BR112019001067B1

BR112019001067B1 - Microorganismo que tem atividade de aciltransferase e usos do mesmo

Info

Publication number: BR112019001067B1
Application number: BR112019001067-0A
Authority: BR
Inventors: So Yeon Hong; Jinseung Park; Hye Min Park; Su Jin Choi; Jun Ok Moon; Sung Gun Lee; Jinwoo Jeon
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2016-07-20
Filing date: 2017-07-19
Publication date: 2022-10-25
Also published as: BR112019001067A2; JP6959978B2; KR101941745B1; PL3489361T3; HUE063574T2; EP3489361A1; US20220042000A1; ES2946513T3; JP2019520845A; EP3489361A4; CA3031318A1; CN110168091B; US20190264215A1; KR20180010382A; NZ750131A; WO2018016873A1; EP3489361B1; CA3031318C; CN110168091A

Abstract

A presente revelação se refere a um polipeptídeo que tem uma atividade de aciltransferase ou um micro-organismo que inclui o mesmo; uma composição para preparar N-acetil-L-metionina, em que a composição inclui o polipeptídeo ou micro-organismo; e um método para preparar N-acetil-L-metionina com o uso do polipeptídeo ou micro-organismo. Adicionalmente, a presente revelação se refere a um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo e um vetor de expressão que inclui o polinucleotídeo. Visto que o micro-organismo que inclui uma aciltransferase inovadora de acordo com a presente revelação tem atividade de aciltransferase intensificada, esse micro-organismo pode ser usado de modo eficaz para produzir N-acetil-L- metionina acetilando-se a L-metionina.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente revelação refere-se a um polipeptídeo que tem uma atividade de aciltransferase ou um micro-organismo que inclui o mesmo; uma composição para preparar N-acetil-L- metionina, em que a composição inclui o polipeptídeo ou micro-organismo; e um método para preparar N-acetil-L-metionina com o uso do polipeptídeo ou micro-organismo. Adicionalmente, a presente revelação se refere a um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo e um vetor de expressão que inclui o polinucleotídeo.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] A N-acetilmetionina, que é um derivado de metionina, tem eficácia similar à metionina, porém, pode reduzir os sabores específicos de metionina e pode ser adicionada em uma grande quantidade em comparação com a metionina quando adicionada a alimentos. No caso de animais que têm um rúmen, quando a metionina é usada como um aditivo alimentício, a mesma é primeiro usada por micro-organismos de rúmen e, assim, não é absorvida pelos animais, enquanto a N- acetilmetionina é um aminoácido protegido do rúmen, que é absorvido após passar através do rúmen e alcançar o intestino. A resistência à degradação de N-acetil-DL-metionina no rúmen é conhecida (Amos et al., Journal of Animal Science, 1974, 39(3), páginas 612 a 617). Consequentemente, a produção de N- acetilmetionina tem valor industrial e, particularmente, é preferencial para fornecer um aminoácido tipo L que tem uma alta taxa de absorção e alta biodisponibilidade quando usada como um aditivo alimentício e, portanto, pesquisa e desenvolvimento de N-acetil-L-metionina são necessários. No caso de enzimas que, segundo os relatórios, convertem metionina em N-acetilmetionina, YncA de Escherichia coli é exclusiva (documento no U.S. 8.143.031 B2). No presente documento, foi constatado que acetil-CoA foi usada indiretamente através de um método de análise de DTNB para medir a inatividade de YncA, e não foi constatado que a N- acetilmetionina foi produzida. Ademais, não foi constatado que a N-acetilmetionina é, na realidade, produzida pelo transformante transformado por YncA.

REVELAÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA

[003] Os presentes inventores conduziram esforços contínuos para produzir N-acetil-L-metionina através de uma fermentação microbiana ou uma reação enzimática e, assim, buscaram for micro-organismos capazes de produzir N-acetil-L- metionina e descobriram seis novas aciltransferases. Ademais, os mesmos constataram que N-acetil-L-metionina pode ser produzida economicamente em uma alta concentração com o uso da aciltransferase inovadora da presente revelação ou um micro-organismo que expressa a aciltransferase inovadora, em comparação com uma aciltransferase conhecida. Com base nessa constatação, a presente revelação foi concluída.

SOLUÇÃO DA TÉCNICA

[004] Um objetivo da presente revelação é fornecer um micro-organismo que tem uma atividade de aciltransferase, o micro-organismo que inclui um polipeptídeo representado por uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 6 ou uma sequência de aminoácidos que tem 90% ou mais de homologia em relação à sequência de aminoácidos.

[005] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um polipeptídeo que tem uma atividade de acetiltransferase, em que o polipeptídeo é representado por uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 6 ou uma sequência de aminoácidos que tem 90% ou mais de homologia em relação à sequência de aminoácidos.

[006] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.

[007] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um vetor de expressão que inclui o polinucleotídeo.

[008] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer uma composição para preparar N-acetil-L-metionina a partir de L-metionina, em que a composição inclui, como um ingrediente ativo: (i) o micro-organismo ou uma cultura do mesmo; (ii) o polipeptídeo; ou uma combinação dos mesmos.

[009] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para preparar N-acetil-L-metionina incluindo: acetilar L-metionina com o uso (i) do microorganismo ou uma cultura do mesmo; (ii) do polipeptídeo; ou uma combinação dos mesmos.

EFEITOS VANTAJOSOS

[010] Visto que o micro-organismo que inclui uma aciltransferase inovadora de acordo com a presente revelação tem atividade de aciltransferase intensificada, esse micro-organismo pode ser usado de modo eficaz para produzir N- acetil-L-metionina acetilando-se a L-metionina.

MELHOR MODO PARA A INVENÇÃO

[011] Para alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece um micro-organismo que tem atividade de aciltransferase, em que o micro-organismo inclui um polipeptídeo representado por uma sequência de aminoácidos dentre qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 6 ou uma sequência de aminoácidos que tem 90% ou mais de homologia em relação à mesma.

[012] O termo “aciltransferase” usado na presente revelação se refere a uma enzima que tem uma atividade de transferir um grupo acila a partir de um doador para um receptor. Na presente revelação, o doador não é limitado, desde que possa fornecer um grupo acila a um receptor, porém, pode ser especificamente acetilcoenzima A (acetil-CoA). Ademais, como usado no presente documento, o receptor não é limitado, desde que possa receber um grupo acila a partir de um doador, porém, pode ser especificamente L-metionina.

[013] Especificamente, a aciltransferase pode ser derivada do gênero Pseudomonas, gênero Bacillus, gênero Enterobacter, gênero Pseudovibrio, gênero Yarrowia ou gênero Corynebacterium. Mais especificamente, a aciltransferase pode ser derivada de Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Enterobacter sp. 638, Pseudovibrio sp. FO-BEG1, Yarrowia lipolytica ou Corynebacterium glutamicum.

[014] Especificamente, a aciltransferase pode ser um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 6. Ademais, a aciltransferase pode ser um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que tem 70% ou mais, 80% ou mais ou 90% ou mais de homologia em relação à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 6 e que tem uma atividade de aciltransferase substancialmente igual ou correspondente à da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 6. Ademais, a sequência de aminoácidos que tem tal homologia e que tem uma atividade de aciltransferase substancialmente igual ou correspondente à da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 6 pode ser uma sequência de aminoácidos, cuja uma parte é deletada, transformada, substituída ou adicionada. É evidente que esse caso também pode ser incluído no escopo da presente revelação.

[015] O termo “homologia” usado na presente revelação se refere ao grau de identidade de base ou resíduos de aminoácido entre as sequências após alinhar ambas as sequências de aminoácidos ou sequências de bases de um gene que codifica um polipeptídeo em uma região de comparação específica para serem comparadas uma com a outra tanto quanto possível. Quando a homologia é suficientemente alta, os produtos de expressão do gene correspondente podem ter atividade igual ou similar. A porcentagem da identidade de sequência pode ser determinada com o uso de um programa conhecido de comparação de sequências, por exemplo, BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign (DNASTAR Inc) ou similares.

[016] O termo “micro-organismo que tem uma atividade de aciltransferase” usado na presente revelação se refere a um micro-organismo que produz uma aciltransferase in vivo ou in vitro. Especificamente, visto que o micro-organismo da presente revelação inclui um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 6 e, assim, tem uma atividade de aciltransferase, o mesmo pode transferir um grupo acila a um receptor. Mais especificamente, o micro-organismo da presente revelação tem atividade de acetiltransferase para L-metionina e, assim, pode produzir N- acetil-L-metionina. Na presente revelação, N-acetil-L- metionina e N-acetilmetionina são usadas de modo intercambiável.

