JP2023503415A - 内膜タンパク質の変異体及びそれを用いた目的産物生産方法 - Google Patents

内膜タンパク質の変異体及びそれを用いた目的産物生産方法 Download PDF

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Abstract

【課題】内膜タンパク質であるＹｊｅＨの変異体、それを含む微生物及びそれを用いた目的産物生産方法の提供。【解決手段】本出願は、内膜タンパク質であるＹｊｅＨの変異体、それを含む微生物及びそれを用いた目的産物生産方法に関する。

Description

本出願は、内膜タンパク質であるＹｊｅＨの変異体及びそれを用いた目的産物生産方法に関する。
Ｏ－アセチルホモセリン（O-acetyl homoserine）は、生体必須アミノ酸の一種であるメチオニンの前駆体として作用する。ホモセリン（homoserine）もメチオニン及びトレオニンの前駆体であり、ホスホホモセリンを経てトレオニンになり、またアセチルホモセリンを経てメチオニンに変換されることが知られている。
メチオニンは、飼料や食品添加剤だけでなく、輸液剤、医薬品の合成原料として用いられ、化学合成や生物学的合成により生産される。発酵により生産したＬ－メチオニン前駆体から酵素変換反応によりＬ－メチオニンを生産する二段階工法（特許文献１）が開示されている。
前記二段階工法においては、メチオニン前駆体としてＯ－スクシニルホモセリン（O-succinyl homoserine）又はＯ－アセチルホモセリンが用いられ、メチオニンの経済的な大量生産のためにＯ－アセチルホモセリンを高収率で生産することが非常に重要である。
国際公開第２００８／０１３４３２号 米国特許第７６６２９４３号明細書 米国特許第１０５８４３３８号明細書 米国特許第１０２７３４９１号明細書 国際公開第２０１０／０９８６２９号 中国特許出願公開第１０８５１６９９１号明細書 米国特許第１０６６２４５０号明細書 韓国登録特許第１０－００５７６８４号公報
Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444 Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277 Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453 Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984) Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990) Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745 J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008 Gene, 145 (1994) 69-73
本発明者らは、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリンの生産を増加させるために鋭意努力した結果、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出活性が向上した内膜タンパク質の変異体を見出し、本出願を完成するに至った。
本出願は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体を提供する。
本出願は、前記変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本出願は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本出願は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物を提供する。
本出願は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物を培地で培養するステップを含む目的産物生産方法を提供する。
本出願は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物を培地で培養してＯ－アセチルホモセリンを生産するステップと、前記Ｏ－アセチルホモセリンと硫化物を反応させてＯ－アセチルホモセリンをメチオニンに変換するステップとを含むメチオニン生産方法を提供する。
本出願は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物を培地で培養してＯ－アセチルホモセリン又はホモセリンを生産するステップと、前記Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリンをグルホシネートに変換するステップとを含むグルホシネート生産方法を提供する。
本出願は、前記微生物又は前記微生物の培養物を含むホモセリン生産用組成物を提供する。
本出願は、前記微生物又は前記微生物の培養物を含むＯ－アセチルホモセリン生産用組成物を提供する。
本出願は、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン生産のための前記内膜タンパク質ＹｊｅＨ変異体の使用を提供する。
本出願は、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン生産のための前記微生物の使用を提供する。
本出願の内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体を用いて、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン生産能を有する微生物を培養すると、従来の非改変タンパク質に比べて高収率でＯ－アセチルホモセリン又はホモセリンを生産することができる。
ｐＤＣＭ２プラスミドの模式図である。
以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。
上記目的を達成するための本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体を提供する。
前記内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体は、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出能、すなわちＯ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出活性を有するものであってもよい。
本出願における「ホモセリン（homoserine）」は、側鎖に水酸基を有するα－アミノ酸の一種である。前記ホモセリンは、微生物や植物におけるトレオニン及びメチオニン生合成の中間体であり、アスパラギン酸－４－セミアルデヒドから生成され、Ｃ４Ｈ９ＮＯ３の化学式を有することが知られている。前記ホモセリンは、アセチルＣｏＡの存在下でホモセリンアセチルトランスフェラーゼによりＯ－アセチルホモセリンに変換される。
本出願における「Ｏ－アセチルホモセリン（O-acetyl homoserine）」とは、微生物のメチオニン生合成経路における特異的中間体物質であり、Ｌ－ホモセリンのアセチル誘導体を意味する。前記Ｏ－アセチルホモセリンは、ホモセリンとアセチルＣｏＡの反応がホモセリンアセチルトランスフェラーゼにより触媒されると生成され、Ｃ６Ｈ１１ＮＯ４の化学式を有することが知られている。前記Ｏ－アセチルホモセリンは、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンともいう。
具体的には、本出願は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されるか、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されるか、又はｉｉｉ）９２番目及び３５１番目に相当する位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、タンパク質の変異体であるが、これらに限定されるものではない。前記アミノ酸置換は、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、又はｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換であり、より具体的には、前記タンパク質の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されるか、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸がロイシンに置換されるか、ｉｉｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換され、かつ３５１番目に相当する位置のアミノ酸がロイシンに置換された、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体であるが、これらに限定されるものではない。
本出願における「内膜タンパク質（inner membrane protein）」とは、輸送タンパク質（transporter）のアミノ酸－ポリアミン－有機カチオン（Amino Acid-Polyamine-Organocation, APC）スーパーファミリー内のアミノ酸排出タンパク質（Amino Acid Efflux, AAE）の一種であり、Ｏ－アセチルホモセリン及び／又はホモセリンの細胞外への排出を媒介するタンパク質を意味する。１２個の膜貫通型αヘリックス（transmembrane α helices）を含むものと予測され、それらのうち１０個はＡＰＣスーパーファミリーの特性である反転繰り返し折り畳み（inverted repeat fold）を形成する。前記内膜タンパク質は、例えば配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と混用される。本出願における前記内膜タンパク質は、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出タンパク質、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出能を有するタンパク質、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出活性を有するタンパク質、ＹｊｅＨタンパク質、ＹｊｅＨと混用される。
本出願における配列番号１とは、内膜タンパク質ＹｊｅＨのアミノ酸配列を意味する。具体的には、配列番号１は、ｙｊｅＨ遺伝子によりコードされるＯ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出活性を有する内膜タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号１のアミノ酸は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列が得られる。例えば、大腸菌（Escherichia coli, E. coli）由来のものが挙げられるが、これに限定されるものではなく、上記アミノ酸と同じ活性を有する配列であればいかなるものでもよい。また、本出願における内膜タンパク質は、たとえ配列番号１のアミノ酸を含むタンパク質であると定義したとしても、配列番号１のアミノ酸配列の前後の無意味な配列付加、自然発生する突然変異、又はその非表現突然変異（silent mutation）を除外するものではなく、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、本出願の内膜タンパク質に含まれることは当業者にとって自明である。具体的には、本出願の内膜タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％もしくは９９．７％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、そのような相同性又は同一性を有し、前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願の変異対象となるタンパク質に含まれることは言うまでもない。
すなわち、本出願に「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチド」、「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチド」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本出願に用いられることは言うまでもない。例えば、「配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質」又は「配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、それと同一又は相当する活性を有するものであれば、「配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質」又は「配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド」に属することは言うまでもない。
本出願における「変異体（variant）」とは、少なくとも１つのアミノ酸が保存的置換（conservative substitution）及び／又は改変（modification）により上記列挙した配列（the recited sequence）とは異なるが、前記タンパク質の機能（functions）又は特性（properties）が維持されるタンパク質を意味する。変異体は、数個のアミノ酸置換、欠失又は付加により識別される配列（identified sequence）とは異なる。このような変異体は、一般に前記タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸を改変し、その改変したタンパク質の特性を評価することにより識別することができる。すなわち、変異体の能力は、本来のタンパク質（native protein）より向上するか、変わらないか又は低下する。また、一部の変異体には、Ｎ末端リーダー配列や膜貫通ドメイン（transmembrane domain）などの少なくとも１つの部分が除去された変異体も含まれる。他の変異体には、成熟タンパク質（mature protein）のＮ及び／又はＣ末端から一部分が除去された変異体も含まれる。前記「変異体」には、変異型、改変、変異したタンパク質、変異型ポリペプチド、変異などの用語（英語表現では、modification、modified protein、modified polypeptide、mutant、mutein、divergent、variantなど）が用いられるが、変異を意味する用語であればいかなるものでもよい。本出願の目的上、前記変異体は、天然の野生型又は非改変タンパク質に比べて変異したタンパク質の活性が上昇したものであるが、これらに限定されるものではない。
