo por meio de um processo recombinante secundário (cruzamento) foram obtidas. A fim de comparar as capacidades de WT::hom(G378E) e CA01- 2307::hom(G378E) para produzir treonina, as cepas foram cultivadas da mesma maneira que no Exemplo 2, e a concentração de treonina no meio de cultura foi analisada. [TABELA 5] CONCENTRAÇÕES DE TREONINA PRODUZIDA A PARTIR DAS CEPAS, WT::hom(G378E) E CA01-2307::hom(G378E)

[083] Como resultado da análise da concentração de L-treonina, confirmou-se que a produtividade de L-treonina foi drasticamente aumentada na cepa incluindo a variação lysC (Tabela 5). EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DE CEPA MELHORADA COM L- ISOLEUCINA E COMPARAÇÃO DE PRODUTIVIDADE DE L-ISOLEUCINA

[084] A fim de confirmar o efeito da introdução da variação lysC(L377K) na produtividade de L-isoleucina, um vetor para melhorar a expressão da variação ilvA(V323A) do gene (Appl. Enviro. Microbiol., dezembro de 1996, páginas 4.345 a 4.351) que codifica L-treonina desidratase, que é conhecida na técnica, foi preparado.

[085] A fim de preparar um vetor introduzido com a variação do gene ilvA, a centralização no sítio de variação, um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 17 e 18) para amplificar a região a montante 5‘ e um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 19 e 20) para amplificar a região a jusante 3‘ foram desenvolvidos. Nos iniciadores de SEQ ID NOS: 17 e 20, um sítio de enzima de restrição BamHI (sublinhado) foi inserido em cada extremidade. Adicionalmente, nos iniciadores de SEQ ID NOS: 18 e 19, uma variação de substituição de nucleotídeos (sublinhada) foi colocada no sítio projetado para cruzar um com o outro.

[086] PCR foi realizada com os iniciadores de SEQ ID NOS: 17 e 18 e SEQ ID NOS: 19 e 20 com o uso do cromossomo de WT conforme um modelo. Após a desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi realizada por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 30 segundos. Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, a centralização no sítio de variação do gene ilvA, um fragmento de DNA (627 bp) da região a montante 5‘ e um fragmento de DNA (608 bp) da região a jusante 3‘ foram obtidos.

[087] PCR foi realizada com os iniciadores de SEQ ID NOS: 17 e 20 com o uso de dois fragmentos de DNA amplificados como um modelo. Após a desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi realizada por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 60 segundos. Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA (1.217 bp), incluindo a variação do gene ilvA que codifica a variante IlvA, na qual a valina na posição 323 é substituída por alanina, foi amplificado.

[088] O vetor pECCG117 (patente coreana no 100057684) e o fragmento de DNA (1.011 bp) foram tratados com uma enzima de restrição, BamHI, e esses foram ligados com o uso de uma ligase de DNA e, então, clonados para obter um plasmídeo. O plasmídeo foi nomeado como pECCG117- ilvA(V323A).

[089] O vetor pECCG117-ilvA(V323A) foi introduzido nas cepas WT::hom(G378E) e CA01-2307::hom(G378E), que foram preparadas no Exemplo 3, com o uso de um método de pulso elétrico e, então, manchado em um meio seletivo contendo canamicina (25 mg/l) para obter as cepas transformantes.

[090] As cepas foram cultivadas da mesma maneira que no método de cultura em frasco mostrado no Exemplo 2, e a concentração de L-isoleucina no meio de cultura foi analisada (Tabela 7).

[091] Como resultado da análise da concentração de L-isoleucina, confirmou-se que a produtividade de L- isoleucina foi amplamente aumentada na cepa incluindo a variação lysC. EXEMPLO 5: PREPARAÇÃO DE CEPA MELHORADA COM O-ACETIL- HOMOSSERINA E COMPARAÇÃO DE PRODUTIVIDADE DE O-ACETIL- HOMOSSERINA

[092] A fim de determinar o efeito da introdução da variação lysC(L377K) na produção de O-acetil- homosserina, o gene metB, que codifica a cistationina gama- sintase envolvida na trajetória de degradação de O-acetil- homosserina, e o gene metY, que codifica O-acetil- homosserina (tiol)-liase, foram deletados e, então, o gene metX que codifica a homosserina O-acetiltransferase, que é uma enzima biossintética de O-acetil-homosserina, foi superexpresso e, assim, a cepa que produz O-acetil- homosserina foi preparada. Primeiro, a fim de deletar o gene metB, com base nas informações da sequência de nucleotídeos do gene, metB derivado de WT, um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 21 e 22) para amplificar a região a montante 5‘ do gene metB e um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 23 e 24) para amplificar a região a jusante 3‘ foram desenvolvidos.