[017] Adicionalmente, o micro-organismo da presente revelação inclui, não apenas micro-organismos que contêm, inerentemente, um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 6, mas também, micro-organismos nos quais a atividade do polipeptídeo é intensificada em comparação com uma atividade intrínseca. Ou seja, a capacidade de produção da aciltransferase pode ser conferida ou intensificada por mutagênese natural ou antropogênica ou modificação de espécie. O termo “intensificação” de atividade de polipeptídeo, como usado no presente documento, se refere ao aprimoramento do estado ativo do polipeptídeo incluído no micro-organismo. A intensificação de atividade de polipeptídeo não é limitada, desde que possa intensificar a atividade de cada polipeptídeo, como a intensificação da atividade do polipeptídeo-alvo, em comparação com um estado natural ou com um estado de não variação do polipeptídeo. Por exemplo, a intensificação de atividade de polipeptídeo pode ser realizada por um método selecionado a partir i) do aumento do número de cópias de um polinucleotídeo que codifica cada polipeptídeo, ii) da modificação de uma sequência de expressão para aumentar a expressão do polinucleotídeo, iii) da modificação da sequência de polinucleotídeo no cromossomo para intensificar a atividade de cada polipeptídeo, e iv) de uma combinação dos mesmos. Especificamente, a intensificação de atividade de polipeptídeo pode ser realizada por um método selecionado a partir de um método de inserção de um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica cada polipeptídeo em um cromossomo, um método de introdução do polinucleotídeo em um micro-organismo através de um sistema de vetor, um método de introdução de um promotor que exibe uma atividade aprimorada a montante de uma sequência de base que codifica cada polipeptídeo ou que introduz cada um dentre os polipeptídeos mutados em um promotor, um método de modificação da sequência de nucleotídeos na região 5‘-UTR e um método de introdução de um mutante da sequência de base que codifica cada polipeptídeo, porém, a presente revelação não é limitada aos mesmos.

[018] Ademais, na presente revelação, o microorganismo que tem uma atividade de aciltransferase pode ser usado independentemente da origem do micro-organismo, desde que tenha uma atividade de aciltransferase. Por exemplo, o micro-organismo pode ser Escherichia sp., Corynebacterium sp., Saccharomyces sp. ou Yarrowia sp. Mais especificamente, o micro-organismo pode ser Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Saccharomyces cerevisiae ou Yarrowia lipolytica, porém, não é limitado aos mesmos.

[019] Ademais, na presente revelação, o microorganismo que tem uma atividade de aciltransferase pode ser um micro-organismo que tem permeabilidade de membrana celular intensificada de um doador e/ou um receptor. Como o método para aumentar a permeabilidade de membrana celular, um método conhecido pode ser usado. Especificamente, os processos de congelamento e descongelamento do micro-organismo podem ser repetidos, porém, a presente revelação não é limitada aos mesmos.

[020] Ademais, na presente revelação, o microorganismo que tem uma atividade de aciltransferase pode biossintetizar um receptor ao qual um grupo acila é transferido a partir de um doador, porém, a presente revelação não é limitada nesse sentido. Especificamente, o microorganismo da presente revelação pode produzir N-acetil-L- metionina mesmo quando é cultivado em um meio ao qual a L- metionina não é adicionada devido ao fato de que tem uma habilidade para produzir L-metionina que é um aceitante de um grupo acila.

[021] Ademais, na presente revelação, o microorganismo que tem uma atividade de aciltransferase pode ser um micro-organismo mutante no qual uma mutação conhecida é introduzida em relação a um mecanismo relacionado, como uma trajetória relacionada à biossíntese ou um mecanismo relacionado à capacidade de liberação de substrato para intensificar a habilidade de produção de N-acetil-L-metionina separadamente da aciltransferase.

[022] Um aspecto da presente revelação fornece um polipeptídeo que tem uma atividade de acetiltransferase, em que o polipeptídeo é representado por uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 6 ou uma sequência de aminoácidos que tem 90% ou mais de homologia em relação à sequência de aminoácidos. Especificamente, a atividade de acetiltransferase pode ser uma atividade de acetiltransferase para L-metionina.

[023] O polipeptídeo é como descrito acima.

[024] Outro aspecto da presente revelação fornece um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo que tem uma atividade de acetiltransferase, em que o polipeptídeo é representado por uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 6 ou uma sequência de aminoácidos que tem 90% ou mais de homologia em relação à sequência de aminoácidos. O polipeptídeo é como descrito acima.

[025] Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser uma sequência de base de qualquer uma das SEQ ID NOS. 7 a 12, porém, não é limitada às mesmas. Ademais, o polinucleotídeo pode incluir uma sequência de base que codifica a mesma sequência de aminoácidos devido à degeneração de código genético e um mutante da mesma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser modificado para que tenha um códon ideal dependendo do micro-organismo usado.

[026] Especificamente, o polinucleotídeo pode ser uma sequência de base que codifica uma sequência de aminoácidos que tem 70% ou mais, 80% ou mais ou 90% ou mais de homologia em relação à sequência de base acima e que tem uma atividade de aciltransferase substancialmente igual ou correspondente à da sequência de base acima. Ademais, o polinucleotídeo pode ser uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência de genes conhecida, por exemplo, pode ser uma sequência que codifica um polipeptídeo que tem uma atividade de aciltransferase por hibridização com uma sequência complementar a toda ou a parte da sequência de base sob condições rigorosas. No presente documento, as “condições rigorosas” se referem às condições em que um híbrido específico é formado e um híbrido não específico não é formado. Por exemplo, as condições rigorosas podem incluir uma condição em que os genes que têm alta homologia, por exemplo, genes que têm 80% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, ainda especificamente 97% ou mais ou, em particular, especificamente 99% ou mais homologia são hibridizados e os genes que têm homologia inferior não são hibridizados, e uma condição em que a limpeza é realizada uma vez, especificamente duas ou três vezes sob uma concentração de sal e temperatura correspondente a 60 °C, 1*SSC, 0,1% de SDS, especificamente 60 °C, 0,1*SSC, 0,1% de SDS e mais especificamente 68 °C, 0,1*SSC, 0,1% de SDS, que são condições de limpeza para hibridização convencional, (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)).

[027] A sonda usada na hibridização pode ser uma parte de uma sequência complementar da sequência de base. Essa sonda pode ser preparada por PCR com o uso de um fragmento de gene que inclui tal sequência de base como um modelo com o uso de um oligonucleotídeo preparado com base em uma sequência conhecida como um iniciador. Por exemplo, como a sonda, um fragmento de gene que tem um comprimento de cerca de 300 bp pode ser usado. Mais especificamente, quando um fragmento de gene que tem um comprimento de cerca de 300 bp é usado como a sonda, como condições de limpeza para hibridização, 50 °C, 2xSSC e 0,1% de SDS são exemplificados.

[028] Os genes, sequências de polipeptídeos codificadas pelos genes e as sequências de promotores, que são usados na presente revelação, podem ser obtidos a partir de bancos de dados conhecidos, por exemplo, GenBank de NCBI. Entretanto, a presente revelação não é limitada ao mesmo.

[029] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um vetor de expressão que inclui o polinucleotídeo.

[030] O vetor de expressão que inclui o polinucleotídeo de acordo com a presente revelação é um vetor de expressão capaz de expressar uma proteína-alvo em uma célula hospedeira adequada e se refere a um produto de polinucleotídeo que inclui um elemento de controle essencial operacionalmente ligado de modo a expressar um inserto de polinucleotídeo. As proteínas-alvo podem ser obtidas transformando-se ou transfectando-se o vetor de recombinação preparado na célula hospedeira.

[031] O vetor de expressão que inclui o polinucleotídeo de acordo com a presente revelação não é particularmente limitado, mas inclui plasmídeos derivados de Escherichia coli (pYG601BR322, pBR325, pUC118 e pUC119), plasmídeos derivados de Bacillus subtilis (pUB110 e pTP5), plasmídeos derivados de levedura (YEp13, YEp24 e YCp50) e Ti- plasmídeos que podem ser usados para transformação mediada por agrobactéria. Os exemplos específicos de DNA de fago incluem l- fagos (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, lambda gt10, lambda gt11 e lambda ZAP). Ademais, os vetores de vírus derivados a partir de vírus animais como retrovírus, adenovírus e vírus de vacina, vírus de inseto como baculovírus, vírus de planta de filamento duplo (por exemplo, CaMV), vírus de filamento único ou Geminivírus também podem ser usados.