本出願における「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。前記変異体は、少なくとも１つの生物学的活性を依然として有する状態で、例えば少なくとも１つの保存的置換を有する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。例えば、電荷を帯びた側鎖（electrically charged amino acid）を有するアミノ酸のうち正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられ、電荷を帯びていない側鎖（uncharged amino acid）を有するアミノ酸のうち非極性アミノ酸（nonpolar amino acid）としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びプロリンが挙げられ、極性（polar）又は親水性（hydrophilic）アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ、前記非極性アミノ酸のうち芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン及びトリプトファンが挙げられる。
また、変異体は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時に（co-translationally）又は翻訳後に（post-translationally）タンパク質の移転（transfer）に関与するタンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合されてもよい。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製又は合成できるように、他の配列又はリンカーに結合されてもよい。
前記「他のアミノ酸への置換」は、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸であればいかなるものでもよい。
本出願における「他のアミノ酸への置換」は、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されるものであればいかなるものでもよい。具体的には、リシン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンのうち置換前のアミノ酸とは異なるいずれかのアミノ酸に置換されたものであってもよい。
具体的には、配列番号１のアミノ酸配列の９２番目に相当する位置のアミノ酸であるフェニルアラニンがアスパラギンに置換されたものであってもよく、３５１番目に相当する位置のアミノ酸であるフェニルアラニンがロイシンに置換されたものであってもよい。なお、本出願における「特定アミノ酸が置換された」とは、他のアミノ酸に置換されたと表記していなくても、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されたことを意味することは言うまでもない。
また、前記置換されたアミノ酸残基には、天然アミノ酸だけでなく、非天然アミノ酸も含まれる。前記非天然アミノ酸としては、例えばＤ－アミノ酸、ホモ（Homo）アミノ酸、β－ホモ（Beta-homo）アミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸、α－メチルアミノ酸、異常アミノ酸（例えば、シトルリンやナフチルアラニンなど）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、本出願における「特定アミノ酸が置換された」とは、他のアミノ酸に置換されたと表記していなくても、置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されたことを意味することは言うまでもない。
前記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において、９２番目又は３５１番目に相当する位置のアミノ酸の１つ以上のアミノ酸が置換前のアミノ酸とは異なるアミノ酸に置換されたものであってもよい。あるいは、前記変異体は、電荷を帯びていない側鎖（uncharged amino acid）を有する、置換前アミノ酸とは異なるアミノ酸に置換された変異体であってもよいが、これに限定されるものではない。
具体的には、前記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されるか、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されるか、又はｉｉｉ）９２番目及び３５１番目に相当する位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、タンパク質の変異体であるが、これらに限定されるものではない。前記アミノ酸置換は、ｉ）９２番目のアミノ酸のアスパラギンへの置換、又はｉｉ）３５１番目のアミノ酸のロイシンへの置換であり、より具体的には、前記タンパク質の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目のアミノ酸がアスパラギンに置換されるか、ｉｉ）３５１番目のアミノ酸がロイシンに置換されるか、ｉｉｉ）９２番目のアミノ酸がアスパラギンに置換され、かつ３５１番目のアミノ酸がロイシンに置換された、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体であるが、これらに限定されるものではない。
本出願における「相当する（corresponding to）」とは、タンパク質もしくはペプチドにおいて列挙される位置のアミノ酸残基であるか、又はタンパク質もしくはペプチドにおいて列挙される残基に類似、同一もしくは相当するアミノ酸残基を意味する。本出願における「相当領域」とは、一般に関連タンパク質又は比較タンパク質における類似する位置を意味する。
本出願において、本出願に用いられるタンパク質中のアミノ酸残基位置に特定ナンバリングが用いられる。例えば、比較する対象のタンパク質と本出願のタンパク質のポリペプチド配列をアラインメントすることにより、本出願のタンパク質のアミノ酸残基位置に相当する位置を再ナンバリングすることができる。
本出願が提供する内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体とは、前述したＯ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出能を有する内膜タンパク質の特異的位置のアミノ酸が置換され、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出能が変異前のタンパク質に比べて向上した変異体を意味する。
配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を含む、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体は、配列番号３５～３６のいずれかのアミノ酸配列を含むものであってもよく、具体的には配列番号３５～３６のいずれかのアミノ酸配列から必須に構成される（consisting essentially of）ものであってもよく、より具体的には配列番号３５～３６のいずれかのアミノ酸配列からなるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
また、前記変異体は、配列番号３５～３６のいずれかのアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列において、９２番目又は３５１番目のアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸は固定され、それと８０％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むが、これらに限定されるものではない。具体的には、本出願の変異体には、配列番号３５～３６のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性又は同一性を有するポリペプチドが含まれる。また、そのような相同性又は同一性を有し、前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、９２番目又は３５１番目のアミノ酸位置以外の一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。
本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が関連する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。
保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上ハイブリダイズすることができる。そのハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドがコドンの代わりに縮退コドンを有するようにするものであってもよい。
任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献１のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献３）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献５、６及び７）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献８に開示されているように、非特許文献３などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献９に開示されているように、非特許文献１０の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。
また、任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献１１、１２）で決定されてもよい。
本出願における「内膜タンパク質の変異体」又は「内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体」は、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出能を有するものであり、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン生産能を有する変異型ポリペプチド、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン生産変異型ポリペプチド、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン生産能を有する変異型ポリペプチド、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出活性を有する変異型ポリペプチド、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出活性変異体、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出変異体、変異型ホモセリン排出タンパク質、変異型Ｏ－アセチルホモセリン排出タンパク質、変異型ＹｊｅＨ、変異ＹｊｅＨ、ＹｊｅＨ変異体、ＹｊｅＨ変異型などと混用される。
また、前記タンパク質は、エシェリキア属（Escherichia sp.）、エルウィニア属（Erwinia sp.）、セラチア属（Serratia sp.）、プロビデンシア属（Providencia sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、レプトスピラ属（Leptospira sp.）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium sp.）、ヒフォモナス属（Hyphomononas sp.）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium sp.）、ノカルディア属（Norcardia sp.）、又は菌類（fungi）もしくは酵母類（yeast）に属する微生物菌株に由来するものであり、具体的にはエシェリキア属、コリネバクテリウム属、レプトスピラ属の微生物菌株と酵母に由来するものであり、より具体的にはエシェリキア属の微生物菌株由来のものであり、その具体例として大腸菌（Escherichia coli, E. coli）由来のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