[093] PCR foi realizada com os iniciadores de SEQ ID NOS: 21 e 22, SEQ ID NO: 23 e 24 com o uso do cromossomo de WT conforme um modelo. Após a desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi realizada por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, polimerização a 72 °C por 90 segundos. Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA (450 bp) da região a montante 5‘ do gene metB e um fragmento de DNA (467 bp) da região a jusante 3‘ foram obtidos.

[094] PCR foi realizada com os iniciadores de SEQ ID NOS: 21 e 24 com o uso de dois fragmentos de DNA amplificados como um modelo. Após a desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi realizada por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 3 minutos. Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, a região central do gene metB foi deletada e, assim, um fragmento de DNA (917 bp) incluindo apenas as extremidades a montante e a jusante foi amplificado.

[095] O vetor pDZ e o fragmento de DNA (917 bp) foram tratados com uma enzima de restrição, XbaI, e esses foram ligados com o uso de uma ligase de DNA e, então, clonados para obter um plasmídeo. O plasmídeo foi nomeado como pDZ-ΔmetB.

[096] O vetor pDZ-ΔmetB foi introduzido nas cepas WT::hom(G378E) e CA01-2307::hom(G378E), que foram preparadas no Exemplo 3, com o uso de um método de pulso elétrico e, então, as cepas transformantes foram obtidas a partir de um meio seletivo contendo canamicina (25 mg/l). WT::hom(G378E)ΔmetB e CA01-2307::hom(G378E)ΔmetB, as cepas nas quais o gene metB é deletado pelos fragmentos de DNA inseridos no cromossomo por meio de um processo recombinante secundário (cruzamento), foram obtidas.

[097] A fim de deletar o gene metY envolvido em uma outra trajetória de degradação de O-acetil-homosserina, com base nas informações da sequência de nucleotídeos do gene, metY derivado de WT, um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 25 e 26) para amplificar a região a montante 5‘ do gene metY e um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 27 e 28) para amplificar a região a jusante 3‘ foram desenvolvidos.

[098] PCR foi realizada com SEQ ID NOS: 25 e 26, SEQ ID NO: 27 e 28 com o uso do cromossomo de WT conforme um modelo. Após a desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi realizada por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, polimerização a 72 °C por 90 segundos. Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA (512 bp) da região a montante 5‘ do gene metY e um fragmento de DNA (520 bp) da região a jusante 3‘ foram obtidos.

[099] PCR foi realizada com os iniciadores de SEQ ID NOS: 25 e 28 com o uso de dois fragmentos de DNA amplificados como um modelo. Após a desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi realizada por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 3 minutos. Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, a região central do gene metY foi deletada e, assim, um fragmento de DNA (1.032 bp) incluindo apenas as extremidades a montante e a jusante foi amplificado.

[0100] O vetor pDZ e o fragmento de DNA (1032 bp) foram tratados com uma enzima de restrição, XbaI, e esses foram ligados com o uso de uma ligase de DNA e, então, clonados para obter um plasmídeo. O plasmídeo foi nomeado como pDZ-ΔmetY.

[0101] O vetor pDZ-ΔmetY foi introduzido em cada uma das cepas WT::hom(G378E)ΔmetB e CA01- 2307::hom(G378E)ΔmetB, que foram preparadas no disposto acima, com o uso de um método de pulso elétrico e, então, as cepas transformantes foram obtidas em um meio seletivo contendo canamicina (25 mg/l). WT::hom(G378E)ΔmetBΔmetY e CA01-2307::hom(G378E)ΔmetBΔmetY, as cepas nas quais o gene metY foi deletado pelos fragmentos de DNA inseridos no cromossomo por meio de um processo recombinante secundário (cruzamento), foram obtidas.

[0102] A fim de maximizar a produção de O-acetil- homosserina, um vetor para melhorar a expressão do gene metX foi preparado. Para amplificar o gene que codifica homosserina O-acetiltransferase (MetX), com base nas sequências derivadas de WT relatadas, o vetor foi desenvolvido inserindo-se uma região de enzima de restrição BamHI em ambas as extremidades dos iniciadores (SEQ ID NOS: 29 e 30) para amplificação desde a região promotora (cerca de 300 bp a montante do códon de iniciação) até a região terminadora (cerca de 100 bp a jusante do códon de terminação).

[0103] PCR foi conduzida com os iniciadores de SEQ ID NOS: 25 e 26 com o uso do cromossomo de WT conforme um modelo. Após a desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi realizada por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 90 segundos. Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA (1.546 bp) incluindo o gene metX foi obtido.