[032] Ademais, como o vetor da presente revelação, um plasmídeo de fusão (por exemplo, pJG4-5), ao qual a proteína de ativação de expressão de ácido nucleico (por exemplo, B42) é ligada, pode ser usado. Ademais, para facilitar a purificação de uma proteína-alvo recuperada na presente revelação, o vetor de plasmídeo pode incluir adicionalmente outras sequências conforme for necessário. Tal plasmídeo de fusão pode incluir GST, GFP, His-etiqueta ou Myc-etiqueta como uma etiqueta, porém, o plasmídeo de fusão da presente revelação não é limitado aos exemplos acima.

[033] Ademais, na produção da proteína de fusão, um processo de cromatografia pode ser usado e, em particular, a proteína de fusão pode ser purificada por cromatografia de afinidade. Por exemplo, quando a glutationa-S-transferase é fundida, a glutationa, que é um substrato dessa enzima, pode ser usada. Quando a hexa-histidina é usada, uma proteína-alvo desejada pode ser facilmente recuperada om com o uso de uma coluna de resina conjugada por His, Ni-NTA (Novagen, EUA).

[034] Para inserir o polinucleotídeo da presente revelação como um vetor, um método para clivar DNA purificado com uma enzima de restrição adequada e inserir o DNA clivado em um sítio de restrição ou um sítio de clonagem de um DNA de vetor adequado pode ser usado.

[035] O polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da presente revelação pode ser operacionalmente ligado a um vetor. O vetor da presente revelação pode incluir adicionalmente um cis-elemento como um intensificador, um sinal de splicing, um sinal de adição de poli A, um marcador de seleção, e uma sequência de ligação de ribossomo (sequência de SD), além do promotor e ácido nucleico da presente revelação. Os exemplos do marcador de seleção podem incluir resistência a cloroanfenicol, resistência à ampicilina, di- hidrofolato redutase e resistência à neomicina, porém, componentes adicionais operacionalmente ligados pelos exemplos acima não são limitados. O termo “transformação” como usado no presente documento se refere a um fenômeno de introdução de DNA na célula hospedeira para permitir que o DNA sirva como um fator de um cromossomo ou seja replicado por conclusão de integração de cromossomo e introdução de DNA externo em uma célula para causar uma alteração genética artificial.

[036] Um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da presente revelação ou uma parte do vetor de expressão pode ser introduzida em uma célula hospedeira. No presente documento, uma parte do vetor de expressão se refere a uma porção do vetor de expressão, em que a porção inclui uma porção do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da presente revelação, de modo a conferir a atividade de aciltransferase na célula hospedeira. Por exemplo, T-DNA de Ti-plasmídeo transferido para a célula hospedeira na transformação mediada por agrobactéria pode ser exemplificado, porém, a presente revelação não é limitada nesse sentido.

[037] Qualquer método de transformação pode ser usado para o método de transformação da presente revelação, e pode ser facilmente executado de acordo com um método conhecido na técnica. Em geral, o método de transformação pode incluir um método de precipitação de CaCl2, um método de Hanahan no qual o sulfóxido de dimetila (DMSO) é usado como um material de redução no método de precipitação de CaCl2 para aumentar a eficácia, um método de eletroporação, um método de precipitação de CaPO4, um método de fusão de protoplasma, um método de agitação com o uso de fibra de carbeto de silício, um método de transformação mediada por agrobactéria, um método de transformação com o uso de PEG, um método de transformação mediado por sulfato de dextrano, um método de transformação mediado por lipofectamina e um método de transformação mediado por secagem/inibição. O método de transformação de um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da presente revelação não é limitado aos exemplos acima, e os métodos de transformação ou transfecção comumente usados na técnica podem ser usados sem limitação.

[038] O tipo de células hospedeiras usadas na preparação de um transformante na presente revelação não é particularmente limitado, desde que o polinucleotídeo da presente revelação seja expressado. Os exemplos específicos das células hospedeiras usados na presente revelação podem incluir bactérias do gênero Escherichia como E. coli; bactérias do gênero Bacillus como Bacillus subtilis; bactérias do gênero Pseudomonas como Pseudomonas putida; leveduras como Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe; células animais; células vegetais; e células de inseto. Os exemplos específicos de cepas de Escherichia coli que podem ser usadas na presente revelação podem incluir CL41(DE3), BL21 e HB101, e os exemplos específicos de cepas de Bacillus subtilis que podem ser usadas na presente revelação podem incluir WB700 e LKS87.

[039] O transformante no qual um vetor de expressão que inclui o polinucleotídeo da presente revelação é introduzido pode ser na forma de uma célula ou um organismo transformado.

[040] Como o promotor na presente revelação, qualquer promotor pode ser usado, desde que seja capaz de expressar o polinucleotídeo da presente revelação na célula hospedeira. Por exemplo, promotores derivados de fago ou Escherichia coli como promotor de trp, promotor de lac, promotor de PL e promotor de PR; promotores derivados de fago ou infectados por Escherichia coli como promotor de T7; CaMV35S, MAS ou promotor de histona; e promotor de cj7 (Publicação de Pedido de Patente no KR 10-2004-0107215) podem ser usados. Ademais, os promotores modificados artificialmente como promotor de tac também podem ser usados.

[041] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para preparar N-acetil-L-metionina, incluindo: acetilar L-metionina com o uso (i) do microorganismo da presente revelação ou uma cultura do mesmo; (ii) do polipeptídeo da presente revelação; ou uma combinação dos mesmos.

[042] Especificamente, o método inclui: preparar N- acetil-L-metionina, incluindo: acetilar L-metionina com o uso (i) do micro-organismo da presente revelação ou uma cultura do mesmo; (ii) do polipeptídeo da presente revelação; ou uma combinação dos mesmos; e recuperar a N-acetil-L-metionina, que é a L-metionina acetilada.

[043] Na presente revelação, a “cultura” se refere ao cultivo do micro-organismo sob condições ambientais adequadamente controladas.

[044] O processo de cultura da presente revelação pode ser realizado de acordo com um meio e condições de cultura adequados, os quais são conhecidos na técnica. Tal processo de cultura pode ser facilmente ajustado pelos versados na técnica dependendo da cepa a ser selecionada. No método acima, o processo de cultura do micro-organismo não é particularmente limitado, mas pode ser conduzido por um método de cultura de batelada, um método de cultura contínuo ou um método de cultura de batelada alimentada, que é conhecido na técnica. O meio usado para cultivar o micro-organismo da presente revelação e outras condições de cultura pode ser usado sem qualquer limitação particular desde que possa ser usado para cultivar micro-organismos gerais. Especificamente, o microorganismo da presente revelação pode ser cultivado em um meio geral incluindo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo, um composto inorgânico, aminoácido e/ou vitamina, ao passo que controla a temperatura, o pH e similares sob condições aeróbicas.

[045] Na presente revelação, os exemplos das fontes de carbono podem incluir, mas sem limitações, carboidratos como glicose, frutose, sacarose, maltose, manitol e sorbitol; álcoois como álcool sacarídeo, glicerol, ácido pirúvico, ácido lático e ácido cítrico; ácidos orgânicos; e aminoácidos como ácido glutâmico, metionina e lisina. Ademais, as fontes de nutriente naturais como hidrolisado de amido, melaços, melaços de tira preta, farelo de arroz, cassava, resíduos de cana-de- açúcar, e líquidos de imersão de milho podem ser usados. Especificamente, os carboidratos como glicose e melaços pré- tratados esterilizados (ou seja, melaços convertidos em açúcares de redução) podem ser usados, e quantidades adequadas de outras fontes de carbono podem ser usadas de modo variado, sem limitação. Essas fontes de carbono podem ser usadas sozinhas ou em uma combinação de duas ou mais.

[046] Os exemplos das fontes de nitrogênio podem incluir fontes de nitrogênio inorgânicas como amônia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, acetato de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio; e fontes de nitrogênio orgânicas, como aminoácidos, como ácido glutâmico, metionina e glutamina, peptona, NZ-amina, extratos de carne, extratos de levedura, extratos de malte, líquidos de imersão de milho, hidrolisados de caseína, peixe ou produtos de degradação do mesmo, e bolo de soja desengordurado ou produtos de degradação do mesmo. Essas fontes de nitrogênio podem ser usadas sozinhas ou em uma combinação de duas ou mais. Entretanto, a presente revelação não é limitada ao mesmo.

[047] Os exemplos das fontes de fósforo podem incluir fosfato de potássio, fosfito de potássio e sais contendo sódio dos mesmos. Os exemplos do composto inorgânico podem incluir cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de ferro, sulfato de magnésio, sulfato de ferro, sulfato de manganês e carbonato de cálcio, e podem incluir adicionalmente, mas sem limitações, aminoácidos, vitaminas e/ou precursores adequados. Esses meios ou precursores podem ser adicionados a uma cultura em uma forma de batelada ou contínua, mas sem limitações.