前記内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において９２番目及び／又は３５１番目の位置に変異を含んでもよく、配列番号１にアミノ酸が付加、欠失したアミノ酸配列であっても、配列番号１のＮ末端から９２番及び／又は３５１番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸が置換された変異体であれば本出願に含まれる。前記内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において９２番目及び／又は３５１番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むと共に、配列番号１のアミノ酸配列を含む内膜タンパク質や前記変異を含まない内膜タンパク質に比べて強化された活性を有する変異型内膜タンパク質であってもよい。このような内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体は、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は９９．７％以上及び１００％未満の相同性又は同一性を有するものであってもよい。
前記９２番目又は３５１番目のアミノ酸変異は、９２番目のアミノ酸のアスパラギンへの置換であってもよく、３５１番目のアミノ酸のロイシンへの置換であってもよい。
具体的には、前記内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を含むものであってもよく、また配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質や野生型微生物由来の変異前の内膜タンパク質より強化された活性を有するものであってもよい。
本出願の他の態様は、前記内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
前記内膜タンパク質ＹｊｅＨ及びその変異体については前述した通りである。
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖であり、より具体的には前記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
前記ポリヌクレオチドは、本出願の内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体をコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。本出願において、内膜タンパク質ＹｊｅＨのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ｙｊｅＨ遺伝子であり、前記遺伝子は、大腸菌（Escherichia coli, E. coli）由来のものであるが、これらに限定されるものではない。
具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記ポリペプチドを発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、ポリペプチドのアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列において９２番目又は３５１番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体をコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。
また、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイドリダイズすることにより、配列番号１のアミノ酸配列において９２番目又は３５１番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された内膜タンパク質をコードする配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（例えば、非特許文献１１）に具体的に記載されている。例えば、相同性又は同一性の高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性又は同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性又は同一性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。
具体的には、相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（非特許文献１３参照）。
本出願のさらに他の態様は、前記内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
前記内膜タンパク質ＹｊｅＨ、その変異体、及びポリヌクレオチドについては前述した通りである。
本出願におけるベクターとは、好適な宿主内で標的ポリペプチドを発現させることができるように、公的な発現調節領域（又は発現調節配列）に作動可能に連結された前記標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記発現調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。
本出願における「発現」には、ポリペプチドの生成に関与する任意のステップ、例えば転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、分泌などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本出願における「発現ベクター」とは、コード配列及びその発現のために作動可能に連結された調節配列を含む線状又は環状核酸分子を意味する。
本出願における「作動可能に連結された」ものとは、調節配列がコード配列の発現を示すように調節配列が適切な位置に配置された構成を意味する。よって、「作動可能に連結された」ものには、プロモーター、ターミネーター、信号配列、エンハンサー領域などの周知又は所望の活性を有する機能的ドメインの調節領域がターゲット（遺伝子又はポリペプチド）の発現、分泌又は機能を前記周知又は所望の活性に応じて調節できるようにそのターゲットに付着又は連結されたものが含まれる。
本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、並びにＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。より具体的には、本出願に用いられるベクターは、コリネバクテリウム染色体への遺伝子の挿入及び置換のために作製されたｐＤＣＭ２（図１，配列番号３７）であるが、これに特に限定されるものではなく、公知の発現ベクターが用いられてもよい。
例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、染色体内で標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え（homologous recombination）により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物を提供する。
配列番号１、内膜タンパク質ＹｊｅＨ、その変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターについては前述した通りである。
本出願における「内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体を含む微生物」とは、自然に弱いＯ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出能を有する微生物に内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体が導入されてＯ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出能が増加した微生物を意味する。具体的には、前記微生物は、配列番号１のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸変異を含む内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体を発現する微生物であり、前記アミノ酸変異は、Ｎ末端から９２番目又は３５１番目のアミノ酸の他のアミノ酸への置換であってもよい。
本出願の目的上、前記内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物は、野生型又は非改変微生物に比べてＯ－アセチルホモセリン又はホモセリンの細胞外排出量が増加することにより、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリンの生産能が向上することを特徴とする。これは、野生型又は非改変微生物がＯ－アセチルホモセリン又はホモセリンを排出することができないか、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリンを排出するとしても極微量しか生産できないのに対して、本出願の内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを導入することにより、微生物のＯ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出量が増加するので、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリンの生産能が向上するということに意義がある。
本出願における「非改変微生物」とは、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、天然菌株自体、又は前記内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体を含まない微生物を意味する。前記「非改変微生物」は、「改変前の菌株」、「改変前の微生物」、「非変異菌株」、「非変異微生物」、「非改変菌株」又は「基準微生物」と混用される。
本出願における、タンパク質が「発現するように／する」とは、標的タンパク質が微生物に導入されるか、微生物で発現するように改変された状態を意味する。前記標的タンパク質が微生物中に存在するタンパク質の場合、内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が強化された状態を意味する。本出願の目的上、前記「標的タンパク質」は、前述した内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体であってもよい。
具体的には、「タンパク質の導入」とは、微生物が本来持っていなかった特定タンパク質の活性が現れるようにすること、又は当該タンパク質の内在性活性もしくは改変前の活性に比べて向上した活性が現れるようにすることを意味する。例えば、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドが微生物中の染色体に導入されることや、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが微生物に導入されてその活性が現れることであってもよい。また、「活性の強化」とは、微生物が有する特定タンパク質の内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することを意味する。前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して微生物の形質が変化する場合に、形質変化の前に親株が本来有していた特定タンパク質の活性を意味する。
具体的には、本出願の活性強化は、前記タンパク質変異体をコードする遺伝子の細胞内のコピー数を増加する方法、前記タンパク質変異体をコードする遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、前記タンパク質変異体をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が強力な配列に置換する方法、染色体上の天然内膜タンパク質をコードする遺伝子を前記タンパク質変異体をコードする遺伝子に代替する方法、前記タンパク質変異体の活性が強化されるように前記タンパク質変異体をコードする遺伝子に変異をさらに導入する方法、及び微生物にタンパク質変異体を導入する方法からなる群から選択される少なくとも１つの方法で行われるが、これらに限定されるものではない。
前記遺伝子のコピー数を増加する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体に挿入されることにより行われる。具体的には、本出願のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われる。あるいは、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターが宿主細胞の染色体内に導入されることにより行われる。前記ポリヌクレオチドの染色体への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができる。
次に、ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現調節配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より強い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。
前記ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターに代えて強力なプロモーターが連結されるが、これに限定されるものではない。公知の強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（特許文献２）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（特許文献３）、Ｏ２プロモーター（特許文献４）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より高い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。
このようなタンパク質の導入及び活性の強化とは、対応するタンパク質の活性又は濃度が野生型や非改変の微生物菌株におけるタンパク質の活性又は濃度より増加することを意味するが、これらに限定されるものではない。