[0104] O vetor pECCG117 (patente coreana no 100057684) e o fragmento de DNA de metX foram tratados com uma enzima de restrição, BamHI, e esses foram ligados com o uso de uma ligase de DNA e, então, clonados para obter um plasmídeo. O plasmídeo foi nomeado como pECCG117-metX.

[0105] O vetor pECCG117-metX foi introduzido nas cepas WT::hom(G378E)ΔmetBΔmetY e CA01- 2307::hom(G378E)ΔmetBΔmetY, que foram preparadas no disposto acima, com o uso de um método de pulso elétrico e, então, manchado em um meio seletivo contendo canamicina (25 mg/l) para obter as cepas transformantes.

[0106] A fim de comparar as capacidades das cepas preparadas acima para produzir O-acetil-homosserina (doravante denominada O-AH), as cepas foram cultivadas com o uso do método abaixo, e a concentração de O-acetil- homosserina no meio de cultura foi analisada.

[0107] Uma alça de platina das cepas foi inoculada em um frasco com reentrâncias nos cantos (250 ml) contendo um meio de produção de O-AH (25 ml), e cultivada a 37 °C por 20 horas com agitação a 200 rpm. A concentração de O- acetil-homosserina foi analisada por HPLC, e a concentração analisada é mostrada na Tabela 11. <Meio de Produção de O-AH (pH 7,0)>

[0108] Glicose (100 g), (NH4)2SO4 (40 g), proteína de soja (2,5 g), sólidos macerados de milho (5 g), ureia (3 g), KH2PO4 (1 g), MgSO4^7H2O (0,5 g), biotina (100 μg), cloreto de tiamina (1.000 μg), pantotenato de cálcio (2.000 μg), nicotinamida (3.000 μg), CaCO3 (30 g), L-metionina (0,3 g) (em 1 l de água destilada).

[0109] Como resultado da análise da concentração de O-acetil-homosserina conforme mostrado na tabela acima, confirmou-se que a concentração de O-acetil-homosserina produzida pela variação lysC foi aumentada. EXEMPLO 6: PREPARAÇÃO DE CEPA MELHORADA COM O- SUCCINIL-HOMOSSERINA E COMPARAÇÃO DE PRODUTIVIDADE DE O- SUCCINIL-HOMOSSERINA

[0110] A fim de determinar a influência da introdução da variação lysC(L377K) na produção de O- succinil-homosserina, a cepa que produz O-succinil- homosserina foi preparada. Visto que o Corynebacterium glutamicum do tipo selvagem não produz naturalmente O- succinil-homosserina, a cepa foi modificada de modo a ter a atividade de O-succiniltransferase (MetX) pela substituição do aminoácido na região de ligação de substrato da O- acetiltransferase, que foi preparada no Exemplo 5, a fim de produzir O-succinil-homosserina. Consequentemente, com base nas sequências do gene, metX derivado de WT, um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 31 e 32) foi desenvolvido para preparar o vetor para introduzir a variação metX.

[0111] PCR foi realizada com os iniciadores de SEQ ID NOS: 27 e 28 com o uso do cromossomo de WT conforme um modelo. Após a desnaturação a 95 °C por 5 minutos, PCR foi realizada por um total de 30 ciclos sob as seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 90 segundos. Depois disso, a reação de polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA (1146 bp) da região de codificação do gene metX foi obtido.

[0112] O vetor pDZ e o fragmento de DNA (1146 bp) foram tratados com uma enzima de restrição, XbaI, e esses foram ligados com o uso de uma ligase de DNA e, então, clonados para obter um plasmídeo. O plasmídeo foi nomeado como pDZ-metX. Com base no vetor pDZ-metX, a fim de produzir um vetor de variação, no qual o aminoácido na posição 176 é substituído por asparagina e o aminoácido na posição 313 é substituído por arginina, um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 33 e 34), que provocam uma variação no aminoácido na posição 176, e um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 35 e 36), que provocam uma variação no aminoácido na posição 313, foram desenvolvidos.

[0113] O gene variante metX foi preparado com o uso de um kit de mutagênese sítio-dirigida (Stratagene, EUA) juntamente com cada um dos iniciadores acima. O plasmídeo transformante com base no plasmídeo do tipo selvagem existente pDZ-metX foi nomeado como pDZ-metX(Q176N, L313R). O vetor pDZ-metX(Q176N, L313R), que foi preparado acima, foi transformado nas cepas WT::hom(G378E)ΔmetBΔmetY e CA01- 2307::hom(G378E)ΔmetBΔmetY preparadas no Exemplo 5 com o uso de um método de pulso elétrico e, então, as cepas transformantes foram obtidas em um meio seletivo contendo canamicina (25 mg/l). WT::hom(G378E)metX(Q176N, L313R)ΔmetBΔmetY e CA01-2307::hom(G378E)metX(Q176N, L313R)ΔmetBΔmetY, as cepas nas quais o gene metX é substituído por metX(Q176N, L313R) pelo fragmento de DNA inserido no cromossomo por meio de um processo recombinante secundário (cruzamento), foram obtidas.