[048] Na presente revelação, o pH de uma cultura pode ser ajustado adicionando-se um composto como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico a uma cultura de uma maneira adequada durante a cultura de micro-organismos. Ademais, durante a cultura de micro-organismos, a formação de bolhas pode ser suprimida com o uso de um agente antiespumante como poliglicoléster alifático. Ademais, o oxigênio ou gás contendo oxigênio pode ser injetado em uma cultura para manter o estado aeróbico da cultura, ou gás dióxido de carbono, nitrogênio ou hidrogênio podem ser injetados na cultura para manter os estados anaeróbicos e não aeróbicos da cultura sem injetar o gás.

[049] A temperatura da cultura varia dependendo do micro-organismo da presente revelação. Especificamente, a temperatura do mesmo pode ser de 20°C a 50°C, mais especificamente, de 25°C a 40°C, porém, sem limitações. O período de cultura pode ser continuado até que a quantidade de um material útil desejado seja obtida. Especificamente, o período de cultura pode ser de 10 horas a 100 horas, mas sem limitações.

[050] Ademais, o termo “cultura”, como usado no presente documento, se refere a um produto obtido após a cultura do micro-organismo da presente revelação. A cultura inclui tanto uma forma contendo micro-organismos quanto uma forma na qual os micro-organismos são removidos por centrifugação ou similares em uma solução de cultura contendo os micro-organismos.

[051] Ademais, na presente revelação, a L-metionina pode ser produzida pelo micro-organismo da presente revelação ou pode ser adicionada ao meio.

[052] Ademais, na etapa de recuperação N-acetil-L- metionina na presente revelação, a N-acetil-L-metionina alvejada pode ser recuperada a partir da solução de cultura com o uso de um método adequado conhecido na técnica relacionada de acordo com o método de cultura do micro- organismo da presente revelação, por exemplo, um método de cultura de batelada, um método de cultura contínuo ou um método de cultura de batelada alimentada. Por exemplo, a centrifugação, filtração, cromatografia de troca de ânion, cristalização, HPLC e similares podem ser usadas e uma combinação de métodos adequados conhecidos na técnica podem ser usados.

[053] A etapa de recuperação pode incluir uma etapa de separação e/ou uma etapa de purificação.

[054] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece uma composição para preparar a N-acetil-L-metionina a partir da L-metionina, em que a composição inclui, como um ingrediente ativo: (i) o micro-organismo da revelação ou uma cultura do mesmo; (ii) o polipeptídeo da presente revelação; ou uma combinação do mesmo. O micro-organismo, a cultura, o polipeptídeo e a N-acetil-L-metionina são conforme descrito acima.

MODO PARA A INVENÇÃO

[055] Doravante, a presente revelação será descrita em maiores detalhes com referência aos exemplos. Entretanto, esses exemplos são apenas ilustrativos da presente revelação, e o escopo da presente revelação não é limitado a esses exemplos.

EXEMPLO 1: SELEÇÃO DE ENZIMA INOVADORA PARA PRODUZIR N- ACETILMETIONINA EXEMPLO 1-1. SELEÇÃO DE MICRO-ORGANISMO PARA PRODUZIR N- ACETIL-L-METIONINA

[056] Como micro-organismos que têm uma habilidade para produzir N-acetil-L-metionina, os pontos de N- acetilmetionina, que são produtos, foram confirmados a partir de seis tipos de soluções de cultura de micro-organismo aleatoriamente selecionadas (Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Enterobacter sp. 638, Pseudovibrio sp. FO-BEG1, Yarrowia lipolytica PO1f (ATCC MYA-2613TM) e Corynebacterium glutamicum ATCC 13032).

[057] Especificamente, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Enterobacter sp. 638 ou Yarrowia lipolytica PO1f foi inoculada em um tubo de cultura descartável de 14 ml contendo 3 ml de um meio de YPD líquido (1% de extrato de levedura, 2% de bactopeptona, 2% de glicose) e foi cultivada em agitação por 24 horas sob condições de 30 °C e 200 para obter uma solução de cultura de semente. 1 ml da solução de cultura de semente foi inoculado em um frasco de defletor de aresta de 250 ml preenchido com 24 ml do meio de YPD líquido contendo 0,5% (5 g/l) de metionina, e foi cultivado em agitação por 24 horas sob condições de 30 °C e 200 rpm.

[058] Ademais, a Pseudovibrio sp. FO-BEG1 foi inoculada em um tubo de cultura descartável de 14 ml contendo 3 ml de um meio de caldo Marinho de BACTO líquido (Difco 2216) e foi cultivada em agitação por 24 horas sob condições de 28 °C e 200 rpm para obter uma solução de cultura de semente. 1 ml da solução de cultura de semente foi inoculado em um frasco de defletor de aresta de 250 ml preenchido com 24 ml do meio de caldo Marinho de BACTO líquido (Difco 2216) contendo 0,5% (5 g/l) de metionina, e foi cultivado em agitação por 24 horas sob condições de 28 °C e 200 rpm.

[059] Ademais, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 foi inoculada em um tubo de cultura descartável de 14 ml contendo 3 ml de um meio líquido compósito dedicado (ingredientes mostrados abaixo), e foi cultivada em agitação por 24 horas sob condições de 30 °C e 200 rpm para obter uma solução de cultura de semente. 1 ml da solução de cultura de semente foi inoculado em um frasco de defletor de aresta de 250 ml preenchido com 24 ml do meio de meio líquido compósito dedicado contendo 0,5% (5 g/l) de metionina, e foi cultivado em agitação por 24 horas sob condições de 37 °C e 200 rpm.

[060] 20 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO47H2O, 100 μg de biotina, 1.000 μg de HCl de tiamina, 2.000 μg de pantotenato de cálcio, 2.000 μg de nicotinamida e 25 mg de canamicina (com base em 1 l de água destilada)

[061] Após a conclusão da cultura, a solução de cultura foi deixada em um forno a 50 °C de um dia para o outro para ser concentrada, e 1 μl da solução de cultura concentrada foi analisado com o uso de cromatografia de camada fina. 10 mM de um reagente de N-acetil-L-metionina (Sigma Aldrich 01310) foram usados como um grupo-controle. O mesmo ponto que o grupo-controle foi confirmado a partir do concentrado de líquido de cultura dos seis tipos de micro-organismos acima.

[062] A partir dos resultados acima, foi previsto que cada um dentre os seis tipos de micro-organismos que têm uma habilidade para produzir N-acetil-L-metionina contém uma aciltransferase incluindo L-metionina como um substrato.

EXEMPLO 1-2. CONFIRMAÇÃO DE SEQUÊNCIA DE ACILTRANSFERASE INOVADORA

[063] A metionina aciltransferase foi selecionada a partir dos seis tipos de micro-organismos selecionados no Exemplo 1-1.

[064] As buscas de homologia heterogênea por proteínas selecionadas foram realizadas restringindo-se o banco de dados às espécies de micro-organismo com base em uma sequência de aminoácidos com YncA conhecida como uma metionina aciltransferase convencional. Como resultado, constatou-se que todos os seis tipos de enzimas buscadas têm baixa homologia com a sequência de aminoácidos de YncA, e a homologia da sequência de aciltransferase derivada de Enterobacter sp. 638, que tinha a homologia mais alta, foi de 82%. As homologias das respectivas leveduras com YncA são fornecidas na Tabela 1.

[065] A partir dos resultados acima, é inferido que os tipos acima de polipeptídeos são polipeptídeos que têm atividade de aciltransferase inovadora inferior à homologia de uma aciltransferase convencional, e os micro-organismos incluindo esses polipeptídeos também são micro-organismos que têm a atividade de aciltransferase inovadora, o que não se sabia anteriormente. [TABELA 1]

EXEMPLO 2: PRODUÇÃO DE N-ACETILMETIONINA ATRAVÉS DE CONVERSÃO DE ENZIMA IN VITRO COM O USO DE ACILTRANSFERASE INOVADORA EXEMPLO 2-1. PREPARAÇÃO DE ESCHERICHIA COLI INTRODUZIDA POR ACILTRANSFERASE INOVADORA

[066] Os genes de aciltransferase inovadora derivados de Pseudomonas, derivados de Bacillus, derivados de Enterobacter e derivados de Pseudovibrio (SEQ ID NOS. 7, 8, 9 e 10) foram sintetizados como códons otimizados para Escherichia coli com base em sequências de aminoácidos (SEQ ID NOS. 1, 2, 3 e 4) das respectivas enzimas.