本出願における、前記内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体を含む微生物は、前記内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターでの形質転換により作製される組換え微生物であるが、これに限定されるものではない。
本出願における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それらが全て含まれるものである。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入される。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
前記ホモセリン生産能を有する微生物は、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリンを生産するものであればその種類が特に限定されるものではなく、具体的には、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、エシェリキア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterbacter）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物であり、より具体的には、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物である。
さらに具体的には、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、コリネバクテリウム・シングラレ（Corynebacterium singulare）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Corynebacterium pollutisoli）、コリネバクテリウム・イミタンス（Corynebacterium imitans）、コリネバクテリウムテス・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）、コリネバクテリウム・フラベッセンス（Corynebacterium flavescens）などであり、コリネバクテリウム属に属する微生物であればいかなるものでもよい。
本出願における前記微生物の親株は、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリンの生産量を増加させるために、さらにＯ－アセチルホモセリン又はホモセリンの生合成経路を弱化させる遺伝子を不活性化した微生物であるか、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリンの生合成経路を強化した微生物であるが、これらに限定されるものではない。
具体的には、前記Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリンの生合成経路を弱化させる遺伝子を不活性化するために、例えばＯ－アセチルホモセリン分解経路のシスタチオニンγ－シンターゼ（cystathionine gamma-synthase）をコードするｍｅｔＢ遺伝子（配列番号１７）、Ｏ－アセチルホモセリン分解経路のＯ－アセチルホモセリンチオールリアーゼ（O-acetylhomoserine (thiol)-lyase）をコードするｍｅｔＹ遺伝子（配列番号２２）などの発現を微生物中で弱化又は不活性化してもよい。
前記Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリンの生合成経路を強化するために、例えばアスパルトキナーゼをコードするｌｙｓＣ遺伝子（配列番号２７）などに遺伝子変異を導入してもよく、Ｏ－アセチルホモセリントランスフェラーゼをコードするｍｅｔＸ遺伝子（配列番号３２）の発現を増幅させてもよい。
しかし、これらに限定されるものではなく、当該技術分野で公知の遺伝子発現調節方法によりＯ－アセチルホモセリン又はホモセリン生産能を強化することができる。
本出願における「強化／増加」は、内在性活性に比べて活性が増加することが全て含まれる概念である。
このような遺伝子の活性の強化又は増加は、当該分野で周知の様々な方法を適用することにより達成することができる。前記方法の例として、遺伝子の細胞内コピー数を増加させる方法、遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、遺伝子の発現調節配列を活性が強力な配列に置換する方法、遺伝子の活性が強化されるように当該遺伝子に変異をさらに導入する方法、及び微生物に外来遺伝子を導入する方法からなる群から選択される少なくとも１つの方法が挙げられ、それらの組み合わせによっても達成することができるが、上記例に限定されるものではない。
本出願における「不活性化」は、内在性活性に比べて活性が低下することや、活性がなくなることが全て含まれる概念である。
このような遺伝子の活性の不活性化は、当該分野で周知の様々な方法を適用することにより達成することができる。前記方法の例として、前記遺伝子の活性を除去する場合をはじめとして、染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、当該タンパク質の活性が低下するように突然変異させた遺伝子により染色体上の前記タンパク質をコードする遺伝子を代替する方法、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が低い配列や活性のない配列に置換する方法（例えば、前記遺伝子のプロモーターを内在性プロモーターより弱いプロモーターに置換する方法）、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、前記染色体上の遺伝子の転写産物に相補的に結合させて前記ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子のＳＤ配列の前にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加することにより２次構造物を形成させてリボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法、当該配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法などが挙げられ、それらの組み合わせによっても達成することができるが、上記例に限定されるものではない。
本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物を培地で培養するステップを含む目的産物生産方法を提供する。
配列番号１、内膜タンパク質ＹｊｅＨ、その変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、及びそれを含む微生物については前述した通りである。
前記目的産物は、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリンであるが、これらに限定されるものではない。
本出願における「培養」とは、前記微生物を適宜調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行われる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び流加培養であるが、これらに限定されるものではない。
本出願における「培地」とは、前記微生物を培養するために必要な栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質や発育因子などを供給する。具体的には、本出願の微生物の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられるものであればいかなるものでもよく、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願の微生物を培養することができる。
本出願における前記炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的にはグルコースや殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができ、それ以外に、アミノ酸、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを用いることができる。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加することができるが、これらに限定されるものではない。
本出願において、微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加することにより、培地のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。さらに、培地の好気状態を維持するために、培地中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。
培地の温度は、２０℃～５０℃、具体的には３０℃～３７℃であるが、これらに限定されるものではない。培養期間は、有用物質の所望の生成量が得られるまで続けられ、具体的には１０時間～１００時間であるが、これらに限定されるものではない。
上記培養により生産された目的産物は、培地中に排出されるか、排出されずに細胞内に残留する。
前記方法は、培養した培地又は微生物から目的産物を回収するステップをさらに含むものであってもよい。
本出願の前記培養ステップで生産された目的産物を回収する方法は、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養液から目的とする産物を回収（collect）するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とする産物を回収することができる。前記培養液は、発酵液ともいう。
また、前記回収ステップは、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の好適な方法を用いて行うことができる。よって、前述したように回収される目的産物は、精製された形態であってもよく、目的産物を含有する微生物発酵液であってもよい（非特許文献１４）。
本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物を培地で培養してＯ－アセチルホモセリンを生産するステップと、前記Ｏ－アセチルホモセリンと硫化物を反応させてＯ－アセチルホモセリンをメチオニンに変換するステップとを含むメチオニン生産方法を提供する。
配列番号１、内膜タンパク質ＹｊｅＨ、その変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、それを含む微生物、及びＯ－アセチルホモセリンについては前述した通りである。
本出願におけるＯ－アセチルホモセリンは、メチオニン前駆体であり、硫化物との反応によりメチオニンに変換される。
前記硫化物と反応させるステップは、公知のいずれかの方法を用いてＯ－アセチルホモセリンからＬ－メチオニンを生成するものである。例えば、硫化物であるメチルメルカプタンをＯ－アセチルホモセリンと反応させてＬ－メチオニンを生産してもよい。また、前記反応の速度及び収率向上のために、触媒や酵素を添加してもよく、また酵素を含む微生物中で反応させてもよい。
前記「硫化物」としては、例えばメチルメルカプタンが挙げられ、前記メチルメルカプタンとは、液状のメチルメルカプタンナトリウム（sodium methyl mercaptan，ＣＨ３Ｓ－Ｎａ，Ｎａ－メチルメルカプタン）の形態、ガス又は液状のメチルメルカプタン（ＣＨ３ＳＨ）だけでなく、特許文献５に開示された形態でジメチルスルフィド（DMS, Dimethylsulfide）を含むメチルメルカプタンなど、硫黄原子を提供できる形態を含むメチルメルカプタン誘導体の全てを意味する。
上記メチオニン変換反応に用いられる公知の酵素は、シスタチオニンγ－シンターゼであってもよく、Ｏ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼであってもよく、Ｏ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼであってもよい。
本出願のメチオニン変換反応工程は、次の反応式で表される。
Figure 2023503415000002
上記反応において、メチルメルカプタンのＣＨ３Ｓ－残基がＯ－アセチルホモセリンのアセテート残基に置換されてＬ－メチオニンが生成される。
上記反応は、２０℃～４５℃の温度で反応媒質のｐＨが６～７に維持される条件で行われてもよく、補酵素としてピリドキサール－５’－ホスフェートが添加されてもよい。
前記メチルメルカプタンの存在下でＬ－メチオニン前駆体をＬ－メチオニンに変換する反応は酵素反応であり、例えば特許文献１に開示されている。特許文献１は、メチルメルカプタンの存在下でＬ－メチオニン前駆体をＬ－メチオニンに変換するのに適した活性を有する使用可能なメチオニン変換酵素の性質及び製造についての詳細を提供している。このような好適なメチオニン変換酵素は、例えば生命工学的方法による遺伝子発現を用いて製造される。
例えば、前記メチオニン変換活性を有する酵素をコードする遺伝子の配列は、ＮＣＢＩ（米国）やＤＮＡデータバンク（ＫＥＧＧ）（日本）のデータベースから得られるが、これらに限定されるものではない。生物学的変換反応のために、得られた遺伝子配列から遺伝子がクローニングされ、その後発現ベクターに導入されてもよい。具体的には、前記遺伝子は、組換え菌株内で大腸菌（E. coli）用発現ベクターであるｐＣＬ－ＣＪＩベクター（CJ，韓国）から活性形態で発現するので、発現したタンパク質を超音波処理することにより、細胞が溶解した酵素溶液から得られる。メチオニン変換酵素を発現する菌株、及び発現したメチオニン変換酵素は、どちらもメチオニン変換反応に直接用いられる。
前記遺伝子から発現したメチオニン変換酵素、又はそれを発現する微生物菌株が直接、一部又は全部、Ｌ－メチオニン前駆体が蓄積した発酵上清又は発酵ブロスと混合されると、反応が始まる。すなわち、Ｏ－アセチルホモセリンが蓄積した発酵液にメチオニン変換酵素又はそれを発現する微生物菌株が添加され、さらにメチルメルカプタンが添加されると、反応が始まる。