[0114] A fim de maximizar a produção de O-succinil- homosserina, um vetor para melhorar a expressão do gene variante metX(Q176N, L313R) foi preparado. Com base no pECCG117-metX preparado no Exemplo 5, um vetor que superexpressa a variante metX foi preparado com o uso de iniciadores de SEQ ID NOS: 33 a 36, nos quais o aminoácido variante na posição 176, que tem a atividade de O- succiniltransferase, é substituído por asparagina e o aminoácido na posição 313 é substituído por arginina. Especificamente, o vetor foi preparado com o uso de um kit de mutagênese sítio-dirigida (Stratagene, EUA) juntamente com cada um dos iniciadores, e o vetor preparado foi nomeado como pECCG117-metX(Q176N, L313R).

[0115] pECCG117-metX(Q176N, L313R) e o vetor vazio pECCG117 foram introduzidos em WT::hom(G378E)metX(Q176N, L313R)ΔmetBΔmetY e CA01-2307::hom(G378E)metX(Q176N, L313R)ΔmetBΔmetY, que são as cepas preparadas acima que produzem O-succinil-homosserina, com o uso de um método de pulso elétrico, e manchados em um meio seletivo contendo canamicina (25 mg/l) para obter a cepa transformante.

[0116] A fim de comparar a capacidade da cepa para produzir O-succinil-homosserina, a cepa foi cultivada com o uso dos métodos a seguir, e a concentração de O-succinil- homosserina no meio de cultura foi analisada.

[0117] Uma alça de platina da cepa foi inoculada em um frasco com reentrâncias nos cantos (250 ml) contendo 25 ml da mesma composição do meio de produção de O-AH usada no Exemplo 5, e cultivada a 37 °C por 20 horas com agitação a 200 rpm. A concentração de O-succinil-homosserina foi analisada por HPLC, e a concentração analisada é mostrada na Tabela 14.

[0118] Como resultado da análise da concentração de O-succinil-homosserina conforme mostrado na tabela acima, confirmou-se que a produção de O-succinil-homosserina produzida pela variação lysC foi aumentada.

[0119] Esses resultados sugerem que a variante da presente revelação pode aumentar a produção do aminoácido derivado de aspartato e/ou derivado do mesmo.

[0120] A partir do supracitado, um indivíduo versado na técnica à qual a presente revelação pertence terá capacidade para entender que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente revelação. Nesse sentido, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento têm apenas propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitantes do escopo da presente revelação. Pelo contrário, a presente revelação destina-se a abranger não apenas as modalidades exemplificativas, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes e outras modalidades que podem estar incluídas no espírito e no escopo da presente revelação, conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims (8)

1. Variante de aspartoquinase caracterizada pelo fato de que o aminoácido na posição 377 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído por L-lisina ou L-metionina.

2. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que consiste na SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6, ou sequências degeneradas das mesmas, em que o referido polinucleotídeo codifica a variante conforme definida na reivindicação 1.

3. Microrganismo do gênero Corynebacterium caracterizado pelo fato de que produz um L-aminoácido derivado de aspartato ou um derivado de aminoácido do mesmo que compreende a variante de aspartoquinase conforme definida na reivindicação 1; em que o L-aminoácido derivado de aspartato ou um derivado de aminoácido do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em lisina, treonina, metionina, homosserina, O-acetil-homosserina, O- succinil-homosserina, isoleucina e cadaverina.

4. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o microrganismo do gênero Corynebacterium é Corynebacterium glutamicum.

5. Método para produzir um L-aminoácido derivado de aspartato ou um derivado de aminoácido do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar o microrganismo conforme definido na reivindicação 3, em um meio; e recuperar o L-aminoácido derivado de aspartato ou um derivado de aminoácido do mesmo a partir do microrganismo cultivado ou meio cultivado; em que o L-aminoácido derivado de aspartato ou um derivado de aminoácido do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em lisina, treonina, metionina, homosserina, O-acetil-homosserina, O-succinil-homosserina, isoleucina e cadaverina.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o microrganismo do gênero Corynebacterium é Corynebacterium glutamicum.

7. Método para produzir L-metionina caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar o microrganismo conforme definido na reivindicação 3, em um meio; produzir O-acetil-homosserina ou O-succinil- homosserina a partir do microrganismo cultivado ou meio cultivado; e converter a O-acetil-homosserina ou O-succinil- homosserina em L-metionina.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o microrganismo do gênero Corynebacterium é Corynebacterium glutamicum.

Images