[067] Para obter um gene de aciltransferase inovadora derivado de Yarrowia, gDNA de Yarrowia lipolytica PO1f (ATCC MYA-2613TM) foi extraído. Um gene (SEQ ID NO. 11) de um tamanho desejado e uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO. 5) de um tamanho desejado foram obtidos realizando-se uma reação em cadeia da polimerase com o uso dos iniciadores 1 e 2 com o gDNA como um modelo.

[068] Para obter um gene de aciltransferase inovadora derivado de Corynebacterium, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 foi esfregado em um meio sólido com faixas e, então, cultivado de um dia para o outro para se obter colônias. Um gene (SEQ ID NO. 12) que tem um tamanho de cerca de 0,5 kb e uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO. 6) que tem um tamanho de cerca de 0,5 kb foram obtidos realizando-se PCR (reação em cadeia da polimerase) com o uso dos iniciadores 3 e 4 com a uma colônia como um modelo. Nesse caso, a PCR foi realizada conduzindo-se a desnaturação a 94 °C por 5 minutos, repetindose a desnaturação a 94 °C por 30 segundos, o recozimento a 56 °C por 30 segundos e a polimerização a 72 °C por 1 minuto 30 vezes e, então, conduzindo-se uma reação de polimerização a 72 °C por 7 minutos.

[069] Os seis tipos de DNAs foram tratados com enzimas de restrição NdeI e XbaI e, então, ligados a um vetor de pUCtk tratado com as mesmas enzimas de restrição. O plasmídeo recombinante preparado foi transformado aplicando-se choque térmico a DH5α de Escherichia coli a 42 °C por 90 segundos e, então, foram esfregadas em um meio sólido de LB contendo canamicina e cultivadas de um dia para o outro a 37 °C. Uma colônia obtida na cultura foi inoculada em 3 ml de um meio líquido de LB contendo canamicina e cultivada de um dia para o outro e, então, o plasmídeo recombinante foi recuperado com o uso de um kit de minipreparo de plasmídeo (Bioneer, Coreia). As informações de sequência do plasmídeo recombinante recuperado foram confirmadas através de sequenciamento (Macrogen, Coreia), e os plasmídeos foram denominados pUCtk- ppmat, pUCtk-bsmat, pUCtk-entmat, pUCtk-pvmat, pUCtk-ylmat e pUCtk-cgmat.

[070] As colônias sobreviventes após a introdução do plasmídeo recombinante em BL21 de Escherichia coli (DE3) com o uso de choque térmico e esfregação das mesmas em um meio sólido de LB contendo canamicina foram selecionadas como transformantes. Os transformantes selecionados foram denominados BL21(DE3)/pUCtk-ppmat (ou E. coli CC03-9001), BL21(DE3)/pUCtk-bsmat (ou E. coli CC03-9002), BL21(DE3)/pUCtk- entmat (ou E. coli CC03-9003), BL21(DE3)/pUCtk-pvmat (ou E. coli CC03-9004) e BL21(DE3)/pUCtk-ylmat (ou E. coli CC039005), BL21(DE3)/pUCtk-cgmat (ou E. coli CC03-9006). Ademais, os transformantes foram depositados no Centro de Cultura de Coreia de Micro-organismos (KCCM) em 15 de julho de 2016 sob o Tratado de Budapeste, e receberam os números de depósito KCCM11863P, KCCM11864P, KCCM11865P, KCCM11866P, KCCM11867P e KCCM11868P, respectivamente, de acordo com a ordem descrita acima.

[071] Para examinar a capacidade de produção de N- acetilmetionina da Escherichia coli transformada selecionada, uma colônia foi inoculada em 3 ml de um meio líquido de LB contendo 25 mg/l de canamicina e 0,2% (p/v) de glicose, cultivada em 37 °C por 5 horas e, então, adicionalmente cultivada por 3 horas com a adição de metionina até 2% (p/v), de modo a obter 1 μl de uma solução de cultura. A produção de N-acetilmetionina foi examinada anteriormente por análise de cromatografia de camada fina (TLC) com o uso de 1 μl da solução de cultura. Pontos que se presumem ser N- acetilmetionina foram encontrados em toda a solução de cultura, a concentração dos pontos aumentou na ordem de BL21(DE3)/pUCtk-ppmat, BL21(DE3)/pUCtk-entmat, BL21(DE3)/pUCtk-bsmat, BL21(DE3)/pUCtk-cgmat, BL21(DE3)/pUCtk- pvmat e BL21(DE3)/pUCtk-ylmat. [TABELA 2]

EXEMPLO 2-2. CONFIRMAÇÃO DE CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE N- ACETILMETIONINA COM O USO DE ACILTRANSFERASE INOVADORA

[072] Uma colônia da Escherichia coli transformada preparada no Exemplo 2-1 foi inoculada em 3 ml de um meio líquido de LB contendo 25 mg/l de canamicina e 0,2% (p/v) de glicose e cultivada a 37 °C por 8 horas e, então, inoculada em 50 ml do mesmo meio e cultivada de um dia para o outro, de modo a obter uma solução de cultura. A solução de cultura foi centrifugada para obter péletes, em que os péletes foram suspensos em 5 ml de um tampão de fosfato a 50 mM (pH 7,0) e, então, as células foram perturbadas com o uso de sonicação para obter detritos celulares. Os restos de células foram removidos por centrifugação a 14.000 rpm por 30 minutos para obter um sobrenadante. Considerando-se que o tamanho da aciltransferase inovadora é de cerca de 19 kDa, o filtrado foi passado através de uma membrana de corte de 30 kDa, Amicon Ultra (Milipore, Irlanda) e, então, através de uma membrana de corte de 10 kDa para obter um concentrado que permanece no filtro. O concentrado preencheu uma coluna HiTrap Q FF (GE, EUA) preenchida com Q sefarose, a aciltransferase inovadora foi puramente separada com o uso de gradientes de concentração de NaCl (80, 100, 150, 200, 300, 500 mM, nessa ordem). A enzima diluída foi reconcentrada através de uma membrana de corte de 10 kDa, Amicon Ultra. O grau de superexpressão e purificação da aciltransferase inovadora foi confirmado por SDS-PAGE.

[073] Para analisar a atividade da aciltransferase inovadora purificada, a quantidade da N-acetilmetionina produzida após a introdução de um concentrado de enzima em um tampão de fosfato de pH 7,0 contendo 20 mM de acetilcoenzima A e 20 mM de metionina e realização de uma reação a 37 °C por 10 minutos foi medida com o uso de HPLC (Shimadzu, controlador de sistema CBM-20A e outros acessórios). Ademais, a concentração da aciltransferase inovadora purificada foi medida por um ensaio de Bradford e, então, o valor de N-acetilmetionina produzida foi dividido pela concentração de enzima para comparar a atividade específica da enzima (Tabela 3).

[074] Dentre as aciltransferases inovadoras purificadas, a enzima derivada de Pseudomonas putida exibe a atividade mais alta de 3,8 U/mg, que é 5 vezes a atividade específica (0,745 U/mg) de YncA revelada no documento (documento no U.S. 8143031 B2, Tabela 3). Adicionalmente, a enzima derivada de Bacillus subtilis e a enzima derivada de Enterobacter sp. 638 exibem atividades de 1,6 U/mg e 1,7 U/mg, respectivamente, cada uma das quais tem 2 ou mais vezes a atividade específica de YncA. Cada uma dentre as aciltransferases inovadoras derivadas de Pseudovibrio sp. FO- BEG1, derivadas de Yarrowia lipolytica e derivadas de Corynebacterium glutamicum tem baixa atividade específica de menor do que 1 U/mg, porém, a quantidade de expressão das mesmas em SDS-PAGE não é tão pequena. Portanto, pode-se esperar que a capacidade de produção de N-acetilmetionina do transformante seja aprimorada dependendo do grau de expressão no hospedeiro (Tabela 3). [TABELA 3]

EXEMPLO 3: REAÇÃO DE CONVERSÃO DE N-ACETILMETIONINA COM O USO DE ACILTRANSFERASE INOVADORA DERIVADA DE PSEUDOMONAS PUTIDA EXEMPLO 3-1. REAÇÃO DE CONVERSÃO DE N-ACETILMETIONINA COM O USO DE ACILTRANSFERASE INOVADORA DERIVADA PURIFICADA DERIVADA DE PSEUDOMONAS PUTIDA

[075] Uma reação de conversão de metionina foi realizada com o uso de 1 mg da aciltransferase purificada derivada de Pseudomonas putida, que tinha a atividade mais alta no Exemplo 2. 3 ml de um tampão de fosfato a 50 mM de pH 7,0 contendo 20 mM de metionina e 20 mM de acetilcoenzima A foram usados como uma solução de substrato. Quando a solução de reação foi analisada por HPLC (SHIMADZU, CONTROLADOR DE SISTEMA CBM-20A e outros acessórios) após a reação por 3 horas sob condições de 37 °C e 150 rpm, a produção de 3,1 g/l de N- acetilmetionina foi confirmada. Esse é um valor obtido convertendo-se metionina e acetilcoenzima A na solução de reação por 75% ou mais.