具体的には、発酵液に蓄積したＯ－アセチルホモセリンは、シスタチオニンγ－シンターゼ、Ｏ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ又はＯ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼによりＬ－メチオニンに変換される。
上記メチオニン変換反応はＤＴＮＢ［５，５－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸），Sigma，米国］により確認され、反応産物はＨＰＬＣで分析される。メチオニン変換反応過程において、メチルメルカプタンとＯ－アセチルホモセリンの反応により、別途の生産工程を経ることなく、酢酸などの副産物がさらに得られる。
Ｌ－メチオニン前駆体とメチルメルカプタンの酵素反応は、次の反応式で表される。
Figure 2023503415000003
前記メチオニンを生産する方法は、当該技術分野で公知の最適化された培養条件及び酵素活性条件において当業者が容易に決定することができる。具体的な培養方法及び培地については前述した通りである。
本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物を培地で培養してＯ－アセチルホモセリン又はホモセリンを生産するステップと、前記Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリンをグルホシネートに変換するステップとを含むグルホシネート生産方法を提供する。
配列番号１、内膜タンパク質ＹｊｅＨ、その変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、それを含む微生物、及びホモセリンについては前述した通りである。
本出願における「グルホシネート（glufosinate）」とは、様々な種のストレプトマイセス（Streptomyces）土壌細菌により生成される、天然の広域除草剤を意味し、ホスフィノスリシン（phosphinothricin）としても知られている。
本出願におけるＯ－アセチルホモセリン又はホモセリンは、ハロゲン化反応を含む複数のステップによりグルホシネートに変換される。
前記グルホシネート変換反応は、例えば特許文献６に開示されている。具体的には、前記グルホシネート変換反応は、（１）ホモセリン（化学式ＩＩ）を酸性触媒（acidic catalyst）の存在下で有機溶媒（organic solvent）により共沸脱水（azeotropic dehydration）するステップと、前記共沸脱水したホモセリンにハロゲン化剤（halogenating agent）を添加してハロゲン化反応を行ってＬ－３，６－ビス（２－ハロエチル）－２，５－ジオンピペラジン［L-3,6-bis(2-haloethyl)-2,5-dione piperazin］（化学式ＩＩＩ）を得るステップと、（２）前記Ｌ－３，６－ビス（２－ハロエチル）－２，５－ジオンピペラジンにメチルホスフィン酸ジエステル（methylphosphinic acid diester又はmethyl phosphite diester）を添加して触媒存在下で高沸点溶媒（high boiling solvent）によりアボブ反応（Abbov reaction）を行って化学式ＩＶの化合物を得るステップと、（３）化学式ＩＶの化合物を酸に溶解し、加熱して加水分解反応を行い、反応終了後に溶媒を除去し、アルコールを添加して溶解し、次いでアルキレンオキシド（alkylene oxide）を添加して変換反応によりグルホシネート（化学式Ｉ）を得るステップとを含んでもよい。
ホモセリンを前駆体としたグルホシネート変換反応は、次の反応式で表される。
Figure 2023503415000004
前記グルホシネート生産方法は、本出願において生物学的発酵により作製したホモセリンを前駆体として用いて行うことができ、前述したように、共沸脱水、ハロゲン化などによりメチルホスホニウム（methylphosphonium）と反応させてＬ－３，６－ビス（２－ハロエチル）－２，５－ジオンピペラジンを作製し、その後それをアボブ反応させ、次に加水分解反応を行ってグルホシネートを生産するものであってもよい。
本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物又は前記微生物の培養物を含むホモセリン生産用組成物を提供する。
本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物又は前記微生物の培養物を含むＯ－アセチルホモセリン生産用組成物を提供する。
配列番号１、内膜タンパク質ＹｊｅＨ、その変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、それを含む微生物、ホモセリン及びＯ－アセチルホモセリンについては前述した通りである。
前記Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン生産用組成物とは、本出願の内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体によりＯ－アセチルホモセリン又はホモセリンを生産する組成物を意味する。前記組成物は、前記内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、又は前記内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体を作動させることのできる構成を含むものであればいかなるものでもよい。前記内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体は、導入された宿主細胞で作動可能に連結された遺伝子を発現させることができるようにベクターに含まれる形態であってもよい。
前記組成物は、凍結保護剤又は賦形剤をさらに含んでもよい。前記凍結保護剤又は賦形剤は、非自然発生（non-naturally occurring）の物質、又は自然発生の物質であるが、これらに限定されるものではない。また、一具体例として、前記凍結保護剤又は賦形剤は、前記微生物が自然に接触しない物質、又は前記微生物と自然に同時に含まれない物質であるが、これらに限定されるものではない。
本出願のさらに他の態様は、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン生産のための内膜タンパク質ＹｊｅＨ変異体の使用を提供する。
本出願のさらに他の態様は、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン生産のための配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む微生物の使用を提供する。
前記ホモセリン、Ｏ－アセチルホモセリン、内膜タンパク質ＹｊｅＨ、その変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、及びそれを含む微生物については前述した通りである。
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。これは、本出願の属する技術分野における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
プラスミドの作製
コリネバクテリウム染色体への遺伝子の挿入及び置換のためのプラスミド（ｐＤＣＭ２，図１，配列番号３７）を設計し、バイニックス（株）の遺伝子合成（Gene-synthesis）サービスを用いてプラスミドを合成した。一般に知られているｓａｃＢ系に関する論文［非特許文献１５］を参考にして、クローニングに活用することが容易な制限酵素（restriction enzyme）を含むようにプラスミドを設計した。このように合成したｐＤＣＭ２プラスミドは、次のような特性を有する。
１）大腸菌においてのみ作用する複製起点（replication origin）を有するので、大腸菌内では自己複製（self-replication）が可能であるが、コリネバクテリウムでは自己複製が不可能であるという特性を有する。
２）選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を有する。
３）２次陽性選択（positive-selection）マーカーとしてレバンスクラーゼ（Levan sucrose）遺伝子（ｓａｃＢ）を有する。
４）最終的に作製された菌株には、ｐＤＣＭ２プラスミドに由来するいかなる遺伝子情報も残っていない。
変異型外来膜タンパク質（ＹｊｅＨ）導入菌株の作製並びにＯ－アセチルホモセリン及びホモセリン生産能の評価
２－１．外来膜タンパク質（ＹｊｅＨ）及び変異型ＹｊｅＨ導入菌株の作製
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２に導入する外来膜タンパク質であってＯ－アセチルホモセリン排出タンパク質であるＹｊｅＨの有効性を判断するために、大腸菌由来のＹｊｅＨをコードするｙｊｅＨ遺伝子（配列番号２）を含む染色体導入ベクターを作製した。
具体的には、トランスポザーゼ（transposase）欠損ベクターを作製するために、トランスポザーゼをコードする遺伝子（配列番号３，遺伝子番号ＮＣｇｌ２３３５）の位置を中心に、５’末端上流を増幅するためのプライマー１対（配列番号４及び５）と、３’末端下流を増幅するためのプライマー１対（配列番号６及び７）を設計した。配列番号５及び６のプライマーは交差するように設計し、その部位に制限酵素ＳｍａＩ配列が位置するようにした。プライマー配列を表１に示す。
Figure 2023503415000005
ＡＴＣＣ１３０３２野生型（ＷＴ）の染色体を鋳型とし、配列番号４及び５、配列番号６及び７のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、ＮＣｇｌ２３３５遺伝子の欠損部位を中心に、５’末端上流の８５１ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の８４７ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
増幅された２種類のＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号４及び７のプライマーによりＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、トランスポザーゼをコードする遺伝子（配列番号３，遺伝子番号ＮＣｇｌ２３３５）が欠損する部位を含む１６４８ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
得られたＰＣＲ産物をＳｍａＩ制限酵素で処理したｐＤＣＭ２ベクターとインフュージョンＨＤクローニングキット（In-Fusion HD Cloning Kit, Clontech）によりフュージョンクローニングした。クローニングしたベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、形質転換した大腸菌をカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／ｌ含有ＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲにより上記目的遺伝子が挿入されたプラスミドで形質転換したコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法によりプラスミドを得て、最終的にＮＣｇｌ２３３５欠損カセットがクローニングされたｐＤＣＭ２－ΔＮＣｇｌ２３３５組換えベクターを作製した。
Ｏ－アセチルホモセリン排出タンパク質の有効性を判断するために、大腸菌由来のＹｊｅＨをコードする遺伝子（配列番号２）を含む染色体導入ベクターを作製した。そのために、ＣＪ７プロモーター（配列番号８，特許文献２）を用いてｙｊｅＨ遺伝子を発現するベクターを作製した。ＣＪ７プロモーター部位を増幅するためのプライマー１対（配列番号９及び１０）と、大腸菌のｙｊｅＨ部位を増幅するためのプライマー１対（配列番号１１及び１２）を設計した。プライマー配列を表２に示す。
Figure 2023503415000006
ｐＥＣＣＧ１１７－ＰＣＪ７－ｇｆｐ（特許文献２）を鋳型とし、配列番号９及び１０のプライマーを用いてＰＣＲを行い、野生型大腸菌の染色体を鋳型とし、配列番号１１及び１２のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、ＣＪ７プロモーター部位の３６０ｂｐのＤＮＡ断片と、大腸菌のｙｊｅＨ遺伝子部位の１２９７ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
増幅された２種類のＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号９及び１２のプライマーによりＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、ＣＪ７プロモーターとｙｊｅＨ遺伝子が導入された部位を含む１６１４ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
上記ＰＣＲにより得られた遺伝子欠損ＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＤＣＭ２－ΔＮＣｇｌ２３３５ベクターとインフュージョンＨＤクローニングキット（In-Fusion HD Cloning Kit, Clontech）によりクローニングし、最終的にｐＤＣＭ２－ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，ＷＴ）組換えベクターを作製した。
具体的にはｐＤＣＭ２－ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，ＷＴ）プラスミドを鋳型とし、配列番号１３及び１４のプライマーを用いて、ＹｊｅＨアミノ酸配列の９２番目のアミノ酸であるフェニルアラニン（Ｐｈｅ）をアスパラギン（Ａｓｎ）に置換した（Ｆ９２Ｎ）。作製した変異ＹｊｅＨ（Ｆ９２Ｎ）をコードする遺伝子を含むプラスミドをｐＤＣＭ２－ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ９２Ｎ）と命名した。
また、ｐＤＣＭ２－ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，ＷＴ）プラスミドを鋳型とし、配列番号１５及び１６のプライマーを用いて、ＹｊｅＨアミノ酸配列の３５１番目のアミノ酸であるフェニルアラニンをロイシンに置換した（Ｆ３５１Ｌ）。作製した変異ＹｊｅＨ（Ｆ３５１Ｌ）をコードする遺伝子を含むプラスミドをｐＤＣＭ２－ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）と命名した。プライマー配列を表３に示す。
Figure 2023503415000007
作製したｐＤＣＭ２－ΔＮＣｇｌ２３３５、ｐＤＣＭ２－ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，ＷＴ）、ｐＤＣＭ２－ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ９２Ｎ）、ｐＤＣＭ２－ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）をＡＴＣＣ１３０３２菌株に電気パルス法で形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でＮＣｇｌ２３３５遺伝子が欠損したＡＴＣＣ１３０３２ΔＮＣｇｌ２３３５、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，ＷＴ）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ９２Ｎ）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）を得た。不活性化されたＮＣｇｌ２３３５遺伝子と、新たに導入された大腸菌ｙｊｅＨ遺伝子が挿入されたか否かは、配列番号４及び７のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後ＮＣｇｌ２３３５遺伝子が不活性化されていないＡＴＣＣ１３０３２と比較して最終確認した。
２－２．Ｏ－アセチルホモセリン生産能の評価
実施例２－１で作製したＡＴＣＣ１３０３２ΔＮＣｇｌ２３３５、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，ＷＴ）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ９２Ｎ）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）と野生型菌株であるＡＴＣＣ１３０３２のＯ－アセチルホモセリン（O-AH; O-Acetyl Homoserine）生産能を比較するために、次の方法で培養し、培養液中のＯ－アセチルホモセリンを分析した。
次の培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに菌株を１白金耳接種し、３３℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。ＨＰＬＣを用いてＯ－アセチルホモセリン濃度を分析した。分析した濃度を表４に示す。
Ｏ－アセチルホモセリン生産培地（ｐＨ７．２）
グルコース３０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ，尿素（Urea）３ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ，ペプトン（Peptone）２．５ｇ，ＣＳＬ（Corn steep liquor, Sigma）５ｇ（１０ｍｌ），ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ＣａＣＯ３ ２０ｇ（蒸留水１リットル中）
Figure 2023503415000008
その結果、表４に示すように、対照群菌株であるＡＴＣＣ１３０３２を培養すると、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンが０．３ｇ／Ｌ蓄積したので、トランスポザーゼであるＮＣｇｌ２３３５遺伝子を欠損させてもＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産には影響がないことが確認された。特に、野生型ｙｊｅＨ遺伝子を発現させると、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンが０．７ｇ／Ｌのレベルで蓄積することが確認され、変異型ｙｊｅＨ遺伝子を発現させると、それぞれ１．２、１．０ｇ／Ｌのレベルで蓄積することが確認された。
よって、これらの結果から、本出願の野生型及び変異型ｙｊｅＨ遺伝子がＡＴＣＣ１３０３２からＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリンを排出して目的アミノ酸の生産量を大幅に向上させることが確認された。
前記ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ９２Ｎ）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）菌株をそれぞれＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＭ０４－０６５１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＭ０４－０６５２と命名し、ブダペスト条約上の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１９年１２月４日付けで受託番号ＫＣＣＭ１２６３３Ｐ、ＫＣＣＭ１２６３４Ｐとして寄託した。
２－３．ホモセリン生産能の評価
実施例２－１で作製したＡＴＣＣ１３０３２ΔＮＣｇｌ２３３５、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，ＷＴ）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ９２Ｎ）、ＡＴＣＣ１３０３２ΔＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）と野生型菌株であるＡＴＣＣ１３０３２のホモセリン（Homoserine）生産能を比較するために、次の方法で培養し、培養液中のホモセリンを分析した。
次の培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに菌株を１白金耳接種し、３３℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。ＨＰＬＣを用いてホモセリン濃度を分析した。分析した濃度を表５に示す。
ホモセリン生産培地（ｐＨ７．２）
グルコース３０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ，尿素（Urea）３ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ，ペプトン（Peptone）２．５ｇ，ＣＳＬ（Corn steep liquor, Sigma）５ｇ（１０ｍｌ），ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ＣａＣＯ３ ２０ｇ（蒸留水１リットル中）
Figure 2023503415000009
その結果、表５に示すように、対照群菌株であるＡＴＣＣ１３０３２を培養すると、ホモセリンが０．０ｇ／Ｌのレベルで蓄積しなかったので、トランスポザーゼであるＮＣｇｌ２３３５遺伝子を欠損させてもホモセリン生産には影響がないことが確認された。特に、野生型ｙｊｅＨ遺伝子を発現させても、ホモセリンが０．０ｇ／Ｌのレベルで蓄積しないことが確認され、変異型ｙｊｅＨ遺伝子を発現させると、それぞれ０．２、０．２ｇ／Ｌのレベルで蓄積することが確認された。
よって、これらの結果から、本出願の変異型ｙｊｅＨ遺伝子がＡＴＣＣ１３０３２からホモセリンを排出して目的アミノ酸の生産量を向上させることが確認された。
向上したＯ－アセチルホモセリン生産能を有する菌株の作製並びにＯ－アセチルホモセリン及びホモセリン生産能の評価
３－１．シスタチオニンγ－シンターゼ（ＭｅｔＢ）の不活性
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、Ｏ－アセチルホモセリン分解経路のシスタチオニンγ－シンターゼ（cystathionine gamma(γ)-synthase）をコードするｍｅｔＢ遺伝子を確保した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）からｍｅｔＢ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号Ｎｃｇｌ２３６０，配列番号１７）を確保し、それに基づいてｍｅｔＢ遺伝子のＮ末端部分とリンカー部分を含むプライマー（配列番号１８及び１９）、Ｃ末端部分とリンカー部分を含むプライマー（配列番号２０及び２１）を合成した。プライマー配列を表６に示す。
Figure 2023503415000010
ＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１８及び１９、配列番号２０及び２１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用い、ＰＣＲ条件は、９６℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を３０サイクル行うものとした。その結果、ｍｅｔＢ遺伝子のＮ末端部分とリンカー部分を含む５５８ｂｐの増幅された遺伝子と、ｍｅｔＢ遺伝子のＣ末端部分とリンカー部分を含む５２７ｂｐの増幅された遺伝子がそれぞれ得られた。
前述したように得られた増幅された２つの遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９６℃で６０秒間の変性、５０℃で６０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を１０サイクル行い、その後配列番号１８及び２１を添加して重合反応を２０サイクル行うものとした。その結果、ｍｅｔＢ遺伝子のＮ末端－リンカー－Ｃ末端を含む１０６４ｂｐの不活性化カセットが得られた。上記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ断片を末端に含まれる制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩで処理し、制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩで処理したｐＤＣＭ２ベクターにライゲーション（ligation）によりクローニングし、最終的にｍｅｔＢ不活性化カセットがクローニングされたｐＤＣＭ２－△ｍｅｔＢ組換えベクターを作製した。
作製したｐＤＣＭ２－△ｍｅｔＢベクターをＡＴＣＣ１３０３２に電気パルス法で形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｍｅｔＢ遺伝子が不活性化されたＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢを得た。不活性化されたｍｅｔＢ遺伝子は、配列番号１８及び２１のプライマーを用いたＰＣＲを行い、その後ｍｅｔＢ遺伝子が不活性化されていないＡＴＣＣ１３０３２と比較して最終確認した。
３－２．Ｏ－アセチルホモセリンチオールリアーゼ（ＭｅｔＹ）の不活性
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、Ｏ－アセチルホモセリン分解経路のＯ－アセチルホモセリンチオールリアーゼ（O-acetylhomoserine(thiol)-lyase）をコードするｍｅｔＹ遺伝子を確保した。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）からｍｅｔＹ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号Ｎｃｇｌ０６２５，配列番号２２）を確保し、それに基づいてｍｅｔＹ遺伝子のＮ末端部分とリンカー部分を含むプライマー（配列番号２３及び２４）、Ｃ末端部分とリンカー部分を含むプライマー（配列番号２５及び２６）を合成した。プライマー配列を表７に示す。
Figure 2023503415000011
ＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２３及び２４、配列番号２５及び２６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼとしてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用い、ＰＣＲ条件は、９６℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を３０サイクル行うものとした。その結果、ｍｅｔＹ遺伝子のＮ末端部分とリンカー部分を含む５４８ｂｐの増幅された遺伝子と、ｍｅｔＹ遺伝子のＣ末端部分とリンカー部分を含む５５０ｂｐの増幅された遺伝子が得られた。前述したように得られた増幅された２つの遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９６℃で６０秒間の変性、５０℃で６０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を１０サイクル行い、その後配列番号２３及び２６を添加して重合反応を２０サイクル行うものとした。その結果、ｍｅｔＹ遺伝子のＮ末端－リンカー－Ｃ末端を含む１０７７ｂｐの不活性化カセットが得られた。上記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ断片を末端に含まれる制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩで処理し、制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩで処理したｐＤＣＭ２ベクターにライゲーション（ligation）によりクローニングし、最終的にｍｅｔＹ不活性化カセットがクローニングされたｐＤＣＭ２－△ｍｅｔＹ組換えベクターを作製した。