EXEMPLO 3-2. REAÇÃO DE CONVERSÃO DE N-ACETILMETIONINA DE CÉLULA FORNECIDA AÍ COM ACILTRANSFERASE DERIVADA DE PSEUDOMONAS PUTIDA DEPENDENDO DO AUMENTO DE PERMEABILIDADE DE MEMBRANA CELULAR

[076] Uma colônia da Escherichia coli transformada BL21(DE3)/pUCtk-ppmat produzida pela introdução do gene de aciltransferase inovadora derivado de Pseudomonas putida preparado no Exemplo 2 foi inoculada em 3 ml de um meio líquido de LB contendo 25 mg/l de canamicina e 1% (p/v) de glicose e cultivada a 37 °C por 8 horas para obter uma solução de cultura e, então, 50 μl da solução de cultura foi inoculada em 50 ml de um meio líquido de LB contendo 25 mg/l de canamicina e 0,2% (p/v) de glicose e cultivada de um dia para o outro. A solução de cultura foi centrifugada para obter péletes celulares, em que o péletes celulares foram congelados em um refrigerador a -20 °C. Os processos de refusão dos péletes celulares totalmente congelados à temperatura ambiente e recongelamento desses péletes celulares foram repetidos três vezes para conferir alta permeabilidade à membrana celular. A solução de cultura foi ressuspensa a um volume total de 5 ml adicionando-se um tampão de fosfato a 50 mM (pH 7,0) para concentrar a solução de cultura. 1,8 ml de um tampão de fosfato a 50 mM (pH 7,0) contendo 2% (p/v) de metionina; 1,8 ml de um tampão de fosfato a 50 mM (pH 7,0) contendo 2% (p/v) de metionina e 20 mM de acetilcoenzima A; e 1,8 ml de um tampão de fosfato a 50 mM (pH 7,0) contendo 2% (p/v) de metionina e 2% (p/v) de glicose foram respectivamente colocados em 15 ml tubos de teste e foram, cada um, misturados com as bactérias de enzima que têm a permeabilidade de membrana celular aprimorada obtida através dos procedimentos acima através de 200 μl a um volume total de 2 ml e, então, foram reagidos por 10 horas sob condições de 37 °C e 150 rpm. O propósito de adicionar glicose à solução de reação é aumentar a quantidade de produção de acetilcoenzima A, que pode ser deficiente na reação, e não é destinada à sobrevivência de Escherichia coli. A solução de reação foi analisada por HPLC (SHIMADZU, CONTROLADOR DE SISTEMA CBM-20A e outros acessórios), e os resultados da mesma são fornecidos na Tabela 4. Como fornecido na Tabela 4, constatou-se que, quando a acetilcoenzima A foi adicionada no momento da fermentação, a taxa de conversão molar da solução de reação foi aumentada em comparação com quando a acetilcoenzima A não foi adicionada. Ademais, visto que foi constatado que a taxa de conversão molar da solução de reação foi aumentada mesmo quando a sacarose foi adicionada em vez da acetilcoenzima A, foi estimado que a adição de glicose produz uma porção da acetilcoenzima A. Como resultado do uso de cepas, sendo que cada uma tem uma membrana celular de alta permeabilidade, a N- acetilmetionina pôde ser produzida em alta concentração, e também pôde ser produzido em alta concentração mesmo quando apenas a glicose foi adicionada ao meio, em vez da acetilcoenzima A. [TABELA 4]

EXEMPLO 4: PRODUÇÃO DE N-ACETIL-L-METIONINA ATRAVÉS DE FERMENTAÇÃO DE TRANSFORMANTE FORNECIDO NA MESMA COM ACILTRANSFERASE INOVADORA EXEMPLO 4-1. PRODUÇÃO DE N-ACETIL-L-METIONINA ATRAVÉS DE ESCHERICHIA COLI FORNECIDA NA MESMA COM ACILTRANSFERASE INOVADORA

[077] Uma das colônias dos seis tipos de transformantes preparados no Exemplo 2 foi inoculada em 3 ml de um meio líquido de LB contendo 25 mg/l de canamicina e 1% (p/v) de glicose e cultivada a 37 °C por 8 horas para obter uma solução de cultura e, então, a solução de cultura foi inoculada em 50 ml de um meio líquido de LB contendo 25 mg/l de canamicina, 0,2% (p/v) de glicose e 2% (p/v) de metionina e cultivada de um dia para o outro. Nesse caso, como um grupo- controle, um vetor vazio de pUCtk foi transformado em BL21 (DE3) e usado. Após as células na solução de cultura serem removidas por centrifugação, a N-acetilmetionina produzida foi analisada com HPLC (SHIMADZU, CONTROLADOR DE SISTEMA CBM-20A e outros acessórios). No caso de BL21(DE3)/pUCtk-ppmat, a N- acetilmetionina foi produzida na concentração mais alta de 3,03 g/l. No caso de BL21(DE3)/pUCtk-entmat, a N- acetilmetionina foi produzida na segunda concentração mais alta de 2,23 g/l. Mesmo no caso do vetor vazio, uma quantidade vestigial de N-acetilmetionina foi detectada, o que se presume que seja um papel da enzima de YncA possuída por Escherichia coli (Tabela 5). [TABELA 5]

EXEMPLO 4-2. PRODUÇÃO DE N-ACETIL-L-METIONINA ATRAVÉS DE CORYNEBACTERIUM FORNECIDA NA MESMA COM ACILTRANSFERASE INOVADORA EXEMPLO 4-2-1: PREPARAÇÃO DE VETOR DE SUPEREXPRESSÃO DE ACILTRANSFERASE PARA INTRODUZIR MICRO-ORGANISMO DE GÊNERO CORYNEBACTERIUM

[078] Para examinar o efeito de produção de N-acetil- L-metionina das aciltransferases inovadoras (SEQ ID NOS. 1, 2, 3, 4, 5 e 6) confirmado a partir do Exemplo 1 em microorganismos do gênero Corynebacterium, os vetores para superexpressar os genes correspondentes foram preparados. Um iniciador no qual um sítio de enzima de restrição de EcoRV é inserido na extremidade 5‘ e um iniciador no qual um sítio de PstI é inserido na extremidade 3‘ foram sintetizados com base nas sequências de bases 7, 8, 9, 10, 11 e 12.

[079] O gene baseado na sequência de base 7 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk-ppmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 5 e 6. O gene baseado na sequência de base 8 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk-bsmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 7 e 8. O gene baseado na sequência de base 9 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk-entmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 9 e 10. O gene baseado na sequência de base 10 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk-pvmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 11 e 12. O gene baseado na sequência de base 11 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk- ylmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 13 e 14. O gene baseado na sequência de base 12 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk-cgmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 15 e 16.

[080] Como o promotor da aciltransferase, um promotor cj7 (Publicação de Pedido de Patente não Examinada no KR 102004-0107215) foi usado. Para obter o fragmento de DNA do promotor de cj7, um iniciador no qual uma enzima de restrição de KpnI é inserida na extremidade 5 ‘ e um iniciador no qual um sítio de EcoRV é inserido na extremidade 3 ‘ foram sintetizados, e o promotor de cj7 foi ampliado através de PCR com o uso de p117-cj1-gfp como um modelo (Publicação de Pedido de Patente no KR 10-2004-0107215). Nesse caso, a PCR foi realizada conduzindo-se a desnaturação a 94 °C por 5 minutos, repetindo-se a desnaturação a 94 °C por 30 segundos, o recozimento a 56 °C por 30 segundos e a polimerização a 72 °C por 1 minuto 30 vezes e, então, conduzindo-se uma reação de polimerização a 72 °C por 7 minutos.

[081] Os seis tipos de polinucleotídeos de aciltransferase ampliados foram tratados com enzima de restrição PstI para obter fragmentos de DNA, e o polinucleotídeo de promotor de cj7 foi tratado com KpnI e EcoRV para obter um fragmento de DNA. Após seis fragmentos de DNA serem obtidos, os mesmos foram ligados aos sítios de Kpnl e Pstl do vetor de pECCG117, que é um vetor de transporte de Escherichia e Corynebacterium, para serem transformados em DH5α de Escherichia coli, e foram esfregados em um meio sólido de LB contendo canamicina (25 mg/l). As colônias transformadas com o vetor nas quais o gene foi inserido foram selecionadas por PCR e, então, os plasmídeos foram obtidos com o uso de um método de extração de plasmídeo geralmente conhecido. Os plasmídeos obtidos foram denominados pECCG117-Pcj7-ppmat, pECCG117-Pcj7-bsmat, pECCG117-Pcj7-entmat, pECCG117-Pcj7- pvmat, pECCG117-Pcj7-ylmat e pECCG117-Pcj7-cgmat.

EXEMPLO 4-2-2: PREPARAÇÃO DE CEPA PARA INTRODUÇÃO DE VETOR DE SUPEREXPRESSÃO DE ACILTRANSFERASE INOVADORA E CONFIRMAÇÃO DE CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE N-ACETIL-L-METIONINA

[082] Cada um dentre os vetores pECCG117-Pcj7-ppmat, pECCG117-Pcj7-bsmat, pECCG117-Pcj7-entmat, pECCG117-Pcj7- pvmat, pECCG117-Pcj7-ylmat e pECCG117-Pcj7-cgmat, preparados no Exemplo 4-2-1, e o vetor pECCG117 do grupo-controle experimental foi introduzido em Corynebacterium glutamicum ATCC13032 com o uso de um método de pulso elétrico, esfregado em um meio de placa de compósito contendo canamicina (25 mg/l) e, então, cultivado a 30°C por 24 horas para obter cepas. As cepas obtidas foram denominadas 13032/pECCG117-Pcj7-ppmat, 13032/pECCG117-Pcj7-bsmat, 13032/pECCG117-Pcj7-entmat, 13032/pECCG117-Pcj7-pvmat, 13032/pECCG117-Pcj7-ylmat, 13032/pECCG117-Pcj7-cgmat e 13032/pECCG117. Para confirmar a capacidade de produção de N-acetilmetionina do transformante, as cepas foram inoculadas em 14 ml de um tubo de cultura descartável incluindo 3 ml de um meio líquido de compósito contendo canamicina (25 mg/l) e cultivado em agitação por 24 horas sob condições de 30 °C e 200 rpm para obter uma solução de cultura de semente. 1 ml da solução de cultura de semente foi inoculado em um frasco de defletor de aresta de 250 ml incluindo 24 ml de um meio líquido de compósito contendo canamicina (25 mg/l) e metionina (2% (20 g/l)), e cultivado em agitação por 24 horas sob condições de 37 °C e 200 rpm. Após concluir a cultura, a concentração de N-acetilmetionina foi analisada com o uso de HPLC (SHIMADZU, CONTROLADOR DE SISTEMA CBM-20A e outros acessórios) (Tabela 6).

[083] No caso do transformante 13032/pECCG117 preparado como um grupo-controle, 1,07 g/l de N- acetilmetionina foi produzido. Presume-se que esse resultado seja causado pela habilidade de a aciltransferase possuída por Corynebacterium glutamicum, que é uma cepa parental. Ademais, pode ser averiguado que uma quantidade maior de N- acetilmetionina é produzida em comparação com a habilidade original como o resultado de superexpressão dos seis tipos de aciltransferases inovadoras.

[084] 20 g de glicose, 50 g de (NH4)2SO4, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g ureia, 5 g de KH2PO4, 10 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO47H2O, 100 μg de biotina, 1.000 μg de HCl de tiamina, 2.000 μg de pantotenato de cálcio, 2.000 μg de nicotinamida, 20 g de ágar e 25 mg de canamicina (com base em 1 l de água destilada)

[085] 20 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO47H2O, 100 μg de biotina, 1.000 μg de HCl de tiamina, 2.000 μg de pantotenato de cálcio, 2.000 μg de nicotinamida e 25 mg de canamicina (com base em 1 l de água destilada) [TABELA 6]

EXEMPLO 4-3. PRODUÇÃO DE N-ACETIL-L-METIONINA ATRAVÉS DE SACCHAROMYCES FORNECIDA NA MESMA COM ACILTRANSFERASE INOVADORA EXEMPLO 4-3-1: PREPARAÇÃO DE VETOR DE SUPEREXPRESSÃO DE ACILTRANSFERASE PARA SACCHAROMYCES

[086] Para examinar o efeito de produção de N-acetil- L-metionina das aciltransferases inovadoras (SEQ ID NOS. 1, 2, 3, 4, 5 e 6) confirmado a partir do Exemplo 1 em Saccharomyces, os vetores para superexpressar os genes correspondentes foram preparados. Um iniciador no qual um sítio de enzima de restrição de SpeI é inserido na extremidade 5‘ e um iniciador no qual um sítio de XhoI é inserido na extremidade 3‘ foram sintetizados com base nas sequências de bases 7, 8, 9, 10, 11 e 12.

[087] O gene baseado na sequência de base 7 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk-ppmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 17 e 18. O gene baseado na sequência de base 8 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk-bsmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 19 e 20. O gene baseado na sequência de base 9 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk-entmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 21 e 22. O gene baseado na sequência de base 10 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk-pvmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 23 e 24. O gene baseado na sequência de base 11 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk-ylmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 25 e 26. O gene baseado na sequência de base 12 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk- cgmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 27 e 28. Nesse caso, a PCR foi realizada conduzindo-se a desnaturação a 94 °C por 5 minutos, repetindo-se a desnaturação a 94 °C por 30 segundos, o recozimento a 56 °C por 30 segundos e a polimerização a 72 °C por 1 minuto 30 vezes e, então, conduzindo-se uma reação de polimerização a 72 °C por 7 minutos.

[088] Os seis tipos de polinucleotídeos de aciltransferase ampliados foram tratados com enzimas de restrição SpeI e XhoI para obter fragmentos de DNA. Após seis fragmentos de DNA serem obtidos, os mesmos são ligados aos sítios de SpeI e XhoI do vetor p414ADH, que é um vetor de transporte de Escherichia e Saccharomyces, para serem transformados em DH5α de Escherichia coli, e foram esfregados em um meio sólido de LB contendo ampicilina (100 mg/l). As colônias transformadas com o vetor no qual o gene foi inserido foram selecionadas por PCR e, então, os plasmídeos foram obtidos com o uso de um kit de minipreparo de plasmídeo (Bioneer, Coreia). Os plasmídeos obtidos foram denominados p414ADH-ppmat, p414ADH-bsmat, p414ADH-entmat, p414ADH-pvmat, p414ADH-ylmat e p414ADH-cgmat.

EXEMPLO 4-3-2: PREPARAÇÃO DE CEPA PARA INTRODUÇÃO DE VETOR DE SUPEREXPRESSÃO DE ACILTRANSFERASE INOVADORA E CONFIRMAÇÃO DE CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE N-ACETIL-L-METIONINA

[089] Cada um dentre os vetores p414ADH-ppmat, p414ADH-bsmat, p414ADH-entmat, p414ADH-pvmat, p414ADH-ylmat e p414ADH-cgmat, preparados no Exemplo 4-3-1, e o vetor pECCG117 do grupo-controle experimental foi introduzido em Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D (Registro de Patente no KR 10-1577134), que é uma levedura selvagem típica recebida a partir de EUROSCARF, com o uso de um método de transformação de levedura. Os vetores foram introduzidos em Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D e, então, esfregados em um meio de placa de YPD (1% de extrato de levedura, 2% de bactopeptona, 2% de glicose) e cultivados a 30 °C por 24 horas para obter as cepas. As cepas obtidas foram denominadas ScCEN/p414ADH-ppmat, ScCEN/p414ADH-bsmat, ScCEN/p414ADH-entmat, ScCEN/p414ADH- pvmat, ScCEN/p414ADH-ylmat, ScCEN/p414ADH-cgmat e ScCEN/p414ADH. Para confirmar a capacidade de produção de N- acetilmetionina do transformante, as cepas foram inoculadas em 14 ml de um tubo de cultura descartável incluindo 3 ml de um meio líquido de YPD contendo ampicilina (100 mg/l) e cultivadas em agitação por 24 horas sob condições de 30 °C e 200 rpm para obter uma solução de cultura de semente. 1 ml da solução de cultura de semente foi inoculado em um frasco de defletor de aresta de 250 ml incluindo 24 ml de um meio líquido de YPD contendo metionina (0,5% (5 g/l)) e cultivado em agitação por 24 horas sob condições de 30 °C e 200 rpm. Após a conclusão da cultura, a concentração de N-acetil-L-metionina foi analisada com o uso de HPLC (SHIMADZU, CONTROLADOR DE SISTEMA CBM-20A e outros acessórios) (Tabela 7).

[090] No caso do transformante 13032/pECCG117 preparado como um grupo-controle, 1,07 g/l de N- acetilmetionina foi produzido. Presume-se que esse resultado seja causado pela habilidade de a aciltransferase possuída por Corynebacterium glutamicum, que é uma cepa parental. Ademais, pode ser averiguado que uma quantidade maior de N- acetilmetionina é produzida em comparação com a habilidade original como o resultado de superexpressão dos seis tipos de aciltransferases inovadoras.

[091] Como pode ser visto a partir do transformante ScCEN / p414ADH, presume-se que a própria Saccharomyces cerevisiae não produza N-acetilmetionina, mas foi averiguado que as cepas nas quais seis tipos de aciltransferases inovadoras são superexpressadas têm capacidade de produção de N-acetilmetionina. [TABELA 7]

EXEMPLO 4-4. PRODUÇÃO DE N-ACETIL-L-METIONINA ATRAVÉS DE YARROWIA FORNECIDA NA MESMA COM ACILTRANSFERASE INOVADORA EXEMPLO 4-4-1: PREPARAÇÃO DE VETOR DE SUPEREXPRESSÃO DE ACILTRANSFERASE PARA YARROWIA

[092] Para examinar o efeito de produção de N-acetil- L-metionina das aciltransferases inovadoras (SEQ ID NOS. 1, 2, 3, 4, 5 e 6) confirmado a partir do Exemplo 1 em Yarrowia, os vetores para superexpressar os genes correspondentes foram preparados. Um iniciador no qual um sítio de enzima de restrição de KpnI é inserido na extremidade 5 ‘ e um iniciador no qual um sítio de enzima de restrição de KpnI é inserido na extremidade 3‘ foram sintetizados com base em sequências de bases 7, 8, 9, 10, 11 e 12.

[093] O gene baseado na sequência de base 7 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk-ppmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 29 e 30. O gene baseado na sequência de base 8 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk-bsmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 31 e 32. O gene baseado na sequência de base 9 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk-entmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 33 e 34. O gene baseado na sequência de base 10 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk-pvmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 35 e 36. O gene baseado na sequência de base 11 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk-ylmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 37 e 38. O gene baseado na sequência de base 12 foi polimerizado através de PCR com o uso do vetor de pUCtk- cgmat do Exemplo 1 como um modelo e com o uso dos iniciadores 39 e 40. Nesse caso, a PCR foi realizada conduzindo-se a desnaturação a 94°C por 5 minutos, repetindo-se a desnaturação a 94 °C por 30 segundos, o recozimento a 56 °C por 30 segundos e a polimerização a 72 °C por 1 minuto 30 vezes e, então, conduzindo-se uma reação de polimerização a 72 °C por 7 minutos.

[094] Os seis tipos de polinucleotídeos de aciltransferase ampliados foram tratados com enzima de restrição KpnI para obter fragmentos de DNA. Após seis fragmentos de DNA serem obtidos, os mesmos são ligados ao sítio de KpnI de um vetor de transporte pIMR53_AUX (FEMS Microbiology LettersVolume 199, Artigo 1, páginas 97 a 102, maio de 2001) de Escherichia e Yarrowia, para serem transformados em DH5α de Escherichia coli, e foram esfregados em um meio sólido de LB contendo ampicilina (100 mg/l). As colônias transformadas com o vetor no qual o gene foi inserido foram selecionadas por PCR e, então, os plasmídeos foram obtidos com o uso de um kit de minipreparo de plasmídeo (Bioneer, Coreia). Os plasmídeos obtidos foram denominados pIMR53U-ppmat, pIMR53U-bsmat, pIMR53U-entmat, pIMR53U-pvmat, pIMR53U-ylmat e pIMR53U-cgmat.

EXEMPLO 4-4-2: PREPARAÇÃO DE CEPA PARA INTRODUÇÃO DE VETOR DE SUPEREXPRESSÃO DE ACILTRANSFERASE E CONFIRMAÇÃO DE CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE N-ACETIL-L-METIONINA

[095] Cada um dos vetores pIMR53U-ppmat, pIMR53U- bsmat, pIMR53U-entmat, pIMR53U-pvmat, pIMR53U-ylmat e pIMR53U- cgmat, e o vetor pIMR53_AUX do grupo-controle experimental foi introduzido em Yarrowia lipolytica PO1f (ATCC MYA-2613TM) adquirido junto à American type Culture Collection (Coleção de Culturas tipo Americana) com o uso de um método de transformação de levedura. Os vetores foram introduzidos em Yarrowia lipolytica PO1f e, então, esfregados em um meio de placa de YPD (1% de extrato de levedura, 2% de bactopeptona, 2% de glicose) e cultivados a 30°C por 24 horas para obter as cepas. As cepas obtidas foram denominadas Yl/pIMR53U-ppmat, Yl/pIMR53U-bsmat, Yl/pIMR53U-entmat, Yl/pIMR53U-pvmat, Yl/pIMR53U-ylmat, Yl/pIMR53U-cgmat e Yl/pIMR53U. Para confirmar a capacidade de produção de N-acetilmetionina do transformante, as cepas foram inoculadas em 14 ml de um tubo de cultura descartável incluindo 3 ml de um meio líquido de YPD e cultivadas em agitação por 24 horas sob condições de 30 °C e 200 rpm para obter uma solução de cultura de semente. 1 ml da solução de cultura de semente foi inoculado em um frasco de defletor de aresta de 250 ml incluindo 24 ml de um meio líquido de YPDm (10 g de glicose, 3,28 g de Na2HPO4, 3,22 g de NaH2PO4, 2 g de extrato de levedura e 50 g/l de Proteose- peptona) contendo metionina (0,5% (5 g/l)) e cultivado em agitação por 24 horas sob condições de 30 °C e 200 rpm. Após a conclusão da cultura, a concentração de N-acetil-L-metionina foi analisada com o uso de HPLC (SHIMADZU, CONTROLADOR DE SISTEMA CBM-20A e outros acessórios) (Tabela 8).

[096] Presume-se que N-acetilmetionina também seja produzida no transformante Yl/pIMR53U devido ao efeito da aciltransferase possuída pelo tipo selvagem de Yarrowia lipolytica, porém, foi averiguado que as cepas nas quais seis tipos de aciltransferases inovadoras são superexpressadas têm capacidade de produção de N-acetilmetionina. [TABELA 8]

[097] A partir dos resultados acima, é sugerido que as aciltransferases recém-desenvolvidas na presente revelação e os micro-organismos incluindo as mesmas produzem, de modo eficaz, N-acetil-L-metionina em comparação com uma aciltransferase conhecida, YncA.

[098] Como descrito acima, aqueles versados na técnica poderão entender que a presente revelação pode ser facilmente executada em outras formas detalhadas sem alterar o espírito técnico ou um recurso essencial do mesmo. Portanto, deve ser observado que as modalidades supracitadas são ilustrativas em todos os aspectos e não são restringidas. O escopo da presente revelação é representado pelas reivindicações a serem descritas abaixo em vez da descrição detalhada, e deve-se interpretar que o significado e o escopo das reivindicações e todas as alterações ou formas modificadas derivadas dos equivalentes das mesmas sejam abrangidas pelo escopo da presente revelação.

Claims

1. Micro-organismo que produz N-acetil-L-metionina, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo possuindo uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 7 a 9, ou uma sequência degenerada das mesmas, em que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que tem uma atividade de aciltransferase e representado por uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS. 1 a 3.

2. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é selecionado a partir do grupo que consiste em Escherichia sp., Corynebacterium sp., Saccharomyces sp. e Yarrowia sp.

3. Composição para preparar N-acetil-L-metionina a partir de L-metionina, em que a composição é caracterizada pelo fato de que compreende, como um ingrediente ativo: (i) o microorganismo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, ou uma cultura do mesmo; (ii) o polipeptídeo representado por uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3; ou uma combinação dos mesmos.

4. Método para preparar N-acetil-L-metionina caracterizado pelo fato de que compreende: acetilar L-metionina com o uso (i) do micro-organismo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, ou uma cultura do mesmo; (ii) do polipeptídeo representado por uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 3; ou uma combinação dos mesmos.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: recuperar N-acetil-L-metionina, que é uma L-metionina acetilada.