作製したｐＤＣＭ２－△ｍｅｔＹベクターをＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ菌株に電気パルス法で形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｍｅｔＹ遺伝子が不活性化されたＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹを得た。不活性化されたｍｅｔＹ遺伝子は、配列番号２３及び２６のプライマーを用いたＰＣＲを行い、その後ｍｅｔＹ遺伝子が不活性化されていないＡＴＣＣ１３０３２と比較して最終確認した。
３－３．変異型アスパルトキナーゼ（ＬｙｓＣ）の導入
Ｏ－アセチルホモセリン生成の最大化のために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のアスパルトキナーゼをコードするｌｙｓＣ遺伝子（配列番号２７）にｌｙｓＣ遺伝子の発現強化と、Ｌ－リシン（L-Lysine）及びＬ－トレオニン（L-Threonine）に対するフィードバック阻害解除のための変異（Ｌ３７７Ｋ）（特許文献７）を導入し、前記変異型ｌｙｓＣ遺伝子を含むベクターを作製するために、変異位置を中心に、５’末端上流を増幅するためのプライマー１対（配列番号２８及び２９）と、３’末端下流を増幅するためのプライマー１対（配列番号３０及び３１）を設計した。配列番号２８及び３１のプライマーは各末端にＸｂａＩ、ＳａｌＩ制限酵素部位を挿入し、配列番号２９及び３０のプライマーは交差するように設計し、その部位にヌクレオチド置換変異が位置するようにした。プライマー配列を表８に示す。
Figure 2023503415000012
ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号２８及び２９、配列番号３０及び３１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、ｌｙｓＣ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の５１２ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の５２２ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号２８及び３１のプライマーによりＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、３７７番目のロイシンがリシンに置換されたアスパルトキナーゼ変異体をコードする変異ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）遺伝子を含む１０１１ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
上記ＰＣＲにより得られたｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）ＰＣＲ断片を末端に含まれる制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩで処理し、制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩで処理したｐＤＣＭ２ベクターにライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）によりクローニングし、最終的にｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）置換カセットがクローニングされたｐＤＣＭ２－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）組換えベクターを作製した。
作製したｐＤＣＭ２－ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）ベクターをＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ菌株に電気パルス法で形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｌｙｓＣ遺伝子にヌクレオチド変異が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）を得た。ヌクレオチド変異が導入された遺伝子は、配列番号２８及び３１のプライマーを用いたＰＣＲを行い、その後シーケンシングにより野生型ｌｙｓＣ遺伝子の配列と比較して最終確認した。
３－４．Ｏ－アセチルホモセリントランスフェラーゼ（ＭｅｔＸ）導入プラスミドの作製
Ｏ－アセチルホモセリントランスフェラーゼ（ＭｅｔＸ）をコードする遺伝子を増幅するために、米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）からｍｅｔＸ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣｇｌ０６２４，配列番号３２）を確保し、それに基づいてプロモーター部位（開始コドンの上流約３００ｂｐ）からターミネーター部位（終結コドンの下流約１００ｂｐ）までを増幅するためのプライマー（配列番号３３及び３４）の両末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を挿入して設計した。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、ｍｅｔＸ遺伝子のコード部位１５４６ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。ｐＥＣＣＧ１１７（特許文献８）ベクターとｍｅｔＸ ＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、ＤＮＡライゲーション酵素を用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得た。これをｐＥＣＣＧ１１７－ｍｅｔＸ ＷＴと命名した。プライマー配列を表９に示す。
Figure 2023503415000013
３－５．Ｏ－アセチルホモセリン生産菌株の作製及びＯ－アセチルホモセリン生産能の評価
実施例３－４で作製したｐＥＣＣＧ１１７－ｍｅｔＸ ＷＴベクターを実施例３－３で作製したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）に電気パルス法で導入し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地に塗抹し、それぞれの形質転換株を得た。
前述したように作製した菌株のＯ－アセチルホモセリン生産能を比較するために、次の方法で培養し、培養液中のＯ－アセチルホモセリンを分析した。
次の培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに菌株を１白金耳（inoculation loop）接種し、３７℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。ＨＰＬＣを用いてＯ－アセチルホモセリン濃度を分析した。分析した濃度を表１０に示す。
Ｏ－アセチルホモセリン生産培地（ｐＨ７．２）
グルコース３０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ，尿素３ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ，ペプトン２．５ｇ，ＣＳＬ（Sigma）５ｇ（１０ｍｌ），ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，メチオニン４００ｍｇ，ＣａＣＯ３ ２０ｇ（蒸留水１リットル中）
Figure 2023503415000014
その結果、表１０に示すように、対照群菌株であるＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）を培養すると、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンが０．７ｇ／Ｌ蓄積し、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）／ｐＥＣＣＧ１１７－ｍｅｔＸ ＷＴ菌株を培養すると、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンが１．３ｇ／Ｌ蓄積することが確認された。
よって、これらの結果から、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）／ｐＥＣＣＧ１１７－ｍｅｔＸ ＷＴ菌株においてＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリンの生産が向上することが確認された。
３－６．ホモセリン生産能の評価
実施例３－４で作製したｐＥＣＣＧ１１７－ｍｅｔＸ ＷＴベクターを実施例３－３で作製したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）に電気パルス法で導入し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地に塗抹し、それぞれの形質転換株を得た。
前述したように作製した菌株のホモセリン生産能を比較するために、次の方法で培養し、培養液中のホモセリンを分析した。
次の培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに菌株を１白金耳（inoculation loop）接種し、３７℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。ＨＰＬＣを用いてホモセリン濃度を分析した。分析した濃度を表１１に示す。
ホモセリン生産培地（ｐＨ７．２）
グルコース３０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ，尿素３ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ，ペプトン２．５ｇ，ＣＳＬ（Sigma）５ｇ（１０ｍｌ），ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，メチオニン４００ｍｇ，ＣａＣＯ３ ２０ｇ（蒸留水１リットル中）
Figure 2023503415000015
その結果、表１１に示すように、対照群菌株であるＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）を培養すると、ホモセリンが０．２ｇ／Ｌ蓄積し、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）／ｐＥＣＣＧ１１７－ｍｅｔＸ ＷＴ菌株を培養すると、ホモセリンが０．２ｇ／Ｌ蓄積することが確認された。
よって、これらの結果から、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）／ｐＥＣＣＧ１１７－ｍｅｔＸ ＷＴ菌株においてホモセリンの生産が同等レベルであることが確認された。
向上したＯ－アセチルホモセリン生産能を有する変異型外来膜タンパク質（ＹｊｅＨ）導入菌株の作製及びＯ－アセチルホモセリン生産能の評価
４－１．変異型外来膜タンパク質（ＹｊｅＨ）の導入
実施例２－１で作製したベクターｐＤＣＭ２－△ＮＣｇｌ２３３５、ｐＤＣＭ２－△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，ＷＴ）、ｐＤＣＭ２－△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ９２Ｎ）、ｐＤＣＭ２－△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）を実施例３－３で作製したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でトランスポザーゼであるＮＣｇｌ２３３５遺伝子が欠損したＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）△ＮＣｇｌ２３３５、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，ＷＴ）、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ９２Ｎ）、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）を得た。不活性化されたＮＣｇｌ２３３５遺伝子と、新たに導入された大腸菌ｙｊｅＨ遺伝子が挿入されたか否かは、配列番号４及び７のプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後ＮＣｇｌ２３３５遺伝子が不活性化されていないＡＴＣＣ１３０３２と比較して最終確認した。
４－２．Ｏ－アセチルホモセリン生産菌株の作製及びＯ－アセチルホモセリン生産能の評価
実施例３－４で作製したｐＥＣＣＧ１１７－ｍｅｔＸ ＷＴベクターを実施例４－１で作製したＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）△ＮＣｇｌ２３３５、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，ＷＴ）、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ９２Ｎ）、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）に電気パルス法で導入し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地に塗抹し、それぞれの形質転換株を得た。
前述したように作製した菌株のＯ－アセチルホモセリン生産能を比較するために、次の方法で培養し、培養液中のＯ－アセチルホモセリンを分析した。
実施例３－５のＯ－アセチルホモセリン生産培地（ｐＨ７．２）２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに菌株を１白金耳接種し、３３℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。ＨＰＬＣを用いてＯ－アセチルホモセリン濃度を分析した。分析した濃度を表１２に示す。
Figure 2023503415000016
その結果、表１２に示すように、対照群菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）を培養すると、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンが１．３ｇ／Ｌ蓄積したので、トランスポザーゼであるＮＣｇｌ２３３５遺伝子を欠損させてもＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産には影響がないことが確認された。特に、野生型ｙｊｅＨ遺伝子を発現させると、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンが２．１ｇ／Ｌ蓄積することが確認され、変異型ｙｊｅＨ遺伝子を発現させると、それぞれ２．７、２．３ｇ／Ｌのレベルで蓄積することが確認された。
よって、これらの結果から、本出願の野生型及び変異型ｙｊｅＨ遺伝子がコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２からＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリンを排出して目的アミノ酸の生産量を大幅に向上させることが確認された。
４－３．ホモセリン生産能の評価
実施例３－４で作製したｐＥＣＣＧ１１７－ｍｅｔＸ ＷＴベクターを実施例４－１で作製したＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）△ＮＣｇｌ２３３５、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，ＷＴ）、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ９２Ｎ）、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）に電気パルス法で導入し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地に塗抹し、それぞれの形質転換株を得た。
前述したように作製した菌株のホモセリン生産能を比較するために、次の方法で培養し、培養液中のホモセリンを分析した。
次の培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに菌株を１白金耳接種し、３３℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。ＨＰＬＣを用いてホモセリン濃度を分析した。分析した濃度を表１３に示す。
ホモセリン生産培地（ｐＨ７．２）
グルコース３０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ，尿素３ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ，ペプトン２．５ｇ，ＣＳＬ（Sigma）５ｇ（１０ｍｌ），ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，メチオニン４００ｍｇ，ＣａＣＯ３ ２０ｇ（蒸留水１リットル中）
Figure 2023503415000017
その結果、表１３に示すように、対照群菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）を培養すると、ホモセリンが０．２ｇ／Ｌ蓄積したので、トランスポザーゼであるＮＣｇｌ２３３５遺伝子を欠損させてもホモセリン生産には影響がないことが確認された。特に、野生型ｙｊｅＨ遺伝子を発現させると、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンが０．２ｇ／Ｌ蓄積することが確認され、変異型ｙｊｅＨ遺伝子を発現させると、それぞれ１．２、０．７ｇ／Ｌのレベルで蓄積することが確認された。
よって、これらの結果から、本出願の野生型及び変異型ｙｊｅＨ遺伝子がコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２からホモセリンを排出して目的アミノ酸の生産量を大幅に向上させることが確認された。
菌株から生産されたＯ－アセチルホモセリンに対する変換反応を用いたメチオニン（ＭＥＴ）生産
実施例３－４で作製したｐＥＣＣＧ１１７－ｍｅｔＸ ＷＴベクターを実施例４－１で作製したＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）ΔＮＣｇｌ２３３５、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，ＷＴ）、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ９２Ｎ）、ＡＴＣＣ１３０３２△ｍｅｔＢ△ｍｅｔＹ ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）に電気パルス法で導入し、その後カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有する選択培地に塗抹し、それぞれの形質転換株を得た。
また、既に出願した特許（特許文献１）に開示されている方法に従って、Ｏ－アセチルホモセリンをメチオニンに変換する酵素として用いられるシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のＯ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードするｍｅｔＺ遺伝子をクローニングした。各菌株のクロモソームを鋳型とし、シュードモナス・エルギノーサ及びシュードモナス・プチダのｍｅｔＺ遺伝子のプライマーを用いて、９４℃で３０秒間の変性ステップ、５５℃で３０秒間のアニーリングステップ、７２℃で２分間の伸長ステップを３０サイクル行うＰＣＲ反応を行ってＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＰａｃＩで切断し、同様に切断したｐＣＬ－ＣＪ１ベクター（韓国，CJ社）にクローニングした。クローニングしたベクターをＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞に形質転換し、５０μｇ／Ｌのスペクチノマイシン含有ＬＢ平板培地で培養し、その後コロニーを選択した。選択したコロニーを５０μｇ／Ｌのスペクチノマイシン含有ＬＢ培地３ｍｌに接種し、３７℃で一晩培養した。培養した細胞を再度回収して０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（potassium phosphate, ｐＨ７．５）で洗浄し、再度２００μｌのリン酸カリウム緩衝液に懸濁し、３０秒間隔で５回ソニケーションして細胞を破砕した。破砕した細胞抽出液を１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その後上清を取り、Ｂｉｏ－Ｒａｄタンパク質定量液（米国，BIO-Rad社）を用いてタンパク質の総量を定量した。また、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法を用いてタンパク質の発現を確認した。回収した細胞抽出液の上清を酵素変換反応に用いた。
また、ヒフォモナス・ネプツニウム（Hyphomonas Neptunium）由来のＯ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードするｍｅｔＺ遺伝子をクローニングした。クロモバクテリウム・ビオラセウムのクロモソームを鋳型とし、プライマーを用いて、上記と同様のＰＣＲ反応を行ってＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＡｖｒＩＩで切断し、同様に切断したｐＣＬ－ＣＪ１ベクター（韓国，CJ社）にクローニングした。クローニングしたベクターから上記と同様の方法により細胞抽出液の上清を回収し、酵素変換反応に用いた。
抗生剤であるスペクチノマイシンを含む平板ＬＢ培地に、Ｗ３１１０をシュードモナス由来ｍｅｔＺ発現ベクター又はヒフォモナス由来ｍｅｔＺ発現ベクターで形質転換した菌株をそれぞれ接種し、３０～４０℃で一晩培養し、その後単一コロニーをスペクチノマイシン含有ＬＢ培地４０ｍｌに接種し、次いで３０～４０℃で５時間培養した。培養したシュードモナス由来ｍｅｔＺ発現菌株及びヒフォモナス由来ｍｅｔＺ発現菌株を１Ｌ発酵槽にて、６００～９００ｒｐｍ、３０～４０℃で１５～３０時間培養して発酵液を得た。培養に用いた培地の組成を次に示す。得られた発酵液において超音波振動により細胞を破砕して酵素液を作製した。
２ＸＹＴ培地
酵母抽出物１０ｇ，トリプトファン１６ｇ，グルコース４０ｇ，スペクチノマイシン５０ｇ（蒸留水１リットル中）
前記Ｏ－アセチルホモセリンを生産する形質転換株の培養液に前記シュードモナス及びヒフォモナス由来のＯ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素液を添加してメチオニン変換反応を行った。細胞を除去していないＯ－アセチルホモセリン培養液２．０Ｌに酵素液０．１Ｌを添加し、その後１５％Ｎａ－メチルメルカプタン０．３Ｌを添加して反応を開始し、２時間経過後に発酵液を回収して細胞を除去し、次いでＨＰＬＣにより生成されたメチオニン濃度を確認した。分析した濃度を表１４に示す。
Figure 2023503415000018
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
Figure 2023503415000019
Figure 2023503415000020

Claims (16)

  1. 配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、
    配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体。
  2. 前記変異体は、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン排出能を有するものである、請求項１に記載の変異体。
  3. 請求項１に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
  4. 請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  5. 配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、及び前記変異体をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つを含む微生物。
  6. 前記微生物は、非改変微生物より増加したＯ－アセチルホモセリン又はホモセリン生産能を有するものである、請求項５に記載の微生物。
  7. 前記微生物は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）である、請求項５に記載の微生物。
  8. 配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、及び前記変異体をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つを含む微生物を培地で培養するステップを含む目的産物生産方法。
  9. 前記方法は、培養した培地又は微生物から目的産物を回収するステップをさらに含む、請求項８に記載の目的産物生産方法。
  10. 前記目的産物は、Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリンである、請求項８に記載の目的産物生産方法。
  11. 配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、及び前記変異体をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つを含む微生物を培地で培養してＯ－アセチルホモセリンを生産するステップと、
    前記Ｏ－アセチルホモセリンと硫化物を反応させてＯ－アセチルホモセリンをメチオニンに変換するステップとを含むメチオニン生産方法。
  12. 配列番号１のアミノ酸配列において、ｉ）９２番目に相当する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、ｉｉ）３５１番目に相当する位置のアミノ酸のロイシンへの置換、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のアミノ酸置換を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上１００％未満の相同性を有する、内膜タンパク質ＹｊｅＨの変異体、及び前記変異体をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つを含む微生物を培地で培養してＯ－アセチルホモセリン又はホモセリンを生産するステップと、
    前記Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリンをグルホシネートに変換するステップとを含むグルホシネート生産方法。
  13. 請求項５に記載の微生物又は前記微生物の培養物を含むホモセリン生産用組成物。
  14. 請求項５に記載の微生物又は前記微生物の培養物を含むＯ－アセチルホモセリン生産用組成物。
  15. Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン生産のための請求項１に記載の内膜タンパク質ＹｊｅＨ変異体の使用。
  16. Ｏ－アセチルホモセリン又はホモセリン生産のための請求項５に記載の微生物の使用。